Chế tạo hạt từ gắn kháng thể kháng Salmonella SPP, dùng để tăng khả năng phát hiện vi khuẩn

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 250 CHẾ TẠO HẠT TỪ GẮN KHÁNG THỂ KHÁNG SALMONELLA SPP.,  DÙNG ĐỂ TĂNG KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN VI KHUẨN  Dương Ngọc Diễm*, Đỗ Thị Kim Yến*, Nguyễn Thị Nguyệt Thu*  TÓM TẮT  Đặt vấn đề: Salmonella spp. là tác nhân hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm. Phân tách miễn dịch từ (IMS)  sử dụng các vi hạt từ tính, có bề mặt gắn kháng thể đặc hiệu với Salmonella để tóm bắt và cô đặc vi khuẩn trực  tiếp trên các nền mẫu phức tạp, giúp giảm thiểu khả năng cho kết quả âm tính giả.   Mục tiêu nghiên cứu: Chế tạo phức hợp hạt từ gắn kháng thể kháng Salmonella và tối ưu phương pháp  IMS trong việc bắt giữ và cô đặc vi khuẩn.  Phương pháp nghiên cứu: Tinh chế kháng thể kháng Salmonella từ kháng huyết thanh thương mại bằng  phương pháp sắc kí ái lực miễn dịch. Kháng thể sau tinh chế được cộng hợp đồng trị lên hạt từ. Khảo sát các điều  kiện tối ưu của phương pháp IMS trong tóm bắt và phát hiện Salmonella.  Kết quả nghiên cứu: Phương pháp IMS sử dụng 2 μl (9,8x109 hạt/ml) phức hợp hạt từ 1 μm gắn 200 μg  kháng thể kháng Salmonella ủ với vi khuẩn trong 10 phút cho khả năng phát hiện 103 tế bào Salmonella/ml.   Kết luận: Kháng thể kháng Salmonella được tinh chế từ kháng huyết thanh thương mại và được gắn lên hạt  từ đường kính 1 μm. Phức hợp hạt từ ‐ kháng thể có khả năng bắt được tất cả các nhóm vi khuẩn Salmonella gây  ngộ độc thực phẩm (B, D, E, C1, C2‐C3) và nhóm A (chỉ được phân lập từ mẫu bệnh phẩm). Phương pháp IMS sử  dụng phức hợp hạt từ‐kháng thể tự chế tạo để tóm bắt và cô đặc hiệu quả Salmonella trực tiếp từ từ dung dịch  đệm pha loãng.   Từ khóa: Salmonella, phân tách miễn dịch từ, phương pháp cộng hợp  ABSTRACT  PREPARE THE COMPLEX OF IMMUNOMAGNETIC BEAD WITH COVALENTLY LINKED ANTI‐ SALMONELLA ANTIBODIES USED TO ENHANCE THE ABILITY TO ISOLATE SALMONELLA SPP.  Duong Ngoc Diem, Do Thi Kim Yen, Nguyen Thi Nguyet Thu   * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 5‐ 2014: 250 ‐ 256  Background: Salmonella is one of the most common causes of food poisoning in humans. Immunomagnetic  separation  (IMS) using  small  super‐paramagnetic  particles  coated with  antibodies  against Salmonella  for  the  isolation of this pathogen directly from complex samples. It helps to reduce false negative results.  Objectives: Prepare the complex of immunomagnetic bead with covalently linked anti‐Salmonella antibodies  and optimize the IMS procedure for trapping and isolating Salmonella.  Method:  Purified  antibodies  from  the  commercial  Salmonella  O  Antiserum  by  immuno‐affinity  chromatography on Hitrap‐protein A column. The antibodies were conjugated onto magnetic beads by 1‐ethyl‐3‐ (3‐dimethylaminopropyl)carbodiimide  hydrochloride  (EDC).  