Các hợp chất methoxyflavonoid và coixol được phân lập từ cây cam thảo đất (Scoparia dulcis Linn) - Tôn Nữ Liên Hương

Tạp chí Hóa học, 54(5): 586-590, 2016 DOI: 10.15625/0866-7144.2016-00369 586 Các hợp chất methoxyflavonoid và coixol được phân lập từ cây cam thảo đất (Scoparia dulcis Linn) Tôn Nữ Liên Hương1*, Bùi Minh Phúc1, Huỳnh Diễm Tú1, Lê Thị Thùy Trang1 Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ Đến Tòa soạn 25-5-2016; Chấp nhận đăng 25-10-2016 Abstract Chemical constituents of Scoparia dulcis Linn growing in An Giang province were investigated. The result showed that four compounds, including 5,6,7,8,3',4'-hexamethoxyflavone (1), 5,7,8,4'-tetramethoxyflavone (2), 5,7-dihydroxy- 6,8,3',4'-tetramethoxyflavone (3) and coixol (4) were isolated from the dichloromethane extract. In which, two methoxyl flavonoid (1) and (2) were firstly isolated from this material. These structures were elucidated by modern spectroscopic methods as ESI-MS, 1D- and 2D-NMR and by comparison to the published data. The study has been continued. Keywords. Scoparia dulcis Linn, 5,6,7,8,3',4'-hexamethoxyflavone, 5,7,8,4′-tetramethoxyflavone, 5,7-dihydroxy- 6,8,3',4'-tetramethoxyflavone, coixol. 1. GIỚI THIỆU Cam thảo đất có tên khoa học là Scoparia dulcis Linn thuộc họ Scrophulariaceae. Tùy theo từng vùng mà Cam thảo đất có tên gọi khác nhau: Dã cam thảo, Cam thảo nam hay Thổ cam thảo [2]. Cam thảo đất là loại thực vật thân thảo, mọc thành bụi cao khoảng 1 m. Lá mọc đối, thƣờng mọc thành vòng xoắn, dài khoảng 3 cm, rộng 1,5 cm hình mũi mác hay bầu dục, mép có răng cƣa thƣa ở nữa cuối, gân lá hình lông chim. Thân cao 30-80 cm. Hoa lƣỡng tính cánh hoa màu trắng, cuống hoa mảnh, cuống dài 0,8-1,5 cm. Đài hoa hình bầu dục, có thùy 4, thùy trên đỉnh tù, hơi cong và lớn hơn các thùy khác. Quả nang nhỏ, hình cầu màu nâu đen chứa nhiều hạt nhỏ [5]. Với thuận lợi vừa có sẵn trong tự nhiên, vừa không tốn kém, cam thảo đất từ lâu đã đƣợc sử dụng nhƣ một loại thảo dƣợc với nhiều tác dụng: thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, kháng khuẩn, kháng nấm, hạ sốt, và là một thành phần dẫn truyền không thể thiếu trong các bài thuốc nam. Ở nƣớc ta, việc khảo sát hóa học trên cam thảo đất còn hạn chế, ngoài các nghiên cứu của nhóm tác giả Phan Minh Giang [4]. Chúng tôi đã nghiên cứu và cô lập đƣợc nhiều hợp chất từ nguyên liệu thu tại An Giang và báo cáo trong bài này về bốn hợp chất gồm coixol và ba hợp chất metoxyflavon từ cao diclorometan của cây. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu Mẫu nguyên liệu dùng nghiên cứu là toàn bộ cây Cam thảo đất (rễ, hoa, thân, lá, quả...) đƣợc thu hái ở tỉnh An Giang. 2.2. Phương tiện Dung môi đƣợc sử dụng bao gồm: metanol (MeOH), diclorometan (CH2Cl2), cloroform (CHCl3), n-hexan (Hex), ete dầu hỏa (PE), etyl axetat (EA), axeton (Me2CO) (Chemsol), Việt Nam. Silica gel 60 và 60G (Merck) dùng trong sắc ký cột. Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck) để tiến hành sắc ký lớp mỏng. Phổ khối lƣợng (EST-MS) ghi trên máy Aligent Technologies và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) đƣợc ghi trên máy Bruker AM500-FT-NMR của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.3 Chiết xuất và cô lập Mẫu nguyên liệu sau khi thu hoạch đƣợc rửa sạch, loại bỏ tạp, hong khô, sau đó xay nhuyễn thành bột (8 kg). Bột đƣợc tận trích với MeOH bằng phƣơng pháp ngâm dầm, lọc bỏ bã, phần dịch chiết TCHH, 54(5) 2016 Tôn Nữ Liên Hương và cộng sự 587 đƣợc cô quay và thu hồi dung môi dƣới áp suất thấp. Thực hiện nhiều lần thu đƣợc cao MeOH dạng sệt (1 kg). Cao MeOH hòa tan trong lƣợng nƣớc vừa đủ, sau đó đƣợc chiết lỏng-lỏng lần lƣợt với các dung môi theo thứ tự tăng dần độ phân cực và cô quay thu đƣợc các cao ete dầu hỏa (PE), diclorometan (DC, 80 g), etyl axetat (EA). Với 40g cao DC tiến hành sắc ký nhanh-cột khô với hệ dung môi CHCl3:MeOH tăng dần độ phân cực, thu đƣợc năm phân đoạn P1-P5. Tiếp tục sắc ký nhanh cột khô với phân đoạn P1 với hệ dung môi Hex:EA với độ phân cực tăng dần thu đƣợc năm phân đoạn PP1-PP5, ngoài ra thu đƣợc kết tinh hình kim, sau khi kết tinh lại trong MeOH nóng thu đƣợc hợp chất CTD-04 (3000 mg). Sắc ký nhiều lần trên phân đoạn PP1 (8,13 g) thu đƣợc 2 hợp chất dạng bột mịn, màu trắng ngà ký hiệu CTD-01 (25 mg) và màu vàng ký hiệu CTD-03 (12 mg). Sắc ký nhiều lần trên phân đoạn PP3 thu đƣợc hợp chất bột mịn, màu trắng, ký hiệu CTD-02 (15 mg). O O O O O O O O 1 4 1' 3' 4' (1) 5 O O O O O O 7 5 8 4' (2) O O O HO O O O 1 4 1' 3' 4' (3) 5 OH 26 N H O O O (4) 8 9 Số liệu phổ NMR của các hợp chất lần lƣợt đƣợc ghi trong các bảng 1, 2 và 3. Bảng 1: So sánh phổ NMR của CTD-01 với hợp chất nobiletin [1] δ (ppm) Vị trí CTD-01 Nobiletin 1 H-NMR (J, Hz) 13 C-NMR 1 H-NMR (J, Hz) 13 C-NMR 2 - 161,1 - 161,0 3 6,62 (1H, s) 106,9 6,62 (1H, s) 106,7 4 - 177,3 - 177,4 5 - 148,4 - 144,0 6 - 144,1 - 138,0 7 - 151,4 - 151,4 8 - 138,0 - 138,0 9 - 147,7 - 147,7 10 - 114,9 - 114,8 1 ’ - 124,0 - 124,0 2 ’ 7,42 (1H, d, J = 2) 108,6 7,41 (1H, d, J = 2,1) 108,7 3 ’ - 149,3 - 149,3 4 ’ - 152,0 - 151,9 5 ’ 7,0 (1H, d, J = 8,5) 111,3 6,99 (1H, d, J = 9,0) 111,0 6 ’ 7,57 (1H, dd, J = 2; 8,5) 119,6 7,57 (1H, dd, J = 2,1; 9,0) 119,6 3 ’ -OCH3 3,98 (3H, s) 56,1 3,98 (3H, s) 56,1 4 ’ -OCH3 3,97 (3H, s) 56,0 3,97 (3H, s) 56,0 5-OCH3 3,96 (6H, s) 61,8 3,96 (6H, s) 62,3 6-OCH3 62,3 62,0 7-OCH3 4,11 (3H, s) 61,7 4,11 (3H, s) 61,8 8-OCH3 4,03 (3H, s) 61,9 4,03 (3H, s) 61,7 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Cấu trúc của CTD-01 Hợp chất CTD-01 có dạng bột, màu trắng ngà (25 mg). Từ phổ ESI-MS cho pic ion giả phân tử m/z = 403,1 [M+H] + phù hợp với công thức phân tử C21H22O8 (khối lƣợng phân tử là 402 amu). Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): có 22 proton. Trong vùng từ trƣờng thấp, δ (ppm) 6,60-8,00 có 4H gồm một proton của liên kết đôi -HC=C< ở δH = 6,62 (1H, s, H-3) và 3 proton thuộc vòng thơm có 3 nhóm thế khác, trong đó có 1H ở δH = 7,57 (1H, dd, J = 2; 8,5, H-2') có tƣơng quan ghép cặp vị trí meta TCHH, 54(5) 2016 Các hợp chất methoxyflavonoid và coixol 588 và para với 2H còn lại (Jmeta = 2 Hz, Jpara = 8,5 Hz). Ở vùng từ trƣờng cao từ 3,90-4,20 ppm có các tín hiệu đặc trƣng của 18H trong 6 nhóm metoxy (–OCH3). Phổ 13C- và DEPT-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): cho thấy có 21 tín hiệu cacbon. Một tín hiệu cacbon tứ cấp của cacbonyl (>C=O) ở δ = 177,3 ppm ứng với C-4. Trong vùng δC: 114,0-162,0 có 10C tứ cấp bao gồm 4C tứ cấp đặc trƣng của khung flavon là C-2, C-9, C-10, C-1' và 6C tứ cấp của nhân thơm (C-5, C-6, C-7, C-8, C-3', C-4') có mang nhóm thế. Trong vùng δC: 106,0-120,0 có bốn tín hiệu của cacbon bậc ba, trong đó một cacbon của nối đôi –HC=C< ở δ = 106,9 ppm (C-3) và 3 cacbon thuộc vòng thơm gồm C-2', C-5', C-6'. Ở vùng từ trƣờng cao δC: 56,0-63,0 có 6 tín hiệu của cacbon bậc nhất ứng với 6 nhóm metoxy. Từ các dữ liệu phổ đã nêu, CTD-01 đƣợc đề nghị là hợp chất 5,6,7,8,3',4'-hexamethoxy flavone (thƣờng gọi là nobiletin). Các số liệu phổ của hợp chất này hoàn toàn khớp với tài liệu tham khảo của Jie Chen và cộng sự (1997) [1]. 3.2. Cấu trúc CTD-02 Hợp chất CTD-02 dạng bột mịn, màu trắng (15 mg). Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) có 18 proton. Trong vùng từ trƣờng thấp có 6H bao gồm: 1 proton của liên kết đôi -HC=C< ở δH 6,6 ppm (1H, s, H-3), 1 proton của nhân thơm (vòng A) với δH 6,44 ppm (1H, s, H-6); ngoài ra khác với hợp chất (1) đã phân tích trên, có 2 tín hiệu mũi đôi với cƣờng độ tích phân là 2, tƣơng ứng với 4 proton thuộc vòng thơm có 2 nhóm thế đối xứng khác (vòng B), tại δH 7,02 ppm là (d, J = 9,0 Hz, H-3', H-5' ) và δH 7,89 ppm (d, J = 9,0 Hz, H-2',H-6'). Ở vùng 3,8-4,0 ppm chỉ có các tín hiệu đặc trƣng của 12H trong 4 nhóm –OCH3. Phổ 13C- và DEPT-NMR (500 MHz, CDCl3) cho thấy có 19 tín hiệu cacbon. Một tín hiệu cacbon tứ cấp đặc trƣng của cacbonyl (>C=O) ở δC 177,9 ppm ứng với C-4. Trong vùng δ (ppm) 109,1-162,2 có 8C tứ cấp gồm 4C đặc trƣng của khung flavon là C-1', C-2, C-9, C-10 và 4C tứ cấp của nhân thơm (C-4', C-5, C-7, C-8) mang 4 nhóm metoxy. Vùng δC (ppm) 107-127,7 có năm tín hiệu cacbon bậc ba, trong đó một cacbon của nối đôi –C=C< ở δ = 106,9 ppm (C-3) và 4 cacbon metin trên vòng thơm gồm hai cặp cacbon tƣơng đƣơng là C-2', C-6' (δ = 127,7 ppm) và C-3', C-5' (δ = 114,4 ppm); còn một tín hiệu cacbon metin trên vòng thơm khác tại δC 92,6 ppm, ứng với.C-6. Ở vùng từ trƣờng cao hơn có tín hiệu của cacbon bậc nhất của 4 nhóm –OCH3. Dựa vào các dữ liệu phổ, hợp chất CTD-02 đƣợc đề nghị là hợp chất 5,7,8,4'-tetramethoxyflavone (còn có tên khác là tetra-O-methylisoscutellarein). Các số liệu phổ của chất này hoàn toàn khớp với tài liệu tham khảo của