Bài tiểu luận phân tích hàm lượng Salbutamol (Sal) và Clenbuterol (Clen)

A. MỞ ĐẦU: 1. Lí do chọn đề tài:Trong lĩnh vực dược phẩm, β-agonist là nhóm chất được sử dụng nhiều trong điều trị bệnh hen suyễn, hai chất điển hình là salbutamol và clenbuterol . Salbutamol được dùng cho người với tên biệt dược là albuterol, salbutamol Clenbuterol được dùng với tên biệt dược là broncodil, clenburol, ventolax, protovent Trong chăn nuôi, các dược liệu này đã có lúc được đưa vào trong thức ăn gia súc nhằm làm giảm lớp mỡ dưới da, tăng cơ, tăng trọng đối với thú vật nuôi. Theo nhiều nghiên cứu, các loại dược liệu này gây hại cho gia súc và cả cho người nếu ăn phải thịt thú vật nuôi bằng loại thức ăn có trộn các loại dược liệu trên, vì các hóa chất thuộc nhóm β-agonist thường là những chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức năng gan.1. Lí do chọn đề tài:Tại Châu Âu và Châu Mỹ, những loại hóa chất trên bị cấm sử dụng. Ở Việt Nam, các loại dược liệu thuộc nhóm β-agonist trong đó có clenbuterol và salbutamol được xếp vào danh mục 18 hóa chất bị cấm của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn . Tuy nhiên, các chất này vẫn còn bị một bộ phận người dân lén sử dụng trong chăn nuôi và việc kiểm tra sự hiện diện của chúng trong thức ăn gia súc. Việc định lượng chính xác dư lượng của các β-agonist trong thức ăn chăn nuôi là vấn đề cần được quan tâm trong công tác kiểm tra chất lượng sản phẩm.Xuất phát từ tình hình thực tế, trên cơ sở khoa học của các công trình nghiên cứu về Salbutamol (Sal) và Clenbuterol (Clen) được công bố trong và ngoài nước, chúng tôi đã thực hiện đề tài “ Đánh giá hàm lượng các chất β-agonists (clenbuterol và salbutamol) trong thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt gia súc bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ”. Nghiên cứu này sẽ góp phần vào việc bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.1. Lí do chọn đề tài:2. Mục đích nghiên cứu:Đề tài này được thực hiện với mong muốn: • Xây dựng được phương pháp phân tích dư lượng clen và sal trong thức ăn chăn nuôi, thịt gia súc, gia cầm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ đạt độ nhạy và độ chọn lọc cao, đáp ứng được nhu cầu phân tích của các đơn vị kiểm nghiệm trong nước. • Theo dõi mức độ tồn lưu của Clen và Sal trong thực phẩm gà, heo khi nuôi gà, heo với thức ăn có chứa Clen và Sal. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: a. Mẫu thịt heo: nuôi thử nghiệm với thức ăn có chứa nồng độ nhất định Clen và Sal để kiểm tra khả năng tồn lưu của hai chất nầy. b. Mẫu thịt dùng cho điều tra: được lấy từ các chợ đầu mối trên địa bàn Tp Hồ Chí Minh, là nơi phân bố nguồn thịt chủ yếu đi khắp các quận trên thành phố. c. Thiết bị phân tích:Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực LC/MS/MS TSQ Quantum Access của Thermo Scientific (Công ty dịch vụ KHCN Sắc ký Hải Đăng – Thành phố Hồ Chí Minh). Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ 1 tứ cực LC/MS 2010A của Shimadzu (Công ty dịch vụ KHCN Sắc ký Hải Đăng – Thành phố Hồ Chí Minh).4. Phương pháp nghiên cứu:Xây dựng phương pháp chuẩn bị mẫu để tách chiết và làm giàu chất phân tích (Clenbuterol và Salbutamol) trước khi đưa vào máy sắc ký lỏng ghép khối phổ. Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực để xác định khả năng tồn dư Clen và Sal trong thịt heo.B. NỘI DUNG:1. Tổng quan về Clenbutarol và Salbutamol2. Các phương pháp phân tích dư lượng salbutamol và clenbutarol trong thịt heo:3. Xác định dư lượng β2-Agonist trong thịt heo bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ.1. Tổng quan về Clenbutarol và Salbutamol: 1.1 Khái quát về họ β- agonist: -Trong lĩnh vực dược phẩm, β_agonist là nhóm chất được sử dụng nhiều trong điều trị bệnh hen suyễn, hai chất điển hình là Clenbuterol và Salbutamol- Trong chăn nuôi, các dược liệu này đã có lúc được đưa vào trong thức ăn gia súc nhằm giảm lớp mỡ dưới da, tăng cơ, tăng trọng đối với thú vật nuôi. Theo nhiều nghiên cứu, các loại dược liệu này gây hại cho gia súc và cả cho người nếu ăn phải thịt thú vật nuôi bằng loại thức ăn có trộn các loại dược liệu trên, vì các hoá chất thuộc nhóm β_agonist thường là những chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức năng gan.Tại Châu Âu và Châu Mỹ, những loại hoá chất trên bị cấm sử dụng. Ở Việt Nam, các loại dược liệu thuộc nhóm β_agonist trong đó có Clenbuterol và Salbutamol được xếp vào danh mục 18 hoá chất bị cấm của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn.1.2. Giới thiệu về Clenbuterol và Salbutamol:ClenbuterolSalbutamol 1.2.1. Clenbuterol:-Công thức phân tử : C12H8Cl2ON2- Khối lượng phân tử: 276.0796 ( đvC)-Tên gọi: 2-(tert-butylamino)-1-(4-amino-3,5-diclophenyl) ethanol- Tên thương mại: vetipulmin- Hình dạng: tinh thể không màu, mịn.- Nhiệt độ nóng chảy (℃): 174-175.5- Nhiệt độ sôi (℃): 404.9- pKa: 9.29- Độ tan: tan nhiều trong nước, aceton, methanol; ít tan trong clorofom; không tan trong benzen. ** Trong y học, Clenbuterol có tác dụng làm giãn phế quản, giãn cơ trơn ở cuống phổi, Clenbuterol còn là dược phẩm được chỉ định để điều trị các chứng bệnh có liên quan đến phổi như hen, suyễn, tuy nhiên có thể hại đến hệ thần kinh và tuần hoàn của con người. ** Trong thú y,Clenbuterol được sử dụng để điều trị các căn bệnh dị ứng đường hô hấp ở ngựa (tên thương mại là ventipulmin), điều trị bệnh đường hô hấp ở trâu bò,Thuốc có thể thải qua đường tiểu và qua phân nhưng với thời gian rất dài.** Trong y học, Clenbuterol có tác dụng làm giãn phế quản, giãn cơ trơn ở cuống phổi, Clenbuterol còn là dược phẩm được chỉ định để điều trị các chứng bệnh có liên quan đến phổi như hen, suyễn, tuy nhiên có thể hại đến hệ thần kinh và tuần hoàn của con người. ** Trong thú y, Clenbuterol được sử dụng để điều trị các căn bệnh dị ứng đường hô hấp ở ngựa (tên thương mại là ventipulmin), điều trị bệnh đường hô hấp ở trâu bò,Thuốc có thể thải qua đường tiểu và qua phân nhưng với thời gian rất dài.1.2.2 Salbutamol:Công thức phân tử : C13H21O3NKhối lượng phân tử: 239,152 (đvC)Tên gọi: 2-(tert-butylamino)-1-(3-hydroxyethyl-2-hydroxyphenyl) ethanol.Tên thương mại: VentolinHình dạng: tinh thể màu trắng, mịn.Nhiệt độ nóng chảy (℃): 157-158Nhiệt độ sôi (℃): 433.5pKa: 9.27Độ tan: tan nhiều trong nước, aceton và ethanol; ít tan trong eter. ** Salbutanol được ứng dụng trong y học được dùng để điều trị bệnh hen suyễn rất hiệu nghiệm. Thuốc điều trị hen suyễn có chứa Salbutanol có nhiều trên thị trường trong nước cũng như trên thế giới. ** Tác dụng của Clenbuterol và Salbutamol lên động vật nuôi và người: Clenbuterol và Salbutamol tích luỹ trong thực phẩm thịt sẽ làm ảnh hưởng đến sức khoẻ người tiêu dùng thông qua dây chuyền thực phẩm, gây ra các triệu chứng rối loạn nhịp tim, tim đập nhanh, tăng huyết áp, co thắt phế quản, phù nề, run cơ, liệt cơ, choáng váng,1.3. Những dấu hiệu nhận biết thịt gia súc gia cầm có chứa Clenbutarol và Salbutamol:Với loại lợn siêu nạc tốt nhất ở nước ta hiện nay, người ta phải mất 5 tháng mới đạt được trọng lượng 95-100 kg/con nhưng cho thêm 1 thìa cà phê salbutamol vào thức ăn (cho 10 con lợn loại 78-80kg/con), thời gian xuất chuồng rút ngắn chỉ còn 3 