Evaluation  the  activity  of  antibodies  conjugated  beads by agglutination reaction on glass slide. Determine  the optimal conditions of  IMS method. Build‐in  the culture method  for the isolation of Salmonella  in  food samples using  the magnetic bead- antibodies  complex.  Results: Magnetisable beads  in 1 μm diameter were coated with 200 μg anti‐Salmonella antibodies. The  sensitive  of  system  in PBS  is 103 Salmonella per ml.  IMS method  is  set with  the  following parameters: 2  μl  * Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh  Tác giả liên lạc: Dương Ngọc Diễm   ĐT: 0909966780  Email: ngocdiem99s@yahoo.com  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 251 complex was incubated with bacteria in 10 minutes and the complex after catching bacteria were washed 3 times  with PBS – 0,1% Tween 20.  Conclusion: Purified anti‐Salmonella from commercial antiserum and prepared magnetic bead-antibodies  complex. This complex can arrest Salmonella groups: A, B, C1, C2‐C3, D and E. IMS technique using fabricated  complex to capture and concentrate Salmonella directly from diluted buffer solution.   Keywords: Salmonella, immunomagnetic separation, coating procedure  ĐẶT VẤN ĐỀ  Salmonella  spp.  là  một  trong  các  tác  nhân  hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm. Năm 2012, tại  Mỹ có 423 vụ ngộ độc thực phẩm thì ngộ độc do  Salmonella đứng hàng thứ hai và chiếm 25% 4. Ở  Việt Nam, mỗi năm có khoảng 120‐250 vụ ngộ  độc thực phẩm do nhiễm khuẩn trong đó số vụ  ngộ  độc  do  Salmonella  chiếm  đến  70%15.  Theo  thống  kê,  S.  enteritidis  và  S.  typhimurium  là  hai  kiểu huyết  thanh phổ biến nhất được phân  lập  từ mẫu thực phẩm cũng như từ bệnh nhân trên  toàn thế giới4,5.  Các  thực phẩm  thường nhiễm Salmonella  là  thịt,  cá,  trứng,  sữa,  thủy  sản,  rau  quả,  nước  chấm, nước khoáng,  Trong những năm gần  đây, tỷ lệ bùng phát ngộ độc thực phẩm gây ra  bởi  trái  cây  tươi và  rau quả đã  tăng  lên và  trở  thành mối quan tâm lớn ở nhiều nước(12).   Do  Salmonella có  khả năng gây hại nghiêm  trọng đến sức khỏe con người và động vật nên  nhiều nước  trên  thế giới  trong đó có Việt Nam  đã qui  định không  cho phép  sự hiện diện  của  Salmonella thực phẩm(3,11).  Phương pháp phát hiện Salmonella hiện nay  thường cho kết quả  từ 5‐7 ngày và  trên một số  nền mẫu phức  tạp  có  thể  cho kết quả  âm  tính  giả.  Vì  thế,  một  phương  pháp  xác  định  Salmonella cho kết quả nhanh hơn, với độ nhạy  bằng hay cao hơn phương pháp nuôi cấy thông  thường là cần thiết.   Phân tách miễn dịch từ được sử dụng thành  công và  rộng  rãi  trong nhiều  lĩnh vực sinh học  khác nhau như sinh học phân tử, miễn dịch học  và vi sinh học13. Để tách vi khuẩn mong muốn có  trong mẫu, các vi hạt có từ tính được gắn kháng  thể  đặc hiệu với vi khuẩn  đích. Vi hạt  sau khi  liên kết đặc hiệu với vi khuẩn đích dễ dàng được  tách khỏi  các  thành phần khác  trong mẫu nhờ  vào thanh nam châm đặt bên ngoài ống nghiệm.  