Jie Chen và cộng sự (1997). Bảng 2: So sánh phổ NMR của CTD-02 với hợp chất 5,7,8,4'-tetramethoxyflavone [1] δ (ppm) Vị trí CTD-02 5,7,8,4'-tetramethoxyflavone 1 H-NMR (J, Hz) 13 C-NMR 1 H-NMR (J, Hz) 13 C-NMR 2 - 162,2 - 162,3 3 6,60 (1H, s) 107,0 6,60 (1H, s) 106,9 4 - 177,9 - 177,9 5 - 152,0 - 152,0 6 6,44 (1H, s) 92,6 6,44 (1H, s) 92,6 7 - 156,4 - 156,3 8 - 130,8 - 130,8 9 - 156,3 - 156,3 10 - 109,1 - 109,1 1 ’ - 123,9 - 123,8 2 ’ và 6’ 7,90 (1H, d, J = 9,0) 127,9 7,90 (2H, d, J = 9,0) 127,7 3 ’ và 5’ 7,02 (1H, d, J = 9,0) 114,4 7,02 (2H, d, J = 9,0) 114,5 4 ’ - 160,7 - 160,7 4,01 (3H, s) 55,5 4,10 55,0 3,98 (3H, s) 56,6 3,99 56,6 3,88 (3H, s) 56,3 3,89 56,2 3,96 (3H, s) 61,6 3,96 61,5 TCHH, 54(5) 2016 Tôn Nữ Liên Hương và cộng sự 589 3.3. Cấu trúc của CTD-03 Phổ 1H-NMR (CDCl3, δH ppm): Trong vùng từ trƣờng thấp xuất hiện 1 tín hiệu proton của nhóm –OH kiềm nối H 12,73 (s, 1H, 5-OH), có 4 tín hiệu proton H 7,57-7,91 (1H, dd, J1 = 8,5; J2 = 2,2 Hz; H- 6'); H 7,41 (1H, d, J = 2,2 Hz; H-2'); H 7,01 (1H, d, J = 8,5 Hz; H-5') và H 6,59 (1H, s, H-3); và còn có tín hiệu đơn của OH ở vị trí 7 tại H 6,48 (s). Ngoài ra, ở vùng từ trƣờng cao hơn, tại H (3,97–4,04) có 4 tín hiệu proton đặc trƣng của 4 nhóm metoxy. Phổ 13C- kết hợp với phổ DEPT-NMR (CDCl3) có tín hiệu 19 cacbon của khung flavon ( C 103,9- 182,9) và 4 nhóm metoxy ( C 56,0-61,7) tƣơng thích với phổ proton đã phân tích. Khung flavon gồm 1 cacbon cacbonyl C 182,9 (C-4); 10 cacbon tứ cấp khác tại C 123,7 (C-1'), 149,4 (C-3'), 148,7 (C-4'), 163,7 (C-2), 148,4 (C-5), 130,7 (C-6), 152,4 (C-7), 103,9 (C-8), 145,7 (C-9), 104,6 (C-10). Trên phổ HMBC nhận đƣợc các tƣơng quan của proton tại δH 6,59 với các cacbon tại δC 163,6 (C-2) và 182,9 (C-4); proton δH 12,75 với các cacbon có δC 104,6 (C-10) và δC 130,7 (C-6) cũng chứng minh 2 proton này lần lƣợt là H-3 và H-5. Nhƣ vậy, CTD-03 đƣợc đề nghị là 5,7-dihydroxy-6,8,3',4'- tetramethoxyflavone (thƣờng gọi là hymenoxin). 3.4. Cấu trúc của CTD-04 Hợp chất CTD-04 kết tinh hình kim, không màu, là hợp chất có hàm lƣợng cao trong cao diclorometan của cây Cam thảo đất. Phổ khối lƣợng ESI-MS (positive) cho mảnh cơ bản ion giả phân tử m/z 166,0 [M+H] + cho phép suy luận hợp chất có chứa số lẻ nguyên tử nitơ; ngoài ra có vài khác nhƣ m/z 149,0 [M-OH]+; m/z 130,0 [M-CH2N] + phù hợp với công thức phân tử C8H7O3N (M = 165 amu) với độ bất bão hòa là 6. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δ ppm) trong vùng từ trƣờng thấp có 3 tín hiệu proton gồm có 1 mũi đôi ghép meta H 6,86 (1H; d; 2,5), 1 mũi đôi ghép ortho H 6,95 (1H; d; 8,5) và 1 mũi đôi-đôi vừa ghép meta vừa ghép ortho H 7,73 (1H; dd; 2,0; 8,5) chứng tỏ 3 proton này cùng thuộc 1 vòng thơm. Ngoài ra còn có tín hiệu proton của 1 nhóm metoxy với độ dịch chuyển hóa học H 3,78 ppm (3H; s). Phổ 13C- kết hợp với phổ DEPT-NMR (125 MHz, CDCl3, δ ppm) cho thấy CTD-04 có 8 cacbon cacbon ại