Chọn lọc các cá thể F2 đồng hợp tử mang QTL9 liên quan đến cấu trúc bông lúa bằng chỉ thị phân tử CAPS

55 Khoa học Nông nghiệp 63(2) 2.2021 Đặt vấn đề Cấu trúc bông là một trong những tính trạng quan trọng hàng đầu quyết định năng suất lúa. Từ những năm 1960, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu nhằm tối ưu hóa kích thước cấu trúc bông lúa, trong đó chiều dài bông, số lượng các gié/bông và số lượng hạt/bông là những đặc điểm thu hút sự quan tâm nhiều nhất. Rất nhiều gen liên quan đến chiều dài trục bông, sự phân nhánh và số hạt/bông đã được tìm ra bằng phương pháp lập bản đồ QTL (quantitative trait loci) và phân tích đột biến: Ghd7, Ghd7.1, Ghd8/DTH8 [1-3], LAX1 [4], DEP1 [5]... Ngoài ra, một số lượng nhỏ gen được xác định liên quan đến sự phân nhánh bậc cao (số gié thứ cấp/bông, tam cấp/ bông) và số hạt/bông: Gn1a [6], LRK1, LAX2, TAW1 [7-9]. Những năm gần đây, phân tích GWAS trở thành một công cụ hữu ích để nghiên cứu sự đa dạng của quần thể và phát hiện thêm nhiều hơn các loci quan trọng, đặc biệt là các loci liên kết với các tính trạng nông học phức tạp như tính trạng năng suất. Nhiều QTL liên quan đến các tính trạng năng suất như: trọng lượng 1.000 hạt, số lượng bông/cây, số gié sơ cấp/bông, số gié thứ cấp/bông, chiều dài trục bông, số nhánh/bông, số hạt/bông đã được công bố trong vài năm gần đây [10-14]. Những thành tựu này phản ánh sự phổ biến, mức độ đáng tin cậy cũng như tiềm năng to lớn của các nghiên cứu bằng GWAS trên các tính trạng nông học ở lúa. Tuy nhiên, kết quả phân tích GWAS dựa vào các thuật toán thống kê để khai thác được các QTL mới vào các chương trình chọn tạo giống nên chúng cần phải được kiểm chứng vai trò thông qua các quần thể lai và phân tích bằng chỉ thị phân tử kết hợp với đánh giá kiểu hình. Trong số các quần thể được sử dụng để lập bản đồ QTL như quần thể F 2 , Doubled haploids (DHs) hoặc quần thể các dòng lai tái tổ hợp (Recombinant Inbred Lines - RILs) thì quần thể RILs là lựa chọn chính cho cây tự thụ phấn như lúa, Arabidopsis [15], nhờ những lợi thế thu được từ sự đồng hợp tử và tái tổ hợp có hiệu quả của chúng. RILs được phát triển từ một hạt F 2 duy nhất: từ mỗi cây F 2 một hạt giống duy nhất được trồng thành cây F 3 , từ đó một hạt giống duy nhất trồng thành cây F 4 ... Các quần thể RILs được sử dụng để lập bản đồ QTL rất hiệu quả bởi ảnh hưởng của môi trường đến đặc điểm định lượng có thể giảm đi nhiều bằng cách đánh giá một số cây có cùng kiểu gen thay vì chỉ một cây duy nhất. Hơn nữa, việc Chọn lọc các cá thể F2 đồng hợp tử mang QTL9 liên quan đến cấu trúc bông lúa bằng chỉ thị phân tử CAPS Phạm Thị Mai1, Lê Thị Như1, Stefan Jouannic2, Khổng Ngân Giang1* 1Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2Viện Nghiên cứu phát triển Montpellier, Đại học Montpellier (Pháp) Ngày nhận bài 28/9/2020; ngày chuyển phản biện 1/10/2020; ngày nhận phản biện 30/10/2020; ngày chấp nhận đăng 19/11/2020 