Vi khuẩn  liên kết trên hạt từ vẫn giữ được khả  năng  tăng  sinh  trên  các  loại  môi  trường.  Kỹ  thuật IMS được thực hiện trong khoảng 30 phút,  có  thể  thay  thế hay  làm  tăng hiệu quả  của  các  bước tăng sinh chọn lọc (thông thường cần 18‐48  giờ)10.  Hiện  nay,  tại Việt Nam,  đã  có  nghiên  cứu  đầu  tiên  ứng dụng phức hợp hạt  từ‐kháng  thể  kháng E.coli O157 dạng thương mại để phân lập  vi khuẩn E.coli O157:H7 10. Tuy nhiên, vấn đề về  chế tạo phức hợp hạt từ gắn kháng thể kháng vi  sinh vật mục tiêu vẫn chưa có công bố trong bất  kì công trình nghiên cứu nào.  Mục tiêu nghiên cứu  ‐ Chế  tạo  phức  hợp  hạt  từ  gắn  kháng  thể  kháng Salmonella.  ‐ Tối ưu và đánh giá phương pháp IMS trong  việc bắt giữ và cô đặc Salmonella.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng nghiên cứu  ‐  Chủng  vi  khuẩn:  Salmonella  Paratyphi  A  ATCC  9150,  Salmonella  Typhimurium  ATCC  14028,  Salmonella  Choleraesuis  ATCC  12011,  Salmonella Newport, Salmonella Enteritidis ATCC  13076,  Salmonella  Anatum,  Salmonella  Senftenberg.   ‐  Hạt  từ  mang  nhóm  carboxylic  acid:  Carboxylic acid MyOne với kích  thước hạt  là 1  μm và Carboxylic acid M‐270 với kích thước hạt  là 2,8 μm (Invitrogen).  ‐ Huyết thanh thỏ đa giá kháng Salmonella  nhóm  O:  Salmonella  O  Antiserum  Poly  A,  Salmonella O Antiserum Poly B (BD Difco).  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 252 Phương pháp nghiên cứu  Xác  định  khả  năng  phản  ứng  của  kháng  huyết thanh thương mại với các chủng vi khuẩn  S.  paratyphi A,  S.  typhimurium,  S.  cholerasuis,  S.  newport, S. enteritidis, S. anatum và S. Senftenberg  Mỗi  loại vi khuẩn  sau 24 giờ nuôi  cấy  trên  TSA  ở  37ºC  trộn với 10  μl kháng huyết  thanh.  Quan  sát  ngưng  kết  sau  1  phút. Chứng  âm  là  mẫu vi khuẩn trong NaCl 0,9%.   Tinh  chế  kháng  thể  từ  kháng  huyết  thanh  thương  mại  bằng  sắc  ký  ái  lực  qua  cột  Hitrap‐Protein A  Cho 1 ml dung dịch kháng huyết thanh qua  cột Hitrap‐Protein A. Rửa cột sắc ký bằng dung  dịch đệm Tris‐HCl 10 mM, pH=7,5. Đẩy kháng  thể bám trên cột bằng dung dịch glycine 0,1 M,  pH=2,5 và trung hòa bằng Tris 1 M, pH=8. Thu  phần kháng thể qua cột và bảo quản ở 4ºC cho  đến khi sử dụng.  Định  lượng  protein  bằng  phương  pháp  Bradford  Dung dịch  IgG  chuẩn: pha  trong  đệm PBS  (dải nồng độ đi  từ 0‐32 g/ml). Dung dịch  IgG  chuẩn  và  IgG  mẫu  được  ủ  với  dung  dịch  Bradford  trong  5  phút  tại  nhiệt  độ  phòng.  Đo  hấp phụ quang của các dung dịch tại bước sóng  595 nm.   Dựng  đường  chuẩn  dựa  trên  lượng  IgG  chuẩn và độ hấp  thụ của nó. Dựa  trên đường  chuẩn  xác  định  nồng  độ  của  dung  dịch  IgG  chưa biết.  Dùng  phần mềm  KC4  để  tính  hàm  lượng  kháng thể có trong mẫu.  Cộng hợp đồng trị kháng thể sau tinh chế vào  hạt từ (theo hướng dẫn của nhà sản xuất)  1 ml hạt từ được rửa với 1 ml đệm MES 15  mM, pH=6. Huyền phù hạt từ trong 100 l đệm  MES 15 mM, pH=6 và hoạt hóa bằng 100 l EDC  trong 30 phút ở nhiệt độ phòng và lắc tròn. Loại  bỏ nước nổi bằng DynaMag‐2 và thu hạt từ.  