Bước đầu đánh giá điều kiện sinh trưởng của một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy sinh học cao su thiên nhiên

ISSN 2354-0575 Khoa học & Công nghệ - Số 20/Tháng 12 - 2018 Journal of Science and Technology 37 BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ ĐIỀU KIỆN SINH TRƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC CAO SU THIÊN NHIÊN Nguyễn Việt Thùy, Trần Thị Ưng Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Hưng Yên Ngày tòa soạn nhận được bài báo: 15/10/2018 Ngày phản biện đánh giá và sửa chữa: 16/11/2018 Ngày bài báo được duyệt đăng: 07/12/2018 Tóm tắt: Cao su thiên nhiên là một polymer có khả năng chống mài mòn và rách. Vì vậy nó được ứng dụng rộng rãi trong quá trình làm vật liệu cơ bản để sản xuất lốp xe, găng tay cao su, sản phẩm xốp, Cùng với việc mở rộng sản xuất thì chất thải và cao su phế thải cần phải có biện pháp xử lý. Tuy nhiên, các biện pháp xử lý như chon lấp, đốt và tái chế cao su rất khó khăn và ít thân thiện với môi trường. Do vậy hướng theo con đường xử lý sinh học là một trong những hướng đi mang lại tính hiệu quả và thân thiện với môi trường. Tuy nhiên để xử lý sinh học thì việc lựa chọn chủng vi sinh vật là điều vô cùng quan trọng và việc sử dụng được những giống bản địa sẽ giải quyết được vấn đề thích nghi của vi sinh vật với môi trường sống mới và có thể ứng dụng ngay vào thực tiễn giảm bớt quá trình khảo sát điều kiện sinh trưởng và phát triển. Với nguồn phân lập từ bể làm giàu và các thành phần là nước thải, mủ thải, bùn thải từ nhà má cao su Cẩm Thủy – Thanh Hóa thì nhóm nghiên cứu đã phân lập được 2 chủng E1 và E2 từ bể làm giàu. Đồng thời từ 2 chủng phân lập được chúng tôi đi vào nghiên cứu để khảo sát điều kiện sinh trưởng để thu sinh khối tốt nhất của từng chủng trong môi trường nuôi cấy. Từ khoá: Cao su thiên nhiên, phân hủy sinh học, vi sinh vật,mẫu làm giàu, điều kiện sinh trưởng. 1. Đặt vấn đề Cao su hiện nay là một vật liệu được sử dụng rộng rãi trên toàn cầu bởi các tính năng vượt trội của nó bao gồm như độ đàn hồi, chống rách, chống mài mòn [1,5]. Cùng với những lợi ích từ ngành công nghiệp này mang lại thì chất thải cao su cũng đang là một trong những vấn đề đáng lo ngại. Các biện pháp xử lý cao su thải hiện nay đang được sử dụng rộng rãi là chon lấp, nhiệt phân và chất đống. Tuy nhiên các biện pháp này còn nhiều bất cập, việc chôn lấp gây tốn diện tích còn đốt phếp liệu để làm nhiên liệu trong các nhà máy lại gây ô nhiễm môi trường và hiệu quả kinh tế thì không cao. Chính vì vậy mà việc tìm ra các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy mạnh cao su và phù hợp với điều kiện thời tiết khí hậu, môi trường ở từng khu vực là một điều thực sự cần thiết. Các nghiên cứu về phân hủy cao su đã tìm ra nhiều loài vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm có khả năng phân hủy cao su tuy nhiên với mỗi nhóm vi sinh vật thì khả năng sinh trưởng và đặc tính của chúng lại có sự khác biệt đồng thời nó chỉ có thể phát huy được vai trò phân hủy khi được sinh trưởng trong môi trường phù hợp với sinh lý của chúng [4, 6]. Vì vậy với cơ sở đã phân lập được 2 chủng E1 và E2 từ nước thải, mủ thải, bùn thải từ nhà máy cao su Cẩm Thủy – Thanh Hóa chúng tôi tiến hành nghiên cứu về điều kiện sinh trưởng của chủng với mong muốn tìm được điều kiện để nuôi cấy tạo được nhiều sinh khối nhất nhằm phục vụ việc đưa các chủng ứng dụng xử lý trong thực tiễn tại Việt Nam. 2. Nội dung 2.1. Vật liệu và phương pháp 2.1.1. Nguồn vi sinh vật: Các chủng E 1 , E 2 trong bộ sưu tập giống của bộ môn Công nghệ sinh học – Viện Công nghệ sinh học – Đại học Bách Khoa Hà Nội [2,3]. 