Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng sinh khối tế bào thông đỏ

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 5 BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƢỢNG SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ (Taxus wallichiana Zucc.) Vũ Bình Dương*; Nguyễn Văn Long* TÓM TẮT Mục tiêu: xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) của sinh khối tế bào (SKTB) Thông đỏ (Taxus wallichiana). Đối tượng và phương pháp: SKTB Thông đỏ nuôi cấy trong môi trường lỏng. Tiến hành khảo sát các chỉ tiêu chất lượng chung theo Dược điển Việt Nam (DĐVN) IV, định tính và định lượng paclitaxel, baccatin III bằng HPLC. Kết quả: đã khảo sát được các chỉ tiêu chất lượng của SKTB Thông đỏ. Từ đó đưa ra các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm, bao gồm: hình thức cảm quan, độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong axít, định tính, định lượng, độ nhiễm khuẩn. Trong đó, các chỉ tiêu chất lượng quan trọng là định tính, định lượng paclitaxel và baccatin III: hàm lượng paclitaxel không được < 0,03% và baccatin III không được ít hơn 0,005%. Kết luận: đã xây dựng và thẩm định được TCCS của SKTB Thông đỏ. Với TCCS xây dựng được, có thể sử dụng trong kiểm nghiệm đánh giá chất lượng của SKTB Thông đỏ thu được từ quá trình nuôi cấy sinh khối. * Từ khóa: Thông đỏ; Sinh khối tế bào; Tiêu chuẩn chất lượng; Nuôi cấy tế bào. Initial Study of the Standardization of Cellmass of Taxus Wallichiana Summary Objective: Establishment of institutional standard of Taxus wallichiana cellmass. Subjects and methods: Taxus wallichiana cellmass which was cultured in liquid media. Evaluate general specifications as regulated by Vietnamese Pharmacopoeia IV, qualitative and quantitative determination of baccatin III by HPLC. Results: All specification of Taxus wallichiana cellmass has been evaluated for standardization. From which, we established the standard criteria of Taxus cellmass including: appearance, humidity, total ash, acid-insoluble ash, qualitative, quantitative, bacteria count. In which, the most important specifications are qualitative and quantitative criteria of paclitaxel and baccatin III: the content of paclitaxel is recommended to be not less than 0.03% and baccatin III should be not less than 0.005%. Conclusion: Institutional standard of taxus wallichiana cellmass has been established. With the selected criteria, the Taxus cellmass can be evaluated for quality control during plant cell biomass production process. * Key words: Taxus wallichiana; Cellmass; Quality control; Plant cell culture. * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương (vbduong2978@gmail.com) Ngày nhận bài: 14/11/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/12/2014 Ngày bài báo được đăng: 29/12/2014 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 6 ĐẶT VẤN ĐỀ Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) phân bố ở Cao nguyên Đà Lạt (Lâm Đồng) với số lượng cá thể nhỏ. Đây là dược liệu ghi trong sách đỏ cần lưu ý bảo vệ [2]. Từ Thông đỏ chiết xuất được paclitaxel (biệt dược taxol) sử dụng phổ biến và hiệu quả trong điều trị nhiều loại ung thư như: ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư dạ dày... Tuy nhiên, việc khai thác Thông đỏ tự nhiên để chiết xuất