Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự sinh trưởng của vi tảo thalassiosira sp trong môi trường nước biển nhân tạo

Năm học 2009 – 2010 227 BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA AUXIN VÀ CYTOKININ LÊN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO THALASSIOSIRA SP. TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC BIỂN NHÂN TẠO Võ Thị Ngọc Thành (SV năm 3, Khoa Sinh học) GVHD: TS. Lê Thị Trung, CN. Huỳnh Thị Ngọc Như 1. Mở đầu Trong tự nhiên, vi tảo được xem là “đồng cỏ” của biển, là mắt xích rất quan trọng trong chuỗi thức ăn của sinh vật biển, là khâu đầu tiên trong chu trình vật chất của biển [1]. Về ứng dụng, chúng là nguồn thức ăn bổ dưỡng cho người, động vật, đặc biệt là ngành nuôi trồng thuỷ sản; là nguồn phân bón sinh học; nguồn năng lượng sạch [4]. Trong vi tảo, tảo Silic chiếm 60-70% về số loài và sinh vật lượng. Do đó, tảo Silic giữ vai trò trọng yếu. Trên thế giới, việc nghiên cứu vi tảo đã tiến hành từ rất lâu và đã khảo cứu sâu, rộng nhiều vấn đề. Tuy nhiên, ở Việt Nam việc nghiên cứu sinh lý học vi tảo còn nhiều hạn chế. Bên cạnh đó, vai trò của các chất điều hoà sinh trưởng thực vật cũng được nghiên cứu nhiều ở thực vật bậc cao nhưng với đối tượng thực vật bậc thấp nói chung và tảo Silic nói riêng, vai trò của chúng vẫn chưa được hiểu rõ. Và đó cũng chính là lý do chúng tôi chọn đề tài “Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự sinh trưởng của Thalassiosira sp. trong môi trường nước biển nhân tạo”. 2. Mục đích nghiên cứu Khảo sát hình thái tế bào, đường cong tăng trưởng và tốc độ tăng trưởng Thalassiosira sp. trong môi trường nước biển nhân tạo (NBNT). Khảo sát ảnh hưởng của IAA (indol-3-acetic-acid) và BA (benzyl adenin) lên sự sinh trưởng Thalassiosira sp. trong môi trường NBNT thông qua các chỉ số trên. 3. Vật liệu - phương pháp nghiên cứu 3.1. Vật liệu Mẫu vi tảo Thalassiosira sp. được thạc sĩ Nguyễn Tấn Đại thu tại vùng biển Cần Giờ - TPHCM, phân lập và giữ mẫu tại phòng thí nghiệm sinh lý thực vật trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh. Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 228 3.2. Phương pháp Môi trường nuôi cấy Môi trường nước biển nhân tạo, độ mặn 3%, pH 8,2 (Harrison, 1980). Lấy mẫu và cấy chuyền Mẫu được lấy và cấy chuyền nhằm mục đích giữ giống và bố trí thí nghiệm mới. Sau khi cấy chuyền mẫu tảo được nuôi và theo dõi theo phương pháp bán liên tục, mỗi ngày sẽ lấy một lượng mẫu nhất định và bổ sung lại lượng môi trường tương đương. Thời gian lấy mẫu nằm trong khoảng sai số nửa giờ [9]. Trong các thí nghiệm, mẫu đều được cấy chuyền sang bình tam giác 250ml với thể tích dịch nuôi cố định là 125ml. Mật độ xuất phát là 5.103 tế bào/ml được cấy chuyền vào ngày thứ tư. Điều kiện nuôi: cường độ ánh sáng 3000 ± 500lux, nhiệt độ 25oC ± 2oC, chu kỳ sáng tối 12:12. Đếm tế bào và xác định mật độ tế bào Mật độ tế bào của dịch nuôi được xác định thông qua số tế bào đếm được bằng phòng đếm hồng cầu, đếm ít nhất ba ô trong mỗi ngăn buồng đếm và hai lần đưa mẫu lên buồng đếm [6]. Quan sát hình thái Mẫu được lấy với thể tích 10 µl, quan sát trên kính hiển vi quang học X40. Xác định đường cong tăng trưởng Đường cong tăng trưởng của mẫu được xác định dựa trên mật độ tế bào hàng ngày. Tính tốc độ tăng trưởng Mật độ tế bào tại hai thời điểm khác nhau trong quá trình tăng trưởng của mẫu được dùng để tính tốc độ tăng trưởng trong khoảng thời gian đó [9]. Khảo sát ảnh hưởng của IAA và BA riêng rẽ Theo dõi sự tăng trưởng của vi