Chọn giống lúa chất lượng cao bằng gen chức năng WX và khảo sát tính trạng phẩm chất

45 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 8(105)/2019 Selection of inbreed rice varieties with high quality in Hanoi Vu Van Khanh, Nguyen Thi Phuong Lan Tran Hau Hung, Nguyen Van Bang Abstract In recent years, demand for high quality rice of the inhabitants of the capital has been very high. The supply has mainly been from the provinces of Nam Dinh, Thai Binh and from some other provinces, but has not been active while the source of high-quality rice offered by the farmers in Hanoi has only guaranteed a small share of the needs. The initial results of selection of inbreed rice varieties with high quality in Hanoi have selected some inbreed rice varieties such as BT09, CXT30, Bac Huong 9, LH12 with high yield, delicious rice, good resistance to pests and diseases, and short growth time suitable for the Spring season and Summer season to release for production, contributing to increase productivity and yield of high quality rice in Hanoi. The selected rice varieties had high yield, ranging from 60 - 64 quintals/ha, slightly infected by pests and diseases; non-lodging; good quality rice with elongated grain shape; fragrant equivalent to BT7, soft and non-sticky rice. Keywords: High quality, selection, inbred rice variety Ngày nhận bài: 22/4/2019 Ngày phản biện: 10/5/2019 Người phản biện: TS. Tạ Hồng Lĩnh Ngày duyệt đăng: 15/5/2019 1 Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ 2 Viện Nghiên cứu Phát triển Đồng bằng sông Cửu Long, Trường Đại học Cần Thơ CHỌN GIỐNG LÚA CHẤT LƯỢNG CAO BẰNG GEN CHỨC NĂNG Wx VÀ KHẢO SÁT TÍNH TRẠNG PHẨM CHẤT Huỳnh Kỳ1, Trần Hữu Phúc2, Văn Quốc Giang1, Nguyễn Văn Mạnh1, Nguyễn Lộc Hiền1, Nguyễn Châu Thanh Tùng1 TÓM TẮT Nghiên cứu sử dụng chỉ thị gen chức năng Wx quyết định tới hàm lượng amylose trong hạt gạo ở một số giống lúa địa phương nhằm chọn ra các giống địa phương có hàm lượng amylose thấp phục vụ cho công tác chọn giống chất lượng cao ở Đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả đã chọn được 3 giống lúa địa phương Bờ Liếp 2, Móng Chim Trắng, Thơm Mẳn có kiểu gen A cho hàm lượng amylose thấp, trung bình (≤ 22%). Các giống này có thể sử dụng cho công tác chọn tạo giống chất lượng cao, phục vụ cho nhu cầu sản xuất lúa ở Đồng bằng sông Cửu Long. Từ khóa: Lúa, amylose, gen chỉ thị chức năng, chất lượng I. ĐẶT VẤN ĐỀ Khu vực Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) có khoảng hơn 2.000 giống/dòng lúa địa phương được thu thập và đang tồn trữ ở Trường Đại học Cần Thơ, trong đó khoảng 517 giống/dòng được đưa cho nông dân canh tác (Sen and Trinh, 2009). Trên thực tế, một chiến lược nhân giống thành công trong cải tiến lúa gạo không thể được thực hiện nếu không có nhiều nguồn gen (Collard et al., 2005; Subudhi et al., 2006). Dấu chỉ thị phân tử (MAS) đã sử dụng trong nghiên cứu chọn giống, nhằm kiểm tra nhanh sự di truyền của tính trạng mong muốn ở thế hệ con lai. Đặc tính mềm cơm được quy định bởi hàm lượng amylose (AC) trong gạo là một trong những mục tiêu quan trọng nhất để xác định chất lượng gạo chịu ảnh hưởng chủ yếu bởi tinh bột, một thành phần của amylose và amylopectin (Juliano, 1971; Khoomtong and Noomhorm, 2015). Việc sử dụng gen chức năng là dấu phân tử (MAS) trực tiếp ảnh hưởng lên kiểu hình, với dấu phân tử loại này đã giúp các nhà chọn giống chọn lọc chính