tháng.Người sử dụng chất tạo nạc này chỉ cho lợn ăn không quá nửa tháng trước khi xuất chuồng. nếu nuôi quá nửa tháng lợn sẽ tự khuỵu chân,vì hóa chất này làm xương giòn. Khắp người con lợn sẽ bắt đầu xuất hiện những vết lở rỉ nước.Theo ông Nguyễn Xuân Dương, Phó cục trưởng Cục Chăn nuôi (Bộ NN&PTNT): “ Nếu nhìn bằng mắt thường thì rất khó phân biệt thịt lợn được nuôi bằng thức ăn tạo nạc và thịt nạc bình thường. Để biết thịt lợn nào bị nhiễm chất tạo nạc thì phải lấy mẫu thịt để kiểm tra, phân tích mới có thể đưa ra kết luận chắc chắn. Tuy nhiên, người dân nên tránh những loại thịt lợn phần nạc có màu đỏ giống thịt bò”.** Cách nhận biết thịt nào có chất tạo nạc hay thịt bình thường:Đây là 4 đặc điểm nhận biết thịt siêu nạc có hóa chất theo các chuyên gia Cục Chăn nuôi:2. Các phương pháp phân tích dư lượng salbutamol và clenbutarol trong thịt heo:2.1 Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ GC/MS:2.2 Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ đầu dò 3 tứ cực:2.1. Xác đinh dư lượng β2- Agonists trong thịt heo bằng phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ phổ GC/MS:  2.1.1. Giới thiệu chung:Kết hợp kỹ thuật sắc ký khí và đầu dò khối phổ cho kỹ thuật sắc ký khí khối phổ Cấu tạo gọn nhẹ và giảm thời gian phân tích đi rất nhiềuKhả năng phân tích trong rất nhiều ứng dụngGC/MS là công cụ hữu hiệu để xác định các hợp chất chưa biết, cho độ phân giải cao và nhiều dữ liệu về điện tử và hóa học của hợp chất. Ứng dụng nhiều trong pháp y, xét nghiệm, dược phẩm, hóa dầu, môi trường, phân tích sinh học2.1.2. Nguyên tắc hệ thống GC/MS:GC/MS là kỹ thuật phân tích có độ chọn lọc cao để xác định các chất nhờ vào quá trình đo khối lượng, sắc ký khí GC gồm: Một pha động là pha khí, trong sắc ký lỏng pha động là pha lỏng.Lưu ý : trong GC/MS là quá trình chuẩn bị mẫu và lựa chọn dung môi vì mẫu bị bẩn hoặc phân hủy sẽ làm sai lệch độ nhạy của khối phổ rất nhiềuCác kỹ thuật chuẩn bị mẫu thường dùng: Chiết pha rắn (SPE) Chiết lỏng – lỏng (LLE) Vi chiết pha rắn (SPME).Hệ thống sắc ký khí ghép nối khối phổ liên tục GCMS-TQ8040 Triple Quadrupole GC/MS/MS của hãng Shimadzu2.1.3. Quy trình định tính và định lượng β- agonists (salbutamol và clenbuterol):Hầu hết các phương pháp phân tích sắc ký dùng phát hiện và định lượng salbutamol và clenbuterol đều trãi qua ba giai đoạn như sau :Chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu (mẫu nguyên liệu) Làm sạch mẫu, loại tạp chất ra khỏi dịch chiết và làm giàu chất phân tích  Sử dụng các phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ để định lượng chất phân tích.2.1.4. Thiết bị , hóa chất và dung dịch thử 2.1.4.1 Thiết bị : Hệ thống máy LC- MS/MS Thermo Finnigan gồm:Hệ thống máy sắc ký lỏng: Bơm và hệ thống tiêm mẫu tự động Đầu dò khối phổ ba tứ cực TSQ Quantum Access với hai loại nguồn ion hóa ESI và APCI Cột sắc ký lỏng pha đảo Purospher Star C18, 150 mm x 4,6 mm, kích cỡ hạt 5 µm, cột bảo vệ pha đão C18 (hãng Merck) Phần mềm Xcalibur, điều khiển thiết bị và xử lý dữ liệu sắc ký 2.4.2 Hóa chất và dung dịch thử Nước cất 2 lần khử ion, CH3OH loại HPLC; H3PO4, p.a (pure analysis); HCOOH loại HPLC và K2HPO4, p.a (pure analysis); Dung dịch thử K2HPO4 0,1M Dung dịch pha động: MeOH (0,1% HCOOH) và H2O (0,1% HCOOH) (v/v) 2.1.5 Chất chuẩn và nội chuẩn: Clenbuterol hydrochloride, Dr. Ehrenstorfer, 95% (C12H18Cl2ON2,HCl) Clenbuterol–d9 (100 mg/L), Dr. Ehrenstorfer (C12H 9D9 Cl2ON2). Salbutamol sulfate, Dr. Ehrenstorfer, 99 % (C13H22O3N, ½ H2SO4)Salbutamol–d3 (100 mg/L), Dr. Ehrenstorfer (C13H19D3O3N). 