Bước đầu khảo sát mối liên hệ giữa sự hiện diện trichoderma và các yếu tố của đất

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********* KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT MỐI LIÊN HỆ GIỮA SỰ HIỆN DIỆN Trichoderma VÀ CÁC YẾU TỐ CỦA ĐẤT Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN NGỌC PHÚC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********* KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT MỐI LIÊN HỆ GIỮA SỰ HIỆN DIỆN Trichoderma VÀ CÁC YẾU TỐ CỦA ĐẤT Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS. ĐINH MINH HIỆP NGUYỄN NGỌC PHÚC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. Tôi xin chân thành cảm ơn Thạc sĩ Đinh Minh Hiệp đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc công ty Gia Tƣờng đã tạo điều kiện cho tôi thực tập tại công ty. Tôi xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Uyên Thảo – công ty Gia Tƣờng đã hƣớng dẫn và chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian tôi thực tập tại công ty. Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các anh chị hiện đang làm việc tại chi nhánh Bình Dƣơng - công ty Gia Tƣờng đã nhiệt tình giúp đỡ và truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt quá trình tôi thực tập tại công ty. Xin cảm ơn gia đình cùng tất cả bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học đại học. TÓM TẮT NGUYỄN NGỌC PHÚC, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. “BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT MỐI LIÊN HỆ GIỮA SỰ HIỆN DIỆN Trichoderma VÀ CÁC YẾU TỐ CỦA ĐẤT”. Giáo viên hƣớng dẫn: Thạc sĩ Đinh Minh Hiệp Đề tài đƣợc thực hiện trên đối tƣợng vi nấm Trichoderma. Chúng là giống vi nấm phân bố rộng rãi trong đất, có khả năng đối kháng với nấm gây bệnh cây trồng. Do đó, chúng tôi tiến hành phân lập Trichoderma từ các mẫu đất thu thập trên khu vực miền Đông Nam bộ nhằm khảo sát sự phân bố của các chủng Trichoderma trên khu vực này, và đánh giá khả năng đối kháng của các chủng này đối với một số loài nấm gây bệnh cây trồng. Những kết quả đạt đƣợc: - Phân lập đƣợc 18 chủng Trichoderma tự nhiên. - Xác định sự phong phú của các chủng Trichoderma trong các mẫu đất khu vực Đông Nam bộ. - Mật độ Trichoderma trong đất có liên hệ với các yếu tố môi trƣờng đất: pH, độ ẩm, hàm lƣợng Mg, Ca, Ti trong đất. - Các chủng Trichoderma Đ1, Đ2, Đ14, Đ15, Đ22, Đ25, Đ29 có khả năng đối kháng mạnh với 3 chủng nấm bệnh Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Phytophthora palmivora. MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn .................................................................................................................... i Tóm tắt ......................................................................................................................... ii Mục lục ....................................................................................................................... iii Danh sách các hình ...................................................................................................... v Danh sách các bảng .................................................................................................... vi Danh sách các biểu đồ ............................................................................................... vii 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................ 2 2.1. Đặc điểm sinh học của Trichoderma ................................................................ 2 2.1.1. Vị trí phân loại ........................................................................................ 2 2.1.2. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 3 2.1.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá ...................................................................... 4 2.2. Khả năng kiểm soát sinh học của Trichoderma ............................................... 5 2.2.1. Tƣơng tác với nấm bệnh ......................................................................... 5 2.2.2. Tƣơng tác với cây trồng .......................................................................... 8 2.3. Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma ........................................ 13 2.3.1. Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng ......... 13 2.3.2. Trong lĩnh vực xử lý môi trƣờng .......................................................... 15 2.3.3. Trong các lĩnh vực khác ....................................................................... 16 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................... 17 3.1. Thời gian tiến hành thí nghiệm ....................................................................... 17 3.2. Địa điểm thực hiện .......................................................................................... 17 3.3. Vật liệu ............................................................................................................ 17 3.3.1. Môi trƣờng phân lập Trichoderma ....................................................... 17 3.3.2. Môi trƣờng thử tính đối kháng của Trichoderma ................................. 17 3.3.3. Các mẫu đất thu thập thực địa .............................................................. 17 3.3.4. Các chủng vi sinh vật sử dụng .............................................................. 18 3.4. Dụng cụ - Thiết bị ........................................................................................... 18 3.5. Phƣơng pháp ................................................................................................... 18 3.5.1. Phƣơng pháp khảo sát thực địa ............................................................. 18 3.5.2. Phƣơng pháp thu thập mẫu đất ............................................................. 19 3.5.3. Phƣơng pháp tiến hành đo giá trị pH của mẫu đất ............................... 20 3.5.4. Phƣơng pháp tiến hành đo độ ẩm của mẫu đất ..................................... 20 3.5.5. Phƣơng pháp phân tích thành phần khoáng trong đất .......................... 20 3.5.6. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu để phân tích vi sinh vật ............................ 20 3.5.7. Phƣơng pháp phân lập và phân lập thuần khiết vi nấm Trichoderma ....... 21 3.5.8. Phƣơng pháp xác định số lƣợng nấm mốc bằng cách đếm số khuẩn lạc nấm mốc mọc trên môi PDA ..................................................................................... 21 3.5.9. Phƣơng pháp thử tính đối kháng của Trichoderma đối với các chủng nấm gây bệnh cây trồng ...................................................................................................... 22 3.5.10. Phƣơng pháp xử lí số liệu ..................................................................... 26 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................... 27 4.1. Kết quả thu thập mẫu đất và phân lập các chủng Trichoderma trong đất khu vực Đông Nam bộ............................................................................................ 27 4.2. Mối tƣơng quan giữa sự hiện diện của Trichoderma và tính chất cơ giới của đất ............................................................................................................................... 30 4.3. Mối tƣơng quan giữa sự hiện diện của Trichoderma và trạng thái sử dụng đất ... 31 4.4. Kết quả phân tích pH, độ ẩm của đất ............................................................... 33 4.5. Kết quả phân tích một số thành phần khoáng trong đất .................................. 37 4.6. Kết quả đối kháng các chủng Trichoderma với nấm gây bệnh thực vật ......... 43 4.6.1. Kết quả đối kháng của Trichoderma đối với Sclerotium rolfsii ............ 43 4.6.2. Kết quả đối kháng của Trichoderma đối với Rhizoctonia solani ............ 44 4.6.3. Kết quả theo dõi sự đối kháng tƣơng đối của Trichoderma đối với Phytophthora palmivora ........................................................................... 45 4.6.4. Nhận xét chung ...................................................................................... 46 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................ 48 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 49 7. PHỤ LỤC DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Trichoderma harzianum KRL-AG2 phát triển trên môi trƣờng PDA ... 3 Hình 2.2. Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma ................................. 3 Hình 2.3. Trichoderma kí sinh trên Pythium gây bệnh trên rễ cây họ đậu ............ 6 Hình 2.4. Heä sôïi naám Trichoderma kíù sinh treân khuaån ty naám beänh Rhizoctonia solani ................................................................................................ 6 Hình 2.5. Sự gia tăng phát triển hệ rễ với thể cạnh tranh T-22 ở vùng rễ ............... 10 Hình 2.6. Sự gia tăng sản lƣợng trên cây ớt với hạt giống đƣợc xử lí với T-22 ..... 10 Hình 2.7. Hiệu quả giữa sử dụng và không sử dụng Trichoderma harzianum T-22 trên rễ ....................................................................................................................................... 15 Hình 3.1. Cách cấy điểm thử đối kháng Trichoderma với nấm gây bệnh thực vật ........ 23 Hình 3.2. Kết quả đối kháng tƣơng ứng với hiệu quả “-” ....................................... 24 Hình 3.3. Kết quả đối kháng tƣơng ứng với hiệu quả “+” ...................................... 24 Hình 3.4. Kết quả đối kháng tƣơng ứng với hiệu quả “++” .................................... 25 Hình 3.5. Kết quả đối kháng tƣơng ứng với hiệu quả “+++” .................................. 25 Hình 3.6. Kết quả đối kháng tƣơng ứng với hiệu quả “++++”................................ 26 DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Tác dụng và hiệu quả đề kháng cho cây trồng do loài Trichoderma mang lại ................................................................................................................... 11 Bảng 4.1. Sự hiện diện của Trichoderma trên các mẫu đất khu vực Đông Nam bộ .................................................................................................................... 27 Bảng 4.2. Kết quả phân lập và phân lập thuần khiết các chủng Trichoderma từ các mẫu đất thu đƣợc ................................................................................................................................................ 28 Bảng 4.3. Kết quả thu thập mẫu đất đƣợc phân tích theo thành phần cơ giới của đất ...................................................................................................................... 30 Bảng 4.4. Kết quả phân tích pH và độ ẩm các mẫu đất ........................................... 33 Bảng 4.5. Mối liên hệ giữa mật độ Trichoderma trong đất và giá trị pH đất .......... 34 Bảng 4.6. Mối liên hệ giữa mật độ Trichoderma và độ ẩm của đất ........................ 35 Bảng 4.7. Kết quả phân tích khoáng quan trọng trong các mẫu đất ........................ 37 Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng Mg trong đất đến sự hiện diện của Trichoderma .. 38 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng Mg trong đất đến mật độ Trichoderma ....... 38 Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng Ca trong đất đến sự hiện diện của Trichoderma .. 39 Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng Ca trong đất đến mật độ Trichoderma ...... 39 Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng Fe trong đất đến sự hiện diện của Trichoderma .. 40 Bảng 4.13. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng Fe trong đất đến mật độ Trichoderma ...... 40 Bảng 4.14. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng Ti trong đất đến sự hiện diện của Trichoderma ..... 40 Bảng 4.15. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng Ti trong đất đến mật độ Trichoderma ....... 41 Bảng 4.16. Kết quả đối kháng của Trichoderma đối với Sclerotium rolfsii .......... 43 Bảng 4.17. Kết quả đối kháng của Trichoderma đối với Rhizoctonia solani ......... 44 Bảng 4.18. Kết quả đối kháng của Trichoderma đối với Phytophthora palmivora ........ 