δC 110,9; 110,6; 98,0 và b cacbon ở vùng từ trƣờng tƣơng đối thấp (δC 157,6; 146,0; 124,9) chứng tỏ có mang dị nguyên tố nhƣ oxi và nitơ. Vậy, với một vòng thơm benzen (có 3 nhóm thế cacbon cacbonyl và một nhóm metoxy ứng với 8 cacbon và độ bất bão hòa là 5, suy ra phân tử CTD-04 cần có thêm một vòng thơm nữa có dị nguyên tố nitơ, từ đó cấu trúc đƣợc đề nghị là khung benzoxazinone. Nhƣ đã phân tích CTD-04 đƣợc nhận danh là 6- methoxybenzoxazolinone (tên IUPAC: 6-methoxy- 3H-1,3-benzoxazol-2-one, tên thông thƣờng là coixol); và khi so sánh với tài liệu tham khảo [3] thì hầu hết dữ liệu là trùng khớp. Bảng 3: So sánh số liệu phổ NMR của CTD-04 ( ,CDCl3) và coixol ( # , DMSO-d6) Vị trí DEPT H (J Hz) # H (J Hz) C # C >C=O - - 157,5 155,1 4 CH 6,95 (1H; d; 8,5) 7,02 (1H; d) 110,9 109,9 5 CH 6,73 (1H; dd; 8,5; 2,5) 6,72 (1H; dd) 110,6 109,1 6 C - - 157,6 155,4 7 CH 6,86 (1H; d; 2,0) 6,97 (1H; d) 98,0 97,1 8 C - - 124,9 123,9 9 C - - 146,0 144,3 OCH3 -CH3 3,78 (3H; s) - 56,4 55,8 4. KẾT LUẬN Nhƣ vậy, cùng với hợp chất coixol (4), ba hợp chất flavon mang nhiều nhóm thế metoxy đã đƣợc phân lập, xác định cấu trúc hóa học và đƣợc nhận danh là: 5,6,7,8,3',4'-hexamethoxyflavone (1); 5,7,8,4'-tetramethoxyflavone (2) và 5,7-dihydroxy- 6,8,3',4'-tetramethoxyflavone (3). Trong đó, hai hợp chất: 5,6,7,8,3',4'-hexa methoxyflavone và 5,7,8,4'- tetramethoxyflavon lần đầu tiên đƣợc biết đến có trong cây này. Việc phân lập và xác định thêm các metoxyflavon này là đóng góp mới về thành phần hóa học của cây Cam thảo đất thu tại tỉnh An Giang. Các nghiên cứu trên những phân đoạn còn lại và cao etyl axetat đang đƣợc tiếp tục thực hiện và báo cáo tại Hội thảo toàn quốc về nghiên cứu hợp chất thiên nhiên lần 5. TCHH, 54(5) 2016 Các hợp chất methoxyflavonoid và coixol 590 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chen J., Antonio M. M., and Wilbur W. W. Two new polymethoxylated flavones, a class of compounds with potential anticancer activity, isolated from cold pressed Dancy tangerine Peel oil solids, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 364-368 (1997). 2. Đỗ Tất Lợi. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb. Y học (2001). 3. Nagao T., Otsuka H., Kohda H., Sato T. and Yamasaki K. Benzoxazinones from Coix lachryma- jobi Var. Ma-yuen, Phytochemistry, 24, 2959-2962 (1985). 4. Phan Minh Giang, Phan Tong Son, Katsuyoshi Matsunami and Hideaki Otsuka. Chemical and biological evaluation on Scopadulane-type diterpenoids from Scoparia dulcis of Vietnamese origin, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 54, 546-549 (2006). 5. Võ Văn Chi. Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học (1999). Liên hệ: Tôn Nữ Liên Hương Trƣờng Đại học Cần Thơ, Khoa Khoa học tự nhiên Khu 2, Đƣờng 3/2, Phƣờng Xuân Khánh, Quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ E-mail: tnlhuong@ctu.edu.vn; Điện thoại: 0939156066.