2.2 Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ đầu dò 3 tứ cựcĐầu dò tứ cực có độ nhạy cao được sử dụng trong phân tích định lượng một chất đã biết, tạo được nhiều phân mảnh trong chế độ MS/MS, thích hợp cho phân tích vi lượng các chất đã biết trước cấu trúc.Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ đầu dò 3 tứ cực (Agilent 6410 Triple quad LC/MS/MS) bao gồm hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao LC1200 (thiết bị bơm mẫu tự động - HiP-ALS kèm bộ phận điều chỉnh nhiệt độ - FC/ALS, bơm áp suất cao - Binary SL, bộ phận loại khí - degasser, cột phân tích) và đầu dò khối phổ.2.2.1. Nguyên tắc hoạt động Mẫu cần phân tích sẽ đi qua một ống dẫn đến đầu dò MSdiễn ra quá trình ion hóa trong buồng API với kiểu ESI, APCI hoặc APPIIon sinh ra tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion đưa vào bộ phân tích khối Tứ cực thứ nhất sẽ chọn ion mẹ có m/z xác định, các phân mảnh của ion này được tạo ra tại buồng va chạm (collision cell) nhờ tương tác với khí trơ và được phân tích nhờ tứ cực thứ ba, tạo ra tín hiệu đặc trưng tại bộ phận phát hiện ion.2.2.2 Cấu tạo đầu dò khối phổ ba tứ cựcĐầu dò khối phổ ba tứ cực bao gồm 4 bộ phận chính sau: Nguồn ion hóa tại áp suất khí quyển: đầu dò khối phổ ba tứ cực 6410A có 4 nguồn ion gồm ESI, APCI, APPI và MMIHệ quang học ion (ion optics) là một bát cực (octopole) gồm tám thanh hình trục xếp song song có tác dụng như bộ lọc khối để đưa ion vào tứ cực thứ nhất Q1, ngoài ra còn còn có 2 thấu kính nằm trước và sau buồng va đập để hỗ trợ đưa ion vào buồng va đập và tứ cực thứ 3.Bộ phân tích khối (mass analyzer) gồm một buồng va chạm (collision cell, được xem là tứ cực thứ hai Q2) đặt ở giữa 2 tứ cực (Q1 và Q3).Đầu dò phát hiện ion (Dual Dynode Detector) gồm có 2 dynode đặt vuông góc với dòng các ion và phân tử trung tính đi ra khỏi bộ phân tích khối.2.2.3. Ứng dụng hệ thống Agilent 6410 Triple quad LC/MS/MS Phân tích được các chỉ tiêu ở hàm lượng siêu vết (ppb/ppt);Phân tích dư lượng các loại kháng sinh thuộc nhóm A (theo quy định của châu Âu Các loại vitamin trong thực phẩmDư lượng thuốc trừ sâu nhóm Carbamate, diệt cỏ, thủy hải sản, thức ăn gia súc,Hóc môn tăng trưởng (họ β-Agonist, Clenbuterol, Salbutamol) trong thịt gia súc, thủy hải sản,Hệ thống HPLC bao gồm các bộ phận cơ bản như sau:1. Sơ lược về hệ thống HPLCHệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm có các bộ phận cơ bản như sau:Trong đó:1: Bình chứa pha động.2: Bộ phận khử khí3: Bơm cao áp4: Bộ phận tiêm mẫu5: Cộ sắc ký (pha tĩnh)6: Đầu dò 7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu , xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống.8: In dữ liệu.  1.1.  Bình chứa pha động :Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đường là 100%.Nhưng ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc thường sử dụng 2 hoặc 3 đường hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, đơn giản hơn ổn định quá trình rửa giải. Lưu ý: Tất cả dung môi đều phải là dung môi tinh khiết. Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải là hóa chất tích khiết dùng cho phân tích.Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên các peak tạp trong quá trình phân tích.1.2. Bộ khử khí DegasesMục đích sử dụng bộ khử khí nhằm lọai trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động, tránh xảy ra một số hiện tượng có thể có như sau:Tỷ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời gian lưu của peak thay đổi.Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể lọai trừ hết được thì bơm cao áp có thể không hút được dung môi, khi đó ảnh hưởng đến áp suất và hoạt động của cả hệ thống HPLC.Trong các trường hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích.1.3. Bơm cao ápMục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải tạt được áp suất cao khỏang 250-600bar và tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 10ml/phút.1.4. Bộ phận tiêm mẫuĐể đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đồi.Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động (autosamper).1.5. Cột sắc kýCột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5-25cm đường kính trong 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0.3-5µm,Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột và kiểu sắc ký.1.6. Đầu dòLà bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất phân tích mà lựa chọn lọai đầu dò phù hợp.Tín hiệu đầu dò thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,1.7. Bộ phận ghi nhận tín hiệuBộ phận này ghi tín hệiu do đầu dò phát hiện.Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần này được phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan đến peak như tính đối xứng, hệ số phân giải, đồng thời tính tóan, xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân tich.1.8. In dữ liệuSau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển.2.2.4. Một số hệ thống HPLC Ngày nay, phương pháp HPLC được ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh vực phân tích định tính cũng như định lượng các thành phần trong dược phẩm, thực phẩm, môi trường, hóa chất, Các hệ thống HPLC hiện đại phân tích như Shimadzu (model 10A, 20A), Agilent (LC 1200), Dionex (UltiMate 3000), Thermo, Mehtromvới hầu hết các đầu dò như quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS), huỳnh quang (RF), khúc xạ (RI), đo độ dẫn (sắc ký ion-IC), khối phổ (MS), Các hệ thống HPLC này đều có gắn các bộ chích mẫu tự động nhằm nâng cao tính chính xác và có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu.2.2.5. Ứng dụng HPLC phân tích mẫu:Phân tích đa lượng vitamin, kháng sinh, kháng khuẩn, chất bảo quản phụ gia thực phẩm, các loại đường, trong thực phẩm, dược liệu, hóa chất, phân bón, thức ăn gia súc,Phân tích vi lượng các vitamin trong trái cây, sữa, bánh kẹo, nước, thủy hải sản. Phân tích dộc tố sinh học biển trong nghêu (ASP). Phân tích các hoạt chất, tạp chất trong dược phẩmPhân tích các acid hữu cơĐặc biệt, hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang có độ nhạy và tính chọn lọc cao có thể phân tích các độc tố Mycotoxin trong thực phẩm, nguyên liệu chế biến và thức ăn gia súc như Aflatoxin, Orchatoxin, Zearalenone,2.2.5. Ứng dụng HPLC phân tích mẫu Phân tích đa lượng vitamin, kháng sinh, kháng khuẩn, chất bảo quản phụ gia thực phẩm, các loại đường, trong thực phẩm, dược liệu, hóa chất, phân bón, thức ăn gia súc,Phân tích vi lượng các vitamin trong trái cây, sữa, bánh kẹo, nước, thủy hải sản. Phân tích dộc tố sinh học biển trong nghêu (ASP). Phân tích các hoạt chất, tạp chất trong dược phẩm Phân tích các acid hữu cơ.Đặc biệt, hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang có độ nhạy và tính chọn lọc cao có thể phân tích các độc tố Mycotoxin trong thực phẩm, nguyên liệu chế biến và thức ăn gia súc như Aflatoxin, Orchatoxin, Zearalenone, 3.1 Phạm vi áp dụng3.2 Nguyên tắc3.3 Thuốc thử3.4 Thiết bị, dụng cụ3.5 Lấy mẫu3.6 Chuẩn bị mẫu3.7 Tiến hành thí nghiệm3.8 Tính toán và biểu thị kết quả3.Xác định dư lượng β2-Agonist trong thịt heo bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ.3.1. Phạm vi áp dụng:Xác định dư lượng nhóm β2 Agonist gồm các chất Clenbuterol, Salbutamol và Ractopamine