Bước đầu tạo cây tiêu (Piper nigrum) in vitro kháng nấm Phytophthora sp

ực vật bậc cao là zeatin lấy từ mầm ngô. Việc phát hiện vai trò của IAA, NAA, 2,4D và kinetin cùng với phát hiện vai trò của các vitamin và nƣớc dừa là những bƣớc tiến rất quan trọng trong giai đoạn phát triển thứ hai cùa nuôi cấy mô thực vật, đó là tiền đề kỹ thuật cho việc xây dựng các môi trƣờng xác định về mặt hóa học và cho việc làm các thí nghiệm ổn định dẫn đến các giai đoạn tiếp theo của ngành khoa học này. Năm 1957, Skoog và Miller công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hƣởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trƣờng nuôi cấy đối với việc hình thành các cơ quan của mô sẹo thuốc lá. Khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin, mô sẹo có khuynh hƣớng phát triển rễ, ngƣợc lại nếu tỷ lệ kinetin/auxin tăng thì dẫn đến hiện tƣợng tạo chồi ở mô sẹo. Hiện tƣợng này đƣợc xác nhận trên nhiều cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào điều khiển sinh trƣởng, phát triển, phát sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy. Thành công của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn thứ ba của lịch sử nuôi cấy mô thực vật. Trong thời gian từ 1954 đến 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn, các tế bào sống độc lập không dính với các tế bào khác đã đƣợc phát triển. Muir, Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào mô sẹo thành một dịch huyền phù các tế bào đơn bằng cách đƣa lắc trên máy lắc. Nickell (1956) nuôi liên tục đƣợc một huyền phù tế bào đơn cây đậu (Phaseolus vulgaris). Melches và Beckman (1959) đã nuôi liên tục tế bào đơn trong các bình dung tích khá lớn bằng cách sục khí liên tục và thỉnh thoảng thu hoạch tế bào, thêm dung dịch dinh dƣỡng mới. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn đã phát triển cao độ với các thiết bị tinh vi phức tạp do Street và những ngƣời cộng tác đề nghị. Năm 1960 Bergman công bố có thể dùng phƣơng pháp lọc đơn giản để thu đƣợc một huyền 13 phù không có tế bào dính cụm ma gồm hầu hết là tế bào đơn. Các tế bào đơn có thể gieo trên môi trƣờng, trong các hộp lồng, tiếp tục sống, phân chia và tái tạo mô sẹo. Cùng với kỹ thuật gieo tế bào của Bergman, nhiều tác giả đã thành công trong việc tạo dựng đƣợc một cây hoàn chỉnh từ một tễ bào, chứng minh một cách tốt đẹp tính toàn thế của tế bào thực vật. Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật trong các bình lên men dùng trong công nghiệp vi sinh và khả năng tái tạo cây hoàn chỉnh từ tế bào đã mở ra những triển vọng mới trong việc tạo dòng tế bào đột biến, các dòng tế bào siêu sản xuất (over production) một sản phẩm thứ cấp nào đó và khả năng tăng tần suất đột biến trong di truyền đột biến ở thực vật bậc cao. Ngƣời ta bắt đầu chú ý đến kỹ thuật nuôi cấy túi phấn sau khi Guha và Maheswari (1966) công bố tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dƣợc (Datura inoxia). Một năm sau, nhóm Bourgin và Nitsch tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn thuốc lá. Đến nay, việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn dã thành công ở rất nhiều cây và đã đóng góp vô cùng lớn vào việc tăng thêm các kiến thức di truyền thực vật và thực tiễn tuyển chọn giống. Năm 1960, Cooking ở trƣờng đại học Nottingham công bố có thể dùng cellulase để phân hủy vỏ cellulose của vỏ tế bào thực vật, kết quả thu đƣợc các tế bào tròn, không có vỏ bọc gọi là protoplast. Ngƣời ta thật sự chú ý đến triển vọng của protoplast vào đầu những năm 1970, khi các tác giả Nagata và Takebe (Nhật) thành công trong việc làm cho các protoplast tách từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo thành một quần lạc tế bào trong môi trƣờng lỏng. Đông thời Takebe, Labib và Melchers đã sử dụng kỹ thuật gieo tế bào của Bergman vào protoplast và tạo cây hoàn chỉnh từ protoplast. Do các protoplast có khả năng dung hợp đƣợc với nhau trong các điều kiện nhất định và hấp thu các phân tử lớn hoặc thậm chí các cơ quan tử từ bên ngoài, các nhà nuôi cấy mô thực vật đặt hi vòng vào kỹ thuật protoplast để chọn giống có hiệu quả hơn. Hy vọng này đến nay đƣợc thực tế hoàn toàn xác nhận sau khi nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đã tuyên bố lai thành công giữa loài nhờ kỹ thuật protoplast, một việc không thể thực hiện đƣợc bằng lai hữu tính cổ điển. Về mặt lý luận di truyền học, protoplast là công cụ không thay thế đƣợc để nghiên cứu hiện tƣợng NST hòa hợp của các tế bào khác loài sau khi dung hợp, vai trò của DNA trong các cơ quan tử và quan hệ của chúng với DNA trong nhân bào. 14 Vấn đề biến tính của tế bào thực vật đƣợc Ledoux và cộng tác viên đề xƣớng vào năm 1965. Ông cho rằng tế bào, thậm chi hạt gống thực vật, có khả năng hấp thụ DNA ngoại lai vào trong tế bào. DNA ngoại lai có thể gắn với DNA nội bào và có hoạt động biểu hiện tính di truyền, gây nên sự biến tính ở thực vật nhƣ đã chứng minh ở vi sinh vật Các thí nghiệm của Ledoux đƣợc tranh cãi rất nhiều, đến nay hầu hết các nhà khoa học có liên quan đều xác nhận khả năng xâm nhập của DNA ngoại lai, nhất là vào protoplast thực vật, khả năng tồn tại và biểu hiện các thông tin di truyền của chúng. Vấn đề quan trọng là làm thế nào để bảo vệ DNA ngoại lai chống lại hệ phân hủy acid nucleic có trong tế bào chủ. Từ năm 1980 đến 1922 hàng loạt các thành công mới trong lĩnh vực gene thực vật và đƣợc công bố. Nhờ các plasmid, phân tử DNA vòng thƣờng có trong tế bào vi khuẩn, đƣợc lắp ghép, cấu trúc lại sao cho trong plasmid có gắn thêm một gene xác định đã thực hiện thành công, hàng loạt công trình chuyển gene ngoại lai vào nhiều họ thực vật. Chỉ trong một thời gian rất ngắn các thành công này đƣợc các công ty cây trồng siêu quốc gia khai thác triệt để. Các phƣơng pháp để đƣa gene ngoại lai vào tế bào thực vật cũng