Cải thiện khả năng ra rễ in vitro và nâng cao tỷ lệ sống sót ngoài vườn ươm của cây chanh dây tím (passiflora edulis sims) có nguồn gốc từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 15, Số 2 (2020) 97 CẢI THIỆN KHẢ NĂNG RA RỄ IN VITRO VÀ NÂNG CAO TỶ LỆ SỐNG SÓT NGOÀI VƢỜN ƢƠM CỦA CÂY CHANH DÂY TÍM (Passiflora edulis Sims.) CÓ NGUỒN GỐC TỪ NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO LÁ Trần Hiếu1, 2, 3, Hoàng Thanh Tùng1, Cao Đăng Nguyên2, Dƣơng Tấn Nhựt1* 1 Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên 2 Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế 3 Trường Cao đẳng Sư phạm Ninh Thuận *Email: duongtannhut@gmail.com Ngày nhận bài: 02/7/2019; ngày hoàn thành phản biện: 4/9/2019; ngày duyệt đăng: 02/10/2019 TÓM TẮT Cải thiện khả năng ra rễ in vitro và nâng cao tỷ lệ sống sót ngoài vườn ươm của cây chanh dây tím có nguồn gốc từ tTCL lá đã được thiết lập trong nghiên cứu này. Mẫu tTCL lá được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 1 mg/l BA, 30 g/l sucrose và 8 g/l agar cho số chồi cao nhất (4 chồi/mẫu) sau 8 tuần. Chồi sau đó được nhân nhanh trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l BA và 0,5 mg/l Kin. Ở giai đoạn ra rễ, chồi được nuôi cấy trong 2 hệ thống khác nhau, (1) hệ thống GB và (2) hệ thống RPB. Sau 8 tuần nuôi cấy kết quả cho thấy, tỷ lệ ra rễ in vitro được cải thiện đáng kể và không có sự hình thành mô sẹo trong hệ thống RPB so với trong hệ thống GB. Ngoài ra, cây con trong hệ thống RPB cho tỷ lệ sống sót cao (100%) cũng như khả năng sinh trưởng và phát triển tốt hơn so với những cây con trong hệ thống GB sau 8 tuần thích nghi ngoài vườn ươm. Từ khóa: chanh dây tím, lớp mỏng tế bào, ra rễ, sống sót, sự tái sinh chồi. 1. MỞ ĐẦU Chanh dây tím (Passiflora edulis Sims.) là một giống có giá trị kinh tế quan trọng nhất trong chi Passiflora (một chi lớn nhất trong họ Passifloraceae). Nó được trồng phổ biến ở các vùng nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới để cung cấp quả tươi hoặc làm nguyên liệu phục vụ cho ngành công nghiệp sản xuất nước giải khát. Ngoài ra, lá của nó được sử dụng phổ biến trong các vị thuốc dân gian ở Nam Mỹ để điều trị chứng nghiện rượu, các bệnh liên quan đến thần kinh như lo lắng, đau nửa đầu, hồi hộp và mất ngủ [1]. Giống như các loài chanh dây khác thuộc chi Passiflora thì chanh dây tím cũng có thể được nhân giống bằng phương pháp truyền thống như gieo hạt, giâm cành, ghép. Cải thiện khả năng ra rễ in vitro và nâng cao tỷ lệ sống sót ngoài vườn ươm của cây chanh dây tím 98 Tuy nhiên, cây con được tạo ra từ phương pháp trên không kiểm soát được mầm bệnh, số lượng và chất lượng cây giống,... Do đó, kỹ thuật vi nhân giống có thể hữu ích trong việc bảo tồn và nhân nhanh những giống cây trồng mang kiểu gen quý và tạo cây sạch bệnh; trong đó có những loài thuộc chi Passiflora [2]. Vi nhân giống bao gồm 4 giai đoạn: thiết lập nguồn mẫu in vitro, nhân nhanh chồi, ra rễ in vitro và thích nghi của cây con ex vitro [3]; trong đó, hiệu quả của vi nhân giống phụ thuộc rất lớn vào số lượng chồi, tỷ lệ ra rễ in vitro và thuần hóa cây con ngoài vườn ươm. Hiện nay, những nghiên cứu trên đối tượng chanh dây, các nguồn mẫu đa dạng như đỉnh sinh trưởng, đốt thân, trụ dưới lá mầm, rễ và mẫu lá thường được sử dụng làm vật liệu để tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro [4-6]. Theo nghiên cứu của Lombardi và cộng sự (2007) cho thấy, mẫu rễ cho hiệu quả tái sinh chồi cao hơn mẫu lá, mẫu đốt thân; tuy nhiên, hệ số tái sinh chồi chỉ đạt 5,1 chồi/mẫu [4]. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu khác được thực hiện với mục đích tìm ra phương pháp tối ưu cho sự ra rễ in vitro và nâng cao tỷ lệ sống ngoài vườn ươm; nhưng hiệu quả đạt được vẫn còn thấp như nghiên cứu của Isutsa và cộng sự (2004) trên chanh dây tím đã báo cáo tỷ lệ ra rễ đạt 47%, số rễ/chồi là 1 và tỷ lệ sống sót là 32% [7]. Kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) đã phát triển trên 30 năm, được chứng minh là phương pháp tối ưu cho hiệu quả tái sinh chồi và ứng dụng thành công trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau như cây chuối, cây cam, cây dừa, cây măng cụt và cây cà chua [8, 9]. Hiện nay, kỹ thuật này chưa được ứng dụng trên đối tượng chanh dây. Vì vậy, nghiên cứu cải thiện khả năng ra rễ in vitro và nâng cao tỷ lệ sống sót ngoài vườn ươm của cây chanh dây tím có nguồn gốc từ nuôi cấy tTCL lá được thực hiện. