Chế tạo chitosan khối lượng phân tử thấp bằng h2o2 và khảo sát khả năng cải thiện tỉ lệ sống của mô lan hồ điệp - Đặng Xuân Dự

CHẾ TẠO CHITOSAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP BẰNG H2O2 VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CẢI THIỆN TỈ LỆ SỐNG CỦA MÔ LAN HỒ ĐIỆP Đặng Xuân Dự(1), Phan Tứ Quý(2), Đinh Thị Thanh Thúy(1), Đặng Thị Ngọc Thanh(1), Lê Văn Trung Hiếu(1) (1) Trường Đại học Sài Gòn, (2) Trường Đại học Tây Nguyên Ngày nhận bài 27/05/2018; Ngày gửi phản biện 31/05/2018; Chấp nhận đăng 30/06/2018 Email: dangxuandu@sgu.edu.vn Tóm tắt Chitosan khối lượng phân tử thấp đã được chế tạo hiệu quả bằng phương pháp cắt mạch đồng thể và dị thể bằng dung dịch H2O2. Độ deacetyl (DDA) của chitosan được xác định bằng phương pháp phổ hồng ngoại (IR). Khối lượng phân tử chitosan được xác định bằng phương pháp sắc kí gel thấm qua (GPC). Kết quả cho thấy chitosan khối lượng phân tử khoảng 40 kDa và DDA khoảng 88% đã được chế tạo hiệu quả bằng dung dịch H2O2 ở nồng độ khá thấp, khoảng 2%. Chitosan thu được thể hiện hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm tốt trong quá trình khử trùng mẫu đối với nuôi cấy mô lan Hồ điệp (Phalaenopsis aphrodite). Từ khóa: chitosan, chitosan khối lượng phân tử thấp, lan Hồ điệp Abstract PREPARATION OF LOW MOLECULAR WEIGHT CHITOSAN BY HYDROGEN PEROXIDE AND ITS ACTIVITY FOR  ENHANCEMENT OF SURVIVAL RATIO IN PLANT TISSUE CULTURE OF PHALAENOPSIS APHRODITE Low molecular weight chitosan was prepared by heterogeneous and homogeneous degradation using hydrogen peroxide solution. The degree of deacetylation (DDA) of obtained chitosan samples was characterized by infrared spectra (IR). Chitosan molecular weight (Mw) was measured by gel permeation chromatography (GPC). Results showed that low molecular weight chitosan with Mw ~ 40kDa and DDA ~ 88% could be efficiently prepared by hydrogen peroxide solution at low concentration (~2%). The obtained low molecular weight chitosan showed good antimicrobial activity in sterilization in plant tissue culture of Phalaenopsis aphrodite. 1. MỞ ĐẦU Nghiên cứu ứng dụng các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên vào các lĩnh vực khác nhau trong đời sống là một trong những hướng đang được quan tâm hiện nay. Chitosan và các dẫn xuất của nó thường có hoạt tính sinh học cao, độc tính thấp và tự phân hủy sinh học. Nhờ các đặc tính này chúng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như xử lí nước thải, công nghiệp giấy, y tế, mỹ phẩm, thực phẩm, thức ăn chăn nuôi [5]. Nhiều nghiên cứu cho thấy khối lượng phân tử (KLPT) có ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của chitosan [4]. Thông thường, chitosan có KLPT thấp thể hiện hoạt tính sinh học tốt hơn chitosan có KLPT cao. Do đó, để tăng khả năng ứng dụng, chitosan cần được cắt mạch để thu được chitosan có KLPT thấp hơn hoặc oligochitosan. Nhiều phương pháp cắt mạch chitosan khác nhau như phương pháp vật lý, hóa học, sinh học đã được đề nghị và áp dụng để chế tạo các loại chitosan KLPT thấp có hoạt tính sinh học. Trong đó, phương pháp hóa học sử dụng hydro peoxit (H2O2) được cho là phương pháp khá hiệu quả dựa trên các phương diện: thao tác đơn giản, có thể tiến hành ở