Chiết tách và xác định đặc điểm cấu trúc của sulfated polysaccharide từ rong nâu hormophysa articulata ở vịnh Nha Trang

17 CHIẾT TÁCHVÀXÁCĐỊNH ĐẶCĐIỂM CẤU TRÚC CỦA SULFATED POLYSACCHARIDE TỪ RONG NÂU HORMOPHYSA ARTICULATA Ở VỊNH NHA TRANG BùiVănNguyên1, Lê Công Hoan1,LêĐỗ Thùy Vi1, Ngô Thị Uyên Tuyền1, Chu Thị Hoài Thu1, Thành Thị Thu Thủy2 và Trần Thị Thanh Vân3 1TrườngĐại học Khánh Hòa 2Viện Hóa Học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 3Viện Nghiên cứu Ứng dụng và Công nghệ Nha Trang Tómtắt: Bàibáonàytrìnhbàykếtquảnghiêncứuchiếttáchsulfatedpolysaccharide(fucoidan)từrong nâu Hormophysa articulatathuthậpởVịnhNhaTrang.Kếtquảchothấyhàmlượngfucoidanlà2,03%trên trọng lượngrongkhô.Bằngphươngphápsắcký traođổi ionchothấy fucoidanthôđược táchthành3phân đoạn(F1, F2 và F3)trêncộtsắckýDEAE-cellulose. Đặcđiểmcấutrúc củafucoidan đượckhảosátbằngphương phápphổESI-MSvàphổcộnghưởngtừhạtnhânNMR.PhânđoạnF3 cóchứahàmlượngsulfatecaonhấtlà 36,3%vàthànhphầngồmFucvàGalvớitỉlệ(L-Fuc:D-Gal=1:0,3)liênkếtvớinhauqualiênkếtglycoside (1→3)hoặc(1→4),nhómsulfategắnvàogốcFucchủyếuvịtríC2 hoặcC4,gốcGalchủyếuvịtríC2. Kếtquả chothấysulfatedpolysaccharidetáchchiếtđượctừphânđoạnF3 cócấutrúcdạnggalactofucansulfate. Từ khóa:Rong nâu, polysaccharide sulfate, fucoidan, Hormophysa articulata, các phương pháp phổ 1. Mở đầu Trong đa dạng vô tận của thảm thực vật đại dƣơng, rongNâu làmột trong số các loài thựcvật biểncóthểtựtái tạođángđƣợclƣuýnhấtmàloài ngƣờiđãpháthiệnra.RongNâuchứarấtnhiềucác hợp chấtthiênnhiêncógiá trịdinhdƣỡngvàdƣợc dụng cao. Đó là các đƣờng (galactose, mannose, xylose); axit amin; axit béo nhiều nối đôi; chất khoángdƣớidạngkeo;cácvitamincầnthiếtchocơ thểsống;cácpolyphenolcóhoạttínhchốngoxihóa mạnhbảovệcơthểloạitrừcácgốctựdonguyhại; fucoidancókhảnăngkíchthíchhệmiễndịch,chống viêmnhiễm,ngănngừaungthƣđồngthờilàmtăng chỉ số chức năng gan; iốt hữu cơ giúp tuyến giáp hoạtđộngtốiƣu;alginatlàchấtgiảiđộcthiênnhiên và laminaran làchấtchốngđôngcụcmáuvàung thƣ[3,4,5,11]. Fucoidanlàmộtsulfatepolysaccharidecócấu trúchóahọcphứctạp.Thànhphầncủanóbaogồm nhiều loại đƣờng, chủyếu là fucose vàmột số các loạikhácnhƣgalactose,glucose,manose...,ngoàira còn có axít uronic. Fucoidan đƣợc biết đến làmột chất có nhiều hoạt tính sinh học quí báu nhƣ hoạt tính chống u, chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, chống đông tụmáu và kháng virus nhƣHIV. Ngoàirafucoidancònđƣợcmôtảcónhiềutácdụng sinhhọckhácnhƣtácdụnghạcholesterol,giảmmỡ máu... Do có các tính chất quí báu nhƣ vậy nên fucoidanthuhútđƣợcrấtnhiềusựquantâmcủacác nhàkhoahọctrênthếgiới[3,4,5,11]. Nƣớc ta có hơn 3260 km bờ biển với nguồn tài nguyên rong biển rất phong phú, rong Nâu là nguồn lợirongbiểntựnhiên