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu Nguồn mẫu Lá thứ 3 (tính từ chồi đỉnh xuống) từ các chồi in vitro (1,5 tháng tuổi) của cây chanh dây tím (hiện có tại Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên) được sử dụng làm nguồn mẫu trong nghiên cứu này. Giá thể xơ dừa Xơ dừa (Công ty TNHH COCOGREEN, Việt Nam) được ngâm và rửa sạch với nước nhiều lần để loại bỏ chất chát (tanin và lignin), sau đó tiến hành hấp khử trùng và sử dụng như là giá thể nuôi cấy thay thế cho agar trong nghiên cứu này. Hệ thống nuôi cấy TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 15, Số 2 (2020) 99 Hệ thống GB (chai thủy tinh 500 ml, 60 ml môi trường MSM (MS cải biên) [10], 30 g/l sucrose, 8 g/l agar và bổ sung 1-naphthaleneacetic acid (NAA) với các nồng độ khác nhau) và hệ thống RPB (hộp nhựa tròn 500 ml Đại Đồng Tiến (Việt Nam), thể tích môi trường MSM khác nhau, 30 g/l sucrose, 20 g xơ dừa và không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng). Môi trƣờng nuôi cấy Môi trường nuôi cấy in vitro được sử dụng trong nghiên cứu này là môi trường MS [11] và MSM có bổ sung 30 g/l sucrose; agar và chất điều hòa sinh trưởng thực vật được bổ sung vào môi trường tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm. Môi trường được điều chỉnh về pH = 5,8 trước khi hấp khử trùng ở 121C, 1 atm trong 30 phút. 2.2. Phƣơng pháp Tái sinh chồi thông qua kỹ thuật lớp mỏng tế bào Lá được cắt thành những lớp mỏng theo chiều ngang (tTCL) với kích thước 10 mm x 2,5 mm. Những tTCL lá này được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar và Benzyladenine (BA), Kinetin (Kin) ở nồng độ khác nhau (0; 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/l) hoặc Thidiazuron (TDZ) (0; 0,25; 0,5; 0,75 và 1,0 mg/l) nhằm xác định loại và nồng độ cytokinin thích hợp cho khả năng tái sinh chồi in vitro. Sau 8 tuần nuôi cấy, tỷ lệ tái sinh chồi (%), số chồi/mẫu và chiều cao chồi (cm) được ghi nhận. Những chồi tách ra khỏi cụm chồi tái sinh từ tTCL lá (tối ưu ở thí nghiệm trên) được cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA và 0,5 mg/l Kin [12] để tăng sinh chồi. Ra rễ in vitro Chồi in vitro (kích thước 2 cm) được nuôi cấy trong 2 hệ thống khác nhau, GB có bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 3,0 mg/l) tùy theo từng nghiệm thức và RPB với các thể tích môi trường MSM khác nhau (20 ml; 40 ml và 60 ml) nhằm đánh giá khả năng ra rễ của 2 hệ thống này. Sau 8 tuần nuôi cấy, tỷ lệ ra rễ (%), số rễ/mẫu, chiều dài rễ (cm), chiều cao cây (cm), số lá/cây và chỉ số SPAD - tổng hàm lượng chlorophyll đo bằng máy SPAD-502 (Minolta Co., Ltd., Osaka, Japan) được ghi nhận. Thích nghi ngoài vƣờn ƣơm Những cây con khỏe mạnh ở thí nghiệm ra rễ in vitro được chuyển ra điều kiện ngoài vườn ươm nhằm đánh giá sự thích nghi và khả năng sinh trưởng. Cây con (10 cây/nghiệm thức) được lấy ra khỏi các hệ thống nuôi cấy và rửa lại nhiều lần bằng nước để loại bỏ giá thể trên bề mặt rễ. Sau đó, cây con được trồng vào chậu nhựa chứa hỗn hợp đất và xơ dừa (tỷ lệ 1:1) vô trùng. Trong 1 tuần đầu, cây con được giữ ẩm bằng cách che phủ kín bởi màng nhựa polyethylen. Sau 1 tuần giữ ẩm, Cải thiện khả năng ra rễ in vitro và nâng cao tỷ lệ sống sót ngoài vườn ươm của cây chanh dây tím 100 cây con được chuyển ra nhà kính trong 7 tuần tiếp theo để thích nghi ở điều kiện ex vitro. Tỷ lệ sống sót (%), chiều cao cây (cm), số lá/cây, chiều rộng lá (cm) và chiều dài lá (cm) được ghi nhận. 2.3. Điều kiện nuôi cấy Điều kiện in vitro: các bình nuôi cấy được đặt ở 25±2C, độ ẩm 55-60%, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng 40-45 µmol.m–2.s–1 dưới ánh sáng huỳnh quang. Điều kiện ex vitro: nhiệt độ 18-25°C, độ ẩm trung bình 70-75% và sử dụng ánh sáng tự nhiên có che sáng 40%. 