tảo trong các môi trường NBNT có bổ sung IAA và BA riêng rẽ với các nồng độ khác nhau 10-10 g/ml, 10-9 g/ml, 10-8 g/ml và so với chuẩn. Trong tất cả các nghiệm thức, mẫu tảo Thalassiosira sp. được nuôi trong các môi trường trên với cùng một mật độ xuất phát và cùng một thời điểm cấy chuyền. Mỗi ngày lấy 2ml mẫu và bổ sung lại một lượng môi trường tương đương, mẫu được cố định bằng lugol để đếm số lượng tế bào. Năm học 2009 – 2010 229 Mỗi nghiệm thức lặp lại hai lần, thời gian tiến hành thí nghiệm từ tháng 11/ 2009 đến tháng 1/2010, tại phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh. Các bảng và biểu đồ được vẽ trong phần mềm Microsolf Excel 2003. Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phần mềm SPSS phiên bản 11.5. 4. Kết quả 4.1. Khảo sát sự sinh trưởng của Thalassiosira sp. trong môi trường NBNT Hình thái tế bào Từ ngày thứ hai, tế bào bắt đầu kết chuỗi nhưng đến ngày thứ tư chuỗi mới dài, tế bào to và thể sắc tố chiếm trong thể tích tế bào nhiều nhất. Sang ngày thứ sáu, tế bào tồn tại ở dạng đơn lẻ, một số bị vỡ và thể sắc tố thoát ra ngoài (hình1). Hình 1: Hình thái tế bào Thalassiosia sp. qua một số ngày trong môi trường NBNT (x40) (N2: ngày thứ hai, N4: ngày thứ tư, N6: ngày thứ sáu) Đường cong tăng trưởng Đường cong tăng trưởng được xác định qua việc đếm số lượng tế bào mỗi ngày. Nhìn chung, đường cong tăng trưởng của Thalassiosira sp. trong môi trường NBNT có dạng hình chữ S. Pha tiềm phát kéo dài khoảng ba ngày đầu. Pha tăng trưởng mạnh kéo dài trong ba ngày từ ngày thứ tư đến ngày thứ sáu. Pha cân bằng diễn ra trong khoảng hai ngày thứ bảy và tám. Sau đó, quần thể nhanh chóng bước vào pha suy vong từ ngày thứ chín, số lượng tế bào suy giảm nhanh chóng (hình 1). Tốc độ tăng trưởng Tốc độ tăng trưởng của Thalassiosira sp. tăng cao giữa ngày 2-3 và ngày 4- 5, sau đó giảm dần, từ ngày 8-9 thì tốc độ tăng trưởng đạt giá trị âm (hình 2). N2 N4 20μm 20μm N6 20μm Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 230 0 10 20 30 40 50 60 70 N0 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 Thời gian tăng trưởng (ngày) M ật đ ộ tế b ào (1 00 00 tb /m l) NBNT Hình 2: Đường cong tăng trưởng Thalassiosira sp. trong môi trường NBNT. 4.2. Ảnh hưởng của IAA lên sự tăng trưởng của Thalassiosira sp. trong môi trường NBNT Hình thái tế bào IAA ở các nồng độ 10-8 g/ml, 10-9 g/ml, 10-10 g/ml đều có tác dụng gia tăng khả năng kết chuỗi, duy trì trạng thái chuỗi, hình thái tế bào to, thể sắc tố đẹp qua nhiều ngày, nhất là với nồng độ IAA 10-10 g/ml (hình1, hình 3). Hình 3: Hình thái tế bào Thalassiosia sp. qua một số ngày trong môi trường NBNT bổ sung IAA ở các nồng độ khác nhau (x40) 20μm 20μm 20μm N2 20μm 20μm 20μm 20μm A C B N4 N6 20μm 20μm Năm học 2009 – 2010 231 (Trong mỗi hàng, thứ tự hình từ trái qua: A: NBNT + IAA 10-10 g/ml, B: NBNT +IAA 10-9 g/ml, C: NBNT +IAA 10-8 g/ml. Trong mỗi cột, thứ tự hình từ trên xuống: N2: ngày thứ hai, N4: ngày thứ tư, N6: ngày thứ sáu). Trong cả bốn môi trường, vào ngày thứ hai, chuỗi tế bào bắt đầu hình thành; đến ngày thứ tư, số chuỗi và số tế bào trong chuỗi nhiều, tế bào to và thể sắc tố đậm nhất (hình 1-N2, N4; hình 3-N2, N4), đặc biệt ở môi trường NBNT+IAA10-10 g/ml (hình 3-N4-A). Từ ngày thứ sáu, tế bào tách chuỗi dần, kích thước tế bào giảm. Tuy nhiên, trong các môi trường NBNT bổ sung IAA, có một số tế bào do mới hình thành nên có kích thước lớn hơn so với những tế bào cũ (hình 3-N6-B,C). Riêng với môi trường NBNT, từ ngày thứ sáu một số tế bào bị vỡ, thể