Chẩn đoán di truyền ở các bệnh nhân mắc bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Sức Khỏe Sinh Sản và Bà Mẹ Trẻ em 502 CHẨN ĐOÁN DI TRUYỀN Ở CÁC BỆNH NHÂN   MẮC BỆNH TĂNG SẢN TUYẾN THƯỢNG THẬN BẨM SINH  Ngô Thị Hồng Phước*, Đỗ Thị Thanh Thủy*,**, Nguyễn Ngọc Minh***, Nguyễn Thị Băng Sương*,**  TÓM TẮT  Đặt vấn đề: Bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh (CAH) là bệnh di truyền ở người gây nên do đột  biến gen CYP21A2 trên nhiễm sắc thể số 6. Việc xác định đột biến gen CYP21A2 đóng vai trò quan trọng trong  việc chẩn đoán xác định bệnh cũng như tư vấn di truyền.   Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự và kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán đột biến gen CYP21A2.  Đối tượng và phương pháp: Tiến hành trên hai bệnh nhân CAH được chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm  sàng, tách chiết DNA của bệnh nhân và thực hiện kỹ thuật giải  trình  tự gen và MLPA  (Multiplex  ligation‐ dependent probe amplification) để phân tích đột biến gen CYP21A2.   Kết quả: Phát hiện được một bệnh nhân bị đột biến điểm và một bệnh nhân bị đột biến mất đoạn đồng hợp  tử từ exon 1 đến exon 3 của gen CYP21A2.   Kết luận: Nghiên cứu đã hoàn thiện quy trình và ứng dụng thành công kỹ thuật giải trình tự và kỹ thuật  MLPA trong chẩn đoán đột biến mất đoạn gen CYP21A2 gây bệnh CAH.  Từ khóa: Tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh, gen CYP21A2, MLPA.  ABSTRACT IDENTIFICATION OF GENE MUTATIONS AT CONGENITAL ADRENAL HYPERPLASIA PATIENTS  Ngo Thi Hong Phuoc, Do Thi Thanh Thuy, Nguyen Ngoc Minh, Nguyen Thi Bang Suong  * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 502 ‐ 507  Introduction:  Congenital Adrenal Hyperplasia  (CAH)is  a  genetic  disease  caused  by mutations  in  the  CYP21A2gene which  is  located  on  chromosome  6. Detection  of CYP21A2  gene mutations  is  important  for  diagnostic and genetic counseling. Sequencing and MLPA technique are used by many authors for diagnostic of  CYP21A2 gene mutations.  Objectives: Applification of sequencing and MLPA technique to identify mutations in CYP21A2 gene.  Patients and Methods: Two patients were diagnosed CAH by clinical symptoms,DNA of these patients  was  extracted  by Qiagen  kit. After  that we  performedsequencing  technique  to  identify  point mutations  and  MLPA technique to identify deletion mutations in CYP21A2 gene.  Results: Onepatient had point mutation and the other patient had homozygote deletion in CYP21A2 gene.   Conclusions: The research was initially completed the application process and successfully in the diagnosis  of CYP21A2 mutations causing CAH disease.  Keywords:Congenital Adrenal Hyperplasia, CYP21A2gene, MLPA .  