Tóm tắt: QTL9 là một tính trạng số lượng tiềm năng mới liên quan đến cấu trúc bông lúa, được xác định thông qua phân tích liên kết trên toàn hệ gen (GWAS) quần thể lúa bản địa Việt Nam. Các quần thể lai tái tổ hợp đã được phát triển từ 2 giống lúa bố mẹ G6 và G189 thuộc 2 haplotype tương phản về số gié thứ cấp/bông và số hạt/bông, nhằm nghiên cứu chức năng của QTL9. Bên cạnh đó, sử dụng công nghệ gen capture kết hợp với giải trình tự thế hệ mới đã xác định được 1.002 biến thể di truyền trong vùng QTL9 của 2 giống bố mẹ, trong đó 12 điểm đột biến đa hình đơn nucleotide (SNPs) được tìm thấy nằm trong vùng cắt của 5 enzym giới hạn. Trong nghiên cứu này, 12 cặp mồi đã được thử nghiệm để nhân chỉ thị CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences), được phát triển dựa vào 12 SNPs trên, nhằm ứng dụng để chọn lọc các dòng F2 đồng hợp tử mang kiểu gen QTL9 của bố và của mẹ. Phân tích sản phẩm PCR và cắt enzym giới hạn chọn lọc được 4 chỉ thị CAPS cho sự đa hình giữa 2 giống bố mẹ và phân bố bao phủ vùng QTL9. Kết quả đánh giá quần thể F2 gồm 275 cá thể bằng 3 chỉ thị CAPS thu được 74 dòng đồng hợp tử mang kiểu gen QTL9 của mẹ, 66 dòng đồng hợp tử mang kiểu gen QTL9 của bố và 135 dòng dị hợp tử. Các dòng đồng hợp tử sẽ được sử dụng để phát triển quần thể F3, đánh giá kiểu hình cấu trúc bông của quần thể F3 để làm sáng tỏ vai trò của QTL9 liên quan đến cấu trúc bông lúa. Từ khóa: cấu trúc bông lúa, chỉ thị phân tử CAPS, đồng hợp tử, năng suất, QTL, quần thể F2. Chỉ số phân loại: 4.6 * Tác giả liên hệ: Email: ngangiang.khong2010@gmail.com 56 Khoa học Nông nghiệp 63(2) 2.2021 ứng dụng các chỉ thị phân tử cho phép chọn lọc các dòng đồng hợp tử ngay ở thế hệ F 2 , rút ngắn thời gian thu được quần thể RILs đồng hợp tử xuống còn 3 thế hệ thay vì 8. Quần thể RILs có nguồn gốc từ cặp lai chéo giữa 2 giống Indica Minghui 63 và Zhenshan 97 đã được sử dụng rộng rãi để lập bản đồ QTL cấu trúc bông [16-18]. Các QTL liên quan đến hình dạng hạt (GS3), số hạt/bông, ngày ra hoa và chiều cao cây (Ghd7) đã được phân lập thành công [1, 19]. Các quần thể lập bản đồ có thể được đánh giá kiểu gen với bất kỳ chỉ thị phân tử nào, như SSR, CAPS, hoặc các chỉ thị được xây dựng từ các dữ liệu giải trình tự như: SNPs, INDELs (Inserts/Deletions) [15]. Cùng với sự phát triển của các thế hệ giải trình tự mới, hàng triệu SNPs đã được tìm thấy ở hàng trăm giống lúa khác nhau trên thế giới, tạo điều kiện cho việc phát triển chỉ thị phân tử CAPS, được ứng dụng rộng rãi không chỉ trong nghiên cứu lập bản đồ QTL mà còn hỗ trợ công tác chọn tạo giống [20-23]. Nguyên tắc của chỉ thị này là dựa vào sự đa hình của SNPs trong vùng trình tự cắt của enzym giới hạn. Ở những cá thể xảy ra đột biến trong vị trí cắt của enzym giới hạn (thường là SNPs) thì enzym sẽ không nhận ra để cắt. Từ đó, mồi được thiết kế để nhân đoạn DNA chứa vị trí cắt của enzym giới hạn. Sản phẩm PCR sau đó được cắt bởi enzym