2.4. Xử lý số liệu Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần lặp lại. Mỗi lần lặp lại cấy 20 bình/nghiệm thức với 3 mẫu/bình. Các số liệu thu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel® 2010 và phần mềm SPSS 20.0 với phép thử Duncan ở mức α = 0,05 [13]. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hƣởng của BA, Kin và TDZ lên khả năng tái sinh chồi từ tTCL lá Cytokinin là một trong những chất điều hòa sinh trưởng thực vật chính tham gia vào việc điều khiển sự sinh trưởng và phát triển của chồi bất định và chúng đã cho thấy hiệu quả trong việc cảm ứng phát sinh cơ quan ở chi Passiflora [14]. Vì vậy, trong nghiên cứu này BA, Kin và TDZ được sử dụng nhằm khảo sát ảnh hưởng của chúng lên khả năng tái sinh chồi từ tTCL lá. Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy cho thấy, BA tỏ ra hiệu quả hơn so với TDZ, Kin trong việc cảm ứng tái sinh chồi từ tTCL lá; ở tất cả các nồng độ của BA được sử dụng trong thí nghiệm đều cho tỷ lệ tái sinh chồi cao (lớn hơn 50%) và tỷ lệ tái sinh chồi đạt cao nhất (100%) tại nồng độ 1,0 mg/l BA. Ngoài ra, số chồi/mẫu (4,00 chồi) và chiều cao chồi (1,53 cm) thu được cũng cao nhất ở nồng độ này (Bảng 1 và Hình 1a). Kết quả của nghiên cứu này tương tự như nghiên cứu của Ragavendran và cộng sự (2012); Otoni và cộng sự (2013), nhóm tác giả cho thấy rằng so với TDZ và Kin thì BA cho hiệu quả hơn trong việc tái sinh chồi từ các nguồn mẫu khác nhau của các giống chanh dây thuộc chi Passiflora [15, 16]. Cũng trên nguồn mẫu lá (đĩa lá có đường kính 5 mm) của Passiflora cincinnata Mast., ở nồng độ 1,0 mg/l BA cho tỷ lệ tái sinh chồi (41,33%) và số chồi/mẫu (2,32 chồi) [4]. Trong khi đó, mẫu tTCL lá có kích thước (10 mm x 2,5 mm), cho tỷ lệ tái sinh chồi (100%) và số chồi/mẫu (4,0 chồi) (Bảng 1). Ngoài mẫu lá, BA cũng cho hiệu quả tái sinh chồi từ mẫu trụ dưới lá mầm của P. setacea được nuôi cấy dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ [14]. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 15, Số 2 (2020) 101 Bảng 1. Ảnh hưởng của BA, Kin và TDZ trong môi trường MS lên khả năng tái sinh chồi từ tTCL lá sau 8 tuần nuôi cấy. BA (mg/l) Kin (mg/l) TDZ (mg/l) Tỷ lệ tái sinh chồi (%) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) 0 0 0 0,00e* 0,00e 0,00e 0,5 - - 73,33c 2,67c 0,23c 1,0 - - 100,00a 4,00a 1,53a 1,5 - - 81,67b 3,33b 0,73b 2,0 - - 58,33d 2,00d 0,13d - 0,5 - 0,00e 0,00e 0,00e - 1,0 - 0,00e 0,00e 0,00e - 1,5 - 0,00e 0,00e 0,00e - 2,0 - 0,00e 0,00e 0,00e - - 0,25 0,00e 0,00e 0,00e - - 0,5 0,00e 0,00e 0,00e - - 0,75 0,00e 0,00e 0,00e - - 1,0 0,00e 0,00e 0,00e *Những chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở α = 0,05 theo phép thử Duncan. Chồi thu được từ sự tái sinh chồi tTCL lá được cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA và 0,5 mg/l Kin nhằm tăng sinh số chồi và gia tăng chiều cao chồi. Sau 8 tuần nuôi cấy, các chồi có kích thước khoảng 2 cm (Hình 1b) được sử dụng làm vật liệu cho thí nghiệm ra rễ. 3.2. Sự ra rễ in vitro Loại và nồng độ của auxin có ảnh hưởng đáng kể đến sự hình thành rễ. Auxin không chỉ cần thiết cho giai đoạn sớm của sự hình thành rễ mà còn có hiệu quả cho sự phát triển của rễ mới [17]. Vì vậy, ở giai đoạn ra rễ, auxin thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Trong nghiên cứu này, NAA cũng đóng vai trò quan trọng cho sự hình thành rễ in vitro của chồi chanh dây tím được nuôi cấy trong hệ thống GB. Kết quả ở bảng 2 cho thấy, NAA ở nồng độ 2,5 mg/l cho tỷ lệ ra rễ (67,67%), số rễ/chồi (4,33 rễ) là cao nhất. Khi tăng nồng độ NAA (lớn hơn 2,5 mg/l) thì tỷ lệ ra rễ giảm. Isutsa và cộng sự (2004) nghiên cứu sự ra rễ của chồi (có nguồn gốc từ chồi đỉnh) chanh dây tím cho thấy, tỷ lệ ra rễ (47%), số rễ/chồi (1 rễ) quan sát được ở nồng độ 4,0 mg/l NAA [7]. Trong khi đó, Mukasa và cộng sự (2016) cho rằng, sự ra rễ của chồi (có nguồn gốc từ mẫu đốt thân) thu được số rễ/chồi (2,5 rễ) tại nồng độ 3,0 mg/l NAA [18]. Như