paclitaxel khó đáp ứng được nhu cầu điều trị ung thư (do tốc độ sinh trưởng chậm, hàm lượng hoạt chất thấp). Để khắc phục nhược điểm này, bên cạnh việc nghiên cứu nhân giống, trồng phát triển nguồn gen cây Thông đỏ, công nghệ SKTB thực vật là hướng đi mới có triển vọng trong sản xuất các hoạt chất từ dược liệu nói chung và các loài Thông đỏ nói riêng [3]. Học viện Quân y đã nghiên cứu thành công quy trình SKTB Thông đỏ ở quy mô phòng thí nghiệm để chiết xuất paclitaxel cũng như các dẫn chất sử dụng làm nguyên liệu bào chế thuốc điều trị ung thư [4]. Để có căn cứ cho việc thẩm định quy trình sản xuất sinh khối, cũng như sử dụng sản phẩm SKTB Thông đỏ cho chiết xuất paclitaxel và các hoạt chất được ổn định, cần có nghiên cứu về xây dựng tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm. Chúng tôi nghiên cứu đề tài này nhằm: Khảo sát xây dựng TCCS SKTB Thông đỏ. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Nguyên vật liệu và thiết bị. Sinh khối tế bào Thông đỏ thu hoạch từ nuôi cấy trong môi trường lỏng hildebrandt, được rửa sạch, sấy khô (lô SH 03/2011); các hóa chất, dung môi hữu cơ đạt tiêu chuẩn tinh khiết và tinh khiết phân tích; chất chuẩn paclitaxel và baccatin III (Sigma). Thiết bị chiết siêu âm gia nhiệt (Memmert GmbH + Co.KG D-91126 Schwabach FRG, Đức). Máy cất quay (Rotavapor R-200, Buchi, Đức); cân phân tích Sartorius (độ chính xác 0,1 mg); cân kỹ thuật (độ chính xác 0,01 g); máy ly tâm lạnh Universal 320 (Hettich, Đức); máy lắc siêu âm (Soniclean - Úc); sắc ký lỏng hiệu năng cao (Waters - 2695D, Mỹ) và một số trang thiết bị khác. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. Tiến hành khảo sát các chỉ tiêu chất lượng SKTB Thông đỏ theo phương pháp chung của DĐVN IV [1] quy định với dược liệu gồm: hình thức, độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong axít, độ nhiễm khuẩn. - Định tính paclitaxel và baccatin III: tiến hành định tính bằng phương pháp HPLC [5], phân tích sắc ký đồ của mẫu thử với dung dịch hỗn hợp 2 chất chuẩn và với mẫu Thông đỏ tự nhiên chuẩn. - Định lượng paclitaxel và baccatin III: bằng phương pháp HPLC đã khảo sát trước đó [5] gồm: điều kiện sắc ký: cột Luna Phenomenex C18 (5 m, 250 mm x 4,6 mm); pha động:acetonitril:nước cất (chạy theo chương trình gradient), thể tích bơm mẫu (20 µl), detector PDA (238 nm), cột Luna (5 m); tốc độ dòng: 0,7 ml/phút. Xử lý mẫu theo quy trình đã khảo sát [5]. So sánh diện tích pic của mẫu thử với paclitaxel và baccatin III chuẩn. Từ đó tính được hàm lượng paclitaxel và baccatin III trong mẫu sinh khối. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 7 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Hình thức cảm quan. Thấy SKTB Thông đỏ là những khối tế bào khô, xốp, màu nâu, không có nấm mốc, không có mùi lạ. 2. Độ ẩm. Cân chính xác 1,000 g SKTB Thông đỏ. Tiến hành theo phương pháp mô tả trong phụ lục 9.6 - DĐVN IV. Bảng 1: Kết quả xác định độ ẩm trong SKTB Thông đỏ (n = 5). g g 1 1,1124 1,0568 5,00 2 1,1920 1,1429 4,12 3 1,1154 1,0612 4,86 4 1,0256 0,9784 4,60 5 1,0325 0,9827 4,82 X ± SD 4,68 ± 0,34 Độ ẩm trong SKTB Thông đỏ là 4,68 ± 0,34%. 