ĐẶT VẤN ĐỀ  Bệnh  tăng sản  tuyến  thượng  thận  (CAH)  là  bệnh  di  truyền  trong  đó  thể  thiếu  enzym  21‐ hydroxylase là thể bệnh hay gặp nhất, chiếm tỷ  lệ 90 ‐ 95%. Đứng thứ hai là thể 11β‐hydroxylase  5 ‐ 9%, ngoài ra thiếu hụt các enzyme khác gây  các  thể  bệnh:  3β-HSD,  17α‐hydroxylase  và  20,  22‐desmolase  ít gặp hơn. Sự khiếm khuyết của  enzyme  21‐hydroxylase  dẫn  đến mức  độ  khác  * Trung tâm Y Sinh học phân tử, **Bộ môn Hóa sinh, ***Bộ môn Xét nghiệm, Đại học Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: TS. BS. Nguyễn Thị Băng Sương, ĐT: 0914007038, Email: suongnguyenmd@gmail.com  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Nhi Khoa 503 nhau  của  việc  suy  giảm  tổng  hợp  cortisol  và  giảm/hoặc không giảm aldosterone  đi kèm với  tăng sinh tổng hợp nội tiết tố androgen. Những  bất  thường này dẫn  đến nam hóa  các  thai nhi  nữ, phát triển thể trạng nhanh hơn bình thường  và giả dậy thì sớm ở trẻ nam. Trong đó thể mất  muối là hình thức nghiêm trọng nhất của bệnh,  do  thiếu  sinh  tổng  hợp  aldosterone  dẫn  đến  không  có  khả  năng  để  giữ  natri.  Nếu  không  được  điều  trị  kịp  thời  sẽ  dễ  nhanh  chóng  tử  vong trong vài tuần(4).  Tỷ  lệ  mắc  bệnh  trên  thế  giới  là  1/14.000‐ 15.000  trẻ  em  sơ  sinh,  trong  đó  thể  thiếu  enzym 21 – hydroxylase chiếm tỷ lệ 1/10.000 trẻ  sinh  ra(2,3).  Ở Việt Nam,  hiện  nay  vẫn  chưa  có  đề tài nghiên  cứu  về  tỷ  lệ mắc  bệnh  và  tỷ  lệ  người  lành  mang  gen  bệnh  tăng  sản  tuyến  thượng  thận  bẩm  sinh. Theo thống kê tại  khoa  Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền Bệnh viện Nhi  Trung ương, số lượng bệnh nhân hàng năm tăng  lên,  trung bình mỗi năm khoảng  40  –  70 bệnh  nhân nhập viện và được điều trị  tại khoa. Tính  đến  tháng  6  năm  2010  tổng  số  bệnh  nhân  lên  đến 512 trẻ. Hiện nay, Việt Nam được coi là một  trong những nước có tỷ lệ bệnh nhân mắc CAH  cao trên thế giới(9).  Nguyên  nhân  gây  bệnh  được  khẳng  định  chủ  yếu  do  đột  biến  gen  CYP21A2.  Gen  CYP21A2 mã hóa enzyme 21‐hydroxylase, nằm  trên  cánh ngắn NST  số 6  (6p21.3)  có  chiều dài  khoảng 30 kb. Phần lớn các đột biến (95%) do sự  bắt chéo không đồng đều giữa các cặp NST dẫn  đến  trình  tự  ở  vùng  giả  gen  CYP21A1P  sẽ  chuyển sang gen CYP21A2 trong quá trình phân  bào giảm nhiễm, 5% còn lại là do gen CYP21A2  tự đột biến(8, 10).  Việc phân tích đột biến gen CYP21A2 có vai  trò  quan  trọng  xác  định  bệnh  cũng  như  phân  loại  bệnh,  giúp  định  hướng  chỉ  định  điều  trị  bằng  liệu pháp hormon  thay  thế suốt đời và  là  cơ sở của tư vấn di truyền, chẩn đoán trước sinh  bệnh  tăng  sản  tuyến  thượng  thận  bẩm  sinh.  Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề  tài nhằm mục  tiêu:“Ứng dụng kỹ thuật giải trình  tự và kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán đột biến gen  CYP21A2”.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng nghiên cứu  Nhóm  nghiên  cứu:  2  bệnh  nhân  đã  được  chẩn  đoán  lâm  sàng mắc bệnh  tăng  sản  tuyến  thượng thận bẩm sinh.  Nhóm  đối  chứng:  2  người  bình  thường  không mắc bệnh  lý gì đặc biệt, mẫu đối chứng  này được dùng để chuẩn kỹ thuật và chạy cùng  với mẫu bệnh nhân.  Phương pháp nghiên cứu  Tách chiết DNA tổng số  Bước  1:  Thu  2  ml  máu  tĩnh  mạch  chống  đông EDTA của bệnh nhân.  Bước  2:  Sử  dụng  200  μl  máu  tĩnh  mạch  chống đông EDTA để  tách chiết DNA  tổng số,  sử dụng bộ  tách  chiết QIAamp DNA Blood mini  kit (Qiagen).  