xác hơn. Điều này giúp giảm chi phí chọn giống với kỹ thuật khá đơn giản và hiệu quả của MAS và gen chỉ thị, đã rút ngắn thời gian chọn lọc, đây là một biện pháp kỹ thuật sẽ ứng dụng rất nhiều trong tương lai (Tian et al., 2016; Andersen and Lübberstedt, 2003). Vì vậy, trong nghiên cứu này đã ứng dụng dấu phân tử gen chức năng Wx có kiểu gen đột biến SNP WxEx6 có sự thay thế nucleotide A C ở exon 6 của gen waxy dẫn đến việc thay đổi hàm lượng amylose 46 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 8(105)/2019 trong gạo, dựa vào sự thay thế này, Zhou và cộng tác viên (2018) đã được thiết kết 4 cặp mồi dùng để phân nhóm kiểu hình gạo amylose cao thấp khác nhau. Nghiên cứu này nhằm mục đích ứng dụng dấu phân tử để lựa chọn các đặc tính chất lượng hạt gạo của các giống lúa mùa địa phương nhằm phục vụ công tác chọn giống sau này. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Nguồn gốc của 20 giống lúa mùa được thu thập ở ĐBSCL và tồn trữ ở Viện Nghiên cứu Phát triển ĐBSCL - Trường Đại học Cần Thơ. 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Phân tích chất lượng xay chà (chiều dài, chiều rộng, tỷ lệ xay chà) theo IRRI (1996) và amylose theo phương pháp Cagampang và Rodriguez (1980). - Phân tích kiểu gen waxy: DNA của 20 giống lúa được ly trích theo phương pháp CTAB (Doyle and Doyle, 1987). Kiểu gen Wx-in (amylose trung bình và thấp) được đánh giá theo phương pháp của Zhou et. al. (2018) bằng kỹ thuật PCR. Phản ứng PCR được thực hiện ở 15 µl hỗn hợp PCR, trong đó bao gồm dung dịch 2xPCR (e-Taq NEXpro, Hàn Quốc) với 50 ng DNA và 200 nM cho mỗi mồi của 4 mồi cho mỗi phản ứng, trình tự của mồi được liệt kê trong bảng 1. Bảng 1. Các mồi dùng cho nhận diện kiểu gen và Wx-Ex6 (Zhou et. al., 2018) Tên mồi Trình tự mồi (5’à3’) Sản phẩm Sản phẩm PCR (bp) Ex6AF CTGGAGAAGGTGGAGTCAT Ex6CR GGCGGTGATGTACTTGTCC AF-CR (Common band) 1025 Ex6AR GATCTTGAGATCAATTGTAACTCACGAT AF-AR (A type) 310 Ex6CF CAACCCATACTTCAAAGGAACATC CF-CR (C type) 766 Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình sau 950C cho 5 phút, sau đó chu kỳ 35 vòng cho 950C cho 30 giây, 650C cho 30 giây và 720C cho 30 giây, riêng đối với sản phẩm PCR được phân tách trên gel agarose 2% (w/v) (Bioline, UK). Sau khi điện di xong gel điện di được nhuộm với ethidium bromide (10 mg/mL). Kết quả PCR được ghi nhận dựa vào phổ điện di cho kiểu hình dương tính, âm tính và di hợp tử. 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2019 tại phòng thí nghiệm Di truyền và Chọn giống cây trồng, Khoa Nông nghiệp, Đại học Cần Thơ. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đánh giá các tính trạng phẩm chất hạt gạo Kết quả bảng 2 cho thấy chiều dài hạt gạo các giống rất đa dạng, biến động từ 4,8 - 6,3 mm tuỳ thuộc vào đặc tính di truyền của giống. Theo IRRI (1980), chiều dài gạo trắng như sau: gạo rất dài (≥ 7,0 mm), hạt gạo dài (6,0 - 6,9 mm), gạo dài trung bình (5 - 5,9 mm) và gạo ngắn (≤ 5,0 mm). Chiều dài hạt gạo không bị ảnh hưởng bởi môi trường, đây là tính trạng ổn định nhất, được xem là đặc trưng của giống nên cần được quan tâm trong quá trình chọn vật liệu cho mục tiêu lai tạo. Chang and Somrith (1979) thì cho rằng chiều dài hạt gạo do đa gen, tính trội được ghi nhận như sau: hạt dài > hạt trung bình > hạt ngắn > hạt rất ngắn. Dựa vào chiều dài và chiều rộng hạt gạo để phân cấp dạng hạt, trong 20 giống lúa mùa có 7 giống dạng hạt trung bình và 