vậy, kết quả của nghiên cứu này tương đồng với các nghiên cứu khác trước đây, NAA (nồng độ thích hợp khác nhau) có tác dụng hiệu quả lên quá trình ra rễ in vitro của những chồi có nguồn gốc từ các nguồn mẫu khác nhau của cây chanh dây tím. Hơn nữa, khi quan sát cây con in vitro trong hệ thống này cho thấy, khối mô sẹo hình thành ở phần Cải thiện khả năng ra rễ in vitro và nâng cao tỷ lệ sống sót ngoài vườn ươm của cây chanh dây tím 102 gốc của cây con (Hình 1c). Hiện tượng này cũng quan sát được trong nghiên cứu của Jafari và cộng sự (2017) trên đối tượng Passiflora caerulea L. khi IBA được bổ sung ở nồng độ cao [19]. Bảng 2. Ảnh hưởng của NAA lên khả năng ra rễ in vitro trong hệ thống GB sau 8 tuần nuôi cấy. NAA (mg/l) Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ/ chồi Chiều dài rễ (cm) Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi Chiều dài lá (cm) Chiều rộng lá (cm) SPAD 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 0,00g* 0,00e 0,00f 2,00f 3,33d 2,07e 0,93f 31,70b 25,00f 1,00d 0,33e 2,57e 4,00cd 2,13de 1,07ef 26,50d 30,00e 2,33c 0,47e 2,63e 4,33c 2,17de 1,27d 24,80e 38,33d 3,33b 0,83d 2,93d 4,67c 2,27d 1,10e 23,07f 50,00c 3,00bc 1,93c 3,50c 6,00b 2,53c 1,47c 14,83g 66,67a 4,33a 2,83b 3,80b 6,33b 2,97b 2,03b 35,57a 58,33b 2,33c 3,12a 4,67a 7,33a 3,43a 2,40a 29,73c *Những chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở α = 0,05 theo phép thử Duncan. Trong thí nghiệm này, ngoài việc sử dụng hệ thống GB để nghiên cứu sự ra rễ thì hệ thống RPB cũng được tiến hành nhằm đánh giá khả năng ra rễ của chồi in vitro. Kết quả sau 8 tuần cho thấy, chồi được nuôi cấy trong hệ thống RPB với 20 ml môi trường MSM cho tỷ lệ ra rễ (88,33%), số rễ/chồi (5,33 rễ), chiều dài rễ (3,40 cm), chiều cao chồi (4,17 cm), số lá/chồi (7,33 lá), chiều dài lá (2,87 cm), chiều rộng lá (1,63 cm) và chỉ số SPAD (37,03) là cao nhất (Bảng 3 và Hình 1d, e). Khi tăng thể tích môi trường nuôi cấy thì tỷ lệ ra rễ giảm. Thể tích môi trường lớn (60 ml) làm cho giá thể trở nên không thoáng khí, dẫn đến giảm khả năng hô hấp, trao đổi khí giữa chồi với môi trường nuôi cấy, tác động tiêu cực đến sự hình thành rễ của chồi; trong khi đó, với thể tích môi trường ít hơn (20 ml), giá thể trở nên thoáng khí hơn, điều này làm tăng cường khả năng hô hấp, trao đổi khí giữa chồi với môi trường nuôi cấy, kích thích sự hình thành rễ. Yu và cộng sự (2000) cho rằng, sự thoáng khí của môi trường ra rễ là một yếu tố quan trọng trong sự hình thành rễ và nếu sự thoáng khí của môi trường không tốt có thể là lý do làm giảm khả năng cảm ứng hình thành rễ, cũng như giảm chất lượng của rễ hoặc mất chức năng rễ [20]. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 15, Số 2 (2020) 103 Bảng 3. Ra rễ in vitro trong hệ thống RPB với các thể tích môi trường MSM khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy. Thể tích môi trƣờng (ml) Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ/chồi Chiều dài rễ (cm) Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi Chiều dài lá (cm) Chiều rộng lá (cm) SPAD 20 88,33a* 5,33a 3,40a 4,17a 7,33a 2,87a 1,63a 37,03a 40 53,33b 1,67b 2,90b 2,83b 4,67b 1,73b 0,63b 34,70b 60 18,33c 1,33b 0,23c 2,67b 2,33c 1,53b 0,43c 12,70c *Những chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở α = 0,05 theo phép thử Duncan. Khi so sánh sự hình thành rễ của chồi in vitro trong 2 hệ thống với cùng thể tích 60 ml môi trường MSM và không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, kết quả cho thấy chồi được nuôi cấy trong hệ thống GB không hình thành rễ; trong khi ở hệ thống RPB, chồi lại hình thành rễ (Bảng 2, 3). Đặc biệt, khi quan sát sự cảm ứng hình thành rễ của chồi ở hệ thống RPB cho thấy không xuất hiện khối mô sẹo (Hình 1e). Như vậy, kết quả của nghiên cứu này đã chứng minh rằng sự cảm ứng ra rễ khác nhau bị tác động bởi các giá thể khác nhau (agar và xơ dừa). Theo nghiên cứu Gabriel và cộng sự (2002), chồi của Pyrus ‘Bartlett’ và ‘OH x F97’ không tạo ra rễ thứ cấp khi được nuôi cấy trên giá thể agar trong khi cả hai loài này