Bước 3: Hòa mẫu DNA trong 200 μl TE 1X,  bảo quản ở ‐200C.  Kiểm  tra  độ  tinh  sạch  DNA  bằng  máy  đo  quang phổ  Sử dụng 1‐5 μl DNA sau khi tách chiết, kiểm  tra bằng hệ  thống máy  định  lượng quang phổ  DNA Nanodrop 2000c.  Độ  tinh  sạch  nằm  trong  khoảng  1,8  đến  2,0 mới  được  sử dụng  để  tiến  hành phản ứng tiếp theo.  Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)  Sử dụng 2 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại  exon 1 đến exon 3 và exon 3 đến exon 9 của gen  CYP21A2,  phản  ứng  PCR  được  thực  hiện  trên  máy khuyếch đại gen Eppendorft.  Kỹ thuật điện di thường trên gel agarose  Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose  nồng độ 1%, đệm TBE 1X, kết quả được đọc trên  máy  geldoc.  Mẫu  bệnh  nhân  luôn  được  tiến  hành cùng với mẫu người bình thường.  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Sức Khỏe Sinh Sản và Bà Mẹ Trẻ em 504 Kỹ  thuật  MLPA  (multiplex  ligation  –  dependent probe amplification)  Sử  dụng  kit MLPA  P050  (MRC  ‐ Holland)  bao gồm 3 giai đoạn chính:  ‐  Biến  tính  và  lai DNA:  100  ng DNA  (hòa  trong  5μl)  được  biến  tính  và  lai  với  1,5μl  hỗn  hợp  probe  cùng  1,5μl  buffer MLPA  (chu  trình  nhiệt: 98oC – 5 phút, 25oC –  tạm dừng, 95oC– 1  phút, 60oC ‐ 16 giờ).   ‐  Phản  ứng  nối:  thực  hiện  bằng  enzyme  ligase (chu trình nhiệt: 54oC – 15 phút và 98oC – 5  phút).  ‐ Phản ứng PCR: tiến hành thực hiện các quy  trình  nhiệt  để  khuếch  đại  các  probe  đã  nối,  thành  phần  phản  ứng  PCR  gồm:  primer,  Taq  polymerase,  nước  (chu  trình  nhiệt:  95oC  –  1  phút, 30 chu kì với 95oC – 30 giây, 60oC – 30 giây,  72oC – 1 phút và kéo dài ở 72oC – 20 phút, 4oC  dừng).  Điện di và phân  tích kết quả:  điện di mao  quản trên máy Beckman Coulter. Sử dụng phần  mềm GeneMarker v1.92 để phân tích kết quả.  KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU  Bệnh nhân CAH 01   Kết quả PCR  Hình 1: Khuếch đại exon 1 đến exon 3 và exon 3 đến  exon 9 của gen CYP21A2.  BN: Mẫu bệnh nhân, BT: Mẫu người bình thường, (‐):  Mẫu nước  Nhận  xét:  Phản  ứng  PCR  đã  khuếch  đại  được hai đoạn: đoạn 1 từ exon 1 đến exon 3 (có  kích  thước  1157  bp)  và  đoạn  2  từ  exon  3  đến  exon 9  (có kích  thước 2051 bp), sản phẩm PCR  của  bệnh  nhân  và  người  bình  thường  có  kích  thước như nhau, bờ đều sắc nét. Từ đó chúng tôi  tiến hành giải trình tự sản phẩm khuếch đại của  bệnh nhân.  Kết quả giải trình tự gen  Hình 2. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân  CAH 01.  Nhận  xét:  Tại  vị  trí  c.1276  của  bệnh  nhân  xuất hiện một đỉnh của nucleotid T, trong khi đó  trình tự của genBank  là C. Sự sai khác này  làm  thay đổi acid amin arginine tại vị  trí codon 426  thành acid amin cysteine. Đột biến này đã được  Grischuk  công  bố  vào  năm  2006  trên  tạp  chí  J.Clin  Endocrinol  Metab(5).  Như  vậy  chúng  ta  khẳng  định bệnh nhân  bị  đột  biến  điểm  đồng  hợp tử tại c.1276C>T.  Hình 3. Kết quả giải trình tự exon 1 của gen  CYP21A2.  