sắc tố thoát ra ngoài (hình 1-N4). Đường cong tăng trưởng Trong cả ba môi trường NBNT có bổ sung IAA thì mật độ tế bào đều tăng cao đồng thời thời gian tăng trưởng cũng dài hơn so với môi trường NBNT. Môi trường NBNT bổ sung IAA 10-8 g/ml mật độ tế bào đạt cực đại, tuy nhiên xét cả đường cong tăng trưởng thì môi trường NBNT bổ sung IAA 10-10 g/ml mật độ tế bào ở mức cao và ổn định nhất (hình 4). Hình 4: Đường cong tăng trưởng của Thalassiosira sp. trong môi trường NBNT bổ sung IAA ở các nồng độ khác nhau Tốc độ tăng trưởng Sự gia tăng tốc độ tăng độ tăng trưởng ở ba môi trường NBNT bổ sung IAA diễn ra nhanh hơn so với chuẩn, ngày 1-2 và 3-4 ở các môi trường có IAA so với ngày 2-3 và 4-5 ở chuẩn. Sự khác biệt còn thể hiện ở ngày 8-9 khi tốc độ tăng trưởng của quần thể đối chứng giảm nhưng ở ba môi trường bổ sung IAA, tốc độ tăng trưởng vẫn tăng (hình 5). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 D0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 Thời gian tăng trưởng (ngày) M ật đ ộ tế b ào (1 00 00 tb /m l) NBNT NBNT+IAA 10E-10 NBNT+IAA 10E-9 NBNT+IAA 10E-8 NBNT+IAA10-9g/ml NBNT+IAA10-8g/ml NBNT+IAA 10-10g/ml N0 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 232 Hình 5: Tốc độ tăng trưởng hàng ngày của Thalassiosira sp. trong môi trường NBNT bổ sung IAA ở các nồng độ khác nhau 4.3. Ảnh hưởng của BA lên sự tăng trưởng của Thalassiosira sp. trong môi trường NBNT Hình thái tế bào Nhìn chung, cả ba nồng độ BA 10-10 g/ml, 10-9 g/ml và 10-8 g/ml đều có tác dụng kích thích sự hình thành và duy trì chuỗi tế bào, tế bào phát triển lớn và thể sắc tố to hơn so với môi trường NBNT, nhất là ở nồng độ BA 10-10 g/ml (hình 6). Hình 6: Hình thái tế bào Thalassiosia sp. qua một số ngày trong môi trường NBNT bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau (x40) 20μm 20μm 20μm N6 20μm A B C N2 N4 20μm 20μm 20μm 20μm 20μm -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 N0-1 N1-2 N2-3 N3-4 N4-5 N5-6 N6-7 N7-8 N8-9 N9-10 Thời gian tăng trưởng (ngày) T ốc đ ộ tă n g tr ư ở n g/ n gà y NBNT NBNT+IAA 10EE NBNT+IAA 9EEE NBNT+IAA 8EET+IAA 10-9 g/ml +IAA 10-10 g/ml +IAA10-8g/ml Năm học 2009 – 2010 233 (Trong mỗi hàng, thứ tự hình từ trái qua: A- NBNT + BA 10-10 g/ml, B- NBNT +BA 10-9 g/ml, C- NBNT +BA 10-8 g/ml. Trong mỗi cột, thứ tự hình từ trên xuống: N2-ngày thứ hai, N4-ngày thứ tư, N6-ngày thứ sáu). Từ ngày thứ hai, trong cả ba môi trường bổ sung BA, tế bào bắt đầu kết chuỗi; đến ngày thứ tư thì chuỗi dài, tế bào to và thể sắc tố chiếm nhiều thể tích tế bào nhất. Qua ngày thứ sáu, tế bào tách chuỗi dần, thể sắc tố phân mảnh. Đường cong tăng trưởng Mật độ tế bào trong cả ba môi trường NBNT bổ sung BA đều cao và có nhiều khác biệt với môi trường chuẩn. Cả ba nồng độ BA 10-10g/ml, 10-9g/ml, 10- 8g/ml đều có tác dụng kích thích sự tăng trưởng số lượng tế bào so với môi trường NBNT. Nhưng ba nồng độ này vẫn chưa có khoảng cách đủ nhiều để tạo sự khác biệt riêng cho mình (hình 7). Hình 7: Đường cong tăng trưởng của Thalassiosira sp. trong môi trường NBNT bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau Tốc độ tăng trưởng Tốc độ tăng trưởng trong ba môi trường NBNT bổ sung BA cao nhất ở ngày 0-1 và cao hơn cả chuẩn, nhưng sau đó lại có xu hướng giảm dần vào các ngày sau (hình 8), điều này có thể giải thích là do trong ngày đầu tiên, nguồn dinh dưỡng trong môi trường dồi dào và dưới tác dụng của BA nên các tế bào tăng trưởng nhanh. Với hai môi trường NBNT bổ sung BA nồng độ 10-9g/ml và NBNT+BA10- 8g/ml, tốc độ tăng trưởng ổn định hơn so với hai môi trường còn lại. Ở môi trường NBNT+ BA10-10g/ml có thêm đợt tăng tốc độ tăng trưởng vào ngày 3-4 (hình 8). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 N0 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 Thời gian tăng trưởng (ngày) M ật đ ộ tế b ào (1 00 00 tb /m l) NBNT NBNT+BA10EE NBNT+BA9EE NBNT+BA8EENBNT+BA10-8g/ml T+BA10 -9g/ml NBNT+BA 10-10g/ml Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 234 Vậy, trong ba nồng độ BA thí nghiệm, nồng độ BA10-10g/ml ảnh hưởng nhiều nhất đến tốc độ tăng trưởng của quần thể Thalassiosira sp. trong môi trường NBNT. Hình 8: Tốc độ tăng trưởng hàng ngày của Thalassiosira sp. trong môi trường NBNT bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau. 5. Kết luận và đề nghị 5.1. Kết luận Tóm lại, đối với Thalassiosira sp., hai hormon IAA và BA đều có tác dụng làm tăng khả năng kết chuỗi, duy trì chuỗi lâu, tăng kích thước tế bào, thể sắc tố to và có màu đẹp hơn. Ngoài ra, IAA còn có khả năng kéo dài thời gian tăng trưởng của tế bào. Và trong ba nồng độ thí nghiệm, nồng đồ 10-10g/ml có ảnh hưởng tốt nhất đến sự sinh trưởng . Đối với BA, số lượng và tốc độ tăng trưởng tế bào tương đương nhau ở các nồng độ khác nhau. Riêng BA nồng độ 10-10g/ml, hình thái tế bào có phần đẹp hơn. 5.2. Đề nghị Trong thời gian tới nếu có điều kiện, chúng tôi sẽ tiếp tục khảo sát:  Ảnh hưởng của IAA và BA kết hợp.  Hàm lượng diệp lục tố khi IAA, BA tác động riêng rẽ và kết hợp. -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 N0-1 N1-2 N2-3 N3-4 N4-5 N5-6 N6-7 N7-8 N8-9 Thời gian tăng trưởng (ngày) T ốc đ ộ tă n g tr ư ở ng / n gà y NBNT NBNT+BA10 NBNT+BA9 NBNT+BA8T+BA10-9 g/ml BNT+BA10-10 g/ml NT+BA10-8 g/ml Năm học 2009 – 2010 235 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Trương Ngọc An (1993), Phân loại tảo Silic phù du biển Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. [2] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Hoài Hà (2006), [3] Nguyễn Tấn Đại (2007), Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi trồng trên sự tăng trưởng của một số loài tảo Silic ở thuỷ vực ven bờ biển Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh, Luận văn thạc sĩ - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh. [4] Guillard GRL, Sieracki MS., (2005), “Counting cells in cultures with the light microscope”, In: Andersen RA (ed.) Algal culturing techniques. Amsterdam: Elsevier Academic Press, p. 239-252.Amsterdam: Elsevier Academic Press, p. 269-285. [5] Harrison P.J., Water R.E., Taylor F.J.R. (1980), “Abroad spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton.J”, Phycol. 16:28-35. [6] Lê Thị Phương Hồng, Bùi Trang Việt, Phạm Thành Hổ (1997), “Sự hiện diện và vai trò của các chất điều hoà tăng trưởng thực vật ở tảo lam Spirulina platensis”, Tập san Khoa học Kỹ thuật Nông lâm nghiệp, Trường Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh, số tháng 3. [7] Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phước Hiền (1999), Công nghệ sinh học vi tảo, NXB Nông nghiệp Hà Nội. [8] Mazur H, Konop A, Synak R. (2001), "Indole-3-acetic acid in the culture medium of two axenic green microalge”. Journal of Applied Phycology, 13: 35-42. [9] Bùi Trang Việt (2002), Sinh lý thực vật đại cương, (Phần II- Phát Triển), NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh. [10] Wood AM, Everroad RC, Wingard LM. (2005), “Measuring growth rates in microalgal cultures”. In: Andersen RA (ed.), Algal culturing techniques.