Thêm  kháng  thể O‐polyA, O‐polyB  vào.  Ủ  lắc dung dịch  trên qua  đêm  ở nhiệt  độ phòng.  Loại bỏ nước nổi và thu hạt từ. Rửa hạt từ bằng  1 ml đệm PBS‐0,1% Tween 20. Huyền phù lại hạt  từ  trong PBS‐0,1% Tween 20‐0,1% BSA  (9,8x109  hạt/ml). Bảo quản phức hạt từ‐kháng thể ở 4ºC.   Khảo sát các điều kiện tác động đến khả năng  tương  tác  của  hạt  từ  gắn  kháng  thể  với  vi  khuẩn S. Enteritidis  Chuẩn bị mẫu vi khuẩn  Vi  khuẩn  S.  enteritidis  được  nuôi  cấy  trong  nước  đệm pepton  từ 18‐24 giờ  ở 37ºC  cho  đến  khi  OD600  đạt  khoảng  0,8  ứng  với  1‐2x108  cfu/ml(16. Dung dịch trên được pha loãng bậc 10  trong  đệm muối phosphate  thành dãy:  107‐106‐ 105‐104‐103‐102‐101‐100  cfu/ml.  Mật  độ  vi  khuẩn  được xác định bằng cách cấy trải các dung dịch  lên đĩa thạch TSA, ủ ở 37ºC từ 18‐24 giờ và đếm  số khuẩn lạc tạo thành.  Tác động của kích thước hạt từ và lượng kháng thể gắn lên hạt Các  dạng  hạt  từ  được  ủ  với  các  nồng  độ  kháng thể khác nhau. Hạt có đường kính 1 μm:  cộng hợp  ở hai nồng  độ kháng  thể  là  200, 400  μg/ml hạt. Hạt có đường kính 2,8 μm: cộng hợp  ở 3 nồng độ kháng thể là 200, 400, 600 μg/ml hạt.  Sau khi ủ 10 phút với vi khuẩn ở dãy pha loãng  từ  102‐105,  rửa  3  lần,  cấy  trải  lên  thạch XLD,  ủ  37°C trong 18‐24 giờ và đếm số khuẩn lạc.  Tác động của thể tích phức hợp hạt từ‐kháng thể   Phức hợp hạt từ‐kháng thể với thể tích 1, 2, 5  và 10 μl được cho vào bắt vi khuẩn ở dãy pha  loãng  từ  102‐105.  Sau  IMS,  cấy  trải  0,1 ml  lên  thạch XLD.  Tác động của thời gian ủ phức hợp hạt từ‐kháng thể  với vi khuẩn đích   Phức hợp hạt từ‐kháng thể được cho vào bắt  vi khuẩn ở dãy pha loãng từ 102‐104 với thời gian  ủ 5, 10, 20 và 40 phút. Sau IMS, cấy trải 0,1 ml lên  thạch XLD.  Khả năng bắt các loại vi khuẩn Salmonella của hạt từ  gắn kháng thể  Hút 1 ml dung dịch vi khuẩn đã pha  loãng  (102‐106) vào từng ống eppendorf. Thêm 2 μl hạt  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 253 từ và hỗn hợp được ủ lắc ở nhiệt độ phòng trong  10  phút.  Loại  bỏ  nước  nổi  dùng  nam  châm  DynaMag‐2.  Rửa  phức  hợp  hạt  từ  bằng  đệm  PBS‐0,1% Tween 20. Huyền phù phức hợp hạt  từ‐vi  khuẩn  trong  100  l NaCl  0,9%.  Cấy  trải  toàn  bộ  phức  hợp  lên  thạch  XLD  và  đếm  số  khuẩn lạc.  KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN  Xác  định  khả  năng  bắt  Salmonella  của  kháng huyết thanh thương mại  Hiện  nay  có  hơn  2600  kiểu  huyết  thanh  Salmonella, trên 59% thuộc về S. enterica subsp. I  (S.  enterica  subsp.  enterica).  Trong  S.  enterica  subsp. I, các kiểu huyết thanh kháng nguyên O  thông dụng nhất là A, B, C1, C2‐C3, D và E (E1‐E4).  