lớnnhất, trongđóchi rongcótrữlƣợnglớnnhấtlàSargassum (rongMơ) và Hormophysa (rongKhế) [8].Cácnghiêncứuvề polysaccharidetừchiHormophysa mớiđƣợcnghiên cứu rất ít. Đặc biệt là rong Nâu Hormophysa articulata lần đầu tiên đƣợc chúng tôi tiếp cận nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu thành phần polysaccharide táchchiết từ rongNâuHormophysa articulata thu thập ở Vịnh Nha Trang giúp định hƣớngnghiêncứucôngnghệcũngnhƣnghiêncứu cơbảnvềcấutrúcvàhoạttính,chobiếthàmlƣợng dinh dƣỡng và sử dụng làm dƣợc liệu hoặc thực phẩmchứcnăng. Kếtquảnghiêncứunàygópphần 18 bổsungthêmcơsởdữliệuvềnghiêncứufucoidan rongnâuởViệtNam,đồng thời làcơ sởkhoahọc choviệcnghiêncứusâuhơnvề cấu trúccũngnhƣ hoạt tính sinh học của fucoidan từ loài rong này nhằmđịnhhƣớngứngdụng thànhcácsảnphẩmcó giátrịcaovềydƣợc. 2. Thực nghiệm 2.1. Mẫu rong Rong đƣợc thu thập tạiĐảoHònRùa,Vịnh Nha Trang vào tháng4/2019vàđịnhdanhbởiTS. LêNhƣHậu(ViệnNghiêncứuvàỨngdụngCông nghệNhaTrang).Mẫu rong sau khi thu thậpđƣợc rửasạchtạpchất(rác,cát,mùn,...)bằngnƣớcngọt, đemphơikhôởnhiệtđộthƣờngtrongkhôngkhívà đƣợccắtnhỏ. 2.2. Hóa chất và thiết bị Hóa chất: Rƣợu etylic (C2H5OH), axeton (CH3COCH3),axítclohyđric(HCl),nƣớccất(H2O), natri hiđrocacbonat (NaHCO3), natri cacbonat (Na2CO3), nhựa DEAE-cellulose, natri clorua (NaCl), trifloaxetic TFA (CF3COOH), amoniac (NH3),natrihiđroxit(NaOH),cáchóachấtchuẩnbao gồm:fucose,galactose,mannose,rhamnose,glucose vàxylosetấtcảcủahãnhSigma(Mỹ). Thiếtbị:MáyphântíchsắckýGC-FID, máy cô quay chân không, máy ly tâm, máy đông khô, máyghiphổESI-MS vàmáyđophổNMR. 2.3. Tách fucoidan Rongkhôxửlývớicồnvàaxeton đểloạicác hợp chất béo, chất màu,... Mẫu rong thu đƣợc sử dụngđểchiếtpolysaccharide.Lấy500 gam rong khô đem chiếtbằngdungdịchHCl0,02M(pH=2-3)(tỉ lệ rong khô : dịch chiết = 1:10) ở nhiệt độ 60oC trong thờigian2giờ, lọctáchbã rongqua một lớp vải lọcmịn và đem chiết lại hai lần với điều kiện tƣơng tự. Dịch chiết chứa các polysaccharide tan trong nƣớc của 3 lần chiết đƣợc gộp lại và đƣợc trunghòabằngdungdịchNaHCO3 8%đếnpH=6- 7.Dịch chiết đƣợc cô quay chân khôngở nhiệt độ 50oCđếncòn1/5thểtíchbanđầu.Sauđóđƣợctiến hành chạy thẩm tách qua màng 10kDa trong 48h, cuốicùngđôngkhôđểchuyển thành dạng bột. Kết quả ta thu đƣợc hỗn hợp polysaccharide có thành phầnchínhlàfucoidan [9, 10, 11, 14]. 2.4.Táchphânđoạn fucoidan thô Fucoidan đƣợc phân đoạn tinh chế bằng kỹ thuậtsắckýtraođổianiontrêncộtDEAE-Cellulose (2,5x30 cm) [7].Mẫu fucoidan đƣợc hoà tan hoàn toàntrongdungmôiHCl0,04Ntrƣớckhichochạy qua cột sắc ký. Đầu tiên phân đoạn laminaran (polysaccharide không có nhóm mang điện tích) đƣợc rửa giải khỏi cột sắc ký bằng dung dịchHCl 0,04Nđếnkhi thửphảnứngâmtínhvới thuốc thử phenol/acid sulfuric, tiếp theo các phân đoạn fucoidan đƣợc rửa giải theo nồng độ tăng dần của muối NaCl. Tất cả các phân đoạn thu đƣợc đem thẩmtáchquamàng10kDavàđôngkhôthuđƣợc3 phânđoạnkýhiệuF1, F2, F3 [9]. 