13 giống có dạng hạt dài. Chiều dài hạt gạo và dạng hạt gạo là những tính trạng di truyền độc lập, do đó trong quá trình lai tạo ta có thể kết hợp với những tính trạng như: hàm lượng amylose, protein, kiểu cây, tính miên trạng và thời gian sinh trưởng (Jennings et al., 1979). Dạng hạt có ảnh hưởng đến tỷ lệ gạo nguyên sau khi xay chà, hạt càng mảnh, dài và độ bạc bụng cao thì tỷ lệ gạo nguyên thấp (Lê Doãn Diên, 1990). Kết quả bảng 2 cho thấy các giống khác nhau có mức độ bạc bụng khác nhau, trong quá trình lai tạo thì những giống càng ít bạc bụng càng được ưu tiên chọn làm cây bố mẹ nhằm duy trì đặc tính tốt này của giống. Tỷ lệ gạo lức cho biết hạt lúa có vỏ trấu mỏng hay dày của từng giống, giống có vỏ trấu dày thường thì tỷ lệ xay chà thấp. Tỷ lệ gạo lức thể hiện sự vận chuyển chất khô vào hạt ở giai đoạn vào hạt chắc. Tuy nhiên, tỷ lệ gạo lức và gạo trắng ít bị biến động trước những bất lợi của môi trường (Bùi Chí Bửu, 1997). 47 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 8(105)/2019 Bảng 2. Phẩm chất hạt gạo 20 giống lúa mùa ở vùng ĐBSCL TT Tên giống Dài gạo (mm) D/R Cấp (dạng hạt) Gạo lức (%) Gạo trắng (%) Gạo nguyên (%) Bạc bụng (Cấp 9) 1 Lùn Cẩn Đỏ 5,7 2,7 3 80,9 68,3 59,9 13,3 2 Bờ Liếp 2 6,1 3,3 1 80,4 69,1 60,7 5,3 3 Một Bụi Đỏ Cà Mau 5,7 3,3 1 79,9 68,7 60,3 6 4 Một Bụi Lùn 5,8 3,4 1 80,1 69,2 60,8 2,3 5 Lùn Cao Sản Đỏ 5,2 3,0 3 78,4 66,4 56,9 17,3 6 Lùn Cao Sản Trắng 5,7 3,2 1 78,2 65 55,5 13,3 7 Tài Nguyên 6,3 3,5 1 78,2 65,6 56,1 12,7 8 Nàng Co Đỏ 5,6 3,1 1 78,4 66,4 56,9 16,6 9 Trà Long 2 4,8 2,7 3 79,5 67,5 59,1 14,7 10 Ba Bụi 2 6,0 3,2 1 79,3 66,1 57,7 12 11 Năm Tài 1 5,8 3,3 1 80,4 66,3 57,9 17,3 12 Một Bụi 5 5,9 3,4 1 79,7 66,5 58,1 16,3 13 Một Bụi Đỏ 5,7 3,3 1 78,2 65,6 56,1 6 14 Móng Chim Trắng 5,0 2,5 3 80,4 67,8 60,5 1,3 15 Móng Chim Đen 5,4 3,0 3 80,3 65,8 57,4 18,7 16 Tét Rằng 5,4 3 3 80,6 68,6 61,3 13,1 17 Nàng Thơm 6,1 3,5 1 80,4 67,2 59,9 9,7 18 Thơm Mẳn 6,2 3,3 1 81,5 67,4 60,1 2,7 19 Nếp Sữa 5,3 2,6 3 79,3 66,7 58,3 3,3 20 Nàng Thơm Chợ Đào 6,2 3,5 1 78,2 65 55,5 10,7 Ghi chú: D/R: chiều dài hạt gạo/rộng hạt gạo. Cấp (dạng hạt): cấp 1: dạng hạt thon dài, cấp 3: dạng hạt trung bình. 3.2. Kết quả đánh giá hàm lượng amylose trong hạt gạo của 20 giống lúa mùa Trong hạt gạo xay đặc điểm nấu ăn bị ảnh hưởng bởi tỷ lệ của hai loại tinh bột, amylose và amylopectin chứa trong phôi nhũ của hạt gạo (Juliano, 1979). Gạo có thể phân nhóm dựa vào hàm lượng amylose như waxy (0 - 2%), rất thấp (3 - 12%), thấp (13 - 20%), trung bình (21 - 25%), và cao (≥ 26%) (IRRI, 1996). Chất lượng gạo nấu của 20 giống lúa trong nghiên cứu này nhìn chung được phân loại từ thấp đến cao hàm lượng amylose, trong đó chỉ giống Nếp Sữa được phân vào nhóm waxy có hàm lượng amylose khoản 2%, 19 giống còn lại chủ yếu tập trung ở hàm lượng amylose trung bình từ và cao (Bảng 3). Bảng 3. Hàm lượng amylose có trong gạo của 20 giống lúa thí nghiệm TT Tên giống Amylose (%) TT Tên giống Amylose (%) 1 Lùn Cẩn Đỏ 26,50 11 Năm Tài 1 24,00 2 Bờ Liếp 2 21,47 12 Một Bụi 5 26,00 3 Một Bụi Đỏ Cà Mau 24,00 13 Một Bụi Đỏ 24,00 4 Một Bụi Lùn 23,97 14 Móng Chim Trắng 22,53 5 Lùn Cao Sản Đỏ 24,03 15 Móng Chim Đen 26,03 6 Lùn Cao Sản Trắng 26,53 16 Tét Rằng 26,37 7 Tài Nguyên 22,00 17 Nàng Thơm 21,00 8 Nàng Co Đỏ 27,67 18 Thơm Mẳn 20,00 9 Trà Long 2 24,00 19 Nếp Sữa 2,00 10 Ba Bụi 2 24,00 20 Nàng Thơm Chợ Đào 22,00 48 