2.1.2. Môi trường nuôi cấy: Môi trường nghiên cứu sử dụng chủ yếu là môi trường LB, PAB [2,3]. Bảng 1. Môi trường hoạt hóa LB Thành Phần g/l Pepton 10 Cao nấm men 5 NaCl 25 Bảng 2. Môi trường hoạt hóa PAB Thành Phần g/l Pepton 10 Cao nấm men 1.5 Cao thịt 1.5 NaCl 3.5 Glucoza 1 KH2PO 4 1.32 K 2 HPO 4 3.68 ISSN 2354-0575 Journal of Science and Technology38 Khoa học & Công nghệ - Số 20/Tháng 12 - 2018 2.1.3. Hóa chất: Hóa chất dùng nuôi cấy: pepton, cao nấm men, cao thịt, NaCl, Glucoza, KH 2 PO 4 , K 2 HPO 4 . 2.1.4. Thiết bị: - Máy lắc ổn nhiệt (Taitec BR - 43FL, Nhật) - Máy li tâm lạnh (Tomy MX-305, Nhật) - Máy Vortex (Taitec, Nhật) - Nồi hấp tiệt trùng (Tomy ES315, Nhật) - Tủ cấy vô trùng (Panasonic MCV-B91F, Nhật) - Máy đo pH (Hanna Hi 2211, Italia) - Tủ sấy (Eyela LTI-601SD, Nhật) - Kính hiển vi điện tử (Nikon YS100, Nhật) 2.1.5. Sơ đồ nghiên cứu: [2,3] Các chủng vi sinh vật trong bộ sưu tập Môi trường nuôi cấy (Enrichment) Khảo sát với môi trường dinh dưỡng Khảo sát điều kiện nhiệt độ nuôi cấy Khảo sát với điều kiện pH ban đầu Kết luận 2.1.6. Khảo sát sự ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau lên sự sinh trưởng và phát triển của các chủng lựa chọn - Chuẩn bị các bình tam giác sạch, khô có nắp đậy (thông khí) bọc kín bằng giấy bên trong có chứa 40 ml LB hoặc PAB, pH = 7 thanh trùng ở 121oC, 20 phút. - Các chủng E 1 , E 2 , được hoạt hóa trong môi trường LB, 2 - 3 ngày ở 37 oC. Bổ sung 10% (v/v) canh trường có mật độ 109 CFU/ml với các chủng E 1 , E 2 vào các bình tam giác đã chuẩn bị sẵn. Đem nuôi ở 37 oC, tốc độ lắc 170 – 185 vòng/phút. Tiến hành đo mật độ quang tại OD600 nm 12h một lần để xác định sự gia tăng sinh khối của các mẫu. 2.1.7. Khảo sát sự ảnh hưởng của pH ban đầu lên sự sinh trưởng và phát triển của các chủng lựa chọn Thực hiện các bước tương tự như khảo sát với môi trường nuôi cấy sử dụng môi trường phù hợp đã khảo sát ở bước trên với các chủng E 1 , E 2 trong đó các bình tam giác chứa môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH từ 4 đến 8. Khả năng sinh trưởng của các chủng được xác định qua OD600 nm. 2.1.8. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự phát triển của chủng lựa chọn Thực hiện các bước tương tự như với khảo sát pH ban đầu với môi trường, pH đã khảo sát. Thay đổi nhiệt độ nuôi cấy tại 20 oC, 30 oC, 37 oC, 42 oC, 50 oC. Khả năng sinh trưởng của các chủng được xác định qua OD600 nm. 2.2. Kết quả và thảo luận 2.2.1. Đặc điểm hình thái 2 chủng Qua quá trình nuôi cấy trong phòng thí nghiệm và nhuộm gram thu được hình ảnh khuẩn lạc và hình ảnh nhuộm gram của 2 chủng như Hình 1 và Hình 2: Hình 1. Hình ảnh khuẩn lạc của chủng nghiên cứu Hình 2. Hình ảnh nhuộm Gram của các chủng ở độ phóng đại 1000 lần 2.2.2. Kết quả khảo sát sự phát triển của chủng E1 trên các môi trường nuôi cấy tại nhiệt độ 37 oC Hình 3. Kết quả khảo sát sự phát triển của chủng E1 trên các môi trường nuôi cấy tại nhiệt độ 37 oC ISSN 2354-0575 Khoa học & Công nghệ - Số 20/Tháng 12 - 2018 Journal of Science and Technology 39 Nhìn vào kết quả ta thấy cả hai môi trường đều phù hợp với chủng E 1 . Tuy nhiên sinh khối của E 1 trong môi trường LB cao hơn trong môi trường PAB 1,8 lần. Sinh khối của E 1 trong môi trường LB đạt cực đại tại OD = 3,90±0,30 sau 24h tương đương mật độ vi sinh vật 109 CFU/ml. Chính vì vậy LB được chúng tôi lựa chọn là môi trường nuôi cấy chủng E 1 . 