có thể hình thành rễ trên giá thể vermiculite với tần số lần lượt là 31,07% và 53,61% [21]. Zimmerman và Broome (1989) báo cáo rằng, hiệu quả ra rễ in vitro cao khi chồi được nuôi cấy trên giá thể vermiculite hoặc hỗn hợp vermiculite và perlite so với giá thể agar ở các giống táo khác nhau [22]. Tương tự, Hutchinson (1984), cũng thu được tỷ lệ ra rễ cao đáng kể của giống táo ‘Northern Spy’ khi chồi nuôi cấy trên giá thể cát thô và perlite [23]. Thoáng khí thường là vấn đề chính đối với rễ được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung agar [24]. Các hạt mịn của agar trong môi trường nuôi cấy có xu hướng làm giảm khả năng thoáng khí của môi trường và có các tác động tiêu cực đến quá trình tạo rễ in vitro [25]. Vì vậy, để tăng cường cảm ứng rễ của chồi in vitro, cần sử dụng giá thể thoáng khí thích hợp cho quá trình hình thành rễ. Kirdmanee và cộng sự (1995; 1999) cho rằng, sự thoáng khí của giá thể vermiculite cao hơn giá thể agar và gelrite nên chồi của cây bạch đàn cho số lượng rễ chính nhiều hơn khi được nuôi cấy trên giá thể vermiculite so với giá thể agar và gelrite [26, 27]. Những phát hiện của các nghiên cứu trước đây cũng như kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng, việc lựa chọn giá thể như vermiculite; hỗn hợp vermiculite và perlite; giá thể xơ dừa có khả năng thoáng khí tốt hơn là điều cần thiết cho sự hình thành rễ in vitro. Kết quả nghiên cứu trong giai đoạn ra rễ in vitro cho thấy, chồi được nuôi cấy trong hệ thống RPB với 20 ml môi trường MSM cho hiệu quả ra rễ cao hơn so với chồi Cải thiện khả năng ra rễ in vitro và nâng cao tỷ lệ sống sót ngoài vườn ươm của cây chanh dây tím 104 được nuôi cấy trong hệ thống GB với 60 ml môi trường MSM, bổ sung NAA và chất lượng rễ cũng được cải thiện tốt hơn như rễ không hình thành mô sẹo. Mặt khác, sử dụng xơ dừa làm giá thể (trong hệ thống RPB) thay cho agar (trong hệ thống GB) ở giai đoạn ra rễ in vitro có thể giảm được chi phí sản xuất do giảm 2/3 thể tích môi trường nuôi cấy cũng như không sử dụng NAA và giá thành xơ dừa (8.000 đồng/1 kg) thấp hơn nhiều so với giá của agar (450.000 đồng/1 kg, Việt Nam). 3.3. Thích nghi ngoài vƣờn ƣơm Mục tiêu cuối cùng của vi nhân giống cây trồng là thu được số lượng lớn cây con trong một khoảng thời gian ngắn với tỷ lệ sống sót cao ngoài vườn ươm. Vì vậy, trong nghiên cứu này tất cả các cây con trong 2 hệ thống được trồng ra ngoài vườn ươm nhằm đánh giá khả năng thích nghi và sống sót của chúng. Trước khi cây con được chuyển trực tiếp ra ngoài vườn ươm, cây con được phủ kín bằng màng nhựa polyethylen trong 1 tuần (Hình 1f) nhằm giảm sự mất nước sau khi trồng trong chậu nhựa chứa hỗn hợp xơ dừa:đất (1:1). Sau 7 tuần tiếp theo trồng ra ngoài vườn ươm kết quả cho thấy, cây con trong hệ thống RPB với 20 ml môi trường MSM cho tỷ lệ sống sót ngoài vườn ươm đạt cao nhất (100%). Đồng thời, cây con sinh trưởng tốt và khỏe mạnh thông qua các chỉ tiêu như chiều cao cây (17,50 cm), số lá/cây (15,33 lá) và chiều rộng lá (3,73 cm) (Bảng 4 và Hình 1g). Trong khi đó, cây con trong hệ thống GB có bổ sung NAA ở nồng độ khác nhau cho tỷ lệ sống sót ngoài vườn ươm đều không cao và cao nhất chỉ đạt 66,67% ở nghiệm thức bổ sung 2,5 mg/l NAA (Bảng 4). Như vậy, kết quả trong nghiên cứu này cho thấy sự hình thành mô sẹo ở phần gốc của cây con làm giảm khả năng sống sót khi trồng ở giai đoạn ngoài vườn ươm (do giảm sự kết nối các mạch dẫn giữa rễ và chồi, ngăn chặn sự hấp thụ nước và chất dinh dưỡng trong môi trường) và điều này phù hợp với nghiên cứu của Kollemeier và cộng sự (2000) về sự ra rễ và kéo dài rễ của cây ngô [28]. Bảng 4. Khả năng thích nghi và sinh trưởng của cây con trong 2 hệ thống ở điều kiện vườn ươm sau 8 tuần. Nghiệm thức Tỷ lệ sống (%) Chiều cao cây (cm) Số lá/cây Chiều dài lá (cm) Chiều rộng lá (cm) NAA (mg/l) Thể tích môi trƣờng (ml) 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 - 0,00g* 0,00g 0,00e 0,00f 0,00f - 26,67f 5,00f 5,67d 5,17e 2,33de - 36,67e 5,43f 6,33d 5,23e 2,43de - 50,00d 7,33e 6,67d 6,30d 2,37de - 56,67d 