trở nên đa dạng. Ngoài phƣơng pháp chuyển gene bằng vi khuẩn Agrobacterium, các phƣơng pháp chuyển gene trực tiếp nhƣ kỹ thuật sử dụng điện (electroporation), kỹ thuật vi tiêm (microinjection), sử dụng siêu âm (ultrasonic gene transfer), sử dụng súng bắn gene (gene gun) đang đƣợc các phòng thí nghiệm trên thế giới phát triển mạnh và đạt kết quả rất chắc chắn. Khả năng ứng dụng nuôi cấy mô thực vật dễ thấy nhất là trong lĩnh vực nhân giống cây trồng và phục tráng cây trồng. Ngay từ năm 1960, Morel đã nhận thấy đỉnh sinh trƣởng của các loài địa lan (Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các protocorm. Khi chia cắt các protocorm và nuôi cấy tiếp lại thì đƣợc các protocorm mới. Khi để trong các điều kiện nhất định thì protocorm có thể phát triển thành cây lan con. Hơn nữa các tế bào ở đỉnh sinh trƣởng thực vật chứa rất ít hoặc hoàn toàn không chứa virus, do đó với phƣơng pháp nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, Morel có thể phục tráng, tạo các dòng vô tính không bị nhiễm bệnh virus. Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị với cây khoai tây, dâu tây, cây ăn quả và nhiều cây nhân giống vô tính khác. Việc ứng dụng nuôi cấy mô thực vật trong nhân giống đƣợc Nozeran nhân lên một mức mới khi ông nhận thấy sự trẻ hóa của chồi nách cây nho và cầy khoai tây 15 đem nuôi cấy nhiều lần trong ống nghiệm. Việc ứng dụng nuôi cấy mô ở quy mô lớn không còn hạn chế ở cây cảnh mà đƣợc thực hiện ở quy mô thƣơng mại đối với hàng loạt cây trồng có giá trị kinh tế cao nhƣ chuối, cà phê, cọ dầu, sắn, khoai tây, cây ăn quả có múi và đã có những đống góp to lớn cho nông nghiệp thế giới. Chúng ta đang bƣớc vào giai đoạn phát triển thứ 4 của nuôi cấy mô thực vật. Đó là gia đoạn nuôi cấy mô thực vật đƣợc ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. Các hiểu biết cơ bản về đời sống của mô và tế bào đơn độc trong môi trƣờng nhân tạo, nhu cầu chất khoáng, vitamin, chất sinh trƣởng, nguồn cacbon của chúng, các kỹ thuật cơ bản để tách, nuôi cấy, điều khiển sự phân hóa từ các bộ phận khác nhau của cây trồng là những tiền đề đƣợc chuẩn bị trong giai đoạn trƣớc. Nuôi cấy mô thực vật hiện nay đƣợc đƣa vào trong các chƣơng trình chọn giống, nhân giống hiện đại. Mặc dù còn rất nhiều vấn đề phải đi sâu nghiên cứu đẻ giải quyết trong những năm tới, nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam đã thoát ra khỏi giai đoạn phôi thai của nó và đang chuẩn bị những đóng góp tích cực vào lý luận sinh học cây trồng và vào thực tiễn nông nghiệp. 2.6 Sự hình thành và phát triển của mô sẹo 2.6.1 Sự hình thành mô sẹo Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, có hình dạng không nhất định, do không có lớp nhu mô. Mô sẹo đƣợc hình thành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao gồm tế bào nhu mô và thành phần tế bào rây (Esau, 1977). Mô sẹo hình thành ở hầu hết các bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt (Street, 1969). Điều quan trọng đƣợc nhận thấy ở đặc tính của mô sẹo là.: mô sẹo phát triển không theo quy luật nhƣng có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi và phôi để có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh. Đặc điểm sinh trƣởng của mô sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mô sẹo, thành phần môi trƣờng nuôi cấy, và điều kiện nuôi cấy. Sự hình thành mô sẹo chia ra 3 giai đoạn: phát sinh mô sẹo, phân chia tế bào và biệt hóa. (1) Trong phase phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mô đƣợc đƣa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. (2) Tế bào đi vào giai đoạn phân chia tăng sinh khối. 16 (3) Tế bào đi vào quá trình biệt hóa, xuất hiện sự biệt hóa tế bào và sự xuất hiện các con đƣờng trao đổi chất dẫn đến sự sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học (Aitchison và ctv, 1977). Mô sẹo thƣờng có màu vàng, trắng, xanh hay màu sắc tố anthocyanin. Sự biệt hóa tế bào hình thành chất liệu tạo nhu mô các loại, các tế bào rây, hơn nữa hình thành vùng mô phân sinh, trung tâm sự tạo nên chồi và rễ. Nhiều nhà khoa học cho rằng, mô sẹo đƣợc tạo ra từ những mô hay cơ quan có chứa diệp lục có khả năng quang tự dƣỡng (Street, 1969). Hildebrandt và ctv (1963) cho rằng, mô sẹo có chứa diệp lục phụ thuộc vào lƣợng đƣờng bổ sung trong môi trƣờng và cƣờng độ ánh sáng. Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng quang tự dƣỡng của những tế bào có chứa diệp lục (tế bào có màu xanh) nhƣ: cƣờng độ ánh sáng mạnh, ánh sáng màu xanh cần thiết cho sự biệt hóa diệp lục và sự hình thành các enzyme, đƣờng thấp, auxin thấp, CO2 cao và tăng hàm lƣợng phosphate (Barz và Husemanm, 1982), và những tế bào quang tự dƣỡng này có khả năng cố định 14CO2 bằng chu trình Calvin mặc dù có sự xuất hiện của các acid hữu cơ 4 cacbon (Yamada, Sato và Watanabe, 1982). Một vấn đề quan tâm trong nuôi cấy mô sẹo là sự biến tính tế bào. Sự biến tính này xảy ra do: độ già của mẫu, sự thay đổi tế bào chất của nhân, tế bào đa bội có số lƣợng DNA cao, thời gian duy trì nuôi cấy, thành phần môi trƣờng nhất là hormon (Earle và Demarly, 1982). (trích dẫn bởi Trần Văn Minh, 2003) Để tạo mô sẹo trong môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung chất sinh trƣởng, đôi khi có dịch chiết (Kordan, 1959). Phụ thuộc vào loại mô nuôi cấy mà chất sinh trƣởng thêm vào có khác nhau (Yeoman và Macleod, 1977). Chất hormon thƣờng tổ hợp thành 4 nhóm: (1) Auxin (2) Cytokinin (3) Auxin + Cytokinin (4) Dịch chiết Sau khi mô sẹo hình thành, mô sẹo đƣợc cấy chuyền. Môi trƣờng cấy chuyền cũng giống nhƣ môi trƣờng tạo mô sẹo nhƣng chất sinh trƣởng đƣợc giảm nồng độ. Kích thƣớc tách mô sẹo nhỏ vừa phải để tế bào phát triển mạnh nhất, thƣờng cụm mô sẹo có kích thƣớc 5-10mm và có trọng lƣợng là 20-100mg, thời gian giữa hai lần cấy 17 chuyền là 20-30 