2.5.Phươngphápphổ NMR và ESI-MS. Phổ NMR ghi trên máy Bruker AVANCE 500, sử dụng TFA/D2O (1% v/v) làm dung môi, DSSlàmchấtchuẩnnộiđotạinhiệtđộ70oCvớikỹ thuậtđokhửtínhiệuH2O. PhổESIMSđƣợcghitrênmáyXevoTQMS, Waters-USA, kiểu ion hóa âm.DungmôiMeOH : H2O=1:1.Chếđộghimẫuvớikiểuionhoáâm.Khí phun mù là N2 vớiápsuấtkhílà30psi,tốcđộphun khí650lít/giờtạinhiệtđộlà180ºC. 3. Kết quả và thảo luận Thành phần polysaccharide chủ yếu trong rongNâubaogồmalginate,laminaranvàfucoidan. TrongmẫurongNâuHormophysa articulata nghiên cứucó chứa fucoidan2,03% trên trọng lƣợng rong nguyên liệu khô sau khi đã loại chất màu và chất béo. So sánh với kết quả phân tích hàm lƣợng fucoidan trong một số loài rong Nâu trên thế giới [12] thì loài rong Hormophysa articulata ở Vịnh NhaTrangcóhàmlƣợngfucoidanlàthấphơnít,tuy nhiên khácnhaukhôngnhiều.Điềunàymộtlầnnữa khẳng định các yếu tố thủy hóa nơi cây rong sinh trƣởng nhƣ ánh sáng, nhiệt độ, độmuối, ... đã ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp fucoidan của rong . Hình 3.1: Sắc kỳ đồ GPC của mẫu FHA Phƣơng pháp sắc ký lọc gel GPC(Gel Permeation Chromatography) đƣợc sử dụng để xác định sự phân bố theo KLPT (khối lƣợng phân tử) của các polymer thành phần của FHA (Fucoidan from Hormophysa articulata) và xác định KLPT trung bình của FHA.Đồ thị sắc ký GPC thu đƣợc (Hình3.1)chỉgồm1peakchứngtỏFHAcóđộsạch cao.KếtquảtínhtoánchothấyFHA có khốilƣợng phân tử trung bình là 250kDa.ChỉsốđaphântánPI =Mw/Mn=1,8chothấymứcđộphân tánvềkhối lƣợngphântửcủacácpolysaccharidelàkhônglớn Kếtquả táchphânđoạn tinhchế fucoidan từ rong nâu Hormophysa articulata bằng sắc ký trao 19 đổiionchora03phânđoạnF1,F2vàF3tƣơngứng vớicácnồngđộrửagiảităngdầncủaNaCllà0,5N; 1,0N và 1,5N. Thành phần hóa học của các phân đoạn đƣợc chỉ raởBảng 3.1 vàHình 3.2, kết quả cho thấyphânđoạnF3 cóthànhphầnđơngiảnchủ yếu là fucosevà galactose theo tỉ lệ 1:0,3 với hàm lƣợngsulfatecaonhất là36,3%, theonhiềunghiên cứuphânđoạnnàocóhàmlƣợngsulfatecaothìđa phần có hoạt tính sinh học tốt [3]. Do vây, phân đoạnF3 đƣợclựachọnđểnghiêncứuchitiếthơnvề đặcđiểmcấutrúc. Hình 3.2: Sắckýđồ củaphânđoạn F3 đƣợc phân tích trên thiết bị GC-FID Bảng 3.1. Thành phần hóa học củacácphânđoạn fucoidan Phânđoạn Hiệu suất(%) SO3Na Uronic Axit Tỷ lệ monosaccharide (mole) Fuc Gal Xyl Man Gluc FHA 24,5 6,1 1 1,2 0,1 0,1 0,1 F1 7,5 10,5 10,4 1 2,1 0,7 0,3 0,2 F2 43,5 21,5 6,3 1 1,5 0,3 0,1 0,1 F3 26,5 36,3 1,8 1 0,3 0 0 0 Hình 3.3. Phổ 1H-NMR Phổ 1H-NMR của fucoidan phân đoạn F3 (Hình 3.3)thuđƣợccócáctínhiệuproton