2.2.3. Kết quả khảo sát chủng E2 trên các môi trường nuôi cấy tại nhiệt độ 37 oC Hình 4. Kết quả khảo sát chủng E 2 trên các môi trường nuôi cấy tại nhiệt độ 37 oC Qua kết quả trên thì cả hai môi trường đều phù hợp với chủng E 2 . Lượng sinh khối thu được của chủng E 2 trong cả hai môi trường tương đương nhau tuy nhiên khi nuôi trong môi trường LB thời gian thu được sinh khối cực đại ngắn hơn. Trong môi trường LB sinh khối cực đại sau 24h với OD = 3,99±0,29 tương đương mật độ vi sinh vật 109 CFU/ml. Vì vậy trong các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi lựa chọn LB là môi trường nuôi cấy E 2 . 2.2.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu đến sự phát triển của chủng E1 Hình 5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu đến sự phát triển của chủng E1 Trong dải pH từ 4 đến 8 chủng E 1 đều sinh trưởng phát triển trong đó tại pH = 4 lượng sinh khối của chủng E 1 thấp nhất. Tại pH = 6, 7, 8 tốc độ sinh trưởng của chủng tương đương nhau. Lượng sinh khối thu được cao nhất khi nuôi chủng trong môi trường LB, pH = 6, sau thời gian 24h với OD = 4,08±0,18 tương đương mật độ vi sinh vật 109 CFU/ml . Như vậy lựa chọn dải pH từ 6 – 8 là điều kiện phù hợp với chủng E 1 trong những nghiên cứu tiếp theo. 2.2.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu đến sự phát triển của chủng E2 Hình 6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu đến sự phát triển của chủng E 2 Theo kết quả phía trên nhận thấy sử dụng dải pH từ 4 đến 8 chủng E 2 đều phát triển tuy nhiên với pH = 4 và 5 chủng có lượng sinh khối ít. Tại pH = 6 lượng sinh khối của chủng lớn nhất với giá trị gấp 1,09 – 4,89 lần so với tại các giá trị pH khác với OD = 4,39±0,13 sau 24h tương đương mật độ vi sinh vật 109 CFU/ml. Do đó pH ban đầu được lựa chọn để nuôi chủng E 2 thu sinh khối là dải pH từ 6 – 8. 2.2.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự phát triển của chủng E1 Hình 7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự phát triển của chủng E1 ISSN 2354-0575 Journal of Science and Technology40 Khoa học & Công nghệ - Số 20/Tháng 12 - 2018 Nhìn vào lượng sinh khối thu được của chủng E 1 thấy tại dải nhiệt độ 30 - 42 oC lượng sinh khối tạo ra của chủng lớn hơn. Đối với nhiệt độ 20oC và 50 oC chủng E 1 phát triển chậm hơn nhiều.Trong đó tại nhiệt độ 30 oC lượng sinh khối tạo được lớn nhất sau 12h với OD = 4,45±0,30 tương đương mật độ vi sinh vật 109 CFU/ml. Như vậy dải nhiệt độ 30 - 42oC là điều kiện phù hợp với E 1 khi nuôi cấy trong các nghiên cứu tiếp theo. 2.2.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự phát triển của chủng E2 Hình 8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự phát triển của chủng E 2 Nhìn vào đồ thị nhận thấy nhiệt độ 50 oC là nhiệt độ không phù hợp cho sự sinh trưởng của chủng E 2 . Dải nhiệt độ từ 20 oC – 42 oC phù hợp với sự sinh trưởng phát triển của chủng E 2 . Tuy nhiên tại nhiệt độ 30 oC lượng sinh khối tạo ra lớn nhất sau thời gian ngắn nhất với OD = 4,61±0,21 sau 12h tương đương mật độ vi sinh vật 109. Như vậy dải nhiệt độ từ 30 oC – 42 oC là nhiệt độ nuôi cấy phù hợp với E 2 khi nghiên cứu ở những phần tiếp theo. 3. Kết luận Với các chủng có khả năng phân hủy cao su đã phân lập được thì nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo sát các điều kiện