Biệt hóa tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào tiết Insulin để ứng dụng điều trị bệnh tháo đường type 2

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014 50 BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ THÀNH TẾ BÀO TIẾT INSULIN ĐỂ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH THÁO ĐƯỜNG TYPE 2 Trần Đặng Xuân Tùng*, Đặng Vạn Phước**, Lê Thị Bích Phượng*, Phạm Văn Phúc*** TÓM TẮT Mục tiêu: nghiên cứu này nhằm phân lập, nuôi cấy, tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc (TBG) từ mô mỡ thành tế bào tiết insulin giống tế bào beta. Đối tượng và phương pháp: mô mỡ được thu nhận từ người tình nguyện. Sau đó, tế bào gốc từ mô mỡ được phân tách bằng bộ kit ADSC extraction kit và nuôi cấy trong môi trường MSCult kit để làm giàu tế bào gốc ứng viên. Các tế bào gốc này được khẳng định các đặc điểm của tế bào gốc trung mô bằng cách xác định các marker bề mặt. Cuối cùng tế bào gốc được biệt hóa thành tế bào tiết insulin trong môi trường chuyên biệt bổ sung các chất nicotinamide, exendin-4, B27. Kết quả: qui trình này là thu nhận được 1,01 x 106 tế bào trong 1 gram mỡ , trong đó có 78,3 ± 5,7% tế bào sống và tỷ lệ tế bào gốc là 7,15 ± 2,22%, qui trình biệt hóa thành công tế bào gốc này thành tế bào tiết insulin. Kết luận: số lượng tế bào gốc thu được đủ dùng trong các nghiên cứu và nhân lên ứng dụng trong điều trị, qui trình biệt hóa tế bào gốc thành tế bào tiết insulin là hoàn toàn khả thi. Từ khóa: Tế bào gốc, tế bào gốc từ mô mỡ, tế bào tiết insulin, biệt hóa. ABSTRACT DIFFERENTIATION THE ADIPOSE DEVIRED STEM CELL TO INSULINE PRODUCING CELL FOR DIABETTES MELLITUS TREATMENT Tran Dang Xuan Tung, Dang Van Phuoc, Le Thi Bich Phuong, Pham Van Phuc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - No 2 - 2014: 50 - 54 Purposes: This research is carried out in order to subdivide, culture, multiple and differentiate adipose derived stem cell (ADSC) to insulin producing cells, which similar to beta cells. Subjects and Methods: Adipose tissue was obtained from healthy volunteer. Adipose derived cells is isolated by ADSC extraction kit and cultured in MSCult kit to enrich stem cell candidate. These cells are identified as stem cells by defining surface markers following the definition of Mesenchymal stem cells. Finally, ADSC is differentiated to insulin producing cells in specific medium supplemented with nicotinamide, exendin-4, B27. Results: we can obtain1,01 x 106 cells in 1 gram of adipose tissue with stem cell percentage be 7,15± 2,22%, it is 78,3 ± 5,7% life cells and 7,15 ± 2,22% stem cells. ADSC is differentiated successfully to Insulin producing cells. Conclusion: the quality of stem cell have been derived, that is enough for research and culture to clinical treatment. The process for differentiation stem cell to insulin producing cell is realizable. Key words: stem cell, adipose devised stem cell (ADSC), insulin producing cell, differentiation GIỚI THIỆU Đái tháo đường là một bệnh mãn tính, gây ra do tình trạng thiếu insulin tuyệt đối hoặc tương đối của cơ thể. Đặc trưng của bệnh là tình trạng đường huyết tăng cao, kèm theo đó là các rối loạn quan trọng chuyển hóa carbohydrate, protein, lipid và chất khoáng. Các rối loạn này sẽ dẫn đến * *Bệnh viện đa khoa Vạn Hạnh **Đại Học Y Dược TpHCM ***Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TpHCM