trong thịt bò, thịt heo bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ. Giới hạn định lượng của phương pháp cho mỗi chất là Clenbuterol 0,2 µg/kg, Salbutamol 5 µg/kg và Ractopamin.HCl là 10 µg /kg.3.2 Nguyên tắc: Dư lượng Clenbuterol, Salbutamol và Ractopamine tự do trong thịt heo được chiết ra từ mẫu bằng hỗn hợp Axetonitrile và isopropanol. Sử dụng các muối natri clorit, natri sunphat và magiê sunphate để tủa protein và loại nước có trong dịch chiết mẫu. Dịch chiết được làm bay hơi dung môi đến khô, phần cặn hòa tan bằng dung dịch nước chứa 10% . Axetonitril, làm sạch bằng n-hexan và đưa vào phân tích bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC-MS-MS) để xác định và định lượng Clenbutarol, Salbutamol và Ractopamine có trong mẫu.3.3 Thuốc thửTrong tiêu chuẩn này, chỉ sử dụng thuốc thử có cấp độ tinh khiết phân tích và nước cất hai lần đã khử ion.3.3.1 Chuẩn Clenbuterol.HCL (CLEN.HCl) , ≥ 98,5 %; 3.3.2 Chuẩn Salbutamol sunphat (SAL.SUL), ≥ 99 %;3.3.3 Chuẩn Ractopamin.HCL (RAC.HCl), ≥ 98%; 3.3.4 Nội chuẩn Clenbuterol D9 (CLEN D9), > 99 %;3.3.5 Nội chuẩn Salbutamol D3 (SAL D3), ≥ 98%; 3.3.6 Nội chuẩn Ractopamin.HCL D6 (RAC D6), > 99 %;3.3.7 Axetonitril (ACN), loại dùng cho LC-MS;3.3.8 Nước, loại dùng cho LC-MS;3.3.9 Metanol (MeOH), loại dùng cho LC-MS;3.3.10 Isopropanol (IPA), loại dùng cho HPLC;3.3.11 n-Hexan, loại dùng cho phân tích;3.3.12 Natri clorit (NaCl), loại dùng cho phân tích;3.3.13 Natri sunphat (Na2SO4), loại dùng cho phân tích;3.3.14 Magiê sunphat (MgSO4) khan; 3.3.15 Axit formic, độ tinh khiết tối thiểu 99 %;3.3.16 Khí argon, tinh khiết 99,9%;3.3.17 Khí nitơ, tinh khiết 99,9%.3.3.18 Pha chế dung dịch chuẩn và nội chuẩn3.3.19 Pha động3.3.20. Dung dịch 10%ACN trong nước cất3.3 Thuốc thử3.3.18 Pha chế dung dịch chuẩn và nội chuẩn1. Dung dịch chuẩn gốc CLEN, SAL 1000 g / ml trong metanol 2. Dung dịch chuẩn gốc RAC.HCL 1000 g / ml trong metanol3. Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian CLEN: 2 g / ml; SAL: 50 g / ml; RAC.HCL: 100 g / ml (S1)4. Dung dịch chuẩn hỗn hợp CLEN: 20 ng / ml; SAL: 500 ng / ml; RAC.HCL: 1000 ng / ml (S2)5. Dung dịch chuẩn hỗn hợp CLEN, SAL: 2 ng / ml; SAL: 50 ng / ml; RAC.HCL: 100 ng / ml (S3)6 Dung dịch nội chuẩn gốc SAL D3 9.8 g / ml trong metanol7.Dung dịch nội chuẩn gốc CLEN D9 100 g / ml trong metanol 8.Dung dịch nội chuẩn gốc RAC.HCL D6 100g/ml trong metanol. 9. Dung dịch hỗn hợp nội chuẩn CLEN D9, RAC.HCL D6, 10 g / ml (IS1)10. Dung dịch hỗn hợp chuẩn nội làm việc 50 ng / ml trong axetonitril (IS2). 3.3.19 Pha động A: axetonitril (3.3.7) .B: Nước (3.3.8) + 0,1 % axit formic (3.3.15).3.4 Thiết bị và dụng cụ:3.4.1 Hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ LC-MS-MS- Bơm 2 kênh dung môi biến đổi dòng;- Đầu dò MS-MS;- Máy tính và phần mềm phân tích;- Cột sắc ký Hypersil GOLD C18, đường kính trong là 2,1 mm, kích thước hạt nhồi là 1,9 m, độ dài của cột là 100 mm.3.4.2 Ống ly tâm nhựa, dung tích 50 ml có nắp;3.4.3 Ống ly tâm thủy tinh, dung tích 10 ml;3.4.4 Bình định mức thủy tinh, dung tích 10 ml, 20 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml; 1000 ml;3.4.5 Pipet tự động, dung tích 50 l, 100 L, 250 l, 1000 l, 5000 µl;3.4.6 Máy ly tâm lạnh, tốc độ 4000 vòng / phút;3.4.7 Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,1 mg;3.4.8 Bơm hút chân không;3.4 Thiết bị và dụng cụ: 3.4.9 Màng lọc dung môi, đường kính 45 mm, kích thước lỗ 0,2 m, làm bằng chất liệu chịu được cả nước và dung môi hữu cơ;3.4.10 Bộ lọc dung môi bằng thủy tinh; 3.4.11 Máy lắc, tốc độ tối thiểu 4000 vòng / phút;3.4.12 Máy lắc