9,33d 8,33d 7,37c 2,87bc - 66,67c 14,12b 11,67b 8,73a 3,16b - 53,33d 13,17c 10,33c 8,17b 3,07b TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 15, Số 2 (2020) 105 - - - 20 100,00a 17,50a 15,33a 7,67c 3,73a 40 80,00b 12,67c 11,67b 6,40d 2,57cd 60 36,67e 5,33f 5,67d 4,97e 2,13e *Những chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở α = 0,05 theo phép thử Duncan. Hình 1. Vi nhân giống cây chanh dây tím có nguồn gốc từ nuôi cấy tTCL lá. a. Chồi tái sinh từ tTCL lá trên môi trường MS bổ sung 1 mg/l BA sau 8 tuần; b. Nhân nhanh chồi trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA và 0,5 mg/l Kin sau 8 tuần; c. Rễ hình thành trong hệ thống GB có bổ sung 2,5 mg/l NAA sau 8 tuần; d, e. Rễ hình thành trong hệ thống RPB với 20ml môi trường MSM sau 8 tuần; Cải thiện khả năng ra rễ in vitro và nâng cao tỷ lệ sống sót ngoài vườn ươm của cây chanh dây tím 106 f. Cây con trong 2 hệ thống được phủ kín bằng màng nhựa polyethylen để giữ ẩm trong 1 tuần; g. Cây con thích nghi ngoài vườn ươm sau 7 tuần tiếp theo (bên trái: cây con trong hệ thống RPB với 20ml môi trường MSM; bên phải: cây con trong hệ thống GB có bổ sung 2,5 mg/l NAA). 4. KẾT LUẬN Kết quả của nghiên cứu này cho thấy, tTCL lá được nuôi cấy trên môi trường MS chứa 30 g/l sucrose, 8 g/l agar và 1 mg/l BA, cho hiệu quả tái sinh chồi cao hơn so với tTCL lá được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung Kin và TDZ. Sử dụng hệ thống nuôi cấy RPB với 20 ml môi trường MSM là thích hợp hơn cho việc cảm ứng hình thành rễ của chồi có nguồn gốc từ tTCL lá so với hệ thống GB có bổ sung NAA; cũng như khắc phục được hiện tượng hình thành khối mô sẹo ở rễ; tăng khả năng thích nghi, cải thiện tỷ lệ sống sót của cây con và cây con sinh trưởng mạnh ở điều kiện vườn ươm. LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. H. Li, P. Zhou, Q. Yang, Y. Shen, J. Deng, L. Li, D. Zhao (2011). Comparative studies on anxiolytic activities and flavonoid compositions of Passiflora edulis ‘edulis’ and Passiflora edulis ‘flavicarpa’, Journal of Ethnopharmacology, 133(3), pp. 1085-1090. [2]. Y. S. Huh, J. K. Lee, S. Y. Nam (2017). Effect of plant growth regulators and antioxidants on in vitro plant regeneration and callus induction from leaf explants of purple passion fruit (Passiflora edulis Sims.), Journal of Plant Biotechnology, 44(3), pp. 335-342. [3]. E. F. George, P. C. Debergh (2008). Micropropagation: uses and methods. In: E. F. George, M. A. Hall, G. J. De Klerk (eds) Plant propagation by tissue culture, Springer, Dordrecht, The Netherlands, pp. 29-64. [4]. S. P. Lombardi, I. R. da Silva Passos, M. C. S. Nogueira, B. A. da Glória (2007). In vitro shoot regeneration from roots and leaf discs of Passiflora cincinnata Mast., Brazilian Archives of Biology and Technology, 50(2), pp. 239-247. [5]. S. Prammanee, S. Thumjamras, P. Chiemsombat, N. Pipattanawong (2011). Efficient shoot regeneration from direct apical meristem tissue to produce virus-free purple passion fruit plants, Crop Protection, 30(11), pp. 1425-1429. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 15, Số 2 (2020) 107 [6]. D. I. Rocha, L. M. Vieira, F. A. O. Tanaka, L. C. da Silva, W. C. Otoni (2012). Anatomical and ultrastructural analyses of in vitro organogenesis from root explants of commercial passion fruit (Passiflora edulis Sims.), Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 111(1), pp. 69-78. [7]. D. K. Isutsa, (2004). Rapid micropropagation of passion fruit (Passiflora edulis Sims.) varieties, Scientia Horticulturae, 99(3-4), pp. 395-400. [8]. J. A. T. da Silva (2003). Thin cell layer technology in ornamental plant micropropagation and biotechnology, African Journal of Biotechnology, 2(12), pp. 683-691. [9]. D. T. Nhut, T. J. A. da Silva, V. L. Bui, K. Tran Thanh Van (2003). Thin cell layer technology in fruit crop regeneration. In: D. T. Nhut, V. L. Bui, K. Tran Than Van, T. Thorpe (eds) Thin cell layer culture system regeneration and transformation applications, Kluwer, Dordrecht, The Netherlands, pp. 