ngày phụ thuộc vào từng loại mô sẹo. Trong quá trình phát triển mô sẹo thƣờng xuất hiện hai loại tế bào: (1) Loại tế bào xốp, có không bào to, nhân nhỏ và tế bào chất loãng. (2) Loại tế bào chặt, có không bào nhỏ, nhân to và tế bào chất đậm đặc. Mô sẹo cấy chuyền càng nhiều lần thì khả năng tái sinh càng giảm. 2.6.2 Sự hình thành chồi từ mô sẹo Sự hình thành chồi từ mô sẹo đƣợc kích thích bởi: - Các chất sinh trƣởng đƣa vào môi trƣờng. - Chất đƣợc sản sinh ra trong nuôi cấy mô sẹo. - Các chất có chứa sẵn trong mẫu nuôi cấy. Khả năng hình thành chồi từ mô sẹo phụ thuộc vào số lần cấy chuyền mà các chất có trong mẫu không có khả năng tổng hợp trong thời gian dài và sự hình thành tế bào xốp. Sự hình thành chồi đƣợc điều khiển bằng hóa chất (Skoog, 1944). Theo Trần Thanh Vân & Trinh (1978) sự hình thành chồi đƣợc điều khiển bằng: - Tỷ lệ cytokinin / auxin từ 10-100. - Cacbohydrate nhƣ sucrose và các chất hữu cở nhƣ casein hydrolysate. - Điều kiện nuôi cấy. - Dịch chiết Tạo rễ cần auxin, khoáng, nhiệt độ, ánh sáng. Adenine sulfate có tác dụng cản trở auxin. GA3 cản trở sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột, cần thiết trong hình thành chồi. Sự hình thành chồi nhiều khi lại xảy ra trên môi trƣờng không sinh trƣởng (Walker, Wendeln và Jaworski, 1979), hay có cytokinin và không có auxin (Gresshoff, 1978). Để tạo ra rễ thƣờng dùng phlorolgucinol + IBA có hiệu quả hơn chỉ dùng auxin. (trích dẫn bởi Trần Văn Minh, 2003) 2.7 Các nhóm chất kích thích ảnh hƣởng lên quá trình tạo mô sẹo 2.7.1 Auxin Auxin đƣợc khám phá ra do các thí nghiệm thực hiện trên các phản ứng về đƣờng cong của loài Coléoptiles họ Graminées. Do có tác dụng trong hoạt động kéo dài tế bào nên có tên nhƣ vậy. Đây là một chất có nhân indole, có công thức nguyên là C10H9O2N, có tên là acid indole β acetique hoặc acid β indolylacétique. 18 2.7.1.1 Tính chất sinh lý của Auxin Auxin can thiệp vào nhiều hiện tƣợng sinh lý, hoạt động của nó phụ thuộc vào nồng độ và các sự hỗ tƣơng qua lại của chúng với các chất điều hòa khác. Các tác động của Auxin đƣợc thể hiện nhƣ sau: - Kéo dài tế bào: làm gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nƣớc vào bên trong tế bào; lúc đó sự đề kháng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra. - Sự thay đổi về tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phóng thích ion H+, ion này gây ra một hoạt tính acid có tác dụng làm giảm tính đề kháng của thành tế bào và bởi sự hấp thu ion K+. - Một hoạt động tổng quát trên sự chuyển hóa và đặc biệt là trên sự tổng hợp ARN robosomique. - Sự kích thích về sự phân chia tế bào đối với các tế bào nguồn gốc cambium. Hiệu quả này là do chất “histogène” bởi vì nó dẫn đến có nhiều tế bào giống nhau hoàn toàn, các tế bào này tạo nên một “mô sẹo”. - Hoạt động lên sự tổng hợp ethylene bắt đầu từ một vài nồng độ; chất ethylen tham gia trong giai đoạn trở về để điều chỉnh tỉ lệ chất auxin, ít nhất ở mức độ chuyên chở. - Hoạt động trong các phản ứng về tăng trƣởng và trong các sự hỗ tƣơng giữa các cơ quan với nhau, đặc biệt về tính ƣu thế của chồi non. - Có tác dụng làm giảm sự rụng lá và trái. - Có tác dụng kích thích tạo rễ. 2.7.1.2 Auxin trong cây trồng Tất cả cây trồng đều tổng hợp đƣợc chất auxin dạng tổng hợp tùy theo giai đoạn phát triển của chúng. Chất auxin sinh ra đƣợc hiện diện trong các lá rất non, trong các chồi đang hoạt động, ở mức độ phát hoa và ở trên các quả còn non. Auxin lƣu thông từ đỉnh xuống phần dƣới các cơ quan với một sự phân cực rõ ràng đƣợc thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non, nhƣng trong quá trình chuyển vận này chúng bị thoái hóa bởi sự auxin-oxydases, điều này cho thấy nồng độ auxin thì luôn cao hơn gần với những nơi tổng hợp chúng. Nhƣ vậy, auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ ở mức các điểm tăng trƣởng hoặc ở phát hoa để đảm bảo sự nhân giống và kéo dài tế bào. 19 2.7.1.3 Các chất auxin tổng hợp Ngay từ khi auxin đƣợc nhận dạng, có nhiều chất có cấu trúc gần nhau và giống nhau về mặt hóa học đã đƣợc thí nghiệm. Một vài chất trong số này đã thể hiện những đặc tính tƣơng tự nhƣ đặc tính của auxin, nhƣng thƣờng với các liều lƣợng thấp hơn, hơn nữa chúng ít bị kiểm soát bởi các enzyme, chúng có thể có một hoạt động kéo dài. Trong số những chất đƣợc sử dụng, chúng ta có thể kể ra các chất chính sau:  Acid indolylbutyrique (AIB)  Acid naphtylacetique (ANA) hoặc các chất dẫn xuất của chúng nhƣ: Acid naphtyloxyacetique (ANOA) Acid naphtylacétamide (NAD)  Acid 2,4 dichrolophen-oxyacetique (2,4-D) Trong thực tế, auxin có thể đƣợc sử dụng, nó ít độc nhƣng cũng ít hiệu quả bởi vì nó bị kiểm soát rất nhanh, chính vì vậy mà các chất tổng hợp đã thay thế chất auxin mặc dù chúng có những nguy hại về độc tính cao hơn. Trong những ứng dụng thực tiễn, các chất có cấu trúc giống auxin đƣợc sử dụng để giâm cành, chúng đƣợc tìm thấy trong các ứng dụng quan trọng nhƣ: trong nghành cây ăn quả dùng để làm trống, sáng các quả, sự đậu quả hoặc còn để làm chậm sự thu hoạch quả. Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, những chất giống đƣợc sử dụng và auxin đã chiếm một vị trí quan trọng hơn, hai tính chất của chúng đƣợc nghiên cứu thuộc lĩnh vực nhân tế bào và hiệu quả ra rễ. Ngoài ra, trong thực tiễn chúng còn đƣợc dùng để giâm cành, để làm sáng quả, sự đậu quả và làm chậm sự thu hoạch quả. 2.7.2 Cytokinine Cytokinine đƣợc khám phá do trung gian của sự nuôi cấy in vitro. Ngƣời ta đã biết sự thêm nƣớc dừa vào môi trƣờng nuôi cấy gây ra hiệu quả làm thuận lợi cho việc nhân chia tế bào và cho việc hình thành các chồi. Vào năm 1956, Skoog đã cô lập đƣợc một chất rất hoạt động mà ngƣời ta đặt tên là kinétine, do ADN biến chất. Cytokinine là các chất adenine đƣợc thay thế, chất này đƣợc ngƣời ta biết qua 2 nhóm nội sinh là:  Zeatine.  