ngang, tốc độ tối thiểu 300 vòng / phút;3.4.13 Lọ đựng mẫu, dung tích 2 ml; 3.4.14 Màng lọc mẫu, đường kính 13 mm, kích thước lỗ 0,2 m, làm bằng PTFE;3.4.15 Bộ hút dung môi tự động, thể tích 25 ml;3.4.16 Bộ bay hơi nitơ, có điều chỉnh nhiệt độ;3.4.17 Máy xay thịt.3.5 Lấy mẫu:Việc lấy mẫu theo TCVN 4833 – 1: 2002 (ISO 3100-1:1991).Mẫu phân tích tại phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị biến đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.3.6. Chuẩn bị mẫu:Cắt thịt thành từng miếng nhỏ, đồng hóa mẫu bằng cách cho mẫu đi qua máy xay thịt hai lần và trộn. Chuyển mẫu đã đồng nhất sang dụng cụ đựng mẫu, đậy nắp kín và lưu trữ ở nhiệt độ -10C. Khi thực hiện phân tích, phải đưa mẫu về nhiệt độ phòng. 3.6.1. Chuẩn bị mẫu thử Cân 5,0 g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml . Cho vào 50 l dung dịch hỗn hợp chuẩn nội làm việc IS1 50 ng / ml (3.3.18.9). 3.6.2. Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng là mẫu thịt heo, thịt bò đã được xác định không nhiễm Clenbuterol, Salbutamol và Ractopamin.HCl. Mẫu trắng được chuẩn bị như mẫu thử.3.6 Chuẩn bị mẫu3.6.3 Chuẩn bị mẫu kiểm soát Mẫu kiểm soát được chuẩn bị từ mẫu trắng như mẫu thử nhưng có bổ sung thêm 50 L dung dịch chuẩn hỗn hợp S2 vào mẫu. Trộn đều bằng máy lắc, sau đó để yên 15 phút trước khi tiến hành các bước tiếp theo.3.6.4 Chuẩn bị mẫu xây dựng đường chuẩn Đường chuẩn được xây dựng dựa trên nền mẫu trắng. Cân 5 mẫu mỗi mẫu 5,0 g đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml, bổ sung 50 l dung dịch hỗn hợp chuẩn nội làm việc IS1 50 ng / ml (3.3.18.9) vào các ống nghiệm chứa mẫu trắng. Tiến hành trộn đều bằng máy lắc trong 15 giây, sau đó để yên 15 phút trước khi tiến hành các bước tiếp theo.3.7. Tiến hành thử nghiệm:3.7.1. Chiết mẫu và làm sạch mẫu Cho 4 ml axetonitril (3.3.7) và 1ml isopropanol (3.3.10) vào các ống nghiệm chứa mẫu trắng, mẫu kiểm soát, mẫu thử và mẫu trắng dùng để dựng đường chuẩn. Trộn đều bằng máy lắc trong 2 phút. Tiếp theo, thêm vào mỗi ống 1,2 g NaCl (3.3.12), lắc mạnh 2 phút, sau đó tiếp tục thêm vào mỗi ống 4 g Na2SO4 và 0,5 g MgSO4, lắc đều 2 phút trên máy lắc . Sau khi lắc mẫu, ly tâm 4 phút ở tốc độ 4000 vòng / phút. Dùng pipet, chuyển 1 ml lớp trên sang ống nghiệm thuỷ tinh. Sau đó cho bay hơi bằng bộ bay hơi N2 (3.4.9) đến khô ở nhiệt độ 40C. Sau khi bay hơi đến khô. Đối với mẫu trắng, mẫu kiểm soát và mẫu thử hoà tan bằng 1 ml dung dịch 10% ACN trong nước (3.3.20). Đối với mẫu trắng dùng để dựng đường chuẩn, thêm chuẩn theo các thể tích như ở bảng 1, lắc đều khoảng 30 giây trên máy lắc. Tiếp theo, thêm 1 ml n-hexan. Trộn đều bằng máy lắc trong trong 10 giây , ly tâm 6 phút ở 4000 vòng / phút . Sau đó loại bỏ lớp trên. Hút lớp dưới lọc qua màng lọc vào lọ đựng mẫu . Dung dịch sẵn sàng để phân tích trên thiết bị LC-MS/MS.3.7 Tiến hành thử nghiệmSTTNồng độ chuẩn (ng/ml)Thể tích dung dịch chuẩn hỗn hợp S3 sử dụng (l)Thể tích định mức(*) (l)Nồng độ dung dịch nội chuẩn IS, CLEN D9; SAL D3 và RAC D6 (ng / ml)CLENSALRAC.HClMẫu 10000010000,5Mẫu 20,12,5505010000,5Mẫu 30,251010010000,5Mẫu 40,4102020010000,5Mẫu 50,8204040010000,5Mẫu 61,6408080010000,5Bảng 1 - Xây dựng đường chuẩn (*): Dung dịch dùng định mức: dung dịch 10% ACN trong nước.LƯU Ý:Nếu mẫu nhiều béo, khi cho n-hexan vào và lắc quá mạnh thì dung dịch sẽ tạo huyền phù khó tách lớp. Nên lắc vừa phải và tiến hành loại béo lần thứ 2 nếu cần 3.7. Tiến hành thử nghiệm3.7.2 Tiến hành thử nghiệm trên LC-MS-MS 3.7.2.1 Điều kiện HPLC - Cột sắc ký Hypersil GOLD C18, đường kính trong là 2,1 mm, kích thước hạt nhồi là 1,9 