99% bệnh do Salmonella trên người và các động  vật máu  nóng  gây  ra  từ  các  kiểu  huyết  thanh  này. Tuy nhiên, chỉ khoảng 10 kiểu huyết thanh  thường gây ra ngộ độc: S. typhimurium, S. derby  và S. heidelberg (nhóm B), S. enteriditis (nhóm D),  S. anatum và S. senftenberg  (nhóm E), S. virchow,  S. montevideo và S. infantis (nhóm C1), S. hadar và  S.  newport  (nhóm  C2‐C3)25,  trong  đó  S.  typhimurium  và  S.  enteriditis  được  xem  là mầm  bệnh truyền qua thực phẩm quan trọng nhất.  Kháng huyết thanh thương mại O‐poly A và  O‐poly B  có  đặc  tính ngưng kết  với  các nhóm  Salmonella như sau:   ‐  Salmonella  O  Antiserum  Poly  A  dùng  ngưng kết với Salmonella nhóm A, B, D, E, L.   ‐ Salmonella O Antiserum Poly B dùng ngưng  kết với Salmonella nhóm C1, C2, F, G, H.   Kiểm  tra  khả  năng  phản  ứng  của  kháng  huyết thanh thương mại với các chủng vi khuẩn  S. paratyphi A  (nhóm A), S. typhimurium  (nhóm  B), S. enteritidis (nhóm D1), S. anatum (nhóm E1),  S. senftenberg  (nhóm E4), và S. cholerasuis  (nhóm  C1), S. newport (nhóm C2‐C3), chúng tôi nhận thấy  kháng huyết  thanh  có khả năng ngưng kết với  các  chủng  trên  (hình 1). Do  đó,  để  có  thể phát  hiện  được  tất  cả  các kiểu huyết  thanh gây ngộ  độc  thực phẩm,  chúng  tôi  đã dùng  cả hai  loại  kháng thể trên phủ lên hạt từ.  Hình 1: Kiểm tra kháng huyết thanh thương mại   Khả năng cộng hợp kháng thể lên hạt từ  Mật độ  liên kết của kháng thể vào hạt từ  là  yếu  tố quyết  định hiệu quả  liên kết  của hạt  từ  với vi khuẩn  sau này. Theo hướng dẫn  từ nhà  sản xuất, nồng độ kháng thể gắn lên hạt tối đa là  400  μg/ml  đối với hạt  có  đường kính 1  μm và  600 μg/ml đối với hạt có đường kính 2,8 μm. Do  đó,  chúng  tôi  tiến  hành  gắn  kháng  thể  ở  các  nồng độ khác nhau nhưng không vượt quá nồng  độ khuyến cáo của nhà sản xuất.   ‐ Hạt có đường kính 1 μm: cộng hợp kháng  thể ở 2 nồng độ 200, 400 μg/ml hạt.  ‐ Hạt có đường kính 2,8 μm: cộng hợp kháng  thể ở 3 nồng độ 200, 400, 600 μg/ml hạt.   ‐ Xác định hiệu suất của quá trình cộng hợp  bằng phương pháp Bradford.  Kết quả cho thấy tất cả kháng thể đều cộng  hợp  hết  lên  hạt  từ  trừ  nồng  độ  400  μg  kháng  thể/ml hạt  từ 1 μm hiệu  suất cộng hợp chỉ  đạt  81,3%.  Do  đó,  lượng  kháng  thể  gắn  trên  hạt  tương ứng là 325 μg/ml.   Chúng  tôi  thực  hiện  phản  ứng  ngưng  kết  giữa phức hợp hạt  từ‐kháng  thể với  các  chủng  Salmonella  trên  lam kính  để xác  định khả năng  tương tác giữa kháng thể với Salmonella sau cộng  hợp.   Hình 2: Kiểm tra hoạt tính phức hợp hạt từ‐kháng  thể sau cộng hợp  Kết quả cho thấy, phức hợp hạt từ‐kháng thể  vẫn có khả năng ngưng kết với tất cả các nhóm  Salmonella: A, B, C1, C2‐C3, D và E (biểu hiện qua  các hạt từ kết tụ lại tại tâm của dung dịch). Hạt  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 254 từ không gắn kháng thể được xem là mẫu đối  chứng (phân bố đều trong dung dịch).  Khảo  sát  các  điều kiện  tác  động  đến khả  năng  tương  tác  của hạt  từ  gắn kháng  thể  với vi khuẩn S. enteritidis  Để khảo sát các điều kiện tối ưu cho phương  pháp IMS, chúng tôi dùng chủng S. Enteritidis vì  đây  là kiểu huyết thanh thường gặp nhất trong  các vụ ngộ độc thực phẩm.  