Cấy tủy xương để đánh giá số lượng tế bào gốc trung mô thông qua các đơn vị tạo khúm nguyên bào sợi (CFU-FS)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nội Khoa 487 CẤY TỦY XƯƠNG ĐỂ ĐÁNH GIÁ SỐ LƯỢNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ THÔNG QUA CÁC ĐƠN VỊ TẠO KHÚM NGUYÊN BÀO SỢI (CFU-FS) Trần Công Toại*, Cao Thỉ** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Ở Việt Nam chưa thấy có một nghiên cứu nào xác định đặc điểm của tủy xương liên quan đến khả năng tạo xương của tủy xương. Khả năng tạo xương của tủy xương là nhờ các tế bào gốc trung mô, được đánh giá thông qua số lượng CFU-Fs.Vì vậy chúng tôi thực hiện nghiên cứu nuôi cấy tế bào tủy và đếm số lượng CFU-Fs của tủy xương người Việt Nam. Phương pháp Khoảng 2.0 ml tủy xương được lấy vô trùng pha với 0.1 ml heparin (5000IU/ml). Tủy được cấy vào môi trường IMDM, 15% FBS, kháng sinh. Mẫu được nhuộm Giemsa để quan sát và đếm khúm tế bào CFU-Fs sau 7 ngày nuôi cấy. Có 20 mẩu tủy được cấy và đếm CFU-Fs. Kết quả: Nồng độ tế bào đơn nhân sau khi phân lập: 43,9x106/ml, Số CFU-Fs trung bình đếm được sau 7 ngày nuôi: 79,95. ABSTRACT CULTURE BONE MARROW TO EVALUATE MESENCHYMAL STEM CELLS BY MEANS OF COUNT OF CFU-FS. Tran Cong Toai, Cao Thi * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 12 - Supplement of No 4 - 2008: 488 – 490 Introduction: There aren’t studies about osteogenic potential of bone marrow in Viet Nam. Mesenchymal stem cells (MSCs) are responsible for osteogenic capacity of bone marrow. So, to assess quantity of Vietnamese MSCs, we culture bone marrow and count fibroblast colony forming units (CFU-Fs). Material and results: Average 2ml of non-infected bone marrow is mixed with 500IU heparin and cultured in medium IMDM, 15% FBS and antibiotic. Giemsa stain is used and CFU-Fs is counted after 7 days. Twenty individuals are enrolled in this study. After isolated, average concentration of nucleated cells is 43.9x106/ml. After 7 days of culture, average of CFU-Fs reaches 79.95. ĐẶT VẤN ĐỀ Khả năng tạo xương của tủy xương đã được Goujon nêu lên từ năm 1869[2]. Các thực nghiệm tế bào – sinh hóa, thực nghiệm ứng dụng của tủy xương trên động vật thí nghiệm, cũng như một số các nghiên cứu trên tủy người cho thấy tủy xương có tính chất tạo xương. Tủy xương bao gồm nhiều loại tế bào, trong đó có tế bào gốc dòng tạo máu và tế bào gốc trung mô. Các tế bào gốc trung mô là các tế bào trong thành phần mô đệm của tủy xương. Các tế bào này biệt hóa thành nhiều kiểu hình tế bào khác nhau, trong đó có các tiền tế bào tạo xương. Nhờ các tế bào này mà tủy xương có tính chất tạo xương. Để đánh giá số lượng của tế bào gốc trung mô trong tủy, cần phải cấy tủy và đếm số lượng các đơn vị tạo khúm nguyên bào sợi (CFU-Fs) sau khi nuôi cấy. Và do đó số lượng CFU-Fs đặc trưng cho khả năng tạo xương của tủy. Ở Việt Nam, chưa thấy một báo cáo nào nghiên cứu đặc điểm của tủy xương liên quan đến tính