giới hạn sẽ cho các đoạn DNA có chiều dài khác nhau giữa giống có đột biến trong vị trí cắt của enzym giới hạn (chỉ có 1 đoạn DNA dài vì enzym không cắt sản phẩm PCR) và giống không có đột biến (sản phẩm PCR được cắt thành 2 mảnh DNA ngắn hơn). Đa hình của sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn dễ dàng quan sát được trên gel agarose. Tính di truyền đồng trội của CAPS là một trong những đặc tính quan trọng nhất của loại chỉ thị này dẫn đến cả cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử có thể dễ dàng phân biệt được. Trong các nghiên cứu trước đây của chúng tôi nhằm nghiên cứu chức năng của QTL9 liên quan đến cấu trúc bông [24], các quần thể lai tái tổ hợp đã được phát triển bằng cách lai 2 giống bố mẹ G6 và G189 thuộc 2 haplotype đối lập về cấu trúc bông (bông to và nhỏ) [25]. Bên cạnh đó, 12 SNPs nằm trong vùng cắt của 5 enzym giới hạn (SacI, DraI, EcoRV, BamHI, SalI) thuộc vùng QTL9 đã được xác định thông qua ứng dụng công nghệ chụp gen kết hợp với giải trình tự thế hệ mới [26]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát triển, thử nghiệm chỉ thị phân tử CAPS nhằm phân tích sự phân ly kiểu gen của QTL9 trong quần thể F 2 , góp phần tạo cơ sở để làm sáng tỏ vai trò của QTL9 liên quan đến cấu trúc bông lúa. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu 275 cây F 2 tự thụ được phát triển từ quần thể F 1 của cặp lai G6 x G189 [25], trong đó G6 (bông nhỏ, haplotype 1) là cây mẹ và G189 (bông to, haplotype 2) là cây bố. 12 chỉ thị CAPS được giới thiệu trong bảng 1 và 5 enzym cắt giới hạn được giới thiệu trong bảng 2 [26]. Selection of F2 homozygous plants over the QTL9 related to rice panicle structure by using CAPS markers Thi Mai Pham1, Thi Nhu Le1, Stefan Jouannic2, Ngan Giang Khong1* 1National Key Laboratory of Plant Cell Biotechnology, Agricultural Genertics Institute, Vietnam Academy of Agricultural Sciences 2University of Montpellier, UMR DIADE, IRD, Montpellier, France Received 28 September 2020; accepted 19 November 2020 Abstract: QTL9 is a new potential quantitative trait locus related to rice panicle structure, identified through a GWAS analysis of Vietnamese local rice panel. To validate the QTL9, a biparental population was developed using the low branching (G6) and the high branching (G189) accessions from two haplotypes characterised by a contrasting phenotype for the secondary branch number and spikelet number traits. In parallel, using Gene capture technology combined with new generation sequencing identified 1,002 genetic variants in the QTL9 region between two parents, of which 12 SNPs were found in the cleavage site of 5 restriction enzyme. In this study, 12 primer pairs were tested to amplify the CAPS markers, based on the 12 SNPs, in order to be applied to select homozygous F2 lines over the QTL9 region for both haplotypes. 4 CAPS markers were selected distributing over the QTL9 region and displaying polymorphism between two parents. 