Chế tạo vật liệu tương đương trung bì từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong điều kiện nuôi cấy không giá đỡ để điều trị vết thương bỏng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013  Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 657 CHẾ TẠO VẬT LIỆU TƯƠNG ĐƯƠNG TRUNG BÌ TỪ TẾ BÀO GỐC  TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY   KHÔNG GIÁ ĐỠ ĐỂ ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG BỎNG  Phan Minh Hoàng*, Đinh Văn Hân**, Nguyễn Gia Tiến**, Đoàn Hoàng Thu**  TÓM TẮT  Mục tiêu: Vật liệu tương ương trung bì đã được nghiên cứu phát triển dựa trên việc cấy nguyên bào  sợi da trên giá đỡ 3 chiều. Hiện nay, giá thành cao cộng với quy trình phức tạp trong chế tạo và sử dụng đã  hạn chế tính ứng dụng của tấm vật liệu.  Phương pháp: Trong nghiên cứu này, chúng tôi chế tạo tấm vật liệu tương ương trung bì bằng cách  cấy tế bào gốc trung mô từ dây rốn trên đĩa nhựa nuôi cấy và duy trì các tế bào trong môi trường có kích  thích tổng hợp đệm gian bào  Kết quả. Chúng tôi đã khảo sát về hình thái cấu trúc tấm vật liệu cũng như ánh giá tác dụng của chúng  trên mô hình vết thương ộng vật.   Kết luận: Từ nghiên cứu này, tấm vật liệu tương ương trung bì có thể tạo ra bằng nuôi cấy từ tế bào  gốc màng dây rốn. Tấm vật liệu rất hữu ích trong thử nghiệm in vitro và trên động vật thực nghiệm  Từ khoá: Vật liệu tương đương trung bì, giá đỡ, tế bào gốc trung mô màng dây rốn, vết thương bỏng.  ABSTRACT  PREPARATION OF DERMAL EQUIVALENT WITH CORD LINING MESENCHYMAL STEM CELLS  WITHOUT SCAFFOLD  Phan Minh Hoang, Dinh Van Han, Nguyen Gia Tien, Doan Hoang Thu  * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2013: 657 ‐ 663  Objective: The dermal equivalent is an in vitro model of the dermal layer of skin. It is constructed by  seeding dermal fibroblasts into degradable or polymeric scaffold. It can be used for wound care to accelerate  wound healing process. Due to high cost and lack of dermic components, the dermal equivalent has not been  used popularly.  Methods:  In  this  study, we developed a new dermal  equivalent by  seeding  cord  lining mesenchymal  stem  cells  in  plastic  culture  substrate  and maintaining  in  specific medium  to  stimulate  cells  to  secrete  extracellular matrix  Results: The morphology  of  dermal  equivalent was  investigated, we  also made  evaluation  in  animal  wound model.   Conclusion:  In this study, the dermal equivalent could be cultured from mesenchymal stem cells. The  dermal equivalent is useful in in vitro and animal experiments.  Keywords: dermal equivalent Scaffold, Cord lining mesenchymal stem cells, burn wound.  ĐẶT VẤN ĐỀ  Vật  liệu  tương  đương  da  đã  được  nghiên  cứu phát triển và chế tạo trong thực nghiệm từ  vài thập kỷ trước đây(1,2). Đầu tiên là sự xuất hiện  nuôi cấy chế tạo tấm vật liệu tương đương biểu  * Khoa Thẩm mỹ, BV Chợ Rẫy; ** Viện Bỏng Quốc Gia, Hà Nội.  Tác giả liên lạc: ThS.BS. Phan Minh Hoàng, ĐT: 0908221738, Email: Drminhhoang2010@gmail.com.  