Tác động kích thước hạt từ và lượng kháng thể  gắn lên hạt  Kích  thước  hạt  và  lượng  kháng  thể  sẽ  quyết định khả năng tóm bắt vi khuẩn. Trong  một số nghiên cứu, hạt từ có đường kính nhỏ  bắt vi khuẩn  tốt hơn do  tốc độ  lắng chậm khi  ủ,  thời gian  tóm bắt vi khuẩn mục  tiêu nhanh  và  ít  gắn  kết  với  các  thành  phần  không  đặc  hiệu.  Một  số  nghiên  cứu  khác  cho  thấy  sử  dụng hạt  từ  lớn  tốt hơn do bề mặt  lớn nên dễ  dàng  tiếp  xúc  với  bề mặt  tế  bào  vi  khuẩn8,9. Mật  độ  kháng  thể  liên  kết  lên  hạt  cũng  tác  động  đến  hiệu  suất  bắt  giữ  vi  khuẩn. Nếu  lượng kháng  thể  trên hạt  thấp, khả năng  tóm  bắt  vi  khuẩn  ở  lượng  thấp  giảm. Nếu  lượng  kháng  thể  trên  hạt  cao,  hiệu  suất  bắt  có  thể  giảm  do  hiệu  ứng  cản  không  gian  giữa  các  phân  tử  kháng  thể  làm  chúng  khó  tương  tác  với vi khuẩn.   Trên hai  loại hạt từ có đường kính 1 μm và  2,8  μm  có  các mật  độ  kháng  thể  liên  kết  khác  nhau, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng tóm  bắt  vi khuẩn S.  enteritidis  tại dãy pha  loãng  từ  102‐105. Do Salmonella có  thể  liên kết không đặc  hiệu với hạt  từ gắn kháng  thể nên để xác định  khả năng liên kết vào hạt từ của vi khuẩn là do  liên kết đặc hiệu với kháng  thể hay do  liên kết  không đặc hiệu với phức hợp hạt từ‐kháng thể,  thực  hiện  gắn  kháng  thể  tả  lên  hạt  từ  và  tiến  hành thí nghiệm song song. Kết quả cho thấy hạt  từ gắn kháng thể tả không tương tác không đặc  hiệu với Salmonella. Đường kính hạt và mật độ  kháng thể liên kết trên hạt tác động đến hiệu quả  bắt  giữ  vi  khuẩn  đích  (bảng  1).  Khi  sử  dụng  cùng một thể tích hạt từ để tóm bắt vi khuẩn, hạt  từ 2,8 m chỉ bắt được vi khuẩn ở độ pha loãng  104  trong khi hạt  từ 1 m vẫn  tóm bắt được vi  khuẩn ở độ pha loãng 102. Xét về mật độ kháng  thể  liên kết  trên hạt  từ 1 m, kết quả  cho  thấy  không  có  sự  khác  biệt  về  khả  năng  bắt  giữ  vi  khuẩn đích giữa 2 nồng độ 200 và 325 μg/ml hạt.  Do đó, chúng tôi chọn hạt từ 1‐200 (hạt từ 1 μm  phủ 200 μg kháng thể kháng Salmonella) cho các  bước thử nghiệm tiếp theo.  Bảng 1: Ảnh hưởng của kích thước hạt từ và lượng  kháng thể gắn lên hạt  Vi khuẩn/ml 2,8 m 1 m 1 m- IgGtả 600 µg/ml 400 µg/ml 200 µg/ml 325 µg/ml 200 µg/ml 325 µg/ml 9,2x105 23 28 24 >250 >250 0 9,2x104 19 0 6 >250 >250 0 9,2x103 0 0 0 151 193 0 9,2x102 0 0 0 41 27 0 Tác  động  của  thể  tích  phức  hợp  hạt  từ‐ kháng thể   Lượng hạt từ sử dụng cần phải tối ưu vì đây  là vật liệu có giá thành tương đối cao nhưng vẫn  đảm bảo khả năng bắt giữ được vi khuẩn. Phức  hợp hạt từ‐kháng thể với các thể tích khác nhau  (1, 2, 5 và 10 μl) được cho vào bắt vi khuẩn ở dãy  pha  loãng từ 102‐105. Mỗi nồng độ  lặp  lại 3  lần.  