nhiệt độ thường, tác nhân cắt mạch có tính oxi hóa mạnh và khá thân thiện với môi trường. Lan hồ điệp là một chi lớn (Phalaenopsis Blume) với hơn 60 loài và nhiều dạng lai. Phalaenopsis aphrodite là một loài lan hồ điệp cho hoa lớn, màu sắc trang nhã, kiểu dáng cây đẹp nên được nhiều người ưa chuộng. Chúng được xếp vào loại cây nông nghiệp có giá trị kinh tế cao. Do nhu cầu sử dụng loài hoa này không ngừng tăng lên nên việc nghiên cứu nhân giống chúng bằng nuôi cấy in vitro để thu được số lượng lớn cây giống có độ đồng đều cao là rất cần thiết [3]. Việc nhân giống theo phương pháp này thường gặp khó khăn do mô cây lan rất dễ bị nhiễm khuẩn, nhiễm nấm. Để khắc phục vấn đề này, các tác nhân hóa học như calcium hypochlorite và cồn thường được sử dụng trong xử lý khử trùng mẫu mô trước khi đưa vào nuôi cấy. Tuy nhiên, chính khả năng oxy hóa mạnh của các tác nhân hóa học này cũng có thể làm cho mô thực vật bị tổn thương. Do vậy, trong nghiên cứu này, chitosan KLPT thấp đã được nghiên cứu chế tạo, và hoạt tính của chúng cũng đã được nghiên cứu như tác nhân kháng khuẩn kháng nấm thay thế cho các chất hóa học trong quá trình khử trùng mẫu mô trong nhân giống in vitro lan hồ điệp. 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Nguyên liệu, hóa chất Chitosan có nguồn gốc từ vỏ tôm, DDA khoảng 90%, KLPT Mw = 174,6 kDa. H2O2 ở dạng tinh khiết (Merck- Đức). Cồn 96° của công ty Trường Thịnh (Việt Nam). Một số hóa chất khác như CaOCl2, NaOH,... ở dạng tinh khiết được dùng cho phân tích. Nước cất hai lần được sử dụng cho toàn bộ thí nghiệm. Mẫu mô lan được lấy trên lá cây giống của Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông Nghiệp Công nghệ cao TP. Hồ Chí Minh. Thiết bị hấp tiệt trùng Autoclave SS-325 tại Phòng thí nghiệm Sinh học Trường Đại học Sài Gòn. Máy sắc kí gel thấm qua (GPC) và máy quang phổ hồng ngoại (FT-IR) của Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai công nghệ bức xạ (VINAGAMMA), TP. Hồ Chí Minh. Đĩa petri và một số dụng cụ thủy tinh khác của phòng Thí nghiệm Hóa học, Trường Đại học Sài Gòn. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Chế tạo chitosan khối lượng phân tử thấp: Chitosan được cắt mạch bằng H2O2 qua hai giai đoạn dị thể và đồng thể. Cắt mạch dị thể: Chitosan ban đầu được cắt mạch dị thể bằng H2O2 2%, tỉ lệ chitosan/H2O2 = 1/10 (w/v), phản ứng tiến hành ở điều kiện nhiệt độ phòng, thời gian phản ứng là 24 giờ. Sau phản ứng, mẫu được rửa bằng nước cất rồi để khô tự nhiên. Cắt mạch đồng thể: Để thu được chitosan có KLPT thấp hơn, mẫu chitosan sau quá trình cắt mạch dị thể được hòa tan trong acid lactic 3%, thêm một lượng H2O2 để thu được dung dịch phản ứng gồm chitosan 5%, H2O2 1%. Phản ứng cắt mạch đồng thể được tiến hành ở nhiệt độ phòng, mẫu được lấy theo thời gian 3, 6 và 9 giờ để theo dõi sự thay đổi KLPT và DDA của sản phẩm. Mẫu chitosan sau khi cắt mạch được trung hòa bằng dung dịch NH3 5% đến khi xuất hiện kết tủa. Thêm một lượng cồn gấp 6 lần thể tích mẫu, khuấy đều trong 10 phút. Lọc kết tủa và để khô tự nhiên, sau đó sấy mẫu ở nhiệt độ 60 – 70oC trong 2 giờ. Cuối cùng, mẫu được nghiền mịn và bảo quản trong túi PE để xác định KLPT và DDA. Đánh giá sản phẩm: Cấu tạo của chitosan cắt mạch và