anomeric - H1 ởđộdịchchuyểnhóahọc 5-5,5ppm, tổhợpcác tín hiệu chồng lấn lên nhau trong vùng 3,3ppm - 4,8ppm là thuộc về proton (H2-H4) của vòng pyranose,một nhóm các tín hiệu có cƣờng độ lớn 20 trong vùng trƣờng cao 1,2-1,4ppm là các tín hiệu đặctrƣng cho nhóm CH3 củaL-fucose. Bêncạnhđó trênphổ1H-NMRcủaphânđoạnnàycònpháthiện thấymộttínhiệucócƣờngđộmạnhkhácởđộdịch chuyểnhóahọc2,2ppmchỉrasựcómặtcủanhóm Acetyl trong phân tử của phân đoạn fucoidan này. Nhƣvậy,quaphântíchphổ1H-NMR (hình 3.2) cho tabiếtnhữngthôngtincơbảnnhấtvềđặctrƣngcấu trúccủafucoidanphânđoạnF3,phânđoạnfucoidan nàycócấutrúctƣơngđốiphứctạpvớisựtồntạicủa nhiềunhómfucosekhácnhauvềmứcđộsulfatehóa cũng nhƣ kiểu liên kết O-glycoside giữa các gốc đƣờng này với nhau và/hoặc với gốc đƣờng galactose.Ngoàira,trongphântửcủafucoidanphân đoạnnàykhôngchỉcócácnhómsulfatemàcòncó cả các nhóm acetyl.Tuy nhiên, do sự phức tạp về cấu trúcnênphổ (hình3.3) cónhiềuvùng tín hiệu trùnglấpnhauvớiđộphângiảirấtthấpnênrấtkhó để có thể giải thích đƣợcmột cách rõ rànghơnvề các tínhiệu trongphổnày.Vìvậy,phổkhốinhiều lầnESI-MS/MSđƣợcsửdụnglàmộtphƣơng pháp phântíchhiệuquảđểcóthêmcácthôngtinvềđặc điểmcấutrúccủafucoidanF3.KếtquảđophổESI- MS/MScủaphânđoạnF3đƣợctrìnhbàytronghình (3.4avà3.4b).Quađócho thấy tất cả các tínhiệu nóitrênchứngminhmẫuphânđoạnF3 đƣợctáchra làfucoidantinhsạch. Đểsángtỏ thêmcác thông tincấutrúckhác, chúng tôi tiến hành đo phổESI-MS củaF3 với kỹ thuật phổkhối nhiều lần.PhổESI-MScho thấy có pic cơ bản tại m/z 243 là củamonosulfate fucose [FucSO3] -. Tín hiệu tại m/z 225 đƣợc gán cho [FucSO3-H2O] - vàmột tín hiệu ởm/z 405 gắn cho [FucGal(SO3)2] −. Để khẳng định vị trí nhóm thể sulfatetrênmạchchínhfucosevàliênkếtgiữamạch nhánhgalactosevớimạch chính, 2 tínhiệu tạim/z 243và405củađƣợctiếnhànhphámảnhlần2,phổ MS/MSthuđƣợcthểhiệntrênhình3.4a và 3.4b. Hình 3.4a. Phổ ESI-MS của mảnh m/z 243 Hình 3.4b. Phổ ESI-MS của mảnh m/z 405 Berangere Tissot và CS [15] đã nghiên cứu ảnhhƣởng củavị trí nhómsulfate lênphổMScủa fucose,tínhiệucócƣờngđộmạnhtạim/z139làdo nhóm sulfate tại vị trí C-4 của fucose (Hình 3.4a). Tathấycótínhiệuyếutạim/z169và1tínhiệucó cƣờng độ lớn tại 183 cho thấy sự có mặt nhóm sulfatetạivịtríC-2. PhổESI-MS/MScủaion[FucGalSO3] - tạim/z 405 (Hình 3.4b) chocác tínhiệucủacác ionmảnh vớicƣờngđộyếu.Tuynhiênchúng tacó thểnhận biếtđƣợctínhiệuởm/z241(ionmảnhkiểuB1)đặc trƣngchocấu trúccủamộtGalfucmonosulfatevới galactosenằmởđầukhôngkhử,cónhómthếsulfate nằmởvịtríO-2 và liênkếtvớifucoseởvị tríO-3 [1716].Tínhiệuởm/z113đƣợcgánchomảnhchia cắtkiểu0,3A1 (cộnghợpvớiNa).Tínhiệuởm/z310 đƣợcgánchomảnhchiacắtkiểu0,2X1 (cộnghợpvới Na).Tínhiệurấtyếuởm/z225và sảnphẩmcộng hợp củanó vớiNa ởm/z 249 cho thấymột lƣợng nhỏgốc fucose2-O-sulfate cũng có thểnằmởđầu khôngkhử.Cáctínhiệukhácbaogồmm/z326ứng với ion [FucGalSO3 - SO3] -, m/z 397 ứng với ion [FucGalSO3 - H2O] - và m/z 404 ứng với ion [FucGalSO3 - H] -. 