Isopentényladénine (IPA), Cytokinine tự nhiên và các chất tổng hợp. Có hai 20 loại đƣợc sử dụng nhiều nhất là: Kinetine ( 6 furfuryl-aminopurine). Benzyladenine (BAP) (6-benzyl- aminopurine). 2.7.2.1 Tính chất sinh lý của Cytokinine - Tác động hiệu quả rất rõ lên sự phân chia tế bào, trong quá trình này, chúng cần thiết nhƣng chúng không hiệu quả nếu vắng mặt auxin: Cytokinine là chất bổ sung; auxin làm thuận lợi cho sự nhân đôi của acid desoxyribonucleique (ADN) và Cytokinine cho phép làm tách rời các chromosome. - Có vai trò rất rõ trong việc tạo cơ quan thực vật, ở đây chúng sẽ kích thích mạnh mẽ sự thành lập các chồi non. Trái lại, chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ. - Hoạt động kích thích sự chuyển hóa, làm thuận lợi việc tổng hợp protein, mặt khác trong lúc bảo vệ các chất chuyển hóa chống lại tác động của enzyme li giải. - Hiệu quả đối kháng của tính ƣu thế chồi non: các chồi nách đƣợc xử lí Cytokinine sẽ tăng trƣởng và cạnh tranh với chồi tận cùng. - Cytokinine có vai trò quan trọng trong nuôi cấy in vitro, nó thể hiện các tính chất cần thiết để duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hƣớng tế bào trong con đƣờng phân hóa. 2.7.2.2 Cytokinine trong cây trồng Đƣợc tìm thấy đầu tiên vào năm 1963 trong các phôi còn non của cây ngô (là zeatine); chất thứ hai là IPA thấy ở trong cây bị nhiễm vi khuẩn Corynebacterium fascines. Chúng định vị ở lá non trong chồi và ở các đầu của rễ cây. 2.8 Một số nghiên cứu tạo cây kháng bệnh bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro Dựa trên kỹ thuật chọn dòng đột biến in vitro, Steiner, đã chọn đƣợc dòng mía chống chịu bệnh mắt én (eyes spot), bệnh này do Helmintosporium sacchari, một loại nấm sản sinh ra độc tố Helmintosporoside gây hƣ hại lá. Những cây mía tái sinh chống chịu bệnh mắt én từ dòng tế bào bố mẹ CP-57-603 qua chọn dòng chống chịu độc tố Helmintosporoside, những cây mía này đƣợc trồng ra đồng và tiếp tục chọn lựa. Tƣơng tự, Krsishamarthi đã tạo ra dòng mía Pinda 70-31 chống chịu bệnh Fiji, một loại bệnh dự đoán là do virus gây ra. Do tính chống chịu bệnh Fiji tốt nên hiện nay Pinda 70-31 đã trở thành dòng thƣơng mại quan trọng ở Fiji. Ngƣời ta còn nhận thấy Pinda 70-31 còn chống chịu bệnh phấn trắng (Downy Wildew), loại bệnh này gây ra 21 bởi nấm Sclerospora sacchari. Tiếp theo là Gengenbach và Brettel thu đƣợc những dòng tế bào và cây ngô chống chịu độc tố. Nhiều kết quả nghiên cứu chỉ cho thấy rằng ngay trên cây có khả năng kháng bệnh cũng cho thấy mô, tế bào hay protoplast cũng biểu hiện tính kháng khi nuôi cấy với độc tố. Cây phát sinh từ mô sẹo kháng độc tố đã đƣợc tái sinh thành công ở ngô, ở khoai tây ở lúa mì. Behnke (1980) ghi nhận rằng lá cây khoai tây tái sinh từ mô sẹo đƣợc chọn lọc tính kháng với dịch vô trùng (FP) Phytophthora infestans thể hiện tính kháng với FP này tốt hơn so với đối chứng. Tuy nhiên, không có sự liên hệ hoàn toàn về mặt tính kháng FP đƣợc quan sát ở cây tái sinh và cây đối chứng đƣợc xử lý bào tử nấm. Cây kháng bệnh đầu tiên đƣợc thu nhận bởi Karlson (1973) khi xử lý mô nuôi cấy với độc tố. Kế đó tái sinh cây từ những dòng tế bào cho tính kháng ổn định. Cây kháng bệnh vàng lá đƣợc tái sinh sau khi xử lý tế bào đơn bội thuốc lá với các toxin của vi khuẩn. Sau đó những kết quả tƣơng tự đƣợc ghi nhận khi sử dụng mô nhị bội nuôi cấy, với hệ thống nuôi cấy tế bào hay protoplast và mô sẹo, có hay không có chất xử lý đột biến, gần đây cây kháng bệnh đã đƣợc tái sinh ở ngô và mía qua chọn lọc in vitro. Solodkaya và ctv (1983) tái sinh cây thập tự từ dịch huyền phù tế bào đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng có chứa dịch nấm vô trùng Sclerotinia trifolium Erikss. Khromova và cộng tác viên (1983) tái sinh cây khoai tây từ mô sẹo đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng có dịch khuẩn vô trùng gây bệnh thối rễ. Tính kháng của cây còn đƣợc theo dõi cho đến ngày nay. Đã tạo ra những dòng tiêu có tính chống chịu với nấm Phytophthora ở Ấn Độ, Malaysia, Indonesia (Kasim, 1981; Kueh và Sim, 1992; Anandaraji 2000). Và dòng tiêu Natar 1 là một trong những dòng tiêu thƣơng mại có khả năng chống chịu với nấm Phytophthora đã đƣợc đƣa ra trồng ở Indonesia. 22 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian thực hiện từ tháng 2 năm 2006 đến tháng 6 năm 2006. - Địa điểm thực hiện tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 3.2 Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm 3.2.1 Phòng chuẩn bị môi trƣờng - Tủ sấy: để sấy khô các dụng cụ - Nồi hấp autolave: hấp vô trùng môi trƣờng và dụng cụ nuôi cấy - Tủ lạnh: để bảo quản hóa chất và môi trƣờng dự trữ - Bể rửa chai, ống nghiệm - Bếp điện: để nấu môi trƣờng và hấp cách thủy hóa chất - Cân phân tích: để cân đƣờng, Agar, các hóa chất - Máy khuấy từ - Máy đo pH - Chai nƣớc biển 250ml: để cấy cây và mô sẹo 3.2.2 Phòng cấy cây - Tủ cấy vô trùng - Đèn cực tím - Giá, bàn để môi trƣờng và mẫu cấy - Các dụng cụ cấy gồm: dao cấy, kéo, pince, đèn cồn, bình phun và bông gòn tất cả đã đƣợc hấp vô trùng 3.2.3 Phòng cấy nấm - Tủ cấy nấm - Đèn cực tím - Các dụng cụ cấy gồm: dao, que cấy, đèn cồn, bình phun, giấy thấm 23 3.2.4 Phòng nuôi cây - Kệ đặt chai hoặc ống nghiệm nuôi cấy (0,6x2m), trên mỗi kệ đều lắp đèn huỳnh quang dài 1,2m - Máy điều hòa nhiệt độ để đảm bảo nhiệt độ phòng nuôi cây là 25 ± 20 C - Nhiệt kế để đo nhiệt độ phòng nuôi cây - Ẩm kế để đo độ ẩm của phòng nuôi cây 3.2.5 Môi trƣờng cơ bản dùng trong thí nghiệm Môi trƣờng dùng trong thí nghiệm là MS (Murashige & Skoog), gồm các thành phần sau: Nguyên tố đa lượng NH4NO3 1650 mg/L KNO3 1900 mg/L MgSO4.7H2O 370 mg/L KH2PO4 170 mg/L CaCl2.2H2O 440 mg/L Vitamins Inositol 100 mg/L Nicotinic 0,5 mg/L Pyridoxin HCl 0,5 mg/L Thiamin HCl 0,1 mg/L Glyxin 2 