trạng thái tinh thể được xác định lần lượt bằng phương pháp hồng ngoại (FT –IR) và nhiễu xạ tia X (XRD). KLPT của chitosan được xác định bằng phương pháp sắc ký gel thấm qua (GPC). DDA được xác định bằng phương pháp phổ FT-IR dựa vào phương trình: DDA (%) = 100 - ([31,92x (A1320/A1420)] -12,20). Trong đó A1320 và A1420 là mật độ quang tương ứng tại các đỉnh hấp thụ 1320 cm-1 và 1420 cm-1 [1]. Khảo sát khả năng cải thiện tỉ lệ sống của mô lan hồ điệp: Quá trình nuôi cấy in vitro đối với lan Hồ điệp trải qua 3 giai đoạn cơ bản như mô tả ở sơ đồ Hình 1. Trong đó, giai đoạn 1 và 3 được tiến hành theo quy trình chuẩn. Ở giai đoạn 2, cồn 70o hay calcium hypochlorite (CaOCl2) thường được lựa chọn làm tác nhân khử trùng mẫu mô thực vật. Trong nghiên cứu này, các tác nhân trên được thay thế bằng chitosan KLPT thấp nhằm khảo sát ảnh hưởng của chitosan đến khả năng khử trùng và cải thiện tỉ lệ sống của mô lan Hồ điệp trong quá trình nuôi cấy. 1. Pha môi trường nuôi cấy 2. Xử lý và khử trùng mẫu 3. Nuôi cấy mô Hình 1. Ba bước cơ bản trong quy trình nuôi cấy mô lan hồ điệp Pha môi trường nuôi cấy: Môi trường nuôi cấy là MS (Murashigeskoog, 1962) bổ sung 100 mL nước dừa, 15 g sucrose, 1 mL BA và 5 g agar cho 1 L môi trường, pH = 5,8. Hấp khử trùng ở 121oC, trong 20 phút. Đổ môi trường vào đĩa Petri. Xử lý, khử trùng mẫu lá lan hồ điệp: Lá lan được rửa sạch bụi dưới vòi nước chảy. Trong tủ cấy vi sinh, mỗi lá được cắt thành nhiều mảnh nhỏ, kích thước khoảng 0,5 – 0,8 cm2, cho vào các bình tam giác để tiến hành quy trình khử mẫu. Có 4 nghiệm thức đã được tiến hành: - M1: rửa bằng nước cất vô trùng 5 lần → rửa bằng cồn70o trong 30 giây → rửa lại bằng nước cất vô trùng. - M2: rửa bằng nước cất vô trùng 5 lần → rửa bằng cồn70o trong 30 giây → ngâm trong calcium hypochlorite 2,5% trong 15 phút → rửa lại bằng nước cất vô trùng. - M3: rửa bằng nước cất vô trùng 5 lần → rửa bằng cồn70o trong 30 giây → ngâm trong chitosan KLPT thấp 30 ppm trong 15 phút. - M4: rửa bằng nước cất vô trùng 5 lần → ngâm trong chitosan KLPT thấp 30 ppm trong 15 phút. Nuôi cấy mô: Mẫu sau khi khử trùng được gắp ra và đặt vào đĩa Petri chứa môi trường nuôi cấy: 15 mẫu/đĩa. Các đĩa nuôi cấy mô được đặt trong phòng nuôi cây ở nhiệt độ 28°C, cường độ sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày. Sau 5 ngày nuôi cấy, hiệu quả khử trùng và tỉ lệ mẫu sống được đánh giá qua số lượng mẫu còn xanh tốt và không bị nhiễm khuẩn, nhiễm nấm. Bố trí thí nghiệm và đánh giá kết quả: Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Số liệu được xử lý bằng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (one-way ANOVA) theo trắc nghiệm LSD (Least-Significant Difference). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Chế tạo chitosan khối lượng phân tử thấp Cắt mạch dị thể chitosan Với mục tiêu chế tạo chitosan có KLPT thấp, làm chất kích kháng khuẩn, cải thiện tỷ lệ sống trong nuôi cấy mô lan, việc cắt mạch chitosan ban đầu có KLPT Mw ~ 174 kDa (Hình 2a) bằng H2O2 đã được thực hiện nhằm giảm độ nhớt của chitosan và gia tăng nồng độ của chúng trong dung dịch cho quá trình cắt mạch tiếp theo. Theo Qin và cộng sự (2002) [6], H2O2 là tác nhân cắt mạch chitosan hiệu quả và ít làm thay đổi cấu