Bước đầu nghiên cứu hệ izozym liên quan đến tính kháng thuốc phosphine của mọt đục hạt nhỏ (rhyzopertha dominica, fab)

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU HỆ IZOZYM LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG THUỐC PHOSPHINE CỦA MỌT ĐỤC HẠT NHỎ (Rhyzopertha dominica, Fab) PRELIMINARY STUDY ON ISOZYME SYSTEM OF LESSER GRAIN BORE (Rhyzopertha domonica Fab) RESISTANT TO PHOSPHINE Hoàng Trung (1) Trịnh Đình Đạt (2), Trần Đức Long,(2) Nguyễn Quỳnh Hoa (2) Abstract The Esterase isozyme of the two phosphine resistance strains of Rhyzopertha domonica F and reference susceptible strain was anlysed by means of polyacrylamide gel electrophoresis. Esterases content of the worm strains were defined. The result showed that: - Enzyme Esterase of the R.dominica strains is controlled by 3 gene loci. The two phosphine had five codominant alleles and reference susceptible strain has six codominant alleles. - Est-3 a allele frequency and esterase content of the two phosphine resistant strains were apparently higher than the susceptible strain. Keywords: Rodominica, isozym, phosphine. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Mọt đục hạt nhỏ - Rhyzopertha dominica Fab là một trong những loài mọt phá hoạị nghiêm trọng nhất đối với các loại nông sản bảo quản trong kho dự trữ. Loài mọt này phân bố hầu khắp thế giới ở các vùng nhiệt đới và Châu Á. Tất cả các vùng, miền của nƣớc ta đều có loài mọt này. Ngoài phá ngũ cốc trong kho, loài mọt này còn phá các loại thân, củ, rễ và sách báo. Để phòng trừ các loài mọt hạị kho, hầu hết các kho dự trữ nông sản đều đƣợc khử trùng bằng Phosphine (PH3). Việc sử dụng Phosphine thƣờng xuyên đã là một trong những nguyên nhân dẫn đến sự hình thành kháng thuốc phosphine của một số loài mọt gây hạị trong kho. Những kết quả nghiên cứu gần đây ở nƣớc ta (Dƣơng Minh Tú, Bùi Công Hiển, 1993 và Hoàng Trung, 1999) đã xác định ở một số địa điểm nhƣ Vĩnh Phúc, Hà Nội đã có những dòng của loài mọt đục hạt nhỏ (Rhyzoporthe dominica F.) kháng mạnh với thuốc Phosphine. Điều này đã gây ra những khó khăn cho công tác phòng trừ và bảo quản hàng ho á trong kho ngày càng cao. Sự hình thành tính kháng phosphine nói riêng và các thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ nói chung có liên quan đến hệ thống locus gen tổng hợp các izozym chuyển hoá làm mất tác dụng của thuốc khử trùng. Theo nhiều tác giả thì cơ chế chuyển hoá phosphine và các hoá chất nhóm lân hữƣ cơ nói chung có liên quan dến sự tác động của hệ izozym Esterase. Hệ izozym Esterase chuyển hoá làm biến đổi những thuốc trừ sâu mọt này từ dạng độc đối với côn trùng, sâu mọt thành dạng không độc đối với chúng. Do vậy, nhằm góp phần tìm hiểu cơ chế di truyền hiện tƣợng kháng thuốc phosphine đối với mọt đục hạt nhỏ và so sánh biểu hiện gen kháng của các dòng mọt thu thập ở các địa phƣơng khác nhau và góp phần xây dựng biện pháp phòng trừ tổng hợp loài mọt hại này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu hệ izozym Esterase ở một dòng đục hạt nhỏ với các mục đích sau: - Xác định số locus, số alen của mỗi locus của hệ izozym Esterase ở các dòng mọt. - Xác định hoạt độ Esterase tổng số của các 1. Côc B¶o vÖ Thùc vËt 2. §¹i häc quèc gia Hµ Néi dòng mọt nghiên cứu. - Tìm hiểu sự khác nhau về đặc điểm di truyền tính kháng giữa các dòng mọt. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu: Vật liệu nghiên cứu là loài mọt có vị trí phân loại nhƣ sau: Lớp côn trùng : Insecta Bộ cánh cứng : Coleoptera Họ mọt đục thân nhỏ : Bostrychidae Giống : Rhyzopertha Loài :Rhyzopertha dominica (Fab) Ba dòng mọt sử dụng để phân tích hệ izozym Esterase đó là: - Dòng mẫn cảm chuẩn (Mcc) đƣợc nhập từ Úc và đã đƣợc xác định là dòng không kháng đối với thuốc Phosphine. Dòng mọt này đƣợc nuôi giữ riêng trong phòng thí nghiệm. - Dòng kháng 1 (K1) là dòng mọt đƣợc thu thập từ Kho dự trữ Quốc gia - Hƣơng Canh và Vĩnh Phúc. Dòng mọt này đã đựơc xác định là dòng kháng phosphine với Ri = 11,09 - Dòng kháng 2 (K2) là dòng mọt đƣợc thu thập từ Kho xí nghiệp gà Tam Đảo, Vĩnh Phúc cũng đƣợc xác định là dòng kháng phosphine với Ri: 10,24. Mọt ở dạng trƣởng thành của mỗi dßng đƣợc ph©n tÝch theo từng c¸ thể riªng biệt. Mỗi bản gel điện di đều đƣợc ph©n tÝch đồng thời cả 3 dßng và lặp đi lặp lại nhiều lần 2.2. Phương pháp nghiên cứu Hệ izozym estarza đƣợc tách chiết từ mỗi cá thể trƣởng thành và đƣợc phân tích điện di theo phƣơng pháp của Green CA. (1990) [1] trên gel polyacrylamide 7,5% với hệ đệm TEB pH = 8,5 với U = 150v, I = 100mA trong thời gian 3 giờ ở nhiệt độ 5 0C. Sau điện di, bản gel đƣợc thực hiện phản ứng kết tủa màu với cơ chất là ( +) naphthyl acetate, với chất nhuộm màu Fast Grarnet GBC salt và đệm nhuộm phosphat natrium pH = 6,45. Sau khi nhuộm, bản gel đƣợc rửa sạch, cố định trong dung dịch cố định và tính độ di chuyển tƣơng đối (Rf), phân tích số locus, số alen của mỗi locus Esterase và số liệu đƣợc xử lí thống kê. 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả phân tích điện di izozym Esterase của các dòng mọt R. dominica Phân tích phổ điện di Esterase của các dòng mọt có thể chia ra làm 3 vùng: Vùng 1: Gồm các băng chạy nhanh tƣơng ứng với locus est-1. Biểu hiện hình thái băng ở các dòng nhƣ sau:  Dòng Mcc có 3 loại kiểu hình: các cá thể có một băng chạy nhanh tƣơng ứng với kiểu gel Est-1 a / Est-1 a , Est -1 b / Est -1 b v à có các thể gồm cả hai băng tƣơng ứng với dạng dị hợp có kiểu gen Est-1 a / Est -1 b .  Dòng K1 và K2 chỉ có một kiểu hình với một loại băng chạy chậm tƣơng ứng với kiểu gen Est -1 b / Est -1 b . Nhƣ vậy vùng 1 do 1 locus gen Est -1 có 2 alen qui định Vùng 2: tƣơng ứng với các nhóm băng chuyển động trung bình. Vùng 3: tƣơng ứng với các nhóm băng chuyển động chậm nhất. Ở cả vùng 2 và 3 đều xuất hiện 3 kiểu hình trong đó có hai kiểu gen đồng hợp và một kiểu gen dị hợp. Do vậy Vùng 2 do một locus gen Est -2 có 2 alen Est - 2 a và Est - 2 b qui định. Vùng 3 do một locus gen Est-3 có 2 alen Est - 3a và Est - 3 b qui định. Tần số alen của các locus Esterase ở các dòng mọt đƣợc nêu ở Bảng 1. Bảng 1. Tần số alen của các locus Esterase ở các dòng mọt R. dominica Dòng mọt Alen Các locus Est - 1 Est - 2 Est - 3 Mcc a 0,13 0,72 0,46 N = 50 b 0,87 0,28 0,54 K1 a 0,00 0,51 0,76 N = 41 b 1,00 0,49 0,24 K2 a 0,00 0,50 0,83 N = 43 b 1,00 0,50 0,17 Qua bảng 1 cho thấy dòng Mcc đa hình hơn các dòng kháng K1 và K2 . Tần số alen Est - 3 a của hai dòng kháng K1 và K2 cao hơn hẳn so với dòng Mcc. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy ở nhiều loài côn trùng tần số alen Est - 3a tăng khi môi trƣờng sống của chúng chịu tác động của chất độc hoá học . Một trong những kết qủa điện di Esterase của các dòng mọt đƣợc biểu hiện ở hình 1. Để so sánh sự biểu hiện về phổ điện di ở các loài mọt khác nhau chúng tôi tiến hành phân tích đồng thời cả ba loài mọt đó là mọt gạo (Sitophilus oryzae) mọt đục hạt nhỏ (R. dominica) và mọt bột đỏ (T. castaneum). Một trong những kết quả điện di Esterase của 3 loài mọt đƣợc trình bày ở hình 2. Hình 1: Phổ điện di Esterase của 3 dòng mọt Rhyzopertha dominica Hình 2: Phổ điện di Esterase của 3 dòng mọt Rhyzopertha dominica Hai loài mọt gạo (S.oryzae) và mọt bột đỏ (T. castaneum) có các băng điện di chƣa đƣợc tách biệt rõ ràng. 3.2. Hoạt độ tổng số của 3 dòng mọt loài R. dominica Hoạt độ Esterase tổng số của 3 dòng mọt loài R.dominica đƣợc đo bằng phƣơng pháp của Peiris H và Heminway J., 1990. Kết quả thu đƣợc ở bảng 2. Bảng 2. Hoạt độ Esterase tổng số của 3 dòng mọt loài R. dominica Dòng mọt N OD Mcc 50 0,211 K1 44 0,225 K2 45 0,218 Qua bảng 2 cho thấy hoạt độ Esterase tổng số (OD) của các loài kháng cao hơn dòng mẫn cảm trong đó dòng kháng K1 là cao nhất. Nhận xét chung: Phân tích hệ izozym Esterase của các dòng mọt trong đó có hai dòng K1 và K2 chịu tác động thƣờng xuyên của phosphine cho thấy các dòng kháng này có xu hƣớng tăng dần số alen Est - 3a, tăng hoạt độ Esterase tổng số. Nhiều công trình nghiên cứƣ cho thấy khi tác động các loại chất độc hại, nhiều loài côn trùng hệ izozym Esterase có xu hƣớng biến đổi tƣơng tự (Pasteur và Singre, 1975, Maruyama, 1984; Tào Minh Tuấn, 1991; Trịnh Đình Đạt, 2004. 4. KẾT LUẬN Trên cơ sở phân tích phổ điện di và hoạt độ Esterase tổng số của các dòng mọt đục hạt nhỏ R.dominica chúng tôi có thể rút ra một số kết luận nhƣ sau: - Hệ izozym Esterase do ba loại locus qui định, dòng mẫn cảm có 6 alen xác định còn hai dòng kháng có 5 alen xác định. - Các dòng mọt chịu tác động của phosphine có tần số alen Est -3a liên qua đến tính kháng thuốc và hoạt độ Esterase tổng số cao hơn so với dòng mẫn cảm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Trịnh Đình Đạt, Ngô Thị Hoan, Đinh Nho Thái, Đinh Đoàn Long, 2004. Sự đa hình di truyền của hệ izozym Esterase của hai loài mối M. gilrus và M.carbinarius ở miền Nam Việt Nam. Tạp chí khoa học ĐHKHTN, KHTN & CN TXX Số 2 PT: 93-97. 2. Green C.A et.al, 1990. Population genetic evidence for two species in A.minimus in Thailand J.Met.Vet.Ent. 4: 25-34. 3. Maruyama Y. et.al, 1983. Eletrophoretic analysis of Esterase izozyme in organophosphate resistance moquitoes (Culex pipiens) J.Insect. Bioch. Vol. 14, N 0 2: 181-188 4. Pasteur N., Singre G., 1975. Esterase polymorphism and sensitivity to Dursban organophosphate insecticide in Culex pipiens population J.Bioch. Gen. 13: 789-803. 5. Peiris H.T.R., Hemingway J., 1990. Temefos resistance and associated cross- resistance spectrium in strain Culex quinquefasciatus, Say (Dipten: Culicidea) from pelyagod Srilanka. Bull.Ent.Res Vol. 80. N 0 1: 49-57. 6. Tào Minh Tuấn, 1991. Hiện tƣợng đa hình di truyền một số enzym ở muỗi Culex quinquefasciatus, Say (Dipten: Culicidea). Luận án PTS khoa sinh học, ĐHSPHN. 7. Hoàng Trung, 1999. Nghiên cứu thành phần côn trùng kho ở 9 tỉnh miền Bắc Việt Nam và mức độ kháng thuốc phosphine, DDVP của 3 loài gây hại chính.Luận án thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam. 8. Hoàng Trung, 2003. Đặc điểm phát triển của dòng mẫn cảm và kháng thuốc Phosphine ở loài mọt đục hạt nhỏ Rhizopertha dominica. Tạp chí bảo vệ thực vật, số 5/2003 tr 34-37. 9. Dƣơng Minh Tú, 1991. Tính chống chịu thuốc xông hơi Phosphine của mọt đục thân nhỏ (Rhyzopertha doninica Fab). Tạp chí bảo vệ thực vật, số 2 / 1991 . tr. 18 - 19. 10. Dƣơng Minh Tú và Bùi Công Hiển, 1993. Mức độ kháng thuốc xông hơi phosphine của một số loài côn trùng gây hại chủ yếu trong kho. Tạp chí bảo vệ thực vật, số 4/1993 . tr. 1 - 2.