m, độ dài của cột là 100 mm; - Nhiệt độ cột: 40C;- Thể tích tiêm mẫu: 10 μl;- Thời gian phân tích: 6 phút;- Tốc độ dòng: 0,2 ml / phút;- Pha động: chương trình gradient thể hiện theo bảng 2:3.7 Tiến hành thí nghiệmThời gian(phút)Tốc độ dòng(mL / phút)Pha động A(%)Pha động B(%)Initial0,25950,50,25951,00,220804,00,280204,20,25956,00,2595Bảng 2 - Chương trình pha động3.7 Tiến hành thử nghiệm 3.7.2. Điều kiện trên MSĐiều kiện trên MS như sau:Kiểu ion hóa: ESI (+)Nhiệt độ nguồn ion hóa: 150CNhiệt độ hóa hơi dung môi: 400CTốc độ dòng khí làm bay hơi dung môi: 800 l / hTốc độ dòng khí qua Cone Gas: 30 l / h3.7 Tiến hành thử nghiệmTên hợp chấtIon Mẹ (m/z)Ion Con (m/z)Năng lượng (Sample Cone)(V)Năng lượng va chạm(eV)Clenbuterol276,97167,89202,94*182814Clenbuterol D9286,03168,80203,90*183016Salbutamol240,10148,01222,01*161810Salbutamol D3243,03151,01255,10*181810Ractopamin.HCl302,10121,01164,06*202816Ractopamin.HCl D6308,10290,10168,10*202216Các điều kiện phân ly MS-MS như sau:Bảng 3 - Điều kiện phân ly MS-MSGHI CHÚ: ion có kí hiệu (*) là ion dùng để định lượng.3.7 Tiến hành thử nghiệm: 3.7.3 Trình tự bơm mẫu 3.7.3.1 Bơm dung môi kiểm tra máy: dung dịch 10% ACN trong nước 3.7.3.2 Bơm các dung dịch lập đường chuẩn; 3.7.3.3 Bơm mẫu trắng; 3.7.3.4 Bơm mẫu kiểm soát; 3.7.3.5 Bơm mẫu thử. 3.8 Tính toán và biểu thị kết quả:3.8.1 Tính hệ số tín hiệu Tính cho từng chất cần phân tích theo phương trình: Trong đó: RF: hệ số tín hiệu; Area: diện tích pic của ion định lượng của chất cần phân tích; ISConc: nồng độ của ion định lượng của nội chuẩn; ISArea: diện tích pic của ion định lượng của nội chuẩn.3.8 Tính toán và biểu thị kết quả: 3.8.2 Xây dựng đường chuẩn Xây dựng phương trình bậc nhất giữa hệ số tín hiệu với nồng độ chất chuẩn bổ sung vào mẫu và chuẩn bị mẫu theo mục 3.3.6.4.Phương trình có dạng: RF = ax + b. Trong đó: RF: hệ số tín hiệu x: nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu(3.3.6.4) điểm cắt của đường chuẩn với trục tung; a: hệ số góc của đường chuẩn.Phương trình đạt yêu cầu khi hệ số hồi quy: 1 ≤ R2 ≤ 0.99.3.8 Tính toán và biểu thị kết quả: 3.8.3 Hàm lượng chất phân tích trong mẫu: Dư lượng các chất cần phân tích trong mẫu được tính theo phương pháp đường chuẩn xây dựng theo mục 3.8.2 Nồng độ trong mẫu phân tích được tính theo công thức sau:Trong đó: C: là nồng độ của Agonist có trong mẫu, tính bằng μg / kg; Cx: là nồng độ Agonist đo được suy ra từ đường chuẩn, μg / l; V1: là thể tích ban đầu mà chất phân tích có mặt trong đó (5 ml), tính bằng ml; V2: là thể tích dịch trích mang đi phân tích (1ml), tính bằng ml; V3: là thể tích định mức cuối cùng (1ml), tính bằng ml; F: là hệ số pha loãng mẫu khi đo (nếu không pha loãng, F = 1); a: là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g). Kết quả được biểu thị bằng đơn vị μg / kg (ppb), hai số sau dấu phẩy.C. Kết LuậnChất tăng trưởng β2-Agonist là chất gây nguy hiểm cho sức khỏe của con người, có thể khiến cơ thể bị nhiễm độc, gây rối loạn tiêu hóa, tuần hoàn, thậm chí ảnh hưởng đến tính mạng. Việc sử dụng Salbutamol và Clenbutarol trong chăn nuôi hiện nay đang là thực trạng đáng báo động, cần được quan tâm nhiều hơn và có biện pháp chế tài thích đáng đối với những hành vi của cá nhân, tổ chức gây hại sức khỏe công đồng bằng các hợp chất cấm như salbutamol và clenbutamol trong chăn nuôi gia súcVấn đề phân tích dư lượng β2-Agonist trong thịt heo là rất cần thiết và hữu ích. Phương pháp sắc kí lỏng ghép khối phổ là phương pháp hiệu quả, độ nhạy cao, độ chính xác cao. Phương pháp này có thể phân tích được ở hàm lượng siêu vết (ppm/ppb/ppt).