chất tạo xương của tủy, cụ thể là đếm số lượng CFU-Fs. Nhằm rút ra đặc điểm tủy xương liên quan đến tính chất tạo xương ứng dụng trong ngành chấn thương chỉnh hình, so sánh với một số y văn thế giới, chúng tôi tiến hành nghiên cứu nuôi cấy tủy xương và đếm số lượng CFU-Fs. * Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch ** Đại Học Y Dược TP. HCM Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nội Khoa 488 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Có 20 bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu. Các bệnh nhân này là các bệnh nhân chấn thương cơ quan vận động có phẫu thuật và được chọn ngẫu nhiên trong số các bệnh nhân của Khoa Chấn Thương Chỉnh Hình bệnh viện Chợ Rẫy. Trong lúc bệnh nhân đang được mổ, 2ml tủy xương được lấy từ mào chậu trước. Dùng kim chọc tủy chọc vào mào chậu hút ra 1 ml tủy, thay đổi vị trí đầu kim đến nơi khác trong mào chậu và hút thêm 1ml tủy. Cả 2ml tủy được cho vào ống nghiệm vô trùng có pha sẵn 500IU heparin để chống đông. Sau đó tủy được đưa về phòng thí nghiệm và xử lý trong vòng 4 giờ sau khi lấy. Tại đây, tủy được ly tâm tách và đếm tế bào có nhân. Thành phần tế bào được cấy vào môi trường IMDM, 15% FBS, có pha kháng sinh để chống nhiễm khuẩn. Sau 7 ngày, khi các khúm tế bào mọc thấy rõ, mẩu cấy sẽ được nhuộm giemsa để quan sát và đếm khúm tế bào. Mỗi khúm tế bào được xem là một CFU-F khi khúm phát triển được nhiều hơn 50 tế bào. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết quả phân lập tế bào và đếm CFU-Fs được cho trong bảng 1 Kết quả phân lập tế bào Nồng độ tế bào có nhân biến thiên rất lớn từ 10x106 đến 160x106 tế bào trên mỗi ml tủy. Nồng độ tế bào trung bình trong mỗi ml tủy bằng 43,9X106 với độ lệch chuẩn là 41,2X106. Theo nghiên cứu của Major và cộng sự thì trung bình mỗi ml tủy hút ra từ mào chậu người khỏe mạnh có chứa 46 ± 32,5x106 tế bào có nhân[3]. So sánh hai giá trị trung bình cho thấy kết quả của chúng tôi không khác biệt với kết quả của Major (p<0,05). Đối với nghiên cứu của Hernigou, số lượng tế bào có nhân trong tủy của các bệnh nhân khớp giả xương chày chỉ 18±7x106 [1]. Số liệu này có thể là do các bệnh nhân bị khớp giả thường có số tế bào tủy ít hơn, hoặc cũng có thể do cách lấy tủy của tác giả này là chích hút mỗi nơi đầu kim trong cánh chậu đến 4ml tủy. Kết quả đếm số CFU-Fs Số CFU-Fs cũng biến thiên rất rộng từ 29 đến 156, trung bình là 79,95. Độ lệch chuẩn là 73,2. So với nghiên cứu của Seebach và cộng sự thì ở nam giới khỏe mạnh, số CFU-Fs đếm được là 54±17[4]. Như vậy theo cách lấy tủy và môi trường cấy của chúng tôi, số CFU-Fs đạt được nhiều hơn. Cũng theo nghiên cứu của Seebach thì ở những bệnh nhân đa thương sẽ cho kết quả số CFU-F lớn hơn (59±25). Τrong khi đó theo kết quả của Hernigou thì có thể đếm được 612±134 CFU-Fs trên mỗi cm3 (12- 1224) sau 10 ngày nuôi cấy tủy. Số lượng tế bào có nhân ít hơn nhưng thu được nhiều CFU-Fs hơn. Điều này cho thấy sự