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 8(105)/2019 3.3. Kết quả đánh giá kiểu gen SNP WxEx6 Kiểu gen SNP WxEx6 có sự thay thế nucleotide A C ở exon 6 của gen Wx, khi có sự thay thế nucleotide dẫn đến gạo có hàm lượng amylose cao trở thành gạo có hàm lượng amylose thấp và trung bình, dựa vào sự thay thế này Zhou và cộng tác viên (2018) đã được thiết kết 4 cặp mồi dùng để phân nhóm kiểu hình gạo amylose cao thấp khác nhau. Dựa vào dấu phân tử này 20 giống lúa thí nghiệm có thể nhận diện được các giống lúa Bờ Liếp 2, Móng Chim Trắng, Thơm Mẳn và Nếp Sữa có kiểu gen A cho kiểu hình amylose từ trung bình, thấp và waxy, trong khi đó giống Nàng Co Đỏ, Trà Long 2 và Nàng Thơm Chợ Đào không nhận diện được kiểu gen. Nhóm lúa còn lại là kiểu gen C, mang hàm lượng amylose trung bình và cao (Hình 1). Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Zhou và cộng tác viên (2018). Hình 1. Phổ điện di nhận diện kiểu gen SNP Wx-ln1 cho 20 mẫu lúa địa phương bằng gel agarose 2% (Bioline, UK) Ghi chú: M là thang chuẩn 1 kb DNA (Bioline, UK), giếng từ 1 - 20 tương ứng theo số thứ tự giống bảng 2. Sự tổng hợp tinh bột trong gạo được xúc tác bởi enzyme liên kết hạt tinh bột (GBSS) và nó được mã hóa bởi gen Wx nằm trên NST số 6. Các nghiên cứu trước đây đã xác định được một số đa hình nucleotide có liên quan đến gen Wx, bao gồm một số kiểu đa hình của dấu chỉ thị phân tử SSR với kiểu gen (CT)n và sự đa hình SNP có kiểu gen biến đổi từ A-C ở exon 6 [Ex6A/C SNP] (Wx-in) với sự thay đổi này dẫn đến thay đổi bộ ba mã hóa từ serine thành typrosine và kết quả là cho ra kiểu hình amylose trung bình (Chen et al., 2010). IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Kết quả ứng dụng gen chức năng Wx với chỉ thị phân tử SNP WxEx6 trong nghiên cứu này đã nhận biết được các giống có hàm lượng amylose thấp và trung bình (≤ 22%), từ đó cho thấy việc ứng dụng gen chức năng là chỉ thị thông qua kỹ thuật PCR là hữu ích trong chọn giống. 4.2. Đề nghị Tiếp tục ứng dụng dấu phân tử SNP WxEx6 ở các giống lúa khác nhằm đánh giá chính xác hơn khi ứng dụng kỹ thuật này trong công tác chọn giống lúa chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu phục vụ sản xuất. LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu được tài trợ bởi dự án Nâng cấp Trường Đại học Cần Thơ VN14-P6 (vay ODA từ chính phủ Nhật Bản). Cảm ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo đã cho thực hiện đề tài “Thu thập, bảo tồn và đánh giá một số đặc điểm di truyền của tập đoàn 300 giống lúa mùa vùng Bán đảo Cà Mau” để có nguồn giống thực hiện nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Chí Bửu, 1997. Hiện trạng phát triển giống lúa chất lượng cao ở ĐBSCL. Kết quả nghiên cứu khoa học nông nghiệp (1994 - 1995), Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. Nxb Nông nghiệp. Hà Nội. Lê Doãn Diên, 1990. Vấn đề chất lượng lúa gạo. Tạp chí Khoa học kỹ thuật và Quản lý Kinh tế, Nông nghiệp và Công nghiệp thực phẩm, Số 332 (2). Trang 96. Andersen, J.R., Lübberstedt, T., 2003. Functonal markers in plants. Trends in Plant Science 8: 554-560. Cagampang G.B and Rodriguez F.M., 1980. Methods analysis for screening crops of appropriate qualities. Institute of plant breeding, University of the Philippines at Los Banos, pp.8-9. M 1 953 11 15 1913 1772 10 14 1812 16 2064 8 49 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 8(105)/2019 Chang, T. T. and Somrith, B., 