sinh trưởng và phát triển của 2 chủng này trong điều kiện nghiên cứu của phòng thí nghiệm với mong muốn tìm ra được điều kiện nuôi cấy để tạo ra nhiều sinh khối nhất nhằm phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Bước đầu đã khảo sát được điều kiện sinh trưởng của các chủng lựa chọn: Chủng E 1 phát triển tạo sinh khối lớn nhất trong môi trường LB, pH = 6 - 8, nhiệt độ 30 - 42 oC. Chủng E 2 phát triển tạo sinh khối lớn nhất trong môi trường LB, pH = 6 - 8, nhiệt độ 30 - 42 oC. Với các kết quả bước đầu này sẽ là tiền đề để tiếp tục tiến hành nuôi cấy thu sinh khối và sử dụng sinh khối này phục vụ cho quá trình nghiên cứu quá trình phân hủy cao su của chúng hướng tới một tương lai có thể đưa các chủng vào ứng dụng trong xử lý môi trường. Tài liệu tham khảo [1]. Nguyễn Hữu Trí, Công nghệ cao su thiên nhiên, NXB trẻ, 2008. [2]. Đào Việt Linh, Luận văn thạc sĩ, Nagaoka university of Technology, 2013. [3]. Bui Thi Trang, Dao Viet Linh, Nguyen Lan Huong, To Kim Anh, Phan Trung Nghia, and Fukuda Masao, “Screening of Natural Rubber – Degrading Microorganisms from Rubber Processing Factory Waste in Vietnam”. International Journal of Waste Resources, 2013, 3, pp. 9 – 12. [4]. Ibrahim E.M., Arenskotter M., Lufmann H., and Steinbuchel A, “Identification of poly (cis- 1,4-isoprene) degradation intermediates during growth of moderately thermophilic actinomycetes on rubber and cloning of a functional lcp homologue from Nocardia farcinia strains E1”. A. E. Microbiol, 2016, 72, pp. 3375-3382. [5]. Kim H.C, Jayaram N, Gincy P.T, Nazalan N, Mas R. H, Mas H, Kumar S, Identification of new rubber-degrading bacterial strains from aged latex Polymer Degradation and Stability, Volume, 2014, 109, pp 354–361. [6]. Linos A, Berekaa M.M, Reichelt R, Keller U, Schmitt J, Flemming H.C, Biodegradation of poly (cis-1,4-polyisoprene) rubbers by distinct actinomycetes: microbial strategies and detailed surface analysis. A. E. Microbiol, 2000, 66. pp. 1639-1645. ISSN 2354-0575 Khoa học & Công nghệ - Số 20/Tháng 12 - 2018 Journal of Science and Technology 41 INITIAL EVALUATION OF GROWTH CONDITIONS OF MICROORGANISMSBIODEGRADATION OF NATURAL RUBBER Abstract: Natural rubber is a polymer that is resistant to abrasion and tear. It is widely used in making basic materials for the production of tires, rubber gloves, foam products, etc. Along with the expansion of production waste and waste rubber need to take measures.. However, measures such as covering, burning and recycling rubber are difficult and less environmentally friendly. Therefore, bioprocessing is one of the most effective and environmentally friendly pathways. However, for biological treatment, the selection of microorganisms is of paramount importance and the use of native varieties will address the adaptation of microorganisms to new habitats and may Apply immediately to practice to reduce the process of surveying growth and development. With the source extracted from the enrichment tank and the waste water, waste latex and waste sludge samples collected from a rubber processing from Cam Thuy - Thanh Hoa rubber factory, the research team isolated two strains E1 and E2 from the enrichment tank. At the same time from 2 isolates we went to study to investigate growth conditions to obtain the best biomass of each strain in the culture environment. Keywords: Nature rubber, biodegradations, microbial, enrichment, growth conditions.