mg/L Nguyên tố vi lượng H3BO3 6,2 mg/L MnSO4.4H2O 22,5 mg/L ZnSO4.7H2O 8,6 mg/L KI0,83 mg/L Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/L CuSO4.5H2O 0,025 mg/L CoCl2.6H2O 0,025 mg/L Fe EDTA FeSO4.7H2O 27,8 mg/L Na2 EDTA.2H2O 37,3 mg/L .3. Vật liệu nuôi cấy Đối tƣợng đƣợc dùng để thí nghiệm là cây tiêu Vĩnh Linh in vitro có sẵn trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Đại học Nông Lâm TP. HCM. 24 3.4. Phƣơng pháp thí nghiệm 3.4.1 Khảo sát ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora đến khả năng hình thành chồi từ mô sẹo tiêu 3.4.1.1 Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro  Tiến hành thí nghiệm Sử dụng môi trƣờng nuôi cấy tạo mô sẹo từ lá cây tiêu là môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D và 3mg/L BA. Quá trình hình thành mô sẹo sẽ xày ra trong bóng tối, và mô sẹo sẽ hình thành từ những vết vết thƣơng trong quá trình cắt mẫu lá. Sử dụng cây tiêu nuôi cấy in vitro, lấy mẫu lá cắt nhỏ thành những mẫu nhỏ (0.4 x 0.4cm). Đặt vào môi trƣờng, đặt mặt dƣới lá ở phía dƣới tiếp xúc với môi trƣờng. Mỗi chai cấy 6-7 mẫu lá nhỏ, thực hiện cấy 20 chai. Sau đó để vào trong bóng tối trong 2 tuần, khi từ những vết cắt bắt đầu xuất hiện sự hình thành mô sẹo. Sau đó lấy ra để ngoài ánh sáng nhẹ (50µmol/m2/s) 3 tuần để mô sẹo tiếp tục phát triển. Lấy mô sẹo để tiến hành thí nghiệm.  Điều kiện thí nghiệm Mẫu đƣợc nuôi trên môi trƣờng: khoáng MS + 8,5g/L Agar + 30g/L Đƣờng saccharose + 1mg/L 2,4D + 3mg/L BA. Môi trƣờng đã đƣợc khử trùng ở 1.2 atm, 121 oC trong thời gian 25 phút pH môi trƣờng: 5,8 Thể tích môi trƣờng: 30ml Cƣờng độ ánh sáng: Tối hoàn toàn trong 2 tuần đầu, 3 tuần sau đó cƣờng độ ánh sáng là 50µmol/m2/s Nhiệt độ: 25 ± 20 C Ẩm độ: 65 ± 5% Thời gian theo dõi thí nghiệm: 5 tuần 3.4.1.2 Nuôi cấy tạo dịch nấm Phytophthora  Tiến hành thí nghiệm Giống nấm Phytophthora sử dụng trong thí nghiệm là giống nấm đã đƣợc phân lập tại Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật - Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 25 Nấm Phytophthora đƣợc cấy và nuôi trong môi trƣờng PGA (môi trƣờng dinh dƣỡng cho nấm phát triển gồm: khoai tây, glucose và agar) 48 giờ. Sau đó đƣợc nuôi trong dung dịch nuôi cấy cà rốt 20%, để trong bóng tối từ 48-72 giờ. Rửa sạch và tiếp tục nuôi ngoài sáng trong nƣớc cất trong 3-4 ngày. Lọc nấm bằng vải lọc lấy dịch nuôi cấy nấm để tiến hành thí nghiệm.  Điều kiện thí nghiệm Nấm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng PGA: môi trƣờng gồm khoai tây, glucose và agar khử trùng ở 1.2 atm, 121oC trong thời gian 25 phút Thể tích môi trƣờng: 10ml Nhiệt độ: nhiệt độ phòng Ẩm độ: 65 ± 5% Thời gian theo dõi thí nghiệm: 10 ngày 3.4.2.3 Thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm thực hiện với môi trƣờng nuôi cấy là môi trƣờng MS có bổ sung thêm 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA nồng độ dịch nấm. Nồng độ dịch nấm với 4 mức độ:0%, 5%, 10%, 20% và vô trùng bằng hai cách là: hấp khử trùng ở 1,2 atm, 1210C trong 25 phút bằng autoclave và lọc vô trùng bằng màng lọc có kích thƣớc 0.45 m. Thí nghiệm gồm 7 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 15 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức gồm 1 chai, và mỗi chai gồm 2 mẫu mô sẹo. Tổng số chai: 105 Tổng số mẫu của mỗi nghiệm thức: 30 Tổng số mẫu của thí nghiệm: 210  Tiến hành thí nghiệm Ta sử dụng mô sẹo đã tạo ra ở thí nghiệm 1 để tiến hành thi nghiệm. Lấy mô sẹo cấy vào môi trƣờng đã chuẩn bị sẵn. Các thao tác chuẩn bị này đƣợc tiến hành trong điều kiện hoàn toàn vô trùng. 26 Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu Phƣơng pháp vô trùng Nghiệm thức Nồng độ dịch nấm (%) Số chai Số mẫu/chai Tổng số mẫu DC 0 15 2 30 Hấp khử trùng CC 5 15 2 30 CB 10 15 2 30 CA 20 15 2 30 Lọc vô trùng KC 5 15 2 30 KB 10 15 2 30 KA 20 15 2 30 Ghi chú: DC: đối chứng có nồng độ dịch nấm là 0%, CC: nồng độ dịch nấm 5% có hấp khử trùng, CB: nồng độ dịch nấm 10% có hấp khử trùng, CA: nồng độ dịch nấm 20% có hấp khử trùng, KC: nồng độ dịch nấm 5% lọc vô trùng, KB: nồng độ dịch nấm 10% lọc vô trùng, KA: nồng độ dịch nấm 20% lọc vô trùng.  Điều kiện thí nghiệm: Môi trƣờng: Các mẫu mô sẹo đƣợc nuôi trên môi trƣờng khoáng MS + 7,5g/L Agar + 30g/L Đƣờng saccharose + 3mg/L BA + 1mg/L TDZ với sự thay đổi về nồng độ của dịch nấm, môi trƣờng đƣợc khử trùng ở 1,2 atm, 1210C trong 25 phút pH môi trƣờng: 5,8 Thể tích môi trƣờng: 30ml / bình 250ml Cƣờng độ ánh sáng: 50µmol/m2/s Thời gian chiếu sáng: 16 giờ / ngày Nhiệt độ nuôi: 25 ± 20 C Ẩm độ: 65 ± 5% Thời gian thí nghiệm là 90 ngày  Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Số chồi hình thành ở mỗi chai. Sự thay đổi màu sắc của môi trƣờng 27 Khả năng phát triển mô sẹo ở mỗi nghiệm thức Trọng lƣợng tƣơi mô sẹo: Cân lần lƣợt các mô sẹo của từng nghiệm thức bằng cân phân tích trong điều kiện hoàn toàn vô trùng Hệ số tăng trƣởng của mô sẹo: HSTTMS = Ln(ms) – Ln(mt) / số ngày theo dõi mt: trọng lƣợng của mô sẹo khi cấy ms: trọng lƣợng của mô sẹo khi kết thúc thí nghiệm 3.4.4 Nhuộm mẫu mô sẹo tiêu và xem kết quả dƣới kính hiển vi Sau 10 tuần nuôi cấy, tiến hành cắt lát mỏng mô sẹo, nhuộm mẫu và xem kết quả dƣới kính hiển vi với nhiều vật kính khác nhau. Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu là dung dịch gồm hai thứ phẩm nhuộm: - Phẩm đỏ Carmin sẽ nhuộm màu hồng lạt hay tím lạt nếu màng tế bào bằng chất cellulose pectic. - Phẩm xanh lục vert d’iod sẽ nhuộm màu xanh lục nếu màng tế bào bằng chất gỗ (ligin) hay bần (suberin).  