3. Tro toàn phần. Cân chính xác 1,500 g sinh khối, tiến hành xác định tro toàn phần theo phương pháp mô tả trong phụ lục 9.8 - DĐVN IV. Bảng 2: Kết quả xác định tro toàn phần của SKTB Thông đỏ (n = 5). (g) (g) 1 1,5235 0,0943 7,19 2 1,5795 0,0979 6,20 3 1,5987 0,1092 6,83 4 1,5654 0,1001 6,39 5 1,5901 0,0976 6,14 X ± SD 6,35 ± 0,28 Khối lượng tro toàn phần trong SKTB Thông đỏ là 6,35 ± 0,28%. 4. Tro không tan trong axít. Cân khoảng 1,500 g dược liệu, nung ở 4500C để thu được tro toàn phần. Tiếp tục thêm 25 ml dung dịch HCl 2M (TT), tiến hành theo phương pháp mô tả trong phụ lục 9.7 - DĐVN IV. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 8 Bảng 3: Kết quả xác định tro không tan trong axít của SKTB Thông đỏ (n = 5). g mg 1 1,5235 2,7 0,13 2 1,5795 2,6 0,12 3 1,5987 3,3 0,15 4 1,5654 1,8 0,09 5 1,5901 2,5 0,09 X ± SD 0,11 ± 0,02 Khối lượng tro không tan trong axít trong dược liệu SKTB Thông đỏ là 0,11 ± 0,02%. 5. Định tính paclitaxel và baccatin III. Cân khoảng 500 mg SKTB Thông đỏ và mẫu Thông đỏ tự nhiên. Tiến hành định tính paclitaxel và baccatin III theo phương pháp HPLC. 1 8 .6 2 6 3 1 .1 4 4 A U 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 Minutes 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 1 8 .6 2 9 3 1 .1 4 9A U -0.005 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 Minutes 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 1 8 .6 5 0 3 1 .1 3 1 A U 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 Minutes 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 Hình 1: Sắc ký đồ của chuẩn (a), mẫu Thông đỏ tự nhiên (b) và mẫu SKTB Thông đỏ (c). a b c TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 9 Đa số các pic xuất hiện trên mẫu Thông đỏ tự nhiên đều xuất hiện trên pic của mẫu SKTB Thông đỏ. Tại thời điểm 18,6 phút và 31,1 phút, ở sắc ký đồ mẫu SKTB xuất hiện pic giống như các pic của mẫu chuẩn baccatin III và paclitaxel. Như vậy, trong SKTB Thông đỏ có baccatin III và paclitaxel. 6. Định lƣợng paclitaxel và baccatin III. Cân chính xác 500,0 mg SKTB đã nghiền mịn cho vào ống ly tâm 50 ml, thêm 10 ml methanol, lắc xoáy với tốc độ 1.000 vòng/phút trong 5 phút. Ly tâm với tốc độ 3.000 vòng/phút trong 10 phút. Gạn lấy dịch, SKTB trong ống ly tâm được chiết như trên 3 lần nữa, mỗi lần với 10 ml methanol. Gộp các dịch ly tâm, chuyển vào bình gạn đã có sẵn 25 ml dung dịch natri clorid 5%, lắc đều. Loại tạp bằng n-hexan 2 lần, mỗi lần 10 ml, gạn bỏ dịch chiết n- hexan. Lớp nước được lắc kỹ với dicloromethan 4 lần, mỗi lần 15 ml. Gộp các dịch chiết dicloromethan, lọc qua natri sulfat khan. Sau khi lọc xong, rửa lớp natri sulfat bằng 2 - 3 ml dicloromethan. Gộp các dịch lọc và dịch rửa dicloromethan, bốc hơi dung môi ở 350C dưới dòng khí nitơ tới cắn. Hòa cắn vừa đủ trong 5 ml methanol. Lọc qua màng lọc 0,45 m, được dung dịch tiêm sắc ký. Bảng 4: Kết quả xác định hàm lượng paclitaxel và baccatin III trong SKTB Thông đỏ (n = 6). mg mg KHỐI LƯỢNG PACLITAXEL (mg) KHỐI LƯỢNG BACCA TIN III (mg) 1 524,5 4,98 0,1809 0,0363 0,0324 0,0065 2 498,6 5,04 0,1747 0,0369 0,0270 0,0057 3 516,7 4,97 0,1743 0,0355 0,0304 0,0062 4 505,2 4,45 0,1743 0,0361 0,0304 0,0063 5 501,9 4,69 0,1708 0,0357 0,0277 0,0058 6 517,4 4,87 0,1742 0,0354 0,0300 0,0061 X ± SD 0,1749 ± 0,0030 0,0360 ± 0,0006 0,0297 ± 0,0018 0,0061 ± 0,0003 Hàm lượng paclitaxel và baccatin III trong SKTB Thông đỏ lần lượt là 0,0360% và 0,0061%. 