Tác giả liên lạc: ThS. Trần Đặng Xuân Tùng ĐT: 0903120280 Email: dr_xuantung@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học 51 nhiều biến chứng cấp tính và mạn tính. Nhằm ngăn ngừa các biến chứng cũng như tử vong từ bệnh đái tháo đường, bệnh nhân cần phải kiểm soát đường huyết chặt chẽ tùy theo mục tiêu của từng đối tượng. Khi những tiềm năng to lớn của tế bào gốc được khám phá, nó mang lại hi vọng sử dụng tế bào gốc như một phương pháp điều trị hứa hẹn cho bệnh nhân đái tháo đường. Trong vòng hai thập niên qua, nhiều nghiên cứu về liệu pháp tế bào gốc trong điều trị bệnh đái tháo đường được tiến hành. Các nghiên cứu này đã điều trị được nguyên nhân gây bệnh và mang lại kết quả ổn định lâu dài(3,8). Tại Việt Nam, nhiều tác giả đã thành công trong việc biệt hóa tế bào gốc thu nhận từ máu cuống rốn hoặc tủy xương thành tế bào tiết insulin và đã thử nghiệm thành công trên mô hình động vật(7). Tuy nhiên, những phương pháp này còn có những hạn chế nhất định như tính xâm lấn trong việc thu nhận tế bào gốc từ tủy xương hay người bệnh không có nguồn lưu trữ máu cuống rốn hay dây rốn Do đó, việc phát hiện ra tế bào gốc từ mô mỡ đã mở ra một tương lai mới trong việc ứng dụng tế bào gốc trong điều trị đái tháo đường do những ưu điểm: mô mỡ dễ phân tách, thủ thuật thu nhận ít xâm lấn(9). Với những kết quả trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm (1) xây dựng quy trình thu nhận tế bào gốc trung mô từ mô mỡ, (2) biệt hóa tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào tiết insulin, (3) đánh giá chất lượng tế bào đã biệt hóa để ứng dụng vào điều trị bệnh đái tháo đường type 2, đồng thời là những thử nghiệm cơ bản với các số liệu ban đầu mang tính chất tham khảo cho các nghiên cứu lớn sau này. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Phương pháp nghiên cứu: In vitro Sinh phẩm nghiên cứu Mô mỡ của người tình nguyện được lấy tại Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh TP.Hồ Chí Minh. Tiêu chuẩn chọn mẫu Mô mỡ có kết quả âm tính với HIV, HBV, HCV thông qua các xét nghiệm PCR. Lượng mỡ thu nhận tối thiểu 100ml (kể cả chất gây tê). Tiêu chuẩn loại mẫu Mô mỡ được lấy ở những người tình nguyện có bệnh lý gây viêm hoặc có dấu hiệu nhiễm trùng vùng lấy mẫu. Các quy trình và thao tác được thực hiện tại Phòng thí nghiệm nghiên cứu và ứng dụng Tế bào gốc và Phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.Hồ Chí Minh. Qui trình nghiên cứu gồm các giai đoạn sau: Thu nhận mỡ. Thu nhận SVF và nuôi cấy TBG từ mô mỡ. Định lượng, định danh TBG sau phân tách. Biệt hóa tế bào gốc thành tế bào tiết insulin. Kiểm tra sự nhiễm khuẩn, nhiễm nấm và bộ NST của tế bào tiết insulin. Đánh giá sự biệt hóa thành tế bào tiết insulin. Giai đoạn 1: Thu nhận mỡ bụng Bệnh nhân được gây mê mask thanh quản phối hợp tê tại chỗ bằng lidocaine. Thu mỡ dưới da của vùng bụng dưới rốn, hút đều hai bên đối xứng qua đường trắng giữa bụng. Bơm vào mô mỡ 100ml nước muối sinh lí với hỗn hợp nồng độ Lidocain 1% và adrenaline 1/1000000. Hút mỡ bằng tay nhẹ nhàng tránh tổn thương các tế bào. Số lượng hút là 100ml hỗn hợp mô mỡ và nước muối sinh lý trên 1 tình nguyện viên. Giai đoạn 2: Thu nhận phân đoạn mạch nền (SVF) và nuôi cấy tế bào gốc từ mô mỡ: Bước 1: Xử lí sơ bộ mẫu. Bước 2: Rửa mẫu bằng Washing buffer 1. Bước 3: Lặp lại bước 2. Bước 4: Rửa mẫu bằng Washing buffer 2. Bước 5: Lặp lại bước 4. Bước 6: Phân tách mẫu. Bước 7: Thu nhận tế bào. Bước 8: Rửa tế bào. Bước 9: Sử dụng hay nuôi cấy tế bào. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014 52 Huyền phù cặn trong môi trường DMEM/F12 10% FBS nuôi ở điều kiện 370C, 5% CO2. Thay môi trường 3 ngày/lần đến khi tế bào phát triển 70% bề mặt flask và cấy chuyền dùng hóa chất trypsin 0,25%. Giai đoạn 3: Định lượng, định danh tế bào gốc sau phân tách: Tế bào gốc có trong mẫu được phân tích bằng kĩ thuật flow cytometry trên máy FACS calibur (BD Bioscience) theo hướng dẫn của của nhà sản xuất. Tế bào gốc trung mô phải có kết quả về các marker như sau: (+) với các marker CD13, CD44, CD73, CD90, CD105. (-) với các marker CD14, CD34, CD45, HLA-DR. Giai đoạn 4: Biệt hóa tế bào gốc thành tế bào tiết Insulin Bước 1: Tế bào nuôi tăng sinh trong MSCCult được tách bằng trypsin/EDTA 0,25% cấy vào đĩa 6 giếng, mỗi giếng 100.000 tế bào. Nuôi tế bào trong môi trường IPC-M1 trong 5-7 ngày ở 370 C, với chế độ thay môi trường 3 ngày/lần. Bước 2: Thay môi trường nuôi tế bào thành IPC-M2 nuôi trong 7 ngày. Bước 3: Thay môi trường nuôi tế bào thành IPC-M3. Tiếp tục nuôi như bước 1, trong 3 ngày. Sau đó tách tế bào bằng trypsin/EDTA 0,25% rồi nuôi lại trong cùng giếng của đĩa. Tế bào này được tiếp tục nuôi trong 4-5 ngày. Tất cả môi trường trên được cung cấp bởi công ty GeneWorld, HCM, VN. Giai đoạn 5: Đánh giá sự nhiễm khuẩn, nhiễm nấm và bộ NST của tế bào tiết insulin: bằng các tiêu chí sau: Bảng 1. Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng TBG Tiêu chí Phương pháp phát hiện Nhiễm vi khuẩn Cấy khuẩn trên đĩa petri Nhiễm nấm Cấy nấm trên đĩa petri Nhiễm sắc thể (NST)đồ Tiến hành NST đồ Giai đoạn 6: Đánh giá sự biệt hóa tế bào tiết insulin: Tiến hành chạy Realtime RT-PCR. Với các Gen: Pdx-1, Ngn3, Insulin. Dùng phương pháp 2-∆∆Ct của Livak để định lượng biểu hiện của gen nghiên cứu và gen tham chiếu (GAPDH). Dùng phương pháp nhuộm Dithizone (DTZ) để nhận biết sự tiết insulin trong các tiểu đảo tụy của tuyến tụy hay các cụm tế bào giống tiểu đảo tụy. Đánh giá khả năng tiết insulin của tế bào sau khi biệt hóa phụ thuộc vào nồng độ glucose trong môi trường nuôi. Cho tế bào vào 2 giếng A và B có môi trường IPC-M3 với nồng độ glucose lần lượt là 5.5mmol/L và 23mmol/L. Ủ tế bào trong điều kiện nuôi 24 giờ. Sau đó, định lượng sự hiện diện của insulin trong dịch nuôi tế bào bằng kĩ thuật HPLC. Phân tích thống kê Nghiên cứu được thực hiện trên 7 mẫu. Số liệu nghiên cứu được xử lí bằng phần mềm Excel 2010 với độ tin cậy 95%. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Tế bào gốc trung mô được thu nhận từ mô mỡ, tăng sinh in vitro và biểu hiện các marker đặc trưng sau vài lần cấy chuyền Chúng tôi đã thành công với tỷ lệ 100% (7/7) trong việc tác chiết SVF từ mô mỡ. Tổng số tế bào thu nhận được là 1.0126 ± 0.0933 × 106 tế bào, tỷ lệ sống đạt 78,3 ± 5,7% (n=7). Sử dụng kĩ thuật flow cytometry với các marker đặc trưng cho tế bào gốc trung mô, kết quả đánh giá cho thấy cho 7,12± 2,22% tế bào phân đoạn SVF là tế bào gốc trung mô. Số lượng này đủ để dùng trong các nghiên cứu và nhân lên ứng dụng trong điều trị. Bảng 2: Kết quả định lượng tế bào SVF và tế bào gốc trong mô mỡ của các lần thí nghiệm Tế bào có nhân SVF (x 106) Tế bào/gam (x 106) Phần trăm tế bào sống (%) Phần trăm TBG (%) 103,6 1,036 