4. Kết luận FucoidantừrongNâuHormophysa articulata thu thập ởVịnhNha Trang đã đƣợc chiết tách và phântíchđặcđiểmcấutrúc.Kếtquảchothấyhàm lƣợngfucoidan2,03%trêntrọnglƣợngrongkhô.Có 03phânđoạnfucoidan(F1,F2vàF3)đƣợcthunhận saukhitáchphânđoạntinhchếbằngsắckýtraođổi ion, trong đó phân đoạn F3 với thành phần đƣờng đơn giản nhất chỉ bao gồm Fuc và Gal với tỉ lệ (Fuc:Gal=1:0,3)vàcóhàmlƣợngsulfate lớnnhất 36,3% đƣợc lựa chọn làm phân đoạn đại diện để phân tíchcấutrúc.Phânđoạnnàycóđặcđiểmcấu trúcbaogồmcảhailoạiliênkếtO-glycoside(1→3) và/hoặc (1→4), nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C2 hoặc C4 của gốc Fucose và vị trí C2 của gốc Galactose Lờicảmơn: Côngtrìnhđượcsựhỗtrợkinh phícủađề tàicấp trườngĐạihọcKhánhHòa,mã sốKHTN-18.03.Cáctácgiảxintrântrọngcảmơn TS. Lê Như Hậu (Viện Nghiên cứu và Ứng dụng CôngnghệNhaTrang) đãgiúpđỡđịnhdanhmẫu rong. 21 TÀILIỆUTHAMKHẢO 1. Anastyuk, S. D., Shevchenko, N. M., Nazarenko, E. L., Dmitrenok, P. S., and Zvyagintseva, T. N, Structural analysis of a fucoidan from the brown alga Fucus evanescens by MALDI-TOF and tandem ESI mass spectrometry, Carbohydrate Research, 344(6), 779-787, 2009. 2. BilanMI,GrachevAA,UstuzhaminaNE,ShashkovAS,NifantievNE,UsovAI,Ahighlyregular fractionofafucoidanfromthebrownseaweedFucusdistichusL,CarbohydrateResearch,337,719- 730,2002. 3. Bo Li, Fei Lu, XinjunWei andRuixiangZhao,Fucoidan: Structure and Bioactivity,Molecules, 13, 1671-1695,2008. 4. Black, W.A.P.; Dewar, E.T.; Woodward, F.N, Manufacture of algal chemicals. IV.-Laboratory-scale isolation of fucoidin from brown marine algae, J. Sci. Food Agric, 3, 122-129, 1952. 5. BùiMinhLý,ĐánhgiáhiệntrạngvàNghiêncứugiảiphápbảovệnguồnlợirongMơ(Sargassum)tại KhánhHòa,ĐềtàicấptỉnhKhánhHòa,2010. 6. Choosawad D., Leggat U., Dechsukhum C., Phonggdara A. and Chotigeat W, Anti-tumour activities of fucoidan from the aquatic plant Utricularia aurea lour, Songklanakarin J. Sci. Technol., 27 (3), 799-807, 2005. 7. Dubois, M., Gilles, K.A., Hamilton, J.K., Rebers, P.A, and Smith, F. Colorimetric, method for determination of sugars and related substances, AnalChem, 28, 350-6, 1956. 8. Huynh Q. N and Nguyen H. D, The seaweed resources of Vietnam, A.T Critchley, M. Ohno. Seaweed resources of the World, Japan, 62-69, 1998. 9. Olesya S. Vishchuk, Svetlana P. Ermakova, Tatyana N. Zvyagintseva, Sunphated polysaccharides from brown seaweeds Saccharina japonica and Undaria pinnatifida: isolation, structural characteristics, and antitumor activity, Carbohydrate Research, 346, 2769-2776, 2011. 