Quy trình nhuộm: - Cắt lát mỏng mô sẹo - Ngâm trong nƣớc Javel trong 15 phút để loại nội dung tế bào - Rửa nƣớc cho sạch Javel - Ngâm mẫu trong acid acetic trong 5 phút để loại Javel còn lại - Rửa nƣớc cho sạch acid acetic - Nhuộm bằng phẩm nhuộm hai màu trong 3 phút - Rửa nƣớc cho sạch phẩm thừa  Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm Xem và so sánh sự khác biệt (hình dạng, kích thƣớc…) giữa các mẫu của các nghiệm thức khác nhau. 3.5 Phân tích thống kê Xử lý số liệu thống kê bằng ANOVA trong phần mềm Statgraphics 7.0 28 Hình 4.1 Sự hình thành mô sẹo từ lá cây tiêu trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4D và 3mg/L BA (A) sau 2 tuần nuôi cấy trong tối; (B) tiếp tục nuôi cấy ở cường độ ánh sáng 50µmol/m2/s. PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm : Ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora đến khả nằng hình thành chồi từ mô sẹo tiêu 4.1.1 Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro Sau 2 tuần nuôi cấy trong bóng tối tại những vết cắt (ở mép lá) bắt đầu xuất hiện những vết sần, là dấu hiệu mô sẹo bắt đầu hình thành. Sau 3 tuần tiếp tục phát triển ở điều kiện chiếu sáng (cƣờng độ ánh sáng 50µmol/m2/s), mô sẹo đã phát triển ở toàn bộ mẫu lá. 4.1.2 Thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu Quá trình theo dõi thí nghiệm chúng tôi nhận thấy sự tái sinh chồi của các nghiệm thức khác so với nghiệm thức không chủng dịch nấm trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo tiêu có một số đặc điểm sau: - Khả năng bật chồi kém. - Số chồi rất ít (chỉ 1 – 2 chồi trên mỗi cụm mô). - Chồi có màu hơi tái, chồi hình thành đơn lẻ, chỉ có một đến hai chồi có khả năng phát triển. Điều này cho thấy sự khác biệt rất lớn nếu so sánh với số chồi hình thành trên nghiệm thức không chủng dịch nấm trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo. 29 Bảng 4.1 Kết quả tái sinh chồi và hệ số tăng trƣởng mô sẹo sau 90 ngày cấy Phƣơng pháp vô trùng Nghiệm thức Nông độ dịch nấm (%) Số chồi HSTTMS (g/ngày) Hệ số nhân chồi (chồi/tháng) DC 0 2,10 a 0,0173 0,68 a Hấp khử trùng CC 5 0,87 b 0,0151 0,28 b CB 10 0,33 b 0,0153 0,11 b CA 20 0,67 b 0,0141 0,22 b Lọc vô trùng KC 5 1,27 ab 0,0152 0,42 a KB 10 0,80 b 0,0154 0,26 b KA 20 0,93 b 0,0155 0,31 b Ghi chú: DC: đối chứng có nồng độ dịch nấm là 0%; CC: nồng độ dịch nấm 5% có hấp khử trùng; CB: nồng độ dịch nấm 10% có hấp khử trùng; CA: nồng độ dịch nấm 20% có hấp khử trùng; KC: nồng độ dịch nấm 5% lọc vô trùng; KB: nồng độ dịch nấm 10% lọc vô trùng; KA: nồng độ dịch nấm 20% lọc vô trùng; HSTTMS: hệ số tăng trưởng của mô sẹo Các ký tự giống nhau theo sau các chữ số trong cùng một cột thì không có sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,01< P ≤ 0,05. Kết quả của Bảng 4.1 cho thấy có một sự khác biệt có ý nghĩa về khả năng tái sinh chồi của nghiệm thức không chủng dịch nấm và nghiệm thức có chủng dịch nấm với nồng độ 10% vô trùng dịch nấm bằng màng có kích thƣớc 0,45μm so với các nghiệm thức còn lại. Trong đó, nghiệm thức không chủng dịch nấm cho kết quả tái sinh chồi cao nhất (2,1 chồi/chai). Kết quả này cho thấy rằng dịch nấm đã có những ảnh hƣởng nhất định đến khả năng bật chồi của mô sẹo, nó làm ức chế khả năng tái sinh chồi của mẫu mô. Kết quả Bảng 4.1 cho thấy là không có sự khác biệt có ý nghĩa trong quá trình tăng trƣởng mô sẹo. Tuy nhiên hệ số tăng sinh mô sẹo của nghiệm thức không chủng dịch nấm là cao nhất (0,0173g/ngày). Nó cho thấy rằng dịch nấm không có ảnh hƣởng rõ rệt tới khả năng tăng trƣởng của mô sẹo. Sau 6 tuần nuôi cấy, chúng tôi nhận thấy rằng những cụm mô sẹo của những nghiệm thức có chủng dịch nấm đã có sự biến đổi. phần mô sẹo tiếp xúc với môi trƣờng có dấu hiệu bị đen, và phần môi trƣờng nuôi cấy xung quanh cũng chuyển 30 thành màu đen hơn. Thông thƣờng hiện tƣợng đen của mô sẹo và sự thay đổi màu (bị đen) của môi trƣờng có thể là do hết chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi cấy hay là do nuôi cấy mô sẹo dƣới cƣờng độ ánh sáng cao. Ở đây cả hai nguyên nhân trên đều không phải vì thời gian nuôi cấy chỉ mới 6 tuần (sau khi nuôi cấy khoảng 10 tuần thì dinh dƣỡng trong môi trƣờng mới bắt đầu hết) và điều kiện chiếu sáng vào khoảng 50µmol/m2.s (cƣờng độ ánh sáng khá yếu). Mặt khác, ở cùng điều kiện thì ở nghiệm thức không có bổ sung dịch nấm thì hiện tƣợng mô sẹo bị đen và môi trƣờng chuyển màu không xảy ra. Có thể kết luận hiện tƣợng trên là do dịch nấm bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy đã ảnh hƣởng đến quá trình phát triển của mô sẹo. Dịch nuôi cấy nấm Phytophthora chứa các trao đổi chất của nấm Phytophthora, các hợp chất đó bao gồm các độc tố của loại nấm này đối với ký chủ của loại nấm này. Nhƣ ta biết mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, các tế bào mô sẹo phân chia liên tục, đặc biệt ở các tế bào còn non hiện tƣợng phân chia tế bào rất mạnh mẽ. Trong quá trình phân chia tế bào sẽ làm cho cấu trúc tế bào kém ổn định. Rất có thể độc tố nấm có trong dịch nấm đã tác động và làm ảnh hƣởng tới quá trình phân bào của mô sẹo. Có thể các tế bào tiếp xúc với môi trƣờng bị đen (các tế bào chết) là do các tế bào này đã tiếp xúc và chịu ảnh hƣởng trực tiếp từ dịch nấm. Vậy thì có hay không có các phản ứng của tế bào mô sẹo đối với độc tố của nấm? Các tế bào mô sẹo sẽ có các phản ứng để chống lại với sự ảnh hƣởng của độc tố nấm. Tế bào sẽ sản sinh ra những chất để chống lại độc tố của nấm. Cơ chế phòng vệ của tế bào mô sẹo có thể là do 2 cơ chế: (1) các chất chống lại tác động của độc tố nấm là do các phản ứng sinh hóa phòng vệ của tế bào để chống chịu lại với các điều kiện bất lợi; (2) các chất chống lại tác động của độc tố nấm đƣợc sinh ra là do sự điều khiển của một gene nào đó. Sự tác động của độc tố nấm lên quá trình phân chia tế bào có thể tạo ra một đột biến giúp tế bào có khả năng chống chịu với độc tố nấm. Kết quả thu đƣợc qua thí nghiệm cho thấy rằng với phƣơng pháp vô trùng bằng cách sử dụng đầu lọc kích thƣớc 0,45µm cho kết quả tái sinh chồi cao hơn so với phƣơng pháp hấp khử trùng