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 658 bì và sau đó là sự ra đời của công nghệ chế tạo  tấm biểu bì(3). Tuy nhiên, các vật liệu này đều có  hạn chế trong sử dụng cũng như hiệu quả thành  công  trong điều  trị  là do  thiếu  thành phần của  trung bì. Do đó một  số vật  liệu khác  được chế  tạo dựa  trên công nghệ mô  tạo  ra  tấm vật  liệu  bao gồm cả thành phần tương đương biểu bì và  thành phần tương đương trung bì bằng cách kết  hợp các yếu tố trung bì và biểu bì, các yếu tố này  được  phát  triển  dựa  trên  nguyên  lý  cơ  bản  là  nuôi cấy nguyên bào sợi và  tế bào biểu bì  trên  giá đỡ 3 chiều như  tấm collagen. Từ khi có vật  liệu thay thế da được chế tạo trong labo, chúng  cũng đã được ứng dụng trong trong nhiều  lĩnh  vực khác nhau liên quan đến da như nghiên cứu  dược độc học  thậm chí được sử dụng  trên  lâm  sàng  đề  ghép  điều  trị  thay  thế  da  người  cho  bệnh nhân bỏng hay tổn khuyết da(4). Một số vật  liệu tương đương trung bì đã được sử dụng để  phát  triển nghiên cứu chế  tạo vật  liệu  thay  thế  da. Tuy nhiên,  các vật  liệu này  đều phải dùng  thành phần  đồng  loại hay dị  loại như  collagen  của bò(5,6) hoặc  trung bì không còn  tế bào  sống  lấy  từ  tử  thi(7)  hoặc  các  giá  đỡ  tổng  hợp  bằng  polymer(8) các thành phần này đều rất đắt và  tiểm ẩn các nguy cơ lây bệnh truyền nhiễm  Trong da, nguyên bào sợi  là tế bào chủ yếu  được bao quanh bởi đệm gian bào. Chúng cũng  tạo ra đệm gian bào bao gồm collagen, elastin và  các protein đệm khác và chúng cũng  tương  tác  qua  lại với một  số  loại  tế bào khác như  tế bào  sừng biểu bì, đóng vai trò cốt yếu trong điều tiết  sinh lý da. Đặc biệt trong liền vết thương da, vai  trò của nguyên bào sợi tạo ra ECM đáng kể hơn  nhiều so với da bình thường.  Tương tự như điều kiện của da tự nhiên, các  hormon và yếu tố tăng trưởng cũng được coi là  yếu tố quan trọng trong việc tăng trưởng của tế  bào và  tổng hợp  đệm gian bào  của  các  tế  bào  nuôi cấy(9). Nguyên bào sợi da nuôi cấy được ghi  nhận là tăng sinh và tổng hợp đệm gian bào khi  có  mặt  một  số  hormon  hay  yếu  tố  tăng  trưởng(10,11). Trong nuôi cấy đơn lớp, nguyên bào  sợi da  được  cho  là  tạo nhiều  thành phần  đệm  gian bào hơn như collagen sau khi đạt 100% độ  che phủ  (postconfluent)(12,13). Gần đây chúng  tôi  nhận thấy rằng các nguyên bào sợi có thể được  biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn.  Các  tế bào này có khả năng nhân  lên mạnh và  nhiều hơn các nguyên bào sợi da. Hơn nữa, dây  rốn là rác thải y học nhưng lại là một nguồn mô  cung cấp tế bào  lý tưởng bởi thông thường mổ  dây rốn đều có diện tích 3000 đến 4000 cm2, do  đó chỉ cần một mẫu dây rốn  là đã có  thể cung  cấp số lượng cực kỳ lớn tế bào trung mô để chế  tạo  các  tấm  tế bào hay  các  tấm vật  liệu  tương  đương trung bì để dùng trong các nghiên cứu in  vitro và điều trị bệnh(14). Phát hiện này cùng với  những hạn  chế  của  tấm  vật  liệu  tương  đương  trung bì hiện hành đã  thúc đẩy chúng  tôi phát  triển  loại vật  liệu tương đương trung bì có tính  ứng dụng và an toàn hơn.   