45 Bảng 4.19. Mức độ đối kháng của các chủng Trichoderma với các chủng nấm gây bệnh .................................................................................................................. 46 Bảng 4.20. Các chủng Trichoderma đối kháng mạnh với vi nấm gây bệnh thực vật .................................................................................................................... 46 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1. Sự hiện diện Trichoderma trong các mẫu đất khu vực Đông Nam bộ ..... 29 Biểu đồ 4.2. Sự hiện diện của Trichoderma trong các nhóm đất có thành phần cơ giới khác nhau.......................................................................................................... 30 Biểu đồ 4.3. Sự hiện diện của Trichoderma trong các loại đất có thành phần cơ giới khác nhau ................................................................................................................. 31 Biểu đồ 4.4. Sự hiện diện của Trichoderma trong các mẫu đất canh tác các loại cây trồng khác nhau ................................................................................................. 32 Biểu đồ 4.5. Mối liên hệ giữa sự hiện diện của Trichoderma và pH đất ................ 34 Biểu đồ 4.6. Mối liên hệ giữa sự hiện diện Trichoderma và độ ẩm của đất ........... 35 Biểu đồ 4.7. Mối liên hệ giữa hàm lƣợng của Mg, Ca với sự hiện diện của Trichoderma ..................................................................................................... 42 Biểu đồ 4.8. Mức độ đối kháng của các chủng Trichoderma với Sclerotium rolfsii ....... 43 Biểu đồ 4.9. Mức độ đối kháng của các chủng Trichoderma với Rhizoctonia solani ... 44 Biểu đồ 4.10. Mức độ đối kháng của các chủng Trichoderma với Phytophthora palmivora .................................................................................. 45 PHẦN 1. MỞ ĐẦU Trichoderma là một loại vi nấm hoại sinh trong đất có khả năng đối kháng các loại vi nấm gây bệnh thực vật với phổ tác động rộng, không gây hại cho con ngƣời và cây trồng. Chính vì vậy, việc khai thác tiềm năng của Trichoderma nhƣ là một tác nhân sinh học phòng trừ bệnh hại cây trồng (bệnh khô vằn ở lúa; bệnh thối gốc chảy mủ ở cam quýt, sầu riêng; bệnh thối gốc ở cây tiêu,…) là một khuynh hƣớng hứa hẹn đã và đang đƣợc các nƣớc trên thế giới quan tâm. Ở nƣớc ta, việc sử dụng loại chế phẩm vi sinh này vẫn chƣa phổ biến. Trƣớc khi các sản phẩm này đƣợc sử dụng rộng rãi trên thị trƣờng cần tiến hành nghiên cứu về sự phân bố các chủng Trichoderma ở nƣớc ta. Thực hiện đƣợc điều này sẽ bảo tồn các chủng Trichoderma bản địa, đồng thời có thể sử dụng làm nguồn gen cung cấp cho các hƣớng nghiên cứu sâu hơn về sinh lí, sinh hóa, di truyền… Triển vọng trong tƣơng lai gần là có thể dùng các chủng Trichoderma bản địa để sản xuất các chế phẩm vi sinh dùng cho việc phòng trừ bệnh hại cây trồng mà không cần nhập ngoại, góp phần xây dựng hệ thống nông nghiệp sinh thái bền vững. Mục đích của khóa luận này là tiến hành khảo sát, đánh giá sự phân bố các chủng vi nấm Trichoderma trong các loại đất khác nhau thuộc khu vực miền Đông Nam bộ, đồng thời đánh giá khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma phân lập đƣợc đối với các vi nấm gây bệnh cây trồng điển hình. Các nội dung chính của khóa luận: - Khảo sát các phân vùng đất và xác định các địa điểm cần thu thập mẫu đất. - Tiến hành thu thập mẫu đất và các thông tin cần thiết. - Phân lập và phân lập thuần khiết các dòng Trichoderma. - Thống kê và đánh giá sự phân bố của các chủng nấm Trichoderma tƣơng ứng với các loại đất đƣợc khảo sát. - Bƣớc đầu khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma đối với một số loại nấm gây bệnh cây trồng (Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Phytophthora palmivora...). PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Đặc điểm sinh học của Trichoderma 2.1.1. Vị trí phân loại Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho công tác phân loại do còn nhiều đặc điểm cần thiết cho việc phân loại vẫn còn chƣa đƣợc biết đầy đủ. Persoon ex Gray (1801) phân loại Trichoderma nhƣ sau: [21] Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Euascomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Hypocreaceae Giống: Trichoderma Ainsworth và Sussman lại cho rằng Trichoderma thuộc lớp Deuteromycetes, bộ Moniliales, họ Moniliaceae [10]. Theo hai nhà khoa học Elisa Esposito và Manuela da Silva, Trichoderma thuộc họ Hypocreaceae, lớp Nấm túi Ascomycetes; các loài Trichoderma đƣợc phân thành 5 nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum, Saturnisporum, Pachybasium và Hypocreanum. Trong đó, 3 nhóm Trichoderma, Pachybasium, Longibrachiatum có giai đoạn teleomorph (hình thái ở giai đoạn sinh sản hữu tính) là Hypocrea; nhóm Hypocreanum hiếm khi gặp dƣới dạng teleomorph độc lập; nhóm Saturnisporum không tìm thấy hình thức teleomorph [13]. 2.1.2. Đặc điểm hình thái Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ khuẩn ty [12]. Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn. Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm. Các chủng của Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh, chúng có thể đạt đƣờng kính khuẩn lạc từ 2-9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 20OC [3]. 2.1.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá Môi trƣờng sống Trichoderma spp. là nhóm vi nấm phổ biến ở đất nông nghiệp, đồng cỏ, rừng, đầm muối và đất sa mạc. Hầu hết chúng là những vi sinh vật hoại sinh, nhƣng chúng cũng có khả năng tấn công các loại nấm khác [16]. Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội kí sinh với thực vật. Chúng có thể tồn tại trong tất cả các vùng khí hậu từ miền cực Bắc đến những vùng núi cao cũng nhƣ miền nhiệt đới. Tuy nhiên, có một sự tƣơng quan giữa sự phân bố các loài và các điều kiện môi trƣờng. T.polysporum và T.viride có mặt ở vùng khí hậu lạnh, trong khi T.harzianum có ở các vùng khí hậu nóng. Điều này tƣơng quan với nhu cầu nhiệt độ tối đa cho từng loài [16]. Các loài Trichoderma thƣờng xuất hiện ở đất acid, và Gochenaur (1970) cho rằng có thể có tƣơng quan giữa sự hiện diện của T.viride với đất acid trong vùng khí hậu rất Hình 2.1. Trichoderma harzianum KRL-AG2 phát triển trên môi trƣờng PDA (Vùng màu xanh chứa bào tử) [26] Hình 2.2. Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma lạnh ở Peru [16]. Trichoderma phát triển tốt ở bất cứ pH nào nhỏ hơn 7 và có thể phát triển tốt ở đất kiềm nếu nhƣ ở đó có sự tập trung một lƣợng CO2 và bicarbonat [19]. Trichoderma có thể sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ carbonhydrat, amino acid đến ammonia. Trichoderma là vi nấm ƣa độ ẩm, chúng đặc biệt chiếm ƣu thế ở những nơi ẩm ƣớt, những khu rừng khác nhau. T. hamatum và T.pseudokoningii có thể chịu điều kiện có độ ẩm cao hơn so với những loài khác [22]. Tuy nhiên, Trichoderma spp. thƣờng không chịu đƣợc độ ẩm thấp và điều này đƣợc cho là một yếu tố góp phần làm cho số lƣợng Trichoderma giảm rõ rệt trong những nơi có độ ẩm thấp, song các loài Trichoderma spp. khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau [15,19]. Trichoderma spp. có thể đƣợc phát hiện trong đất bởi mùi hƣơng của chúng, hƣơng dừa (6-pentyl-α-pyrone dễ bay hơi) thƣờng đƣợc tạo ra trong quá trình sinh trƣởng của Trichoderma. Với phƣơng pháp pha loãng ngƣời ta ƣớc tính Trichoderma có thể đạt đến 3% tổng số vi nấm hiện diện trong các loại đất rừng và 1,5% số lƣợng nấm trong đất đồng cỏ [16]. Turner và cộng sự (1997) chỉ ra rằng T.longibrachiatum và T.citrinoviride có nhiều sự trùng nhau về khu vực phân bố địa lí. Sự phân bố rộng khắp này có lẽ do sự phát tán hiệu quả (nhờ gió hoặc côn trùng) hoặc biểu hiện một quá trình tiến hóa rất sớm [16]. Chất chuyển hóa thứ cấp và kháng sinh [16] Trichoderma spp. sản xuất nhiều loại kháng sinh. Ngày nay, danh sách của các chất trên đƣợc kéo dài thêm ra, bao gồm đa dạng các chất có hoạt tính: glioviridin (một diketopiperazin), sesquiterpenoids, trichothecenes (trichodermin), cyclic peptides, isocyanid-bao gồm các chất chuyển hóa (trichoviridin). Bên cạnh khả năng ức chế vi sinh vật khác, chắc chắn những chất chuyển hóa này liên quan đến sự tăng trƣởng yếu kém của thực vật bậc cao hơn và cũng là nguyên nhân gây ra bệnh còi ở cừu thông qua hoạt động ức chế vi sinh vật phân giải cellulose trong dạ cỏ của chúng. Các chủng Trichoderma cũng sinh ra nhiều loại hợp chất ức chế dễ bay hơi có thể trợ giúp cho sự hình thành khuẩn lạc của chúng trong đất. Trichoderma và Gliocladium sản xuất đa dạng chất chuyển hóa thứ cấp. Những chất này bao gồm sắc tố anthroquinon (pachybasin-[1,8-dihydroxy-3-methyl-9,10- anthraquinon]; emodin-[1,6,8-trihydroxy-3-methyl-9,10-anthroquinon]), chức năng của chúng vẫn chƣa đƣợc biết, một số chất khác nhƣ benzoquinon (thermophyllin), cardinan (avocettin); dihydrocoumarins, polyacetylen mạch nhánh (trichodermen) và dẫn xuất các acid béo (methyl-2,4,6-triene-1-1carboxylat). Những chất này cũng chƣa đƣợc biết rõ về hiệu quả của chúng trong sự hình thành khuẩn lạc. 2.2. Khả năng kiểm soát sinh học của Trichoderma 2.2.1. Tƣơng tác với nấm bệnh [17] Sự tƣơng tác đối kháng giữa Trichoderma và các loại nấm khác đƣợc phân loại nhƣ sau: tiết ra các chất kháng nấm bệnh (antibiosis), kí sinh lên cơ thể của nấm bệnh (mycoparasitism), cạnh tranh dinh dƣỡng với nấm bệnh (competition for nutrient). Những cơ chế này không tách biệt nhau, và cơ chế đối kháng thực tế có thể là một trong những loại cơ chế này. Ví dụ, sự kiểm soát Botrytis trên nho bởi Trichoderma bao gồm cả sự cạnh tranh dinh dƣỡng và sự kí sinh lên hạch nấm, cả hai cơ chế đã ngăn chặn tác nhân gây bệnh. Cả cơ chế tạo ra các chất kháng nấm và cơ chế kí sinh có thể liên quan đến sự cạnh tranh dinh dƣỡng, thật ra sự sản xuất ra các chất độc đƣợc biết có ảnh hƣởng đến tình trạng dinh dƣỡng của môi trƣờng tăng trƣởng. Chứng cớ gần đây chỉ ra rằng các chất kháng sinh và các enzym thủy phân không chỉ đƣợc tạo ra đồng thời mà còn hỗ trợ nhau trong cơ chế đối kháng kí sinh. Gần đây có giả thiết cho rằng tác nhân kiểm soát sinh học T.harzianum T39 làm giảm lƣợng enzim phân hủy pectin do B.cinerea tạo ra do đó làm giảm sự gây bệnh. Cơ chế tiết ra các chất kháng nấm bệnh (antibiosis) Các chủng Trichoderma sản xuất đa dạng các chất chuyển hóa thứ cấp dễ bay hơi và không bay hơi, một vài chất loại này ức chế vi sinh vật khác mà không có sự tƣơng tác vật lí. Chất ức chế đƣợc coi là chất kháng sinh. Chất có mùi dừa 6-n-pentyl-2H- pyran-2-one (PPT) đƣợc tìm thấy ở một số chủng Trichoderma phân lập đƣợc. Các chủng Trichoderma sản xuất nhiều loại kháng sinh khác nhau, môi trƣờng cũng tác động vào sự sản xuất cả về chất lƣợng và số lƣợng. Hơn nữa các kháng sinh đặc hiệu tác động vào các tác nhân gây bệnh khác nhau thì khác nhau. Cơ chế kí sinh (mycoparasitism) Theo Chet (1990) cơ chế đối kháng kí sinh gồm 4 giai đoạn : (a)sự tăng trƣởng có tính chất hƣớng hóa, trong giai đoạn này tác nhân kích thích hóa học từ nấm đích hấp dẫn nấm đối kháng; (b) sự nhận dạng đặc hiệu, có lẽ trung gian bởi lectin trên bề mặt tế bào của cả tác nhân gây bệnh và nấm đối kháng; (c) sự tấn công và xoắn vòng của sợi nấm Trichoderma xung quanh vật chủ; và (d) sự bài tiết các enzym phân giải vách tế bào chất. Hệ enzym phân giải vách tế bào bao gồm chitinases, glucanase, protease. Hình 2.3. Trichoderma kí sinh trên Pythium gây bệnh trên rễ cây họ đậu (Trichoderma nhuộm màu vàng, Pythium nhuộm màu lục) [26] Hình 2.4. Heä sôïi naám Trichoderma kíù sinh treân khuaån ty naám beänh Rhizoctonia solani Lockwood (1981, 1982) và Wicklow (1992) đã đƣa ra khái niệm cạnh tranh khai thác và cạnh tranh cản trở vào tƣơng tác giữa quần thể nấm. Sự cạnh tranh cản trở liên quan đến cơ chế hóa học và tập tính bởi vi sinh vật này giới hạn vi sinh vật khác tiếp xúc cơ chất và xảy ra do sự tƣơng tác giữa hệ sợi nấm trong cùng loài hoặc khác loài. Sự cạnh tranh khai thác xảy ra giữa 2 loài cùng khai thác một nguồn lợi nhƣng khác nhau về tốc độ và hiệu quả khai thác. Trong trƣờng hợp nguồn lợi là nguồn dinh dƣỡng đƣợc xem nhƣ cạnh tranh dinh dƣỡng. Sự cạnh tranh cho mô hoại sinh (competition