Thực hiện IMS. Kết quả cho thấy thể tích từ càng  nhiều khả năng bắt vi khuẩn càng tốt, nhưng với  thể  tích 2 μl hạt từ vẫn có khả năng  tóm bắt vi  khuẩn tại độ hòa loãng tương tự như các thể tích  cao hơn (bảng 2) nên chúng tôi chọn thể tích 2 μl  từ cho các thí nghiệm tiếp theo.  Bảng 2: Ảnh hưởng của thể tích phức hợp hạt từ‐ kháng thể đến khả năng bắt S.E  Thể tích hạt từ sử dụng (µl) Khuẩn lạc sau IMS và cấy trải trên XLD 2,4x102 2,4x103 2,4x104 2,4x105 1 1 19 71 234 2 24 197 > 250 > 250 5 49 220 > 250 > 250 10 55 > 250 > 250 > 250 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 255 Tác động của thời gian ủ phức hợp hạt từ‐ kháng thể với vi khuẩn đích   Thời gian ủ lắc giúp phức hợp hạt từ có khả  năng tiếp xúc với vi khuẩn đích trong dung dịch.  Tuy nhiên, thời gian ủ quá nhanh khả năng tiếp  xúc giữa hạt  từ và vi khuẩn kém. Thời gian  ủ  càng  lâu  khả  năng  tóm  bắt  vi  khuẩn  càng  tốt  nhưng đồng thời xuất hiện các tương tác không  đặc hiệu  4. Để  thực hiện  IMS nhanh, giảm gắn  không  đặc  hiệu  nhưng  vẫn  tóm  bắt  vi  khuẩn  đích,  chúng  tôi  tiến hành  cho phức hợp hạt  từ  bắt vi khuẩn ở dãy pha loãng từ 102‐104 với thời  gian thay đổi từ 5, 10, 20, 40 phút. Mỗi nồng độ  lặp lại 3 lần. Kết quả cho thấy, với thời gian ủ là  10  phút,  hạt  từ  vẫn  có  khả  năng  tóm  bắt  vi  khuẩn  (bảng  3).  Thời  gian  phản  ứng  càng  dài  cũng không tăng hiệu suất bắt giữ vi khuẩn.  Bảng 3: Ảnh hưởng của thời gian ủ thể đến khả năng  bắt S.E  Thời gian ủ (phút) Khuẩn lạc sau IMS và cấy trải trên XLD 5,6x102 5,6x103 5,6x104 5 0 15 82 10 24 197 > 250 20 30 185 > 250 40 29 201 > 250 Khả  năng  bắt  các  nhóm  vi  khuẩn  Salmonella của hạt từ gắn kháng thể  Xác  định  khả  năng  tóm  bắt  các  nhóm  vi  khuẩn Salmonella ở dãy pha loãng từ 102‐106 của  phức hợp hạt từ‐kháng thể. Mỗi nồng độ lặp lại  3 lần. Thực hiện IMS. Kết quả cho thấy phức hợp  hạt từ‐kháng thể có khả năng tóm bắt Salmonella  thuộc các nhóm B, D1, E1, E4 ở nồng độ 102 cfu/ml  và  Salmonella  thuộc  nhóm A, C  ở  nồng  độ  103  cfu/ml.  Bảng 4: Khả năng tóm bắt từng nhóm Salmonella của phức hợp hạt từ‐kháng thể  Nồng độ Khuẩn lạc sau IMS và cấy trải trên XLD S. typhimurium (1,15x108) S. enteritidis (3,2x107) S. newport (1,7x107) S. paratyhi A (1,4x107) S. anatum (3,4x107) S. senftenberg (2,4x107) 106 >250 >250 >250 >250 >250 >250 105 >250 >250 127 >250 >250 >250 104 >250 >250 17 110 >250 >250 103 186 206 1 7 >250 223 102 28 38 0 0 91 43 KẾT LUẬN   Chúng tôi đã chế tạo được phức hợp hạt từ  gắn kháng  thể đặc hiệu kháng Salmonella và đã  tối ưu hóa phương pháp  IMS để  tóm bắt và cô  đặc Salmonella  trực  tiếp  từ dung dịch  đệm pha  loãng. Phương pháp này có khả năng phát hiện  Salmonella thuộc các nhóm B, D1, E1, E4 ở nồng độ  102 cfu/ml và Salmonella thuộc nhóm A, C ở nồng  độ 103 cfu/ml.  ĐỀ NGHỊ  Đánh giá hiệu quả của việc sử dụng kết hợp  phương  pháp  IMS  và  phương  pháp  nuôi  cấy  truyền thống để xác định Salmonella trên các nền  mẫu thực phẩm.