Trong  điều  kiện  hiện  nay,  chúng  tôi  phát  triển  loại  vật  liệu  tương  đương  trung  bì mới  bằng  cách nuôi  cấy  tế bào gốc  trung mô  trong  môi trường đặc biệt có chứa một số yếu tố để tạo  tấm tế bào sau đó thay môi trường chuyên biệt  cho nguyên bào  sợi và kích  thích chúng  tiết  ra  những thành phần đệm gian bào để tạo tấm vật  liệu tương đương trung bì mà không cần giá đỡ  hay  các  thành phần dị  loại và  đồng  loại  khác.  Chúng  tôi  đánh giá  loại vật  liệu này  bằng  các  nghiên cứu hình thái cấu trúc mô ‐ tế bào trong  tấm vật liệu. Đồng thời chúng tôi cũng đánh giá  khả  năng  ứng  dụng  in  vivo  của  vật  liệu  này  bằng cách ghép chúng lên động vật với mô hình  điều trị vết thương vết bỏng thực nghiệm ở thỏ.  NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP  NGHIÊN CỨU  Tách tế bào trung mô dây rốn  Mô dây rốn được  thu  từ sản phụ ngay sau  khi  sinh, mô  được bảo quản  trong môi  trường  dinh dưỡng. Sau khi cắt nhỏ  thành các mẩu có  kích  thước 0,2 x 0,2 cm, đặt các mẩu mô  trong  đĩa  nuôi  cấy  nhựa  và  bổ  sung  môi  trường  chuyên biệt được cung cấp từ Ngân hàng tế bào  gốc Mekostem, đặt các đĩa mô vào  tủ ấm 370C  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013  Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 659 với 5% CO2. Thay môi trường nuôi cấy 2‐3 lần/  tuần và theo dõi đến khi các tế bào hình sao hay  hình thoi tách ra khỏi mẫu mô và phát triển đạt  50%‐70%  bề mặt  đĩa  thì  tiến  hành  tách  tế  bào  bằng quy trình sử dụng trypsin. Các tế bào được  nhân  lên  đến  thế hệ  cấy  chuyển  thứ  3‐4 dùng  vào  nghiên  cứu  chế  tạo  tấm  vật  liệu  tương  đương trung bì.  Sơ đồ 1. Cấu trúc mô dây rốn: Lớp tế bào biểu mô  tương  tự  màng  ối  (1);  lớp  tế  bào  gốc  trung mô  màng  dây  rốn  (2);  lớp  tế  bào  gốc  trung  mô  lớp  Wharton’ jelly (3). Các tế bào được sử dụng trong  nghiên cứu này thuộc vị trí số 2.  Tạo tấm vật liệu tương đương trung bì  Tế bào  trung mô được nuôi cấy ở số  lượng  tương đương 5000 tế bào/ cm2 đĩa nuôi cấy d =  100mm.  Sau  khi  đạt  100%  độ  che  phủ  (confluent), chúng  tiếp  tục được nuôi cấy  thêm  vài  tuần  nữa.  Trong  thời  gian  nuôi  cấy,  môi  trường được thay thế bằng biệt hóa nguyên bào  sợi  để kích  thích  tiết  đệm gian bào. Khi  các  tế  bào mọc  chồng  lấn  nhiều  lớp  lên  nhau  và  có  đệm gian bào, tấm vật  liệu sẽ quan sát rõ bằng  mắt thường và dưới kính hiển vi. Dấu hiệu thấy  rõ  là tấm vật  liệu bắt đầu co và tách ra khỏi bề  mặt nuôi cấy  ở mép  đĩa. Dùng dụng cụ  là cell  lifter gạt nhẹ để tách hoàn toàn tấm vật liệu khỏi  bề mặt đĩa. Tấm vật  liệu sau đó được sử dụng  cho các nghiên cứu đánh giá hình thái cấu  trúc  và ghép điều trị vết thương bỏng thực nghiệm.   Mười thí nghiệm được tiến hành sử dụng 5  dòng tế bào ở P3 và P4 thu được từ mô dây rốn.  Hình thái mô   Vật liệu tương đương trung bì được cố định  trong  dung  dịch  Boin  trong  24  giờ,  tiến  hành  khử  nước  và  đúc  tiêu  bản  trong  paraffin,  cắt  thành  các  lát  mỏng  5‐6  micromet  và  nhuộm  haematoxyline  –  eosin,  quan  sát  tiêu  bản dưới  kính hiển vi quang học.   Gây vết thương bỏng thực nghiệm và ghép  tấm vật liệu tương đương trung bì lên vết  thương  Gây  bỏng  20  cm2  theo  phương  pháp  của  Halovec và Pocicado 1961.  