451-472. [10]. A. C. B. de A. Monteiro, E. N. Higashi, A. N. Goncalves, A. P. M. Rodriguez (2000). A novel approach for the definition of the inorganic medium components for micropropagation of yellow passion fruit (Passiflora edulis Sims. f. flavicarpa Deg.), In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant, 36(6), pp. 527-531. [11]. T. Murashige, F. Skoog (1962). A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures, Physiologia Plantarum, 15, pp. 473-497. [12]. M. S. Shekhawat, N. Kannan, M. Manokari, C. P. Ravindran (2015). In vitro regeneration of shoots and ex vitro rooting of an important medicinal plant Passiflora foetida L. through nodal segment cultures, Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 13(2), pp. 209-214. [13]. D. B. Duncan (1955). Multiple range and multiple F test, Biometrics, 11, pp. 1-42. [14]. L. M. Vieira, D. I. Rocha, M. F. Taquetti, L. C. da Silva, J. M. S. de Campos, L. F. Viccini, W. C. Otoni (2014). In vitro plant regeneration of Passiflora setacea D.C. (Passifloraceae): the influence of explant type, growth regulators, and incubation conditions, In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant, 50(6), pp. 738-745. [15]. C. Ragavendran, D. Kamalanathan, G. Reena, D. Natarajan (2012). In vitro propagation of nodal and shoot tip explants of Passiflora foetida L. An exotic medicinal plant, Asian Journal of Plant Science and Research, 2(6), pp. 707-711. [16]. W. C. Otoni, P. D. L. Paim, D. I. Rocha, L. M. Vieira, L. L. C Dias, M. L. Silva, C. V. Silva, E. R. G Lani, L. C. Silva, F. A. O Tanaka (2013). Organogenesis and somatic embryogenesis in passion fruit (Passiflora sp.). In: J. Aslam, O. S. Srivastava, M. P. Sharma (eds) Somatic embryogenesis and gene expression, Narosa Publishing House, New Delhi, pp. 1-17. [17]. J. Dobránszki, T. J. A. da Silva (2010). Micropropagation of an apple a review, Biotechnology Advances, 28(4), pp. 462-488. [18]. S. B. Mukasa, A. Ssamula, P. Asami, T. A. Holton (2016). In vitro propagation of three commercial passionfruit varieties in Uganda, African Crop Science Journal, 24(4), pp. 397- 404. [19]. M. Jafari, M. H. Daneshvar, A. Lotfi (2017). In vitro shoot proliferation of Passiflora caerulea L. via cotyledonary node and shoot tip explants, Biotechnologia, 98(2), pp. 113-119. [20]. T. A. Yu, S. D. Yeh, Y. H. Cheng, J. S. Yang (2000). Efficient rooting for establishment of papaya plantlets by micropropagation, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 61(1), pp. 29-35. Cải thiện khả năng ra rễ in vitro và nâng cao tỷ lệ sống sót ngoài vườn ươm của cây chanh dây tím 108 [21]. B. L. Gabriel, L. F. Nelson, R. D. L. F. Gérson (2002). Use of vermiculite as a substrate and effect of light on in vitro rooting of pears cv. Bartlett and clone OH x F97, Science and Agrotechnology, 26(5), pp. 977-982. [22]. T. W. Zimmerman, O. C. Broome (1989). Micropropagation of woody plant: post tissue cultures aspects, Acta Horticulturae, 22(1), pp. 489-499. [23]. J. F. Hutchinson (1984). Factors affecting shoot proliferation and root initiation in organ cultures of the apple ‘Northern Spy’, Scientia Horticulturae, 22(4), pp. 347-358. [24]. I. Kataoka (1994). Influence of rooting substrates on the morphology of papaya root formed in vitro, Japanese Journal of Tropical Agriculture, 38(3), pp. 251-257. [25]. P. Suksa-Ard, I. Kataoka, Y. Fujime, K. Beppu, S. Subhadrabandhu (1998). Development of rooting system for tissue cultured papaya shoots using rockwool blocks, Japanese Journal of Tropical Agriculture, 42(2), pp. 119-121. [26]. C. Kirdmanee, Y. Kitaya, T. Kozai (1995). Effects of CO2 enrichment and supporting material on growth, photosynthesis and water potential of Eucalyptus shoots/plantlets cultured photoautotrophically in vitro, Environmental Control in Biology, 33(2), pp. 133-141. [27]. C. Kirdmanee (1999). Environmental control in micropropagation: effects of CO2 enrichment and supporting material on growth and photosynthesis of eucalyptus shoots/plantlets cultured photoautotrophically in vitro, In: C. Kirdmanee, A. Altman, M. Ziv, S. Izhar (eds) Plant biotechnology and in vitro biology in the 21st century, Springer, Dordrecht, The Netherlands, pp. 651-654. [28]. M. Kollmeier, H. H. Mafelle, W. J. Horst (2000). Genotypical differences in aluminum resistance of maize are expressed in the distal part of the transition zone. Is reduced basipetal auxin flow involved in inhibition of root elongation by aluminum, Plant Physiology, 122(3), pp. 945-956. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 15, Số 2 (2020) 109 IMPROVED IN VITRO ROOTING AND SURVIVAL RATES OF PURPLE PASSION FRUIT (Passiflora edulis Sims.) PLANTLETS DERIVED FROM LEAF TRANSVERSE THIN CELL LAYER IN EX VITRO CONDITION Tran Hieu1, 2, 3, Hoang Thanh Tung1, Cao Dang Nguyen2, Duong Tan Nhut1* 1Tay Nguyen Institute for Scientific Research 2University of Sciences, Hue University 3Pedagogical College of Ninh Thuan *Email: duongtannhut@gmail.com ABSTRACT Improved in vitro rooting and enhanced survival rates in ex vitro condition of Passiflora edulis Sims. plantlets derived from leaf transverse thin cell layer (tTCL) were established in this study. Leaf-tTCL was cultured on Murashige and Skoog’s medium supplemented with 1.0 mg/L Benzyladenine, 30 g/L sucrose, and 8 g/L agar gave the highest number of shoots (4 shoots/explant) after 8 weeks. The shoots were proliferated on MS medium containing 0.5 mg/L Benzyladenine and 0.5 mg/L Kinetin. In rooting stage, the shoots were cultured in two different systems; (1) GB system and (2) RPB system. After 8 weeks of culture, the results showed in vitro rooting rate was enhanced and without callus formation in the RPB system as compared to that in the GB one. In addition, the plantlets in the RPB system gave high survival rates (100%) as well as better growth and development than the ones in the GB system after 8 weeks of acclimatization in greenhouse. Keywords: Passiflora edulis Sims., rooting, shoot regeneration, survival, thin cell layer. Trần Hiếu sinh ngày 12/03/1983 tại Ninh Thuận. Ông tốt nghiệp cử nhân Sinh học năm 2006 tại Đại học Đà Lạt, thạc sĩ chuyên ngành Sinh học thực nghiệm năm 2014 tại Đại học Đà lạt và hiện là NCS chuyên ngành Sinh lý học Thực vật tại Đại học Khoa học, Đại học Huế. Hiện nay, ông là giảng viên trường Cao đẳng Sư phạm Ninh Thuận. Lĩnh vực nghiên cứu: Công nghệ Sinh học Thực vật. Cải thiện khả năng ra rễ in vitro và nâng cao tỷ lệ sống sót ngoài vườn ươm của cây chanh dây tím 110 Hoàng Thanh Tùng sinh ngày 26/03/1989 tại Quảng Bình. Ông tốt nghiệp cử nhân ngành Sinh học, Ngôn ngữ Anh và thạc sĩ chuyên ngành Sinh học thực nghiệm tại Đại học Đà Lạt. Ông nhận học vị tiến sĩ chuyên ngành Sinh lý thực vật tại Đại học Khoa học, Đại học Huế. Hiện nay, ông là nghiên cứu viên, Phòng Sinh học phân tử và Chọn tạo giống cây trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên. Lĩnh vực nghiên cứu: Công Nghệ Sinh học Thực vật; Công nghệ thủy canh... Cao Đăng Nguyên sinh năm 1956. Ông tốt nghiệp cử nhân năm 1981 tại Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, tốt nghiệp thạc sĩ năm 1996 tại Đại học Huế và nhận học vị tiến sĩ năm 2001 tại Đại học Quốc gia Hà Nội. Năm 2004, ông đi nghiên cứu sau tiến sĩ (Dự án GDĐH) tại Đại học Goettingen, CHLB Đức. Năm 2010, ông nhận học hàm phó giáo sư. Hiện nay, ông là giảng viên khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế. Lĩnh vực nghiên cứu: Tách chiết, tinh sạch và khảo sát đặc tính của Lectin. Hoạt tính protein. Dƣơng Tấn Nhựt sinh ngày 06/04/1967 tại Khánh Hòa. Ông tốt nghiệp cử nhân ngành Sinh học năm 1991 tại Đại học Đà Lạt; thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ Sinh học Thực vật tại Đại học Kagawa (Nhật Bản) vào năm 1999; nhận học vị tiến sĩ năm 2002 tại Đại học Kagawa (Nhật Bản); nhận học hàm phó giáo sư năm 2009 và giáo sư năm 2018. Ông hiện đang giữ chức vụ Phó Viện trưởng của Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên (VAST) Lĩnh vực nghiên cứu: Công nghệ sinh học thực vật.