7. Độ nhiễm khuẩn. Bảng 5: Kết quả đánh giá độ nhiễm khuẩn của SKTB Thông đỏ. Y ª u c Ç u K Õ t q u ¶ K Õ t l u Ë n Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không quá 10 4 /01 g 142 ± 12 Đạt Tống số Enterobacteria không quá 500/01 g 94 ± 11 Đạt Nấm và mốc không quá 100/01 g 22 ± 2 Đạt Không được có Salmonella/10 g Không có Đạt Mẫu không có Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus./01 g Không có Đạt TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 10 Độ nhiễm khuẩn của mẫu SKTB Thông đỏ đạt mức 4 của DĐVN IV. Đây là mức công bố phù hợp cho thuốc, bán thành phẩm từ dược liệu. Từ các kết quả đánh giá trên, căn cứ vào quy định chung của DĐVN IV, chúng tôi đưa ra TCCS của SKTB Thông đỏ gồm các chỉ tiêu sau: - Nguồn gốc: là khối tế bào Thông đỏ được tạo ra bằng công nghệ SKTB thực vật từ nguồn thân non Thông đỏ tự nhiên (Taxus wallichiana Zucc.). SKTB Thông đỏ thu hoạch từ hệ thống bioreactor, lọc, rửa, sấy khô. - Hình thức: khối tế bào khô, xốp, màu nâu, không có nấm mốc, không có mùi lạ. - Độ ẩm: không quá 12%. - Tro toàn phần: không quá 8%. - Tro không tan trong axít: không quá 2%. - Định tính: phải thể hiện phép thử định tính của paclitaxel và baccatin III. - Định lượng: + Hàm lượng paclitaxel trong SKTB Thông đỏ không < 0,03%. + Hàm lượng baccatin III trong SKTB Thông đỏ không < 0,005%. - Độ nhiễm khuẩn: đạt mức IV của DĐVN IV. Bản TCCS đã được Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương thẩm định. Tiến hành kiểm nghiệm mẫu SKTB Thông đỏ theo TCCS đã đề xuất. Kết quả mẫu đều đạt các chỉ tiêu chất lượng theo bản TCCS đã công bố (phiếu kiểm nghiệm số: 42TCH/01 ngày 11 - 12 - 2011 của Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương). Như vậy, TCCS đã khảo sát được có thể sử dụng để kiểm nghiệm, đánh giá chất lượng của mẫu SKTB Thông đỏ thu được từ quá trình nuôi cấy SKTB. KẾT LUẬN Đã khảo sát các chỉ tiêu chất lượng của SKTB Thông đỏ. Từ đó đưa ra các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm, bao gồm: hình thức cảm quan, độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong axít, định tính, định lượng, độ nhiễm khuẩn. Trong đó, các chỉ tiêu chất lượng quan trọng là định tính, định lượng paclitaxel và baccatin III: hàm lượng paclitaxel không được ít hơn 0,03% và baccatin III không được < 0,005%. Với các chỉ tiêu chất lượng khảo sát được, có thể sử dụng trong kiểm nghiệm đánh giá chất lượng của SKTB Thông đỏ thu được từ quá trình nuôi cấy sinh khối. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y tế. Dược điển Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. 2009. 2. Đỗ Huy Bích và CS. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 2. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. 2009, tr.897-900. 3. Phan Đình Châu, Vũ Bình Dương. Sản xuất thuốc điều trị ung thư paclitaxel từ các loài Thông đỏ bằng công nghệ SKTB thực vật. Tạp chí Thông tin Y Dược học. 2011, số 8, 9, tr.7-10, 12- 15. 4. Vũ Bình Dương, Nguyễn Văn Long, Phạm Văn Hiển, Chử Đức Thành. Nghiên cứu nuôi cấy SKTB Thông đỏ Việt Nam trong môi trường lỏng. Tạp chí Y - Dược học Quân sự. 2011, 8, tr.7-14. 5. Vũ Bình Dương, Đào Văn Đôn, Nguyễn Văn Long, Nguyễn Thị Thiện, Phạm Thị Thanh Hà. Nghiên cứu định lượng các hoạt chất trong sinh khối Thông đỏ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Tạp chí Dược học. 2010, 9, tr.21-24.