for necrotic tissue) Botrytis và Sclerotinia spp. là mầm bệnh cơ hội tấn công vào mô thực vật lão hóa hoặc chết coi đó nhƣ nguồn dinh dƣỡng, từ đây tiếp tục tấn công vào những mô khỏe mạnh. Khi đã xử lí Trichoderma, chúng làm suy yếu, làm chậm sự hình thành khuẩn lạc của Botrytis vào mô thực vật. Sau đó làm giảm mức độ bệnh trên cây. Trichoderma đã đƣợc ứng dụng thành công trong kiểm soát Botrytis và Sclerotinia trên những loại rau cải, trái cây khác nhau, dâu, dƣa chuột, … Sự cạnh tranh cho chất dịch rỉ từ hạt (competition for plant exudates) Bệnh chết nhát (Damping-off) gây bởi Pythium ultimum ởmột số loại ngũ cốc và rau quả đƣợc xuất phát bởi sự đáp ứng nhanh chóng của mầm bệnh đối với dịch rỉ từ hạt. Túi bào tử của Pythium nảy mầm và xâm nhiễm vào hạt giống trong vòng vài giờ khi Pythium đã tràn lan trong đất. Xử lí hạt giống với Trichoderma làm giảm sút sự nảy mầm của túi bào tử Pythium, hiện tƣợng này đƣợc cho là sự cạnh tranh chất kích thích nảy mầm. Sự cạnh tranh dinh dƣỡng cũng đƣợc xem nhƣ cơ chế hữu hiệu nhất sử dụng bởi T.harzianum T-35 trong sự kiểm soát Fusarium oxysporum trong vùng rễ cây bông vải và dƣa hấu. Sự cạnh tranh trên vị trí vết thƣơng (competition on wound sites) Một trong những thí nghiệm thành công đầu tiên của sự kiểm soát sinh học trên vết thƣơng gây do cắt xén là sử dụng T.viride, áp dụng trong phun xịt hoặc dùng kéo lớn cắt, để kiểm soát mầm bệnh gây bạc lá (Chondrostereum purpureum). Thể Trichoderma đƣa vào đƣợc chứng minh có khả năng mọc khuẩn lạc trên cây vừa bị cắt và ngăn ngừa sự xâm nhiễm của mầm bệnh ở rễ (Amillaria luteobubalina). Sự thối thân thƣờng theo cùng sự xâm nhiễm Botrytis vào vết thƣơng bị cắt trên cây cà chua trong nhà kính; căn bệnh này rất khó kiểm soát bởi những biện pháp canh tác. Thể Trichoderma đƣợc chứng minh có khả năng kiểm soát sự thối thân khi tiêm chủng trƣớc hay cùng lúc với Botrytis, nhƣng không có hiệu quả kiểm soát nếu đƣợc tiêm sau, nhƣ vậy có thể cho rằng sự cạnh tranh mọc khuẩn lạc trên vết thƣơng là yếu tố xác định sự giảm bệnh. Trong một nghiên cứu sự xâm nhiễm của Pythium vào rễ dƣa chuột đã chỉ ra rằng mặc dù không có sự hình thành khuẩn lạc của chủng T.harzianum T3 trên toàn bộ rễ nhƣng vẫn có sự hình thành khuẩn lạc tại vết thƣơng. Sự cạnh tranh dinh dƣỡng từ dịch rỉ vết thƣơng của thể cạnh tranh rõ ràng là nguyên nhân làm giảm sự xâm nhiễm của Pythium. 2.2.2. Tƣơng tác với cây trồng [18] Hiệu quả của sự hình thành khuẩn lạc ở rễ đến cơ chế trao đổi chất ở lá Một vài nghiên cứu cho thấy sự mọc khuẩn lạc ở rễ do các chủng Trichoderma dẫn đến sự tăng cƣờng hoạt tính của các enzym có liên quan đến tính chống chịu của thực vật, bao gồm các peroxidase, chitinase, β-1,3-glucanase và lipoxygenase. Trong cây dƣa chuột, sự thêm vào Trichoderma asperellum T-203 đã dẫn đến sự gia tăng sản xuất phenylalanine ammonia lyase nhất thời trong cả rễ và chồi cây, nhƣng trong vòng 2 ngày, tác động này sẽ giảm xuống tới mức cơ bản ở cả hai cơ quan trên. Sự thay đổi trong cơ chế trao đổi chất của thực vật có thể dẫn đến sự tích tụ các hợp chất kháng sinh. Trichoderma không chỉ tạo ra các chất kháng sinh một cách trực tiếp mà chúng còn kích hoạt mạnh mẽ vào cây trồng để cây trồng tự sản xuất các hợp chất kháng sinh. Sự hình thành khuẩn lạc trên rễ bởi những loại nấm này gây biến đổi đáng kể đến bộ máy trao đổi chất của cây trồng. Những kết quả trên cho phép chúng ta tạo một mô hình cơ chế Trichoderma spp. kiểm soát và làm giảm bệnh trên cây trồng. Nhiều loài nhƣ T.virens, T.asperellum, T.atroviride và T.harzianum gây sự thay đổi cơ chế trao dổi chất trên cây trồng làm tăng cƣờng khả năng kháng lại phổ rộng các tác nhân gây bệnh là các loài vi sinh vật. Hơn thế, đáp ứng này còn có hiệu quả trên nhiều loại cây trồng (bảng 1). Khi bào tử hoặc cơ quan nhân giống khác, đƣợc thêm vào đất và tiến đến tiếp xúc với rễ thì chúng nảy mầm và tăng trƣởng trên bề mặt rễ, và tối thiểu một ít nhiễm vào phía ngoài tế bào rễ. Chúng sản xuất tối thiểu 3 loại chất mà tạo ra đáp ứng bảo vệ của cây trồng, đáp ứng này ngăn chặn sự xâm nhiễm nhiều hơn nữa của mầm bệnh. Những thể tạo ra sự đáp ứng bao gồm các peptide, protein và hợp chất trọng lƣợng phân tử nhỏ. Trong một vài trƣờng hợp, sự kháng chỉ mang tính cục bộ nhƣ trƣờng hợp của T.virens trẹn cây bông vải, còn trên hầu hết các hệ thống cây trồng-Trichoderma khác thì tính kháng mang tính toàn bộ. Cải thiện sự tăng trƣởng của rễ Trong cả nghiên cứu lí thuyết và ứng dụng thƣơng mại, các chủng Trichoderma đều tăng cƣờng sự phát triển của rễ trên ngô và nhiều loại cây trồng khác. Tác động này kéo dài trong cả cuộc đời của cây lâu năm và có thể đƣợc tạo nên bởi sự thêm vào một lƣợng nhỏ vi nấm (nhỏ hơn 1g ha-1) đƣợc áp dụng nhƣ một biện pháp xử lí hạt giống. Ví dụ cây ngô đƣợc trồng trên cánh đồng từ những hạt giống đƣợc và không đƣơc xử lí với Trichoderma. Sau một vài tháng, khi cây trồng đã cao trên 2m các mƣơng đƣợc đào thành các hàng và tần số mặt tiếp xúc của rễ trên khu vực các luống cày đƣợc xác định. Sự hiện diện của khuẩn lạc Trichoderma đã làm cho mặt tiếp xúc của rễ sâu hơn. Điều này dẫn đến tăng cƣờng khả năng chịu hạn và có lẽ chống lại những loại đất cứng. Sự tăng trƣởng của những cây này có thể đƣợc tăng cƣờng bởi sự hiện diện của vi sinh vật có ích trên rễ khác. Trong hầu hết các trƣờng hợp đã đề cập ở trên thì không thể tách rời các tác động trực tiếp đến sự tăng trƣởng cây trồng khỏi sự kiểm soát các mầm bệnh hoặc các vi sinh vật có hại khác ảnh hƣởng xấu đến sự tăng trƣởng của rễ. Sự gia tăng đồng thời cả sự phát triển của rễ và sự tăng trƣởng cây trồng có lẽ gây bởi sự kiểm soát sinh học và các tác động liên hệ đến rễ do hệ vi sinh vật, và cũng gây bởi sự cải tiến trực tiếp trong sự tăng trƣởng cây trồng. Hệ vi sinh vật có hại cho rễ làm giảm sự tăng trƣởng trong sự thiếu vắng hoàn toàn bệnh cây. Một vi sinh vật có hại sản xuất cyanid-có lẽ tồn lƣu trong nơi ở của chúng trong cuộc cạnh tranh. Trichoderma spp. kháng lại cyanid và tạo ra hai loại enzym khác nhau có khả năng phân hủy chúng trong vùng rễ. Do