Nhận  xét:  Tại  codon  10  của  bệnh  nhân  có  chèn  thêm 3 nucleotid TGC,  trong khi đó  trình  tự genBank NG_007941 không có codon này.  BN Exon 1- 3 BT BN BT Exon 3 - 9 - - Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Nhi Khoa 505 Bệnh nhân CAH 02   Kết quả PCR  Hình 4. Kết quả PCR khuếch đại gen CYP21A2 của  bệnh nhân CAH 02  BN: Mẫu bệnh nhân, BT: Mẫu người bình thường  Nhận xét: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR cho  thấy ở mẫu người bình thường xuất hiện hai vạch  điện di tương ứng với 2 đoạn được khuếch đại có  kích thướng 1157 bp và 2051 bp. Trong khi đó mẫu  bệnh  nhân  không  lên  vạch,  điều  này  chứng  tỏ  bệnh nhân bị đột biến  tại vùng gắn mồi, do vậy  không khuếch đại được sản phẩm PCR.  Kết quả MLPA  Mẫu  bệnh  nhân  được  thực  hiện  phản  ứng  MLPA  cùng  mẫu  đối  chứng  (người  bình  thường) để so sánh.  Ex 3 Ex 1 Ex 4 Ex 8Ex 6 Hình 5. Kết quả MLPA của mẫu bệnh nhân CAH 02  Màu nhạt (bên trái): mẫu đối chứng. Màu đậm (bên phải):  mẫu bệnh nhân CAH 02.  Nhận xét: Tại các đỉnh tương tứng với exon  1 và exon 3 của gen CYP21A2, mẫu người bình  thường xuất hiện  đỉnh nhưng mẫu bệnh nhân  không xuất hiện đỉnh, chứng tỏ rằng bệnh nhân  bị đột biến mất đoạn đồng hợp tử từ exon 1 đến  exon 3 của gen CYP21A2. Xét các đỉnh của exon  4, 6, 8, chiều cao đỉnh của bệnh nhân chỉ bằng ½  so với mẫu người bình  thường,  chứng  tỏ  rằng  bệnh nhân  bị  đột  biến mất  đoạn dị hợp  tử  từ  exon 4 đến exon 8.  BÀN LUẬN  Bệnh tăng sản  tuyến  thượng  thận bẩm sinh  là  bệnh  di  truyền  liên  quan  đến  rối  loạn  hormone của  tuyến  thượng  thận, nguyên nhân  chính  gây  bệnh  là  do  đột  biến  gen  CYP21A2.  Tuy  nhiên  trong  cơ  thể  chúng  ta  tồn  tại  gen  CYP21A1P  là gen giả  (không có chức năng), có  trình  tự nucleotide  tương đồng 98% so với gen  CYP21A2. Như vậy vấn đề chỉ khuếch  đại gen  CYP21A2  để  phân  tích  đột  biến  ở  bệnh  nhân  CAH  là vấn đề rất khó khăn. Dựa vào sự khác  biệt 8 bp tại exon 3 của hai gen này chúng tôi đã  chọn  lựa  hai  cặp  mồi  được  thiết  kế  để  chỉ  khuếch  đại  chọn  lọc  gen  CYP21A2 mà  không  khuếch đại được gen CYP21A1P(7).  Phản ứng PCR ở bệnh nhân CAH 01 khuếch  đại  được  toàn  bộ  gen  CYP21A2  gồm  2  đoạn:  đoạn gen  từ exon 1  đến exon 3  (có kích  thước  1157  bp)  và  đoạn  từ  exon  3  đến  exon  9  (kích  thước 2051 bp). Sau đó, sản phẩm PCR được giải  trình  tự và kết quả phát hiện bệnh nhân bị đột  biến điểm đồng hợp  tử ở vị  trí c.1276 C>T, đột  biến này làm thay đổi acid amin tại codon 426 là  arginin thành cysteine (đột biến p.R426C) và đã  được Grischuk  công bố vào năm 2006  trên  tạp  chí  J  ClinEndocrinoMetab(5).  Arginine  là  một  trong  4  acid  amin  có  liên  kết  hydro  với  chuỗi  propionate của heme  (cysteine‐169, glycine‐178,  tryptophan‐302  và  arginine‐426),  điều  này  không chỉ giúp định hướng heme trong protein  mà còn  tham gia vào việc vận chuyển  điện  tử.  Sự đột biến thay đổi acid amin arginine tại vị trí  codon  426  thành  acid  amin  cysteine  sẽ phá vỡ  các  liên  kết  hydro  với  nhân  tố  heme,  khiến  Exon 1- 3 BN BT BN BT Exon 3 - 9 Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Sức Khỏe Sinh Sản và Bà Mẹ Trẻ em 506 protein  không  có  chức  năng  và  gây  thể  mất  muối CAH(6).  