khác biệt là do môi trường cấy và thời gian cấy, chứ không liên quan đến cách lấy tủy. Liên quan giữa số lượng tế bào có nhân và số CFU-Fs Dùng bảng ANOVA phân tích phương sai 1 yếu tố thì kết quả của chúng tôi không thấy có mối liên hệ giữa số lượng tế bào có nhân và số lượng CFU-Fs đếm được (p=0,11). Hernigou ghi nhận có thể thu được 1 CFU-F trong 3x104 tế bào có nhân của tủy xương, rong khi đó chúng tôi chỉ thu được trung bình là 1 CFU-F trong 53,6x104 tế bào có nhân. Liên quan giữa số CFU-Fs và tuổi, giới Bằng cách tương tự không thấy mối liên hệ giữa số CFU-Fs so với tuổi (p=0,9) và với giới tính (p=0,88). Bảng 1: Kết quả phân lập tế bào và đếm số CFU-Fs STTNăm sinhGiới tính Thể tích mẫu (ml) Mật độ tb/ml (X107) Số CFU-FS 1 1965 Nữ 2,5 5,5 138 2 1985 Nam 2,0 3,2 85 3 1959 Nam 2,0 6,9 120 4 1940 Nam 2,0 2,5 50 5 1952 Nam 2,0 1,5 82 6 1930 Nam 2,0 8,0 110 7 1975 Nam 2,0 16,0 93 8 1956 Nam 2,0 1,2 45 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nội Khoa 489 STTNăm sinhGiới tính Thể tích mẫu (ml) Mật độ tb/ml (X107) Số CFU-FS 9 1981 Nữ 2,0 11,6 89 10 1989 Nam 2,0 1,0 29 11 1990 Nữ 2,0 2,2 34 12 1990 Nam 2,0 4,6 156 13 1969 Nam 2,0 3,0 142 14 1957 Nam 2,0 1,5 44 15 1985 Nam 2,0 10,0 76 16 1965 Nam 2,0 2,5 70 STTNăm sinhGiới tính Thể tích mẫu (ml) Mật độ tb/ml (X107) Số CFU-FS 17 1974 Nữ 2,0 1,5 52 18 1960 Nam 2,0 2,0 46 19 1975 Nam 2,0 1,3 62 20 1954 Nữ 2,0 1,8 76 4,40,9 79,958,31 Một số hình ảnh nuôi cấy: Mẫu sau 1 ngày nuôi Mẫu sau 3 ngày nuôi Mẫu sau 7 ngày nuôi Mẫu sau ngày nuôi. Nhuộm Giemsa KẾT LUẬN Chúng tôi xây dựng được qui trình thu nhận tế bào trung mô tủy xương rút ra từ mào chậu. Kết quả mỗi ml tủy trung bình chứa 43,9x106 tế bào có nhân. Sau khi cấy 7 ngày đếm được 79,95 CFU-Fs. Đây là kết quả bước đầu cấy tủy đếm CFU-Fs, là tài liệu tham khảo cho các tác giả có quan tâm đến vấn đề tế bào gốc trung mô. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Hernigou P., Poignard A., Beaujean F., Rouard H. (2005), “Pecutaneous autologous bone marrow grafting for nonunion. Influence of the number and concentration of progenitor cells”, JBJS,87A(7),pp.1430-1437. 2. Hernigou P., Poignard A., Manicom O., Mathieu G., Rouard H. (2005), “The use of pecutaneous autologous bone marrow transplantation in nonunion and avascular necrosis of bone”, JBJS, 87B,pp. 896-902. 3. Majors A.K., Boehm C.A., Nitto H., Midura R.J., Muschler G.F. (1997), “Characterization of human bone marrow stromal cells with respect to osteoblastic differentiation”, J Orthop Res,15(4),pp.546-557. 4. Seebach C, Henrich D, Tewksbury R, Wilhelm K, Marzi I (2007), “Number and proliferative capacity of human mesenchymal stem cells are modulated positively in multiple trauma patients and negatively in atrophic nonunions”, Calcif Tissue Int,80(4),pp.294-300. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nội Khoa 490 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nội Khoa 491