đó Trichoderma có thể tăng cƣờng trực tiếp cho sự tăng trƣởng của rễ, kiểm soát những vi sinh vật có hại không phải là mầm bệnh, tiêu diệt các chất chuyển hóa độc hại đƣợc tạo ra bởi vi sinh vật có hại và trực tiếp kiểm soát mầm bệnh ở rễ. Sự gia tăng tăng trƣởng rễ do những nấm này cùng với sự tăng cƣờng đồng thời tăng trƣởng cây và sự đề kháng stress đƣợc thực hiện bởi một vài con đƣờng khác nhau, có thể mỗi đáp ứng bao gồm nhiều cơ chế mà đã đƣợc miêu tả ở sự kiểm soát sinh học trên rễ và lá. Hình 2.5. Sự gia tăng phát triển hệ rễ với thể cạnh tranh T-22 ở vùng rễ [26] Ghi chú: Without T-22: không đƣợc xử lí với T-22 With T-22: đã xử lí với T-22 Hình 2.6. Sự gia tăng sản lƣợng trên cây ớt với hạt giống đƣợc xử lí với T-22 [26] Tƣơng tác tăng cƣờng sử dụng chất dinh dƣỡng Trichoderma spp. gia tăng sự sử dụng và sự tập trung các chất dinh dƣỡng (Cu, P, Fe, Mn, Na) trong rễ trong môi trƣờng ngập nƣớc. Sự gia tăng khả năng sử dụng này cho biết sự cải tiến các cơ chế sử dụng dinh dƣỡng của cây trồng. Hơn nữa, có thể gia tăng trạng thái cân bằng dinh dƣỡng khi thêm nguồn nitơ trong phân bón. Dữ liệu này cho thấy Trichoderma gia tăng hiệu quả sử dụng nguồn nitơ trong phân bón trên cây ngô. Và khả năng này có thể làm giảm sự ô nhiễm nitrat trong đất và bề mặt nƣớc. Các phân tích đã cho thấy Trichoderma gây ra sự gia tăng sử dụng các yếu tố bao gồm As, Co, Cd, Ni, Va, Mg, Mn, Cu, Bo, Zn, Al, Na. Tóm lại các chủng Trichoderma có thể hòa tan nhiều loại dinh dƣỡng cho cây trồng khác nhau chẳng hạn nhƣ phosphate khó tan, Fe3+, Cu2+, Mn4+, Zn0, có thể không dùng đƣợc cho cây trồng từ một vài loại đất. Bảng 2.1. Tác dụng và hiệu quả đề kháng cho cây trồng do loài Trichoderma mang lại [18] Chủng T.virens G-6, G-6-5 và G-11 T.harzianum T-39 T.harzianum T-39 T.Asperellum T-203 T.harzianum NF-9 Cây trồng Bông vải Cây đậu Cà chua, hồ tiêu, thuốc lá, rau diếp, đậu Dƣa chuột Lúa Tác nhân gây bệnh Rhizoctonia solani Colletotrichum lindemuthianum ; Botrytis cinerea Botrytis cinerea Pseudomonas syringae pv. lachrymans Magnaporthe grisea ; Xanthomonas oryzae pv.oryzae Tác dụng Bảo vệ tất cả các bộ phận của cây trồng, tạo ra chất độc cho nấm terpenoid phytoalexins Bảo vệ lá khi T- 39 đã xuất hiện duy nhất ở rễ Bảo vệ lá khi T-39 đã xuất hiện duy nhất ở rễ Bảo vệ lá khi T-203 đã xuất hiện duy nhất ở rễ, sự sản xuất các hợp chất kháng nấm trên lá Bảo vệ lá khi NF-9 đã xuất hiện duy nhất ở rễ Thời gian sau khi sử dụng 4 ngày 10 ngày 7 ngày 5 ngày 14 ngày Hiệu quả Giảm 78% bệnh, có khả năng tạo ra phytoalexins cần thiết cho hoạt động kiểm soát sinh học tối đa Giảm 42% trong vùng thƣơng tổn và giảm số lƣợng sự lan tỏa các vùng thƣơng tổn Giảm 25- 100% hội chứng mốc xám Lên tới 80% sự giảm bệnh trên lá, giảm 100 lần mức độ tế bào vi khuẩn gây bệnh cho lá Giảm 34- 50% bệnh Chủng T.harzianum T-22 ; T.atroviride P1 T.harzianum T-22 T.harzianum T-22 Trichoderma GT3-2 T.harzianum Cây trồng Đậu Cà chua Ngô Dƣa chuột Hồ tiêu Tác nhân gây bệnh Botrytis cinera và Xanthomonas campestris pv. phaseoli Alternaria solani Colletotrichum graminicola C.orbiculare, P.syringae pv.lachrymans Phytophthora capsici Tác dụng Bảo vệ lá khi T-22 hoặc P1 đã xuất hiện duy nhất ở rễ, sự sản xuất các hợp chất kháng nấm trên lá Bảo vệ lá khi T-22 đã xuất hiện duy nhất ở rễ Bảo vệ lá khi các chủng Trichoderma đã xuất hiện duy nhất ở rễ Bảo vệ lá khi các chủng Trichoderma đã xuất hiện duy nhất ở rễ, tạo ra sự hóa gỗ và sự sinh ra superoxid Bảo vệ thân khi các chủng Trichoderma đã xuất hiện duy nhất ở rễ, tăng cƣờng sự sản xuất phytoalexins capsidiol Thời gian sau khi sử dụng 7-10 ngày 3 tháng 14 ngày 1 ngày 9 ngày Hiệu quả Giảm 69% hội chứng mốc xám (Botrytis cinerea) với T22 ; mức độ kiểm soát thấp hơn với P1. Giảm 54% hội chứng bệnh gây ra do vi khuẩn. Giảm tới 80% hội chứng thối sớm từ sự xâm nhiễm tự nhiên Giảm 44% kích thƣớc thƣơng tổn trên lá bị thƣơng và không gây bệnh trên lá không bị thƣơng Bảo vệ 59% khỏi bệnh gây bởi C.orbiculare và 52% khỏi bệnh gây bởi P.syringae Giảm gần 40% chiều dài thƣơng tổn 2.3. Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma 2.3.1. Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng Bảo vệ thực vật Một trong những nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma spp. đƣợc quan tâm nhiều nhất, đó là khả năng kiểm soát sinh học cũng nhƣ khả năng đối kháng một số nấm gây bệnh ở thực vật. Các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều loại Trichoderma spp. khác nhau để kiểm soát nhiều loại nấm gây bệnh khác nhau. Kết quả là các loài Trichoderma spp. kiểm soát có hiệu quả các nấm gây bệnh sau: Rhizoctonia spp.:gây mục rễ, thân và hạt,… Sclerotium rolfsii: xơ cứng ở cà chua và khoai tây. Pythium spp.: gây úng thối ở đậu, thuốc lá, cây con,… Armillaria mellea: mục rễ ở cây rừng, cao su, thông. Botrytis cinerea: mốc xám gây hỏng dâu và nho. Penicillium diditatum: hỏng trái ở chanh và chuối Phytophthora spp.: mục rễ, hỏng trái ở ca cao. Chondeostereum purpureum: bạc lá ở đào và mận [11]. Hiện nay các chủng Trichoderma spp. đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm sinh học thƣơng mại nhƣ: GlioGard – một chế phẩm với thành phần chính là Trichoderma spp. kiểm soát có hiệu quả các nấm gây bệnh sau: Rhizoctonia spp.:gây mục rễ, thân và hạt,… Sclerotium rolfsii: xơ cứng ở cà chua và khoai tây. Pythium spp.: gây úng thối ở đậu, thuốc lá, cây con,… Armillaria mellea: mục rễ ở cây rừng, cao su, thông. Botrytis cinerea: mốc xám gây hỏng dâu và nho. Penicillium diditatum: hỏng trái ở chanh và chuối Phytophthora spp.: mục rễ, hỏng trái ở ca cao. Chondeostereum purpureum: bạc lá ở đào và mận Ngoài ra, ở New Zealand, ngƣời ta còn trộn nhiều chủng Trichoderma khác nhau để kiểm soát bệnh trên cây nho và các cây dạng quả hạch [13]. Ở Mỹ, ngƣời ta rắc bột bào tử hay phủ gel bào tử lên các hạt giống để tăng tính kháng bệnh của cây trồng hay phun bào tử lên khắp cánh đồng trƣớc khi trồng trọt. Trong nƣớc, đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng các chủng nấm Trichoderma xử lí đất trƣớc khi gieo