1979. Genetic studies on the grain quality. The International Rice Research Institute, Los Bafios, Philippines, pp. 49-58. Chen, M., Fjellstrom, R.G., Christensen, E.F., Bergman, C.J., 2010. Development of three allele- specific codominant rice Waxy gene PCR markers suitable for marker-assisted selection of amylose content and paste viscosity. Molecular Breeding, 26: 513-523. Collard, B.C.Y., Jahufer, M.Z.Z., Brouwer, J.B., Pang, E.C.K., 2005. An introduction to markers, quantitative trait loci (QTL) mapping and marker- assisted selection for crop improvement: the basic concepts. Euphytica, 142: 169-196. Doyle, J.J., Doyle, J.L., 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin, 19: 11-15. IRRI, 1996. Standard Evaluation system of rice. International Rice Research Institute, P.O. Box 933. 1099, Manila, Philippines. IRRI, 1980. Descriptions for rice Oryza sativa. International Rice Research Institute, Los Baños, Philippines (in press): 21p. Jennings, P.R., W.R. Coffman and H.E. Kauffman, 1979. Rice Improvements. International Rice Research Institute, Los Banos, Philippines, p. 186. Juliano, B. O., 1979. Amylose analysis in rice-A review. In: Proc. Workshop on Chemical Aspects of Rice Grain Quality. IRRI: Los Bafnos, Laguna, Philippines. Juliano, B.O., 1971. A simplified assay for milled rice amylose. Cereal Science Today, 16: 334-338. Khoomtong, A., Noomhorm, A., 2015. Development of a Simple Portable Amylose Content Meter for Rapid Determination of Amylose Content in Milled Rice. Food Bioprocess Technol, 8 (9): 1938-1946. Sen, P.T., Trinh, L.N., 2009. Vietnam Second Country Report on the State of the Nation’s Plant Genetic Resources for Food and Agriculture. Food and Agriculture Organization, 34p. Subudhi, P.K., Sasaki, T., Khush, G.S., 2006. Rice. In: Kole C, editor. Genome mapping and molecular breeding in plants. Berlin: Springer Verlag, pp. 1-78. Tian, D.G., Chen, Z.J., Chen, Z.Q., Zhou, Y.C., Wang, Z.H., Wang, F., Chen, S.B., 2016. Allele-specifc marker-based assessment revealed that the rice blast resistance genes Pi2 and Pi9 have not been widely deployed in Chinese indica rice cultivars. Rice, 9: 19. Vasudevan, K., Vera Cruz, C.M., Gruissem, W., Bhullar, N.K., 2014. Large scale germplasm screening for identification of novel rice blast resistance sources. Front Plant Sci., 5: 505. Zhou, L., Chen, S., Yang G., Zha W., Cai H., Li S., Chen Z., Liu K., Xu H., and You A., 2018. A perfect functional marker for the gene of intermediate amylose content Wx-in in rice (Oryza sativa L.). Crop Breeding and Applied Biotechnology, 18: 103-109. Selection of high quality rice by functional gen marker Wx and evaluation of quality characteristics Huynnh Ky, Tran Huu Phuc, Van Quoc Giang, Nguyen Van Manh, Nguyen Loc Hien, Nguyen Chau Thanh Tung Abstract The amylose functional gene marker Wx (Waxy) conferring low amylose content in landrace rice varieties was used to select high quality varieties for the Mekong Delta. The results showed that 3 local rice varieties including Bo Liep 2, Mong Chim Trang, and Thom Man had genotypes A for low and medium amylose content (≤ 22%). These varieties can be used for the breeding of high quality varieties in the Mekong Delta. Keywords: Rice, amylose, functional gen marker, quality Ngày nhận bài: 10/7/2019 Ngày phản biện: 29/7/2019 Người phản biện: TS. Trần Ngọc Thạch Ngày duyệt đăng: 9/8/2019