10. Percival, E.G.V. and Ross, A.G, Fucoidin. Part I. The isolation and purification of fucoidin from brown seaweeds, Journal of the Chemical Society, 717-720, 1950. 11. Pereira, M. S., Melo, F. R. and Mourão, P. A. S, Is there a correlation between structure and anticoagulant action of sunphated galactans and sunphated fucans? Glycobiology, 12(10), 573-580, 2002. 12. Ruperes P, Mineral content of edible marine seaweeds, Food chemistry, 79, 23-26, 2002. 13. Vauchel P., Kaas R., Arhaliass A., Baron R. and Legrand J, A new process for extracting alginates from Laminaria digitata, Reactive Extrusion, Food Bioprocess Technol, 1, 297-300, 2008. 14. Zvyagintseva,T.N.;Shevchenko,N.M.;Popivnich, I.B,Anewprocedure fortheseparationofwater- solublepolysaccharidesfrombrownseaweeds,Carbohydr.Res,322,32-39,1999. 15. Tissot,B., Salpin, J.Y.,Martinez,M.,GaigeotaM.P.&Daniel,R. -Differentiation of the fucoidan sulfatedL-fucoseisomersconstituentsbyCE-ESIMSandmolecularmodeling,CarbohydrateResearch 341,598–609,2006. 16. Saad, O. M.,&Leary, J. A. -Delineating mechanisms of dissociation for isomeric heparin disaccharidesusingisotopelabelingandiontraptandemmassspectrometry,JournalofAmerican SocietyforMassSpectrometry15,1274–1286,2004. 17. T.NishinoY.AizuT.Nagumo,The influence of sulfate content andmolecularweight of a fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome on its antithrombin activity, Thrombosis Research, 64(6), 723-731,1991. 22 ISOLATION AND STRUCTURAL DETERMINATION OF SULFATED POLYSACCHARIDE FROM BROWN SEAWEED HORMOPHYSA ARTICULATA IN NHA TRANG BAY Bui Van Nguyen1, Le Cong Hoan1, Le Do Thuy Vi1, Ngo Thi Uyen Tuyen1, Chu Thi Hoai Thu1, Thanh Thi Thu Thuy2 and Tran Thi Thanh Van3 1University of Khanh Hoa 2 Institute of Chemistry, Vietnam Academy of Science and Technology 3Nhatrang Institute of Technology Research and Application Abstract:We investigated the structure of sulfated polysaccharide (fucoidan) from brown seaweed Hormophysa articulata in Nha Trang bay. The content of fucoidans was 2,03% per dried brown seaweed. Using DEAE- cellulose column chromatography, fucoidan was fractionated into three fractions (F1, F2 and F3). F3 main fraction of fucoidan, contained 36,3 % mol of ester sulfate and had a simplest sugar component (L-Fuc : D-Gal = 1: 0,3). The structure of F3 was determined by IR, NMR and ESIMS spectra. The results showed that F3 is a galactofucansulfate which composed of α-L-fucose-(2,4-sulfate) and -D-galactose-(2-sulfate) and galactoseresiduesconnecttofucosebylinkage1→3or1→4. Keywords: Brown seaweed, sulfated polysaccharide, fucoidan, Hormophysa articulata, spectroscopic methods.