Thay băng xử lý vết thương được tiến hành  hàng  ngày  theo  quy  trình.  Đặt  tấm  vật  liệu  tương đương  trung bì  lên vết  thương,  tránh để  gấp mép, dịch, bọt khí bên dưới.  Đặt một  lớp  gạc vaselin lên trên tấm vật liệu. Đặt 5‐6 lớp gạc  vô khuẩn, băng ép nhẹ. Băng ép nhẹ bằng  lớp  vải may  theo  dạng  áo  để  tránh  thỏ  làm  tuột  băng. Thay băng hàng ngày hoặc cách nhật tuỳ  theo  tình  trạng  vết  thương. Trong  trường  hợp  vết  thương  nhiễm  khuẩn  thì  điều  trị  nhiễm  khuẩn  vết  thương  cho  đến  khi  sạch  vi  khuẩn  mới tiếp tục ghép.  KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU  Tấm vật liệu tương đương trung bì  Hai tuần nuôi cấy tính từ sau khi tế bào đạt  100% độ che phủ, các tế bào trung mô được duy  trì  trong môi  trường  nuôi  cấy  biệt  hóa  đã  bổ  sung một số yếu tố, các tế bào hình thoi dài phát  triển  chồng  lấn  lên  nhau  khoảng  2‐3  lớp  đan  chéo nhau  theo nhiều hướng và  có  sự  liên kết  với nhau (ảnh 1 a). Trong khi đó tế bào nuôi cấy  trong điều kiện truyền thống không có yếu tố bổ  sung cho thấy các tế bào vẫn phát triển đơn lớp,  các tế bào nhiều hình dạng nằm cạnh nhau trong  đó  có  các  tế bào hình  sao, hình  thoi ngắn hơn  (ảnh 1b).  (2) (1) (3) Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 660 A  B  Hình 1. Tế bào mọc thành hai lớp đan chéo nhau ở ngày thứ 5 trong môi trường biệt hóa (A),  trong khi tế bào vẫn duy trì 1 lớp ở môi trường tăng trưởng cho tế bào gốc trung mô (B), (hình  ảnh soi trên kính hiển vi đảo ngược ‐ 50X)  A  B  Hình 2. Duy trì môi trường nuôi cấy 2 tuần, tế bào trong môi trường biệt hóa tạo thành tấm vật  liệu tương đương trung bì, các tế bào mọc thành hai ‐3 lớp đan chéo nhau, tấm vật liệu bắt đầu  bong (A), lắc nhẹ đĩa nuôi thấy tấm vật liệu bong và bờ mép dịch chuyển về phía trung tâm đĩa  (B). (Soi nổi ‐ 50X)  A  B  Hình 3. Hình ảnh đại thể tấm vật liệu tương đương trung bì sau 2 tuần, tấm vật liệu dai và dễ  tách ra khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy.  Khi tế bào gốc trung mô màng dây rốn phát  triển trong môi trường nuôi cấy, tế bào cũng có  xu hướng  tạo  ra 2  lớp chồng  lấn  lên nhau chứ  không  phát  triển  hình  cuộn  xoáy  như  Fibroblasts trung bì. Theo dõi các ngày sau thay  môi trường biệt hóa, thấy tế bào mọc mạnh xếp  chồng lấn lên nhau, khoảng ngày thứ 6‐8 có thể  nhìn thấy rõ bằng mắt thường. Ngày thứ 10, lớp  tế bào có xu hướng bong bật khỏi bề mặt đĩa, lắc  nhẹ đĩa hoặc dùng đầu pipet gạt nhẹ  là có  thể  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013  Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 661 tạo  ra  tấm  tế  bào. Tấm  tế  bào  chỉ  co nhỏ  hơn  diện  tích  đáy  đĩa một  chút,  còn  khoảng  =  2/3  diện tích đĩa nuôi.   A  B Hình 4. Hình thái cấu trúc trên kính hiển vi quang học nhuộm HE của tấm vật liệu tương đương trung  bì, tấm vật liệu có chứa không chỉ tế bào đơn thuần mà còn bao gồm cả đệm gian bào, tấm vật liệu cho thấy  trong thành phần của chúng chứa rất nhiều tế bào dạng nguyên bào sợi và đệm gian bào tương đối dày.  HE, 50X (ảnh a ); HE, 100X (ảnh b).  