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Arbault P., Buecher V., Poumerol S., Sorin M.‐L (2000). Study  of an ELISA method for the detection of E. coli O157 in food.  In: Bielecki S., Tramper J., Polak J. (eds). Food Biotechnology,  pp. 359‐368. Elsevier Science B.V.  2. BioRad, Salmonella serotyping.  3. Bộ Y tế (2008). Qui định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và  hóa học trong thực phẩm. Nhà xuất bản Hà Nội.  4. Centers  for  Disease  Control  and  Prevention  (2012),  Surveillance for Foodborne Disease Outbreaks United States:  Annual Report, 1‐14.  5. Centre for Health Protection in Hong Kong (2011). Review of  non‐typhoidal  Salmonella  food  poisoning  in  Hong  Kong.  Scientific  Committee  on  Enteric  Infections  and  Foodborne  Diseases, 1‐19.  6. Chen S., Wang F., Beaulieu J.C., Stein R.E., Ge B. (2011). Rapid  detection  of  viable  Salmonellae  in  produce  by  coupling  propidium  monoazide  with  loop‐mediated  isothermal  amplification.  Applied  and  environmental  microbiology,  77(12):4008‐4016.  7. Cudjoe K. S., Krona R., Olsen E. (1994). IMS: a new selective  enrichment  technique  for  detection  of  Salmonella  in  foods.  International journal of food microbiology, 23:159‐165.  8. Kingsley K. Amoako, Michael J. Shields, Noriko Goji, Chantal  Paquet, Matthew C. Thomas, TimothyW. Janzen, Cesar I. Bin  Kingombe,  Arnold  J.  Kell,  Kristen  R.  Hahn  (2012).  Rapid  Detection and Identification of Yersinia pestis from Food Using  Immunomagnetic Separation and Pyrosequencing. Journal of  Pathogens, 1‐6.  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 256 9. Manteca  A.,  Mujika  M.,  Arana  S.  (2011).  GMR  sensors:  magnetoresistive  behaviour  optimization  for  biological  detection  by  means  of  superparamagnetic  nanoparticles.  Biosensors & bioelectronics, 26:3705‐3709.  10. Nguyễn Trọng Hải (2011). Xác định tỉ lệ nhiễm và khả năng  kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli O157:H7  trên  trâu bò  khỏe mạnh ở 1 số tỉnh Nam Trung Bộ. Khoa học Kỹ thuật thú  y, XVIII: 31‐37.  11. Official  Journal  of  the European Union  (2005). Commission  Regulation  No  2073/2005  on  microbiological  criteria  for  foodstuffs.  12. Pui C.F., Wong W.C., Chai L.C., Tunung R., Jeyaletchumi P.,  Noor Hidayah M.S., Ubong A., Farinazleen M.G., Cheah Y.K.,  Son R. (2011). Salmonella: A foodborne pathogen, International  Food Research Journal, 18:465‐473.  13. Safarik I., Safaríková M., Forsythe S.J. (1995). The application  of magnetic  separations  in applied microbiology.  Journal of  Applied Bacteriology, 78:575‐585.  14. Skjerve E., Rorvik L.M., Olsvik O. (1990). Detection of Listeria  monocytogenes  in  foods  by  immunomagnetic  separation.  Applied and environmental microbiology, 56:3478‐3481.  15.    Ngày nhận bài báo:        05/9/2014  Ngày phản biện nhận xét bài báo:    29/9/2014  Ngày bài báo được đăng:  20/10/2014