trồng bắp hay trộn nấm mốc với phân chuồng hoại mục trƣớc khi bón ruộng 5-10 ngày, rồi rải trên ruộng trƣớc khi gieo hạt có tác dụng hạn chế bệnh khô vằn hại bắp [6]. Cải thiện năng suất cây trồng Cũng nhƣ thuốc trừ sâu, phân bón hoá học lâu ngày sẽ làm cho đất canh tác bị thoái hóa, chai sạn; các loại giun đất không phát triển đƣợc, làm hạn chế độ xốp đồng thời, độ thông khí cần thiết cho rễ cây cũng thiếu hụt. Vì vậy, các nƣớc có nền nông nghiệp phát triển trên thế giới có xu hƣớng sử dụng các phân bón hữu cơ sinh học thế hệ mới – thực chất là một sự kết hợp giữa phân bón vi sinh và thuốc trừ sâu sinh học, dựa trên cơ sở đấu tranh sinh học. Các loại phân bón hữu cơ vi sinh này có các tác dụng sau: Phòng ngừa các nấm gây bệnh thối mốc, bệnh héo rũ, bệnh chết cỏ, bệnh nấm sƣơng mai, bệnh đốm nâu… và hạn chế các tác hại nguy hiểm do các nấm gây mục gỗ nhờ khả năng bất hoạt enzym của các nấm gây bệnh, đồng thời bảo vệ cây trồng khỏi các côn trùng đục phá thân [8]. Đẩy mạnh tốc độ tăng trƣởng của cây trồng nhờ khả năng giúp cây trồng tạo ra hệ rễ cứng cáp hơn. Gần đây, khi khảo sát các loài Trichoderma spp. ở các lớp đất sâu, ngƣời ta còn thấy Trichoderma spp. làm tăng số lƣợng các rễ sâu (các rễ cách mặt đất khoảng 1m). Điều này góp phần giúp cho các cây lƣơng thực nhƣ ngô hay các loài dùng để trang trí nhƣ cỏ lát có khả năng chống chịu tốt với hạn hán [24]. Một nghiên cứu gần đây còn cho biết nếu ngô có Trichoderma harzianum T-22 kí sinh ở rễ thì cần lƣợng phân đạm ít hơn 40% so với rễ không có T-22. Vài loài Trichoderma có khả năng kích thích sự nẩy mầm và sự ra hoa. Đã có nhiều công trình khoa học chứng minh rằng Trichoderma harzianum và Trichoderma koningii kích thích sự nẩy mầm và tăng trƣởng của cây. Đối với các hoa đƣợc trồng trong nhà kính, Trichoderma harzianum đẩy nhanh sự ra hoa bằng cách rút ngắn ngày ra hoa hay tăng số lƣợng hoa [23]. Cải thiện cấu trúc và thành phần của đất, đẩy mạnh sự phát triển của vi sinh vật nốt sần cố định nitơ trong đất, duy trì sự cân bằng của các vi sinh vật hữu ích trong đất; bảo toàn và tăng độ phì nhiêu, dinh dƣỡng cho cây trồng. Phân giải từ từ cellulose có trong phân hữu cơ và đất trồng nên tăng cƣờng dinh dƣỡng và kích thích sinh trƣởng của cây. Tăng sức đề kháng của cây trồng, một số chủng Trichoderma harzianum còn có thể xâm nhập vào mô bào cây, làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng. Nhƣ vậy, các chủng nấm Trichoderma spp. trong các chế phẩm phân hữu cơ vi sinh không những cung cấp một nguồn phân bón an toàn, hiệu quả mà còn giúp kiềm chế các bệnh gây hại cây trồng và tạo đƣợc những ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài trong tự nhiên. Hình 2.7. Hiệu quả giữa sử dụng và không sử dụng Trichoderma harzianum T-22 trên rễ [25] Ghi chú: Bên trái: rễ ngô đƣợc xử lí T-22 Bên phải: rễ ngô chƣa xử lí T-22 2.3.2 Trong lĩnh vực xử lý môi trƣờng [13, 20] Trichoderma harzianum có khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm trong đất rừng. Sự tồn tại của các hợp chất chloroguaiacols, hợp chất AOX (các hợp chất halogen thấm nƣớc) trong chất thải của các nhà máy sản xuất bột giấy ở hồ Bonney, Đông Nam nƣớc Úc và các sản phẩm phân giải của Trichoderma harzianum đã đƣợc nhà khoa học Van Leeuwen cùng các cộng sự nghiên cứu. Chất tẩy trắng chlor của các nhà máy sử dụng sulfit hóa bột giấy đƣợc tháo ra hồ một cách gián đoạn đã làm xuất hiện các hợp chất chlorophenol trong nƣớc và cặn bẩn. Hợp chất chlorophenol này rất độc. Trichoderma harzianum có khả năng làm giảm bớt sự tập trung của các hợp chất tự do 2,4,6-trichlorophenol; 4,5- dichloroguaiacol và cả AOX trong môi trƣờng có chứa muối khoáng. Loài nấm này cũng có khả năng dehalogen hóa tetrachloroguaiacol tự do trong môi trƣờng khoáng mặn. Trichoderma harzianum đã chứng tỏ khả năng phân giải hiệu quả của chúng trên ciliatin, glycophosphat và amino methylphosphonic acid (3-methoxyphenyl). Trichoderma harzianum 2023 (Khoa sinh lý thực vật Trƣờng Đại học California) có thể phân giải DDT, endosulfan, pentachloronitrobenzen và pentachlorophenol. Nấm này phân giải endosulfan trong nhiều điều kiện dinh dƣỡng khác nhau trong suốt quá trình sống của nó. Trichoderma harzianum CCT-4790 phân giải 60% thuốc diệt cỏ Duirion trong đất trong 24 giờ, đây là một tiềm năng tốt để xử lý sinh học các hóa chất ô nhiễm trong đất và trong đầm lầy. Một công trình nghiên cứu khác sử dụng chủng nấm mốc Trichoderma reesei RUT-30 để xử lý chất thải sinh hoạt đô thị, hứa hẹn một nguồn sản xuất enzym cellulase rẻ tiền, đồng thời giảm lƣợng rác thải. Các enzym cellulase thu đƣợc từ đây đƣợc đánh giá là tốt hơn và kinh tế hơn so với enzym cellulase đƣợc lấy từ các nguồn cơ chất cellulose tinh chế. 2.3.3. Trong các lĩnh vực khác Trichoderma spp. là nguồn sản xuất hiệu quả các hệ enzym cellulase ngoại bào. Các enzym này đƣợc sử dụng rất nhiều trong công nghiệp dệt, do chúng có thể làm cho vải bông mềm và trắng hơn [24]. L.Grange và cộng sự đã biểu hiện gen -xylanase (XYN2) của Trichoderma reesei ở Saccharomyces cerevisiae để bổ sung vào thức ăn của gia cầm, tăng khả năng tiêu hóa hemicellulose trong lúa mạch và các cây lƣơng thực khác [14]. Tƣơng tự , có rất nhiều gen đƣợc tạo dòng từ Trichoderma spp., mở ra một hƣớng đi mới trong công tác bảo vệ mùa màng, sản xuất các cây lƣơng thực an toàn và gần gũi với thiên nhiên, tạo ra các cây chuyển gen có khả năng chống chịu bệnh tốt [24]. PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian tiến hành thí nghiệm Từ ngày 28-02-2005 đến ngày 15-07-2005 3.2. Địa điểm thực hiện Phòng thí nghiệm công ty TNHH Gia Tƣờng, chi nhánh Bình Dƣơng Địa chỉ: kho C2 – Lô D –Tổng kho Sóng Thần (GRAINCO) Khu công nghiệp Sóng Thần I – Dĩ An –Bình Dƣơng ĐT/FAX:0650.732.625 3.3. Vật liệu 3.3.1. Môi trƣờng phân lập Trichoderma (môi trƣờng PDA) Khoai tây 200g Glucose 20g Agar 20g Ampicilin 100mg Nƣớc cất 1000ml 3.3.2. Môi trƣờng thử tính đối kháng của Trichoderma (môi trƣờng nƣớc giá đỗ) [9] Sucrose 30g KH2PO4 1g MgSO4 0,5g Pepton 2g Nƣớc giá đỗ 1000ml 3.3.3. Các mẫu đất thu thập