78 7,123 82,4 0,97 82 9,562 72,8 1,103 70 9,457 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học 53 Tế bào có nhân SVF (x 106) Tế bào/gam (x 106) Phần trăm tế bào sống (%) Phần trăm TBG (%) 45,2 1,0511 74 7,983 65 0,8228 77 6,786 89,8 1,0322 69 5,994 98,8 1,0739 84 3,124 Mean 1,0126 78,2857 7,147 SD 0,0933 5,6779 2,2178 Kết quả này là tương đương với các nghiên cứu khác trên thế giới(1). SVF đã được chứng minh có chứa đến 3% là tế bào gốc trong tổng số tế bào, gấp 2.500 lần so với tần số tế bào gốc trong tuỷ xương ngươzi(4). Như vậy SVF là nguồn tế bào gốc phong phú, an toàn và hiệu quả hiện nay. Kết quả nuôi cấy ADSC Sau 7 ngày nuôi, các tế bào tăng sinh mạnh và bắt đầu hợp dòng. Khi tế bào chiếm 70-80% diện tích bề mặt nuôi, tiến hành cấy chuyền theo tỷ lệ 1:3. Tốc độ phát triển của tế bào tương đối như nhau giữa các lần cấy chuyền và cao hơn trong nuôi cấy sơ cấp. Hình 1. Tế bào ứng viên gốc trung mô có hình thoi, trải dài trên bề mặt nuôi cấy (20x) Các tế bào gốc trung mô ứng viên biểu hiện các marker của tế bào gốc trung mô. Biểu đồ 1: Kết quả biểu hiện marker của tế bào sau khi nuôi cấy Theo kết quả trên chúng tôi đã bước đầu chứng minh khả năng tách triết được ADSC trong mô mỡ của tình nguyện viên. Biệt hóa thành công tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào tiết insulin Sau 12 ngày biệt hóa, có sự co cụm và rút ngắn của tế bào dồn chúng lại trong một vị trí hình thành một nhóm tế bào ngày càng nén chặt. Từ đó một số cụm tế bào giống đảo tụy bắt đầu xuất hiện vào khoảng ngày thứ 14. Khi nhuộm với dithizone, 100% cụm tế bào giống đảo tụy này bắt màu đỏ với thuốc nhuộm. Hình 2. Các tế bào sau khi co cụm lại thành tụy đảo bắt màu với thuốc nhuộm Dithizone (20x) Các tế bào được kiểm tra các gen chuyên biệt ở tế bào β tụy đảo so với tế bào chưa biệt hóa (đối chứng), được bình thường hóa bằng gen đối chứng nội GAPDH theo công thức của Lavik. Bảng 2. Mức độ biểu hiện Gen chuyên biệt của tế bào β tụy đảo Gen Mẫu GAPDH Insulin 552 97 13 Pdx-1 2702 487 15 Ngn-3 1640 6 4 Kết quả đánh giá sự tiết insulin bằng kỹ thuật HPLC ở 7 lô thí nghiệm đạt 100% dương tính với insulin. Điều này chứng tỏ các tế bào sau khi biệt hóa thành công không những có khả năng biểu hiện các gen liên quan đến kiểu hình tế bào β tụy đảo mà còn có khả năng dịch mã thành công insulin và tiết ra ngoài. Insulin là sản phẩm cuối cùng trong suốt quá trình chuyển biệt hóa của tế bào gốc trung mô thành tế bào tiết insulin. Sự Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014 54 xuất hiện insulin được phát hiện bằng HPLC chứng tỏ chúng tôi đã biệt hóa thành công tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào tiết insulin. Để đánh giá tính toàn vẹn về tính năng của một tế bào β tụy đảo, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng tiết insulin phụ thuộc vào nồng độ đường kích thích. Kết quả là 6/6 (tỷ lệ 100%) mẫu tế bào biệt hóa có khả năng đáp ứng tốt với lượng đường. Cụ thể, lượng đường cao hơn thì lượng insulin tiết ra nhiều hơn. Bảng 3. Mức dộ đáp ứng tiết Insuline theo nồng độ đường. Nồng độ 5 mmol/l Nồng độ 23 mmol/l Mẫu 1 91,4 ng/ml 166,6 ng/ml Mẫu 2 210,7 ng/ml 417,9 ng/ml Mẩu 3 560 ng/ml 650 ng/ml Mẫu 4 310 ng/ml 410 ng/ml Mẫu 5 790 ng/ml 930 ng/ml Mẫu 6 430 ng/ml 460 ng/ml Trong kết quả nghiên cứu của Kim và cộng sự(5), họ cho răzng chỉ có tế bào gốc ở màng xương mới có khả năng biệt hóa thành tế bào tiết insulin mà đáp ứng được với lượng đươzng. Tuy nhiên kết quả của nhiều nhóm nghiên cứu khác lại cho thấy tế bào tiết insulin biệt hóa tưz mô mỡ có khả năng đáp ứng với lượng đươzng, kết quả này tương đương với nghiên cứu của Chardar(2), Mohamad Buang(6). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy sự sản xuất Insulin của tế bào gốc trung mô tưz mô mỡ sau khi biệt hóa thành tế bào tiết insulin có khả năng được điều hòa bởi sự thay đổi của nồng độ glucose. Tế bào sau khi biệt hóa có chất lượng tốt Các tế bào sao khi biệt hóa không phát hiện nhiễm nấm hay vi khuẩn khi quan sát dưới kính hiển vi. Kết quả nhuộm G-banding cho thấy bộ NST của tế bào ổn định về số lượng và cấu trúc sau nhiều lần cấy chuyền và biệt hóa thành tế bào tiết insulin. 100% (3/3) mẫu tế bào được lấy ngẫu nhiên đều không quan sát thấy đột biến NST. KẾT LUẬN Qua nghiên cứu này, chúng tôi bước đầu xây dựng qui trình thu nhận tế bào gốc trung mô từ mô mỡ, đồng thời chứng minh khả năng biệt hóa của ADSC thành thế bào tiết insuline. Các tế bào sau khi biệt hóa đều có khả năng tiết insuline và đều có khả năng thay đổi nồng độ insuline tiết ra theo nồng độ đường. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Arakawa M, Ebato C, Mita T, Hirose T, Kawamori R, Fujitani Y, Watada H (2009), "Effects of exendin-4 on glucose tolerance, insulin secretion, and beta-cell proliferation depend on treatment dose, treatment duration and meal contents", Biochem Biophys Res Commun, 390(3), p. 809-814 2. Chandra V, Muthyala S, Jaiswal AK, Bellare JR, Nair PD, Bhonde RR (2011), "Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice", PLoS One, 6(6) p. 20615 3. Figlinzzi M et al. (2009), "Bone marrow derived mesenchymal stem cells improve islet graft function in diabetic rats", Transplant Proceeding, 41(5) p. 1797-1800 4. Gronthos S, F.D., Leddy HA, Robey PG, Storms RW, Gimble JM (2001), "Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells", J Cell Physiol, 189, p.54-63. 5. Kim SJ, Ko ES, Lim SM, Lee CW, Kim DI (2012), "Glucose- stimulated insulin secretion of various mesenchymal stem cells after insulin-producing cell differentiation", J Biosci Bioeng, 113(6) p. 771-777. 6. Mohamad Buang ML, S.H., Chung LH, Saim AB, Idrus RB (2012), "In vitro generation of functional insulin-producing cells from lipoaspirated human adipose tissue-derived stem cells", Arch Med Res, 43(1) p. 83-88. 7. Phan Kim Ngọc, Dương Thanh Thủy, Phạm Lê Bửu Trúc, Phạm V…n Phúc (2010), "So sánh hiệu quả điều trị bệnh đái tháo đường bằng cách cấy ghép tế bào gốc trung mô tủy xương và tế bào tiết insulin trên mô hình chuột", Hội nghị khoa học Công nghệ sinh học: khu vực miền trung và tây nguyên. 8. Phạm Lê Bửu Trúc, Dương Thanh Thủy, Phạm V…n Phúc, Phan Kim Ngọc (2009), "Đánh giá hiệu quả điều trị bệnh đái tháo đường bằng cách ghép tế bào tiết insulin trên mô hình chuột", Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc khu vực phía Nam, p. 23-24. 9. Trần Thị Như Mai, Vương Gia Tuệ, Khổng Hiệp, Phạm V…n Phúc, Phan Kim Ngọc (2008), "Thu nhận và biệt hóa tế bào gốc trung mô từ mô mỡ người", Hội nghị khoa học lần thứ 6: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Ngày nhận bài báo: 28/02/2014 Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/03/2014 Ngày bài báo được đăng: 20/03/2014