ở 121oC trong 25 phút. Có thể ở nhiệt độ cao dịch nấm có thể bị phân hủy tạo thành những chất ức chế sự tái sinh chồi từ mô sẹo, hay nhiệt độ đã làm giảm tính độc của độc tố nấm. 31 Hình 4.2: Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D và 3mg/L BA sau 90 ngày nuôi cấy. Hình 4.3 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 5% dịch nấm, hấp khử trùng sau 90 ngày nuôi cấy. 32 Hình 4.5 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 20% dịch nấm, hấp khử trùng sau 90 ngày nuôi cấy. Hình 4.4 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 10% dịch nấm, hấp khử trùng sau 90 ngày nuôi cấy. 33 Hình 4.6 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 5% dịch nấm, lọc vô trùng sau 90 ngày nuôi cấy. Hình 4.7 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 10% dịch nấm, lọc vô trùng sau 90 ngày nuôi cấy. 34 4.3 Nhuộm mẫu mô sẹo tiêu sau 10 tuần nuôi cấy Sau 10 tuần nuôi cấy, tiến hành cắt mẫu nhuộm phần mô sẹo trên (phần nằm trên môi trƣờng có màu xanh, trắng hay vàng xám) và phần mô sẹo dƣới (phần tiếp xúc với môi trƣờng). Kết quả nhuộm mẫu cho thấy: Phần mô sẹo nằm trên môi trƣờng của tất cả các nghiệm thức đều cho kết quả nhuộm mẫu giống nhau. Các tế bào xếp sát nhau, hƣớng tâm (hƣớng về phần lõi trong của mẫu mô). Phần mô sẹo nằm dƣới môi trƣờng của nghiệm thức không chủng dịch nấm trong môi trƣờng nuôi cấy có kết quả nhuộm mẫu giống với phần mô sẹo nằm trên môi trƣờng. Kết quả nhuộm mẫu của phần dƣới của các nghiệm thức có chủng dịch nấm cho kết quả khác biệt so với kết quả nhuộm mẫu của nghiệm thức không chủng dịch nấm. Các tế bào sắp xếp thƣa hơn, và kích thƣớc tế bào cũng lớn hơn so với các tế bào phần trên và phần dƣới mô sẹo của nghiệm thức không chủng dịch nấm. Hình 4.8 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 20% dịch nấm, lọc vô trùng sau 90 ngày nuôi cấy. 35 Hình 4.10 Mặt cắt mặt dƣới mô sẹo cây tiêu nuôi cấy trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L2,4D, 3mg/L BA và 10% dịch nấm sau 10 tuần (độ phóng đại 4x10). Hình 4.9 Mặt cắt mặt dƣới mô sẹo cây tiêu nuôi cấy trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L2,4D, 3mg/L BA sau 10 tuần (độ phóng đại 4x10). 36 Chúng tôi cho rằng: Phần trên của mô sẹo (phần thƣờng có màu xanh, trắng hay vàng xám) là phần non, nơi các tế bào mô sẹo phân chia, tăng sinh, là nơi có nhiều tế bào mới sinh và chƣa bị ảnh hƣởng nhiều bởi dịch nấm nên khi nhuộm ta không thấy sự khác biệt. Phần dƣới mô sẹo của các nghiệm thức có chủng dịch nấm có màu đen, đây là nơi tập trung các tế bào chết, các tế bào già và xốp hơn so với phần trên mô sẹo, nên kết quả nhuộm mẫu cho thấy các tế bào ở phần này sắp xếp thƣa hơn và có kích thƣớc lớn hơn. Đối với phần dƣới mô sẹo của nghiệm thức không chủng dịch nấm tuy tiếp xúc với môi trƣờng nhƣng không bị đen nên có rất ít các tế bào chết và ở đây cũng là nơi xảy ra sự phân chia tế bào nên các tế bào ở đây còn non và sắp xếp đặc. Vì thế, kết quả nhuộm mẫu cũng không cho sự khác biệt nào so với phần trên của mô sẹo. 37 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã tạo ra đƣợc những dòng tiêu để sử dụng cho việc chon lọc các dòng tiêu có tính kháng với nấm Phytophthora. Dịch nấm bổ sung trong môi trƣờng nuôi cấy đã có những ảnh hƣởng nhất định khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo. Thành phần bổ sung này đã ức chế đến khả năng tái sinh chồi của mô sẹo, làm cho mô sẹo bật chồi đơn lẻ (chỉ 1-2 chồi trên mỗi cụm mô). Phƣơng pháp vô trùng dịch nấm bằng cách sử dụng màng lọc (0.45μm) cho khả năng tái sinh chồi cao hơn so với phƣơng pháp vô trùng dịch nấm bằng cách hấp khử trùng (1,2 atm, 1210C trong 25 phút). Dịch nấm bổ sung trong môi trƣờng nuôi cấy đã có ảnh hƣởng đến sự phát triển của mô sẹo. Phần mô tiếp xúc với môi trƣờng đã bị đen, có nhiều tế bào chết xuất hiện. 5.2 Kiến nghị Cần gia tăng số lƣợng cây của các dòng tiêu vừa tạo đƣợc, đƣa cây ra trồng ngoài vƣờn ƣơm và thực hiện chon lọc các cá thể có tính kháng. Cần tiếp tục thực hiện thêm các thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora với nhiều nồng độ hơn nữa để gia tăng khả năng tạo đƣợc dòng đột biến có tính kháng cao. Cần có thêm nhiều phƣơng pháp đánh giá khả năng phát triển, phản ứng của mô sẹo đối với dịch nấm. Nếu chỉ nhuộm mẫu thì không thể đƣa ra những kết luận chính xác về khả năng kích kháng của mô sẹo, và những phản ứng của mô sẹo trong quá trình nuôi cấy với dịch nấm. 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Bùi Chí Bửu, 2002. Cơ sở di truyền tính kháng sâu bệnh hại cây trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 272 trang. 2. Dƣơng Công Kiên, 2002. Nuôi cấy mô thực vật, tập 1. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia, TP. Hồ Chí Minh. 199 trang. 3. Nguyễn Hữu Định, 2005. Nghiên cứu nhân giống vô tính cây tiêu (Piper nigrum) bằng phương pháp nuôi cấy mô. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 4. Trần Văn Hòa, 2000. Sâu bệnh hại cây trồng, cách phòng trị. Nhà xuất bản Trẻ. 5. Trần Văn Minh, 2003. Công nghệ sinh vật học thực vật. Giáo trình cao học- nghiên cứu sinh, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 6. Võ Thị Thu Oanh, 1999. Bệnh cây chuyên khoa. Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tài liệu tiếng nƣớc ngoài 7. Anandaraj, M. 2000. Diseases of black pepper. In Ravindran, P.N. (Ed), Black pepper Piper nigrum. Harwood Academic Publisher. 8. Kasim, R. 1981. Ketahanan tujuh species lada terhadap Phytophthora. Pembr. Littri vol VIII (39), 34-38. (with English summary). 9. Kueh. K. T and S.S Liang. 1992. Occurrence and Management of wrinkled-leaf disease of black pepper. Proe The International Workshop of black pepper Disease. Bandarlampung, Indonesia: 227 – 232. 