thực địa Tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu: 3 mẫu VT1A, VT1B, VT2 Tỉnh Đồng Nai: 6 mẫu ĐN1, ĐN2, ĐN2B, ĐN3, ĐN4, AH1 Thành phố Hồ Chí Minh: 3 mẫu HCM1, HCM2, HCM3 Tỉnh Tây Ninh: 6 mẫu TN1, TN2A, TN2B, TN3, TN4, TN5 Tỉnh Bình Phƣớc:4 mẫu BP1, BP2A, BP2B, BP3 Tỉnh Bình Dƣơng: 4 mẫu BD1, BD2, BD3, BD4 3.3.4. Các chủng vi sinh vật sử dụng Các chủng Trichoderma tiến hành thử tính đối kháng nấm gây bệnh thực vật o Các chủng Đ1-Đ18 do Thạc sĩ Đinh Minh Hiệp-Sở Khoa Học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh cung cấp o Các chủng Đ19-Đ36 đƣợc phân lập từ những mẫu đất thu thập thực địa các tỉnh miền Đông Nam bộ. Các chủng nấm gây bệnh cây trồng do Chi Cục Kiểm Dịch Thực Vật vùng 2 cung cấp o Sclerotium rolfsii (kí sinh trên thân cây thuốc lá) o Phytophthora palmivora (kí sinh trên cây ca cao) o Rhizoctonia solani (kí sinh trên cây tiêu) 3.4. Dụng cụ - Thiết bị  Cân điện tử  Máy lắc 150-250 vòng/phút  Máy đo pH: máy pH 526 meter  Máy đo độ ẩm: máy đo độ ẩm IR 200 của hãng Denver  Autoclave  Các dụng cụ thủy tinh thông thƣờng dùng trong phòng thí nghiệm (erlen, ống nghiệm, petri, …)  Các dụng cụ lấy mẫu (xẻng, túi vải, túi giấy chống ẩm, bao polyetylen, …) 3.5. Phƣơng pháp 3.5.1. Phƣơng pháp khảo sát thực địa [1,2]  Nhiệm vụ Tiến hành thu thập mẫu đất tại các địa điểm có đặc điểm địa hình, loại cây trồng, cách canh tác khác nhau. Ở mỗi tỉnh cần thu thập từ 3 đến 6 mẫu.  Cách tiến hành Tham khảo tài liệu bản đồ phân loại đất, bản đồ hành chính xác định địa điểm thu thập, đáp ứng theo các yêu cầu sau o Phải đặc trƣng cho loại đất của vùng o Phải ở khu vực dễ xác định trên bản đồ hành chính, bản đồ phân loại đất. o Phải thuận tiện cho việc tiến hành lấy mẫu về giao thông, về lộ trình chuyến đi. Tiến hành thu thập mẫu đất tại các địa điểm đã đƣợc xác định. Phỏng vấn ngắn các nông hộ tại địa điểm thu thập mẫu đất. Ghi chép các thông tin liên quan đến mẫu đất. o Thời gian lấy mẫu o Địa điểm nơi lấy mẫu o Lớp thực bì o Tình hình canh tác o Nguồn nƣớc tƣới o Độ pH o Độ ẩm o Sơ đồ nơi lấy mẫu. 3.5.2. Phƣơng pháp thu thập mẫu đất [1,2,4] Chọn một ô vuông diện tích 1m2, xác định 4 điểm ở các góc vuông của ô và tâm của ô vuông. Dùng dao hay xẻng đã rửa sạch và lau cồn để lấy mẫu đất. Đầu tiên loại bỏ lớp đất dày 2-3 cm trên cùng vì lớp đất này có thể đã bị xâm nhiễm bởi các vi sinh vật bên ngoài. Sau đó lấy những tảng nguyên vẹn theo độ sâu của lớp đất nghiên cứu. Chiều dài của tảng này bằng chiều dày lớp đất nghiên cứu. Mỗi mẫu lấy khoảng 0,3- 0,5kg. Các mẫu này đuợc trộn đều trong một túi đã khử trùng, sau đó lấy ra khoảng 1 kg cho vào túi giấy chống ẩm đã khử trùng rồi đặt vào trong 1 túi vải. Buộc túi lại rồi cho vào một bao polyetylen. Trên bao này gài nhãn có ghi rõ vùng nghiên cứu, đặc điểm của chỗ lấy mẫu (đặc điểm địa hình, thực vật, tình hình kỹ thuật canh tác) và các đặc tính của đất. Giữ mẫu trong tủ lạnh cho đến khi phân tích và xác định. 3.5.3. Phƣơng pháp tiến hành đo giá trị pH của mẫu đất Lấy 50g đất và 50ml nƣớc cất 2 lần cho vào một becher dung tích 500ml. Đem hỗn hợp này lắc trong 1 giờ. Sau đó để lắng, hút dịch nổi phía trên đem đo giá trị pH. 3.5.4. Phƣơng pháp tiến hành đo độ ẩm của mẫu đất Tiến hành xác định độ ẩm của mẫu đất bằng máy IR 200 theo qui trình sau: Lau sạch đĩa cân, đóng nắp lại, điều chỉnh độ ẩm bằng 0. Sau đó lấy 1g mẫu cho vào đĩa cân. Đóng nắp lại, chờ đọc kết quả. 3.5.5. Phƣơng pháp phân tích thành phần khoáng trong đất Thành phần các nguyên tố khoáng hiện diện trong mẫu đất đƣợc phân tích theo phƣơng pháp quang phổ phát xạ tại Trung Tâm Phân tích thí nghiệm thuộc Liên đoàn Bản đồ Địa chất Miền Nam. 3.5.6. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu để phân tích vi sinh vật [4] Lấy đất đã trộn đều đem trải lên một miếng thủy tinh khô đã lau cồn và hơ trên ngọn lửa. Trộn đất thật kỹ bằng bay rồi trải đều ra. Dùng kẹp sắt gắp bỏ các rễ cây và các vật lạ khác. Trƣớc khi dùng bay và kẹp sắt, phải hơ chúng trên ngọn lửa và làm nguội trong không khí. Dùng bay lấy một ít đất từ các điểm khác nhau trên tấm kính cho vào một chén sứ đã khử trùng và biết trọng lƣợng để cân trên cân kỹ thuật 1g mẫu trung bình của đất. Để tách các vi sinh vật ra khỏi các hạt đất, cần phải xử lý mẫu theo một cách riêng: Chuẩn bị trƣớc 2 erlen vô trùng dung tích 250ml. trong một bình có sẵn 100ml nƣớc cất, bình kia để không. Lấy từ bình thứ nhất 0,4-0,8ml nƣớc cho vào một chén sứ có đựng đất đã cân để làm cho đất có đƣợc trạng thái bột nhão. Nghiền nát trong 5 phút bằng một chày cao su vô trùng hoặc bàn tay có mang găng cao su vô trùng. Lấy nƣớc vô trùng ở bình thứ nhất chuyển hỗn hợp đất đã nghiền nát vào bình không, phải sử dụng hết số lƣợng nƣớc này. Phải nghiền đất và trút nƣớc đất vào bình ngay gần ngọn lửa. Đặt bình có dịch huyền phù đất lên máy lắc và lắc trong 5 phút. Sau đó lấy ra để yên trong 30 giây để làm lắng các hạt lớn và ngay sau đó đƣợc dùng để chuẩn bị tiêu bản hoặc để pha loãng tiếp, khi đó ta coi dịch huyền phù đất nhận đƣợc đầu tiên này có độ pha loãng 100 lần (1:102). Khi muốn phát hiện các vi sinh vật có số lƣợng không lớn trong cơ chất, cần chuẩn bị dịch huyền phù gốc trong 10ml nƣớc (1:10). 3.5.7. Phƣơng pháp phân lập và phân lập thuần khiết vi nấm Trichoderma [5,7] Nguyên tắc o Tách rời các tế bào vi nấm. o Nuôi cấy trên môi trƣờng PDA các khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau. Cách tiến hành gồm 3 bƣớc cơ bản sau o Phân lập vi nấm Trichoderma thuần khiết trên môi trƣờng PDA Hút 0,1ml dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa petri có môi trƣờng PDA. Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch. Tiếp tục sử dụng que gạt này gạt mẫu cho đều khắp mặt thạch đĩa petri còn lại. Đặt các đĩa petri trên ở nhiệt độ phòng, sau 2-3 ngày nhận đƣợc các khuẩn lạc riêng rẽ đặc trƣng của Trichoderma. o Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi nấm ban đầu trên môi trƣờng PDA Tiến hành pha loãng mẫu đất cần phân lập (nhƣ nêu ở mục 3.5.6) để làm cho số lƣợng vi sinh vật ít đi. Cấy chúng trên môi trƣờng PDA,