Ở  bệnh  nhân  này  chúng  tôi  còn  tìm thấy có sự khác biệt so với trình tự Genbank  NG_007941 như sau: tại codon 10 có chèn thêm  3  nucleotid  TGC,  kiểm  tra  kết  quả  SNP  trên  website NCBI  chúng  tôi  phát  hiện  đây  chỉ  là  SNP chứ không phải  đột biến. Từ kết quả này  cho thấy chúng tôi đã bước đầu hoàn thiện được  các yếu  tố  thực hiện quy  trình PCR  để khuếch  đại  gen CYP21A2  như:  lựa  chọn  trình  tự mồi,  chuẩn nồng độ các thành phần phản ứng, nhiệt  độ  của  chu  kì  luân  nhiệt  trong  phản  ứng  PCR,cũng như quá  trình giải  trình  tự gen để  xác định đột biến.  Ở bệnh nhân 2, mặc dù đã sử dụng các cặp  mồi  đặc hiệu như  đối với bệnh nhân CAH  01  nhưng kết quả PCR không khuếch đại được hai  đoạn gen của CYP21A2 như bệnh nhân CAH 01,  trong khi đó mẫu người bình  thường vẫn xuất  hiện 2 vạch  tương  ứng với kích  thước  của  sản  phẩm PCR.  Điều này  cho  thấy khả năng bệnh  nhân bị  đột biến  tại vùng gắn mồi, vì vậy  các  mồi  không  gắn  được  vào  phân  tử  DNA  của  bệnh nhân và không khuếch đại được vùng gen  cần khảo sát. Do cả hai đoạn exon 1‐3 và exon 3‐ 9  đều không  lên vạch  của  sản phẩm PCR nên  chúng tôi nghĩ bất thường có thể liên quan đến  exon gắn mồi chung là exon 3. Từ suy đoán này  chúng tôi tiếp tục sử dụng phản ứng MLPA để  phát hiện đột biến mất đoạn gen CYP21A2. Kết  quả hình 5 cho thấy ở người bình thường, tất cả  các  đỉnh  tương  ứng  với  các  exon  của  gen  CYP21A2  đều  xuất  hiện,  trong  khi  đó  ở mẫu  bệnh  nhân,  đỉnh  của  exon  1  và  exon  3  không  xuất hiện, còn đỉnh của các exon 4, 6, 8 có chiều  cao  chỉ bằng ½  so với người bình  thường. Kết  quả chứng tỏ bệnh nhân bị mất đoạn đồng hợp  tử từ exon 1 đến exon 3, còn từ exon 4 đến exon  8 thì bị mất đoạn dị hợp tử. Điều này suy đoán  rằngmột trong hai người bố (hoặc mẹ) của bệnh  nhân  sẽ  mang  kiểu  gen  CYP21A2  dị  hợp  tử,  trong  đó  1  allele  bình  thường  và  allele  bị  đột  biến mất đoạn từ exon 1‐3. Người mẹ (hoặc bố)  còn  lại  cũng  có  kiểu  gen CYP21A2  dị  hợp  tử,  mang 1 allele bị đột biến mất đoạn từ exon 1‐8.  Muốn khẳng định suy đoán cần tiến hành phân  tích  kiểu  gen  của  bố  và mẹ  bệnh  nhân.  Việc  phân tích di truyền bệnh CAH vẫn còn hạn chế  tại Việt Nam nhưng  đối với  các nước  trên  thế  giới  vấn  đề  này  được  quan  tâm  từ  lâu. Năm  2009, Concolino đã ứng dụng kỹ thuật MLPA để  chẩn đoán đột biến mất  đoạn và  lặp  đoạn gen  CYP21A2(3). Năm 2011, tác giả Rabbani cũng đã  dùng kỹ thuật MLPA để chẩn đoán đột biến mất  đoạn  đồng hợp  tử  gen CYP21A2  gây  thể  nam  hóa ở trẻ Azeri(1). Từ đó cho thấy phương pháp  MLPA  có  thể  sử  dụng  trong  chẩn  đoán  mất  đoạngen  CYP21A2  gây  bệnh  tăng  sản  tuyến  thượng  thận  bẩm  sinh  và  chúng  tôi  đã  thành  công trong việc ứng dụng phương pháp này.  KẾT LUẬN  Nghiên  cứu  đã  bước  đầu  ứng dụng  thành  công kỹ thuật giải trình tự gen để phát hiện đột  biến điểm và kỹ  thuật MLPA để phát hiện đột  biến mất đoạn gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản  tuyến  thượng  thận  bẩm  sinh.  