trúc sản phẩm nếu tiến hành ở nồng độ thấp và cắt mạch không quá sâu (Mw > 50 kDa). Trong nghiên cứu này, để hạn chế sự thay đổi cấu trúc của chitosan, nồng độ H2O2 là 2% cũng đã được lựa chọn cho quá trình cắt mạch dị thể. Quy trình cắt mạch dị thể chitosan được mô tả như ở mục 2.2.1. Sản phẩm thu được là chitosan KLPT thấp có dạng vảy, màu vàng nhạt (Hình 2.b), KLPT trung bình thu được là 80,2 kDa. Hình 2. Chitosan ban đầu (a) và sản phẩm chitosan cắt mạch dị thể (b) Quá trình cắt mạch dị thể đã làm KLPT của chitosan giảm khoảng 54,1%, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cắt mạch đồng thể. Theo nghiên cứu của Qin và cộng sự [6], chitosan KLPT thấp có mạch polymer ngắn, độ xoắn của phân tử polymer ít hơn vì thế gốc •OH dễ dàng tương tác lên mạch phân tử polysaccharide làm cho tốc độ cắt mạch xảy ra nhanh hơn. Từ sự giảm KLPT, có thể nhận thấy H2O2 ở nồng độ thấp (2%) khá hiệu quả trong việc cắt mạch chitosan. Cơ chế của quá trình cắt mạch bằng H2O2 đã được Qin và cộng sự (2002) [6] đề cập. H2O2 ® H+ + HOO- HOO- ® OH- + (O) HOO- + H2O2 ® •OH + O•- + H2O R-H + •OH ® R• + H2O R• ® R• + R2 (R – H: CTS) Hình 3. Sơ đồ cơ chế bắt hydro của gốc tự do [6] Theo cơ chế này, gốc •OH tạo thành từ quá trình thủy phân H2O2 là tác nhân chính của quá trình cắt mạch. Đây là tác nhân có tính oxy hóa mạnh, dễ bắt hydro để tạo thành gốc carbohydrate tự do, các gốc này trải qua quá trình chuyển vị và tái kết hợp, hình thành phân tử chitosan có KLPT thấp hơn (hình 3). Cắt mạch đồng thể chitosan Để thu được chitosan có KLPT thấp hơn cho việc khảo sát khả năng cải thiện tỷ lệ sống của mô lan, chitosan KLPT thấp ~ 80,2 kDa lại tiếp tục được cắt mạch đồng thể bằng H2O2 1% theo quy trình ở mục 2.2.1, thời gian lấy mẫu là 3h, 6h và 9h. Sản phẩm thu được tương ứng với từng thời điểm trên được minh họa ở Hình 4. Nhìn chung, chitosan sau khi cắt mạch đồng thể có dạng hạt mịn, màu vàng đậm. Hình 4. Sản phẩm cắt mạch đồng thể chitosan bằng H2O2 1% theo thời gian 1h (a); 3h (b) và 6h (c) Sự khác biệt về màu sắc của chitosan trước và sau khi cắt mạch dị thể cũng như cắt mạch đồng thể cho thấy chitosan có KLPT càng thấp thì màu sắc càng đậm, từ trắng chuyển sang vàng hay vàng nâu. Sự thay đổi màu đặc trưng cho sự tạo thành cấu trúc vòng glucopyranose chưa bão hòa (chứa nhóm carbonyl hay nhóm carboxyl) khi các gốc tự do tái kết hợp với nhau. Ngoài ra, sự thay đổi màu sắc của chitosan cắt mạch còn do sự hình thành liên kết đôi N=C từ phản ứng Maillard giữa nhóm -CHO (nhóm cuối của 2, 5 - anhydro - D - mannose) và nhóm -NH2 của chitosan [2]. Hình 5. Phổ FT- IR của chitosan ban đầu (a), chitosan cắt mạch dị thể (b), và chitosan cắt mạch đồng thể theo thời gian 3h (c), 6h (d), 9h (e). Phổ FT – IR của chitosan ban đầu và chitosan sau quá trình cắt mạch dị thể và đồng thể được thể hiện trên Hình 5 bên trên. Kết quả cho thấy FT – IR của các mẫu chitosan sau quá trình cắt mạch (Hình 5 b, c, d, e) xuất hiện hầu hết các đỉnh đặc trưng của chitosan ban đầu (Hình 5a). Điều này chứng tỏ sản phẩm cắt mạch có cấu tạo hầu như không thay đổi so với chitosan ban đầu. Đỉnh 1650 và 1597 cm-1 đặc trưng cho dao động kéo dãn của liên kết C=O trong nhóm –CONH– (amide I) và dao động uốn của –NH trong nhóm CONH– (amide II). Các đỉnh xuất hiện 1375 và 1020 cm-1 đặc trưng tương ứng cho metyl và C–O–C [6]. DDA của các mẫu chitosan tính được từ phổ FT – IR được trình bày ở Bảng 1. Kết quả cho thấy DDA của sản phẩm cắt mạnh đồng thể giảm không đáng kể so với chitosan ban đầu. Trong khi đó, KLPT của mẫu chitosan cắt mạch đồng thể sau 9 giờ giảm 50% so với mẫu chitosan ban đầu (Bảng 1). Bảng 1. Sự thay đổi KLPT và DDA của chitosan khi cắt mạch đồng thể theo thời gian Thời gian (h) 0 3 6 9 Mw (kDa) 80,2 63,2 43,5 40,9 DDA (%) 89,3 89,1 90,1 87,7 Giản đồ XRD của sản phẩm chitosan cắt mạch đồng thể theo thời gian được thể hiện ở Hình 6. Kết quả cho thấy các sản phẩm chitosan cắt mạch có 2 peak ở 2θ = 10,3° và 20°, đây là 2 peak đặc trưng của tinh thể chitosan [2]. Cường độ nhiễu xạ tại peak 2θ = 20° giảm dần, đỉnh peak mở rộng hơn khi tăng dần thời gian cắt mạch. Điều này cho thấy, cấu trúc chitosan chuyển dần từ dạng tinh thể sang dạng vô định hình khi cắt mạch đồng thể. Hình 6. Giản đồ XRD của chitosan cắt mạch đồng thể theo thời gian 3h (a); 6h (b); 9h (c) Theo một nghiên cứu trước đây, chitosan có KLPT trung bình trong khoảng 30 - 60 kDa thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt [2]. Dựa vào kết quả này, chitosan KLPT thấp ~ 40 kDa được lựa chọn để khảo sát khả năng kháng khuẩn kháng nấm, cải thiện tỷ lệ sống của mô lan Hồ điệp trong quá trình nuôi cấy in vitro. 3.2. Khả năng cải thiện tỷ lệ sống của mô lan Hồ điệp sử dụng chitosan khối lượng phân tử thấp Quy trình khảo sát khả năng kháng khuẩn kháng nấm, cải thiện tỷ lệ sống của mô lan Hồ điệp được thực hiện theo quy trình ở mục 2.2.3. Các mẫu mô lan sau 5 ngày nuôi cấy được thể hiện ở Hình 7. Trên đó, các điểm khoanh tròn là các mảnh lan bị nhiễm khuẩn nhiễm nấm, mô lan sẽ bị chết. Kết quả về số lượng mẫu lan khử trùng thành công (không bị nhiễm khuẩn nhiễm nấm) của 4 nghiệm thức được thể hiện ở Bảng 2. Kết quả phân tích ANOVA một yếu tố cho thấy ở độ tin cậy 95%, P = 0,000 0,05). Điều này chứng tỏ chitosan KLPT thấp ở nồng độ 30 ppm có khả năng thay thế cho calcium hypochlorite 2,5%, là chất sát khuẩn mạnh hay dùng trong giai đoạn khử trùng của quá trình nuôi cấy mô. Kết quả từ Bảng 2 cũng cho thấy khi không sử dụng calcium hypochlorite hay chitosan thì tỷ lệ sống của mô lan giảm khoảng 10%. Nếu không sử dụng cồn 70o trong quá trình xử lý mẫu thì tỷ lệ sống của mô lan chỉ đạt khoảng 70%. Hình 7. Tình trạng các mẫu mô lá lan trong các nghiệm thức M1, M2, M3 và M4 sau 5 ngày nuôi cấy Bảng 2. Số mảnh lan không nhiễm khuẩn, mốc sau 5 ngày và tỷ lệ sống trung bình của các mẫu sau 3 lần cấy Mẫu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Tỷ lệ sống (%) M1 27 27 28 27,33 91,10 M2 30 30 30 30,00 100,00 M3 30 28 30 29,33 97,77 M4 20 23 22 21,67 72,23 Hình 8. Mẫu mô lan quan sát dưới kính hiển vi. (a) mẫu xanh tốt bình thường, (b) mẫu bị chuyển màu xám do nhiễm nấm mốc ở nghiệm thức M2 sau 9 ngày nuôi cấy Chitosan là một tác nhân sinh học có khả năng kháng khuẩn bề mặt [2], [6]. Ưu điểm của chitosan là không làm tổn thương đến tế bào và có khả năng kích thích sinh trưởng đối với mô thực vật, khác với các tác nhân hóa học có tính sát khuẩn mạnh như calcium hypochlorite thường