Về khía cạnh mô học,  tấm vật  liệu có chứa  không chỉ tế bào đơn thuần mà còn bao gồm cả  đệm gian bào, tấm vật liệu cho thấy trong thành  phần  của  chúng  chứa  rất  nhiều  tế  bào  dạng  nguyên bào sợi. Hình ảnh mô học tấm tế bào gợi  ý đây là vật liệu tương đương trung bì.  Kết quả ghép điều trị vết thương thực nghiệm   A   B   C   D  Hình 5. Vết bỏng được cắt hoại tử toàn lớp, nền vết thương là mô dưới da (a); tấm vật liệu được dàn đều  che phủ bề mặt vết  thương  (b). Ngày  thứ 5 sau ghép,  tấm vật  liệu bám và che phủ  tốt vết  thương  (c).  Ngày nghiên cứu thứ 14 ghép tấm vật liệu tương đương trung bì, vết thương gần liền hoàn toàn bằng cả  hai hình thức là biểu mô hóa từ bờ mép và co hẹp diện tích vết thương, bề mặt sẹo nhẵn và phẳng so với bề  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 662 mặt da lành xung quanh, sẹo vẫn thiếu thành phần phụ của da (d). (Thỏ số 1).  Với  05  thỏ  thí  nghiệm  được  ghép  tấm  vật  liệu  tương đương  trung bì vào  thời  điểm ngày  thứ 2  sau cắt hoại  tử  sớm  làm  sạch hoại  tử và  cầm máu tốt.   Tấm vật  liệu  được dàn  đều  lên vết  thương  (ảnh  5b)  nhanh  chóng  bám  vào  vết  thương.  Ngày nghiên cứu thứ 5, bề mặt vết thương được  che phủ một lớp màng mỏng, bám chắc vào vết  thương  làm  vết  thương  không  chảy  máu  lúc  thay băng nhưng cơ bản vẫn quan sát thấy nền  vết thương màu đỏ hồng và sạch. Tại những chỗ  lớp màng bám vào gạc và bị bong khi thay băng  quan sát thấy tổ chức hạt sạch, đỏ và rớm máu  (ảnh 5 c).  Vết  thương  cũng  chưa  thấy  rõ  hiện  tượng  biểu mô hóa từ bờ mép. Quan sát vết thương từ  ngày thứ 7 thấy biểu mô hóa mạnh ở bờ mép vết  thương tiến dần vào phía trung tâm để làm lành  vết  thương. Kèm  theo hiện  tượng biểu mô hóa  mạnh là dấu hiệu vết thương co nhỏ. Đến ngày  thứ 15, cơ bản các vết thương liền da bằng biểu  mô hóa. Về chất lượng sẹo thấy bề mặt sẹo bằng  phẳng, nhẵn, sờ có cảm giác cứng cộm hơn da  lành xung quanh, không thấy dấu hiệu mọc lông  trở  lại  (ảnh 5 d). Không  thấy  có dấu hiệu kích  thích gây viêm  ở vết  thương hay phản  ứng dị  ứng ở vùng da lành quanh vết thương ở cả 5 thỏ  trong suốt quá trình nghiên cứu.  BÀN LUẬN   Đối với da bình  thường,  trung bì  là  lớp hỗ  trợ  cho  biểu  bì  bao  gồm  thành  phần  sợi  như  collagen và elastin và cũng bao gồm thành phần  tế bào. Tế bào chủ yếu  của  trung bì  là nguyên  bào sợi đây là dạng tế bào nguồn gốc trung mô  mà  có khả năng  tổng hợp và giáng hóa  thành  phần protein đệm sợi và không sợi của mô liên  kêt và các yếu tố hòa tan khác.  Có vài vật  liệu  tương đương  trung bì được  chế  tác  theo khuôn mẫu  tạo  trung bì  trên  labo.  Trong  các mô  hình  này,  nguyên  bào  sợi  được  nuôi cấy trên giá đỡ ba chiều có các thành phần  trung bì như  collagen và glycosaminoglycan(5,6)  hoặc là các polymer tổng hợp(8). Trong đó, có mô  hình  chế  tạo  bằng  trộn  lẫn  đệm  collagen  với  nguyên bào sợi. Với mô hình này, các nhà khoa  học đã có sản phẩm được tạo ra bởi sự kết hợp  giữa nguyên bào sợi da  trong đệm collagen và  đã được sử dụng rộng rãi như một hình mẫu ưu  việt. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của chúng tôi,  chúng tôi kiến tạo ra vật liệu tương đương trung  bì mới bao gồm đệm gian bào và cả các tế bào có  hình dạng  của nguyên bào  sợi bằng  cách nuôi  cấy đơn độc tế bào gốc trung mô tách từ màng  dây rốn và không cần giá đỡ. Về hình thái mô,  tấm vật  liệu theo mô hình này cho thấy một số  đặc  tính  tương  tự  như  trung  bì  bình  thường.  Trong nghiên cứu của chúng tôi, đặc tính giống  trung bì được xác định cả bằng cả đặc điểm đại  thể và vi thể. Về đại thể, tấm vật liệu quan sát rõ  bằng mắt thường có màu trắng ngà như trung bì  da bình thường, tấm vật liệu tương đối chắc khi  dùng các dụng cụ để dịch chuyển,  thậm chí có  thể gấp làm 2 lớp (ảnh 3 a) và ngay cả khi ghép  lên vết thương thì vẫn thấy rõ tấm vật liệu dạng  màng mỏng (ảnh 5 b). Tấm trung bì của chúng  tôi cũng tương tự như mô hình tấm trung bì tạo  ra bằng cách trộn nguyên bào sợi với collagen vì  thấy  rõ  cả  nhân  tế  bào  và  đệm  gian  bào  là  khoảng  cách  rất  rộng  trên  tiêu bản nhuộm HE  của  tấm vật  liệu mặc dù  đã  tách hoàn  toàn  ra  khỏi bề mặt đĩa nuôi (ảnh 4a, 4b) ngay cả khi đã  tách ra khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy. Tuy mô hình  chế tạo sản phẩm này có chứa cả đệm gian bào  cả tế bào dạng nguyên bào sợi nhưng rất có thể  độ  dày  sản  phẩm  của  chúng  tôi  chưa  thể  đạt  được như khi trộn nguyên bào sợi với collagen.  Bởi với mô hình chế  tạo  tấm  trung bì này việc  tạo  ra  tấm  trung bì  có  độ dày bao nhiêu  là do  người chế  tạo có  thể chủ động được bằng cách  dàn  nhiều  hay  ít  hỗn  dịch  nguyên  bào  sợi  –  collgen gell. Còn trong thí nghiệm của chúng tôi,  việc tạo ra tấm vật liệu dựa trên khả năng của tế  bào dạng nguyên bào sợi biệt hóa từ tế bào gốc  trung mô  tạo  ra  đệm  gian  bào  của  chính  nó  trong điều kiện nuôi cấy. Cùng với điều đó, kết  quả nghiên cứu gợi ý rằng sản phẩm của chúng  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013  Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 663 tôi  có  thể  hữu  ích  như  vật  liệu  tương  đương  trung bì và có những đặc điểm gần gũi với sản  phẩm trung bì nuôi cấy khác.   Nghiên cứu của chúng tôi cũng chỉ ra rằng,  vật  liệu  tương  đương  trung bì mới này  có  thể  thích hợp với  các mục  đích  thí nghiệm và  lâm  sàng. Bổ sung cho những thí nghiệm in vitro liên  quan đến loại vật liệu tương đương trung bì mới  này  chúng  tôi  thấy  nó  có  khả  năng  kích  thích  liền  vết  thương  ở  thỏ  gây  vết  thương  thực  nghiệm  bằng  cách  làm  nhanh  hình  thành  tổ  chức hạt đẹp, kích thích biểu mô hóa từ bờ mép  vết thương.   KẾT LUẬN  Từ nghiên  cứu này,  tấm  vật  liệu  rất  giống  với trung bì da bình thường có thể được  tạo ra  bằng nuôi cấy đơn độc tế bào dạng nguyên bào  sợi biệt hóa  từ  tế bào gốc  trung mô màng dây  rốn.  Tấm  vật  liệu  cũng  hữu  ích  trong  các  thử  nghiệm  in vitro và các mục địch  lâm sàng như  kiến  tạo vật  liệu  tương đương da và ghép  trên  động vật.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Lee  DY,  Ahn HT,  Cho  KH.  (2000). A  new  skin  equivalent  model:  use  of  a  dermal  substrate  which  combines  de‐ epidermized  dermis  with  fibroblast‐populated  collagen  matrix. J Dermatol Sci.;23:132—7.  2. Lee DY, Cho KH. (2005). The effects of epidermal keratinocytes  and  dermal  fibroblasts  on  the  formation  of  cutaneous  basement  membrane  in  three‐dimensional  culture  systems.  Arch Dermatol Res.;296:296—302.  3. Green H, Kehinde O, Thomas  J.  (1979). Growth  of  cultured  human  epidermal  cells  into  multiple  epithelia  suitable  for  grafting. Proc Natl Acad Sci USA;76:5665‐8.   4. Ehrlich  HP.  (2004).  Understanding  experimental  biology  of  skin equivalent: from laboratory to clinical use in patients with  burns and chronic wounds. Am J Surg.;187: 29s‐33s.  5. Boyce ST, Michel S, Reichert U, Schroot B, Schmidt R. (1990).  Reconstructed  skin  from  cultured  human  keratinocytes  and  fibroblasts  on  a  collagen‐glycosaminoglycan  biopolymer  substrate. Skin Pharmacol.;2:136—43.  6. Maruguchi T, Maruguchi Y, Suzuki S, Matsuda K, Toda KI,  Isshiki  N.  (1994).  A  new  skin  equivalent:  keratinocytes  proliferated and differentiated on collagen sponge containing  fibroblasts. Plast Reconstr Surg.;93:537‐44.  7. Regnier  M,  Prunieras  M,  Woodley  D.  (1994).  Growth  and  differentiation  of  adult  human  epidermal  cells  on  dermal  substrates. Front Matrix Biol. ;9: 4 ‐ 35.  8. Cooper ML, Hansbrough  JF, Spielvogel RL, Cohen R, Bartel  RL,  Naughton  G.  (1991).  In  vivo  optimization  of  a  living  dermal substitute employing cultured human fibroblasts on a  biodegradable  polyglycolic  acid  or  polyglactin  mesh.  Biomaterials; 12: 243 ‐ 8.  9. Goldstein RH, Poliks CF, Pilch PF, Smith BD,  (1989). Fine A.  Stimulation of  collagen  formation by  insulin and  insulin‐like  growth  factor  I  in  cultures  of  human  lung  fibroblasts.  Endocrinology; 124: 964 ‐ 70.  10. Russell SB, Russell JD, Trupin KM. (1981). Collagen synthesis  in human fibroblasts: effects of ascorbic acid and regulation by  hydrocortisone. J Cell Physiol.;109: 121 ‐ 31.  11. Hata R, Sunada H, Arai K, Sato T, Ninomiya Y, Nagai Y, et al.  (1988). Regulation of collagen metabolism and cell growth by  epidermal growth factor and ascorbate in cultured human skin  fibroblasts. Eur J Biochem.;173: 261 ‐ 7.  12. Booth BA, Polak KL, Uitto J. (1980). Collagen biosynthesis by  human  skin  fibroblasts.  I.  Optimization  of  the  culture  conditions  for  synthesis  of  type  I  and  type  III  procollagens.  Biochim Biophys Acta.;607: 145 ‐ 60.  13. Minor RR, Sippola‐Thiele M, McKeon J, Berger J, Prockop DJ.  (1986). Defects in the processing of procollagen to collagen are  demonstrable  in  cultured  fibroblasts  from  patients with  the  Ehlers‐Danlos and osteogenesis  imperfecta  syndromes.  J Biol  Chem.; 261: 10006 ‐ 14.  14. Katsuhiro Kita,1 Gerd G. Gauglitz,1,2 Thang T. Phan,3 David  N.  Herndon,1  and  Marc  G.  Jeschke1.  (2009).  Isolation  and  Characterization  of Mesenchymal  Stem  Cells  from  the  Sub‐ Amniotic  Human  Umbilical  Cord  Lining  Membrane.  Stem  cells and Development, V 20, N0 20 : 1‐ 11.