Điều  này  có  ý  nghĩa  quan  trọng  trong  việc  chẩn  đoán  người  lành mang  gen  bệnh  và  chẩn  đoán  trước  sinh  cho các bà mẹ có kiểu gen dị hợp tử muốn tiếp  tục mang thai nhằm tránh sinh ra những đứa trẻ  bị bệnh.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Bahareh R, Akbari MT, Mahdieh N, Zaridust E, Ashtiani MT,  Lee HH, Auchus R, Rabbani A  (2011). Homozygous complete  deletion of CYP21A2causes a simple virilizing phenotype in an  Azeri child. Asian Biomedicine. 889‐892.  2. Brook C, Hughes I, and Kelnar C (2000). Antenatal Treatment of  a Mother Bearing a Fetus with Congenital Adrenal Hyperplasia.  Archive Disease Children Fetal Neonatal. 82(3):F176‐81.  3. Concolino  P, Mello  E, Toscano  V, Ameglio  F, Zuppi  C, Capoluongo E (2009). Multiplex  ligation – dependent probe  amplification (MLPA) assay for the detection of CYP21A2 gene  deletions/  duplications  in  Congenital  Adrenal  Hyperplasia:  First technical report.Clin Chim Acta. 402(1‐2):164‐70.  4. Day DJ, Speiser PW, Schulze E, Bettendorf M, Fitness  J, Barany  F, White  PC  (1996).  Identification  of Non‐Amplifying  CYP21  Genes When Using  PCR‐Based Diagnosis  of  21‐Hydroxylase  Deficiency in Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH) Affected  Pedigrees. Hum Mol Genet. 5(12):2039‐48.  5. Grischuk  Y, Rubtsov  P, Riepe  FG, Grötzinger  J, Beljelarskaia  S, Prassolov  V, Kalintchenko  N, Semitcheva  T, Peterkova  V, Tiulpakov  A, Sippell  WG, Krone  N  (2006).  Four  novel  missense mutations  in  the CYP21A2 gene detected  in Russian  patients suffering from the classical form of congenital adrenal  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Nhi Khoa 507 hyperplasia:  identification,  functional  characterization,  and  structural analysis. J.Clin Endocrinol Metab;91(12):4976‐80.  6. Haider S, Islam B, DʹAtri V, Sgobba M, Poojari C, Sun L, Yuen  T, Zaidi M, New MI (2013).Structure phenotype correlations of  human  CYP21A2  mutattions  in  congenital  adrenal  hyperplasia.Proc Natl Acad Sci USA; 110(7):2605‐10.  7. Loke KY, Lee YS, Lee WW, Poh LK (2001). Molecular Analysis  of  CYP‐21 Mutations  for  Congenital Adrenal Hyperplasia  in  Singapore.Horm Res; 55(4):179‐84.  8. Speiser PW, Dupont  J, Zhu D, Serrat  J, Buegeleisen M, Tusie‐ Luna  MT,  Lesser  M,  New  MI,  White  PC  (1992).  Disease  expression  and  molecular  genotype  in  congenital  adrenal  hyperplasia  due  to  21‐hydroxylase  deficiency.  J  Clin.  Invest;  90(2): 584‐595.  9. Trần Vân Khánh,  Lê  Thị  Phương,  Trần Huy  Thịnh  và  Tạ  Thành Văn (2012). Phát hiện đột biến gen CYP21A2 ở bệnh  nhân  tăng  sản  thượng  thận  bẩm  sinh.Tạp  chí nghiên  cứu Y  học, 78(1):100‐103.  10. Vrzalova’ Z, et al  (2011).Chimeric CYP21A1P/ CYP21A2 genes  identified  in  Czech  patients  with  congenital  adrenal  hyperplasia. Eur J Med Genet; 54(2):112‐7.  Ngày nhận bài báo:       01/11/2013  Ngày phản biện nhận xét bài báo:   26/11/2013  Ngày bài báo được đăng:     05/01/2014