39 PHỤ LỤC 1 Kết quả tái sinh của mỗi nghiệm thức sau 90 ngày cấy Số lần lặp lại Số chồi hình thành của mỗi nghiệm thức DC CC CB CA KC KB KA 1 0 0 1 0 2 2 0 2 2 1 0 0 1 0 1 3 0 0 0 0 3 0 2 4 3 4 0 0 4 0 0 5 0 3 0 2 1 2 1 6 3 0 1 2 0 2 2 7 0 0 1 3 1 1 1 8 4 0 0 0 0 1 2 9 0 1 0 0 0 0 0 10 5 1 0 0 0 1 0 11 2 1 0 1 0 0 0 12 7 0 1 1 4 0 2 13 0 0 0 0 2 2 0 14 0 0 1 1 0 0 0 15 5 2 0 0 1 1 3 Tổng 31 13 5 10 19 12 14 Ghi chú: DC: đối chứng có nồng độ dịch nấm là 0%, CC: nồng độ dịch nấm 5% có hấp khử trùng, CB: nồng độ dịch nấm 10% có hấp khử trùng, CA: nồng độ dịch nấm 20% có hấp khử trùng, KC: nồng độ dịch nấm 5% lọc vô trùng, KB: nồng độ dịch nấm 10% lọc vô trùng, KA: nồng độ dịch nấm 20% lọc vô trùng. 40 PHỤ LỤC 2 One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: THANG.so_choi Level codes: THANG.nghiem_thuc Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 27.39048 6 4.5650794 2.638 .0205 Within groups 169.60000 98 1.7306122 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 196.99048 104 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for THANG.so_choi by THANG.nghiem_thuc -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 15 2.0666667 .6052679 .3396677 1.5899277 2.5434056 2 15 .8666667 .3217018 .3396677 .3899277 1.3434056 3 15 .3333333 .1259882 .3396677 -.1434056 .8100723 4 15 .6666667 .2519763 .3396677 .1899277 1.1434056 5 15 1.2666667 .3711843 .3396677 .7899277 1.7434056 6 15 .8000000 .2225395 .3396677 .3232611 1.2767389 7 15 .9333333 .2666667 .3396677 .4565944 1.4100723 -------------------------------------------------------------------------------- Total 105 .9904762 .1283823 .1283823 .8102858 1.1706666 Multiple range analysis for THANG.so_choi by THANG.nghiem_thuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 3 15 .3333333 X 4 15 .6666667 X 6 15 .8000000 X 2 15 .8666667 X 7 15 .9333333 X 5 15 1.2666667 XX 1 15 2.0666667 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 1.20000 0.95348 * 1 - 3 1.73333 0.95348 * 1 - 4 1.40000 0.95348 * 1 - 5 0.80000 0.95348 1 - 6 1.26667 0.95348 * 1 - 7 1.13333 0.95348 * 2 - 3 0.53333 0.95348 2 - 4 0.20000 0.95348 2 - 5 -0.40000 0.95348 2 - 6 0.06667 0.95348 2 - 7 -0.06667 0.95348 41 3 - 4 -0.33333 0.95348 3 - 5 -0.93333 0.95348 3 - 6 -0.46667 0.95348 3 - 7 -0.60000 0.95348 4 - 5 -0.60000 0.95348 4 - 6 -0.13333 0.95348 4 - 7 -0.26667 0.95348 5 - 6 0.46667 0.95348 5 - 7 0.33333 0.95348 6 - 7 -0.13333 0.95348 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: DT.hstsc Level codes: DT.nghiem_thuc Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 2.467550 6 .4112583 2.284 .0423 Within groups 16.564998 92 .1800543 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 19.032548 98 6 missing value(s) have been excluded. Table of means for DT.hstsc by DT.nghiem_thuc -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 13 .6410256 .2310065 .1176874 .4757112 .8063401 2 14 .2380952 .1014460 .1134065 .0787943 .3973962 3 15 .1111111 .0419961 .1095610 -.0427882 .2650105 4 14 .1666667 .0676665 .1134065 .0073657 .3259676 5 14 .3809524 .1252940 .1134065 .2216514 .5402533 6 15 .2666667 .0741798 .1095610 .1127673 .4205660 7 14 .2619048 .0795176 .1134065 .1026038 .4212057 -------------------------------------------------------------------------------- Total 99 .2895623 .0426466 .0426466 .2296571 .3494675 Multiple range analysis for DT.hstsc by DT.nghiem_thuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 3 15 .1111111 X 4 14 .1666667 X 2 14 .2380952 X 7 14 .2619048 X 6 15 .2666667 X 5 14 .3809524 XX 1 13 .6410256 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 0.40293 0.32467 * 42 1 - 3 0.52991 0.31942 * 1 - 4 0.47436 0.32467 * 1 - 5 0.26007 0.32467 1 - 6 0.37436 0.31942 * 1 - 7 0.37912 0.32467 * 2 - 3 0.12698 0.31325 2 - 4 0.07143 0.31860 2 - 5 -0.14286 0.31860 2 - 6 -0.02857 0.31325 2 - 7 -0.02381 0.31860 3 - 4 -0.05556 0.31325 3 - 5 -0.26984 0.31325 3 - 6 -0.15556 0.30780 3 - 7 -0.15079 0.31325 4 - 5 -0.21429 0.31860 4 - 6 -0.10000 0.31325 4 - 7 -0.09524 0.31860 5 - 6 0.11429 0.31325 5 - 7 0.11905 0.31860 6 - 7 0.00476 0.31325 ----------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: HSTTMS.hsttms Level codes: HSTTMS.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 2.18571E-005 6 3.64286E-006 .260 .9494 Within groups 2.94250E-004 21 1.40119E-005 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 3.16107E-004 27 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for HSTTMS.hsttms by HSTTMS.nt -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 4 .0167500 .0014930 .0018716 .0139971 .0195029 2 4 .0145000 .0018484 .0018716 .0117471 .0172529 3 4 .0150000 .0029439 .0018716 .0122471 .0177529 4 4 .0137500 .0014930 .0018716 .0109971 .0165029 5 4 .0150000 .0013540 .0018716 .0122471 .0177529 6 4 .0155000 .0015546 .0018716 .0127471 .0182529 7 4 .0157500 .0019311 .0018716 .0129971 .0185029 -------------------------------------------------------------------------------- Total 28 .0151786 .0007074 .0007074 .0141381 .0162191 43 Multiple range analysis for HSTTMS.hsttms by HSTTMS.nt -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 4 .0137500 X 2 4 .0145000 X 3 4 .0150000 X 5 4 .0150000 X 6 4 .0155000 X 7 4 .0157500 X 1 4 .0167500 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 0.00225 0.00551 1 - 3 0.00175 0.00551 1 - 4 0.00300 0.00551 1 - 5 0.00175 0.00551 1 - 6 0.00125 0.00551 1 - 7 0.00100 0.00551 2 - 3 -0.00050 0.00551 2 - 4 0.00075 0.00551 2 - 5 -0.00050 0.00551 2 - 6 -0.00100 0.00551 2 - 7 -0.00125 0.00551 3 - 4 0.00125 0.00551 3 - 5 0.00000 0.00551 3 - 6 -0.00050 0.00551 3 - 7 -0.00075 0.00551 4 - 5 -0.00125 0.00551 4 - 6 -0.00175 0.00551 4 - 7 -0.00200 0.00551 5 - 6 -0.00050 0.00551 5 - 7 -0.00075 0.00551 6 - 7 -0.00025 0.00551 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.