làm tổn thương đến tế bào. Hình 8b cho thấy các tế bào trong mảnh lan ở mẫu M2, được xử lý bằng calcium hypochlorite, đã bị tổn thương và có hiện tượng nhiễm mốc ở mô sau 9 ngày nuôi cấy, mặc dù tại thời điểm 5 ngày ở các mẫu M2 không quan sát được hiện tượng mảnh lan bị nhiễm mốc. Việc sử dụng chất sát khuẩn mạnh như calcium hypochlorite có thể làm tổn thương mô lan, dễ làm chết mô và tạo điều kiện cho sự nhiễm nấm. Chitosan là một hợp chất có nguồn gốc tự nhiên rất có triển vọng thay thế cho các tác nhân oxy hóa mạnh ở giai đoạn khử trùng trong quy trình nuôi cấy mô mà không làm tổn thương đến tế bào. Tuy vậy, để sử dụng hiệu quả chitosan làm chất kháng khuẩn trong quá trình khử trùng và nuôi cấy mô thực vật in vitro thì ảnh hưởng của các thông số ban đầu như KLPT, DDA và nồng độ áp dụng cần được nghiên cứu chi tiết hơn. Theo Nge và cộng sự [5], chitosan đóng vai trò như một chất kháng nấm mốc, một lượng nhỏ chitosan đã ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng và phát triển của lan. Chitosan có sự kết hợp độc đáo giữa các đặc tính sinh hóa như kích thích sinh trưởng thực vật, bảo vệ cây trồng, giúp kháng các vi sinh vật gây bệnh, và dễ dàng tự phân hủy. Nhờ các tính chất này, chitosan rất có triển vọng ứng dụng trong trồng trọt và nuôi cấy in vitro. 4. KẾT LUẬN Chitosan có KLPT thấp khoảng 40 kDa đã được chế tạo hiệu quả bằng phương pháp cắt mạch dị thể và đồng thể sử dụng H2O2 ở nồng độ thấp 1 – 2%. Chitosan cắt mạch có cấu tạo gần như không thay đổi so với chitosan ban đầu, độ tinh thể giảm. Chitosan sau quá trình cắt mạch thể hiện khả năng kháng khuẩn kháng nấm tốt, có triển vọng thay thế cho calcium hypochlorite ở giai đoạn khử trùng trong quá trình nuôi cấy in vitro đối với mô lan Hồ điệp. Chitosan thu được ở nồng độ khoảng 30 ppm kết hợp với cồn 70o trong việc xử lý khử trùng mô lan cho tỷ lệ sống đạt khoảng 98%. TÀI LIỆU THAM KHẢO Brugnerotto J., Lizardi J., Goycoolea F.M., Arguelles W., Desbrieres J., Rinaudo M. (2002). An infrared investigation in relation with chitin and chitossan characterization. Polymer, 42, pp. 3569-3580. Đặng Xuân Dự, Ngô Huyền Trân, Phạm Thị Thanh Hương (2015). Nghiên cứu chế tạo chitosan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính kháng khuẩn. Đề tài nghiên cứu khoa học, Trường Đại học Sài Gòn. Lê Hồng Giang, Nguyễn Bảo Toàn (2012). Hiệu quả của chitosan lên sự sinh trưởng của cụm chồi và cây con Lan Hồ Điệp (Phalaenosis sp.) in vitro. Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ, 24a, tr. 88-95. Võ Thị Mai Hương, Trần Thị Kim Cúc (2012). Nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan oligosaccharide lên sinh trưởng và năng suất cây lạc giống lạc L14. Tạp chí Khoa học Đại học Huế, 73 (4), tr. 125-135. Nge, K. L., Nwe, N., Chandrkrachang, S., Stevens W. F. (2006). Chitosan as a growth stimulator in orchid tissue culture. Plant Science, 170, pp. 1185-1190. Qin C. Q., Du Y. M., Xiao L (2002). Effect of hydrogen peroxide treatment on the molecular weight and structure of chitosan. Polymer Degradation and Stability,76, pp. 211–218. Xia W., Liu P., Zhang J., Chen J. (2011). Biological activities of chitosan and chitooligosaccharides. Food Hydrocolloids, 25, pp. 170 –179.