275 F2 plants were genotyped using 3 CAPS markers leading to the selection of 74 homozygotes plants over the QTL9 region for haplotype 1, 66 homozygotes plants over the QTL9 region for haplotype 2, and 153 heterozygous plants. Homozygous lines will be used to develop the F3 population, phenotyping of two F3 haplotypes will lead to discovering the role of QTL9 related to rice panicle structure. Keywords: CAPS maker, F2 population, homozygote, QTL, rice panicle structure, yield. Classification number: 4.6 57 Khoa học Nông nghiệp 63(2) 2.2021 Bảng 1. Danh sách 12 chỉ thị phân tử CAPS và trình tự mồi. Ký hiệu CAPS Vị trí SNP Tên Locus Đặc điểm vị trí Trình tự mồi CAPS #1 16748183 LOC_Os02g28334 UTR_3’ F- CTCCAGCATCTCACCCTCTC R- CTCCACCATGAATAACCTGCA CAPS #2 16805351 LOC_Os02g28410 Promoter F- GTTACTCCATCCGTCCCAAA R- GAATGCTCTCGTCGGATGAT CAPS #3 16882053 LOC_Os02g28530 Intron F- TGGTTTGGGTTACTCGGAAG R- TTACCTGGAGTGCAAGGTCC CAPS #4 16919772 Intragenic F- TTGTTCGTGATTCGCACGG R- CGTGCGAACCACGAAG CAPS #5 16961918 LOC_Os02g28670 Promoter F- GGCAGCATCAGCAAGCATAC R- GGATTAGCTCCCTACCACGC CAPS #6 17035526 LOC_Os02g28810 Promoter F- CTGAATCCGTCCAGCAAGGT R- TGCGAGAGGAACGAAACGAA CAPS #7 17039753 LOC_Os02g28820 Promoter F- TGGTGATTACGGCGTTTGGT R- TTCGGCAATACGTCACACTA CAPS #8 17124682 LOC_Os02g28910 Promoter F- CACGCAGTTTAGCATGACGG R- TTCCCGTACTCTCGTCACCT CAPS #9 17161487 LOC_Os02g28980 UTR_3’ F- TGAGAAGCGAAACGCACCTT R- GCTTCCTCTGCTGTCGGTAA CAPS #10 17205540 LOC_Os02g29040 Intron F- GTCTGCGCCCACATTTTAGT R- GCCTTTCTCTCACCTTGCAC CAPS #11 17254246 LOC_Os02g29130 Intron F- TGGATTGCATGGTTTAGCTG R- ATGCATTGAGAGGGACCTTG CAPS #12 17271258 LOC_Os02g29150 UTR_3’ F- TGGTGGATTAATGCTGTGGA R- GCCACATTTAGATGTGTAA Bảng 2. Danh sách 5 enzym giới hạn sử dụng để cắt chỉ thị phân tử CAPS. Enzym Chỉ thị phân tử CAPS SNP (H1/H2) Trình tự vị trí cắt của enzym giới hạn Kích thước sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn G6 (H1) G189 (H2) G6 (H1) G189 (H2) SacI CAPS#1 G/A GAGCTC AAGCTC 134 &223 357 DraI CAPS#2 T/G TTTAAA TTGAAA 346&531 877 CAPS#3 A/T TTAAAA TTTAAA 689 473&216 CAPS#4 T/TA TTTAAA TTAAAA 601&251 852 CAPS#8 TA/T TTTAAA TTTTAA 273&779 1052 CAPS#9 TA/T TTTAAA TTTTTA 1027&683 1710 CAPS#11 T/A TTTAAA TTTAAT 226&333&339 559&339 TTTAAA TTTAAA EcoRV CAPS#5 A/T GATATC GTTATC 643&394 1037 CAPS#7 T/C GATATC GATACC 1321&127 1358 SalI CAPS#10 A/T GTCGAC GTCGTC 886&1023 1909 BamHI CAPS#6 G/A GAATCC GGATCC 577 304&273 CAPS#12 G/C GGATGC GGATCC 1103 1041&62 Chữ gạch chân: điểm đột biến trong vị trí cắt của enzym giới hạn. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế mồi: các mồi thiết kế dựa trên trình tự của giống Nipponbarre trên trang MSU Rice Genome Annotation (Osa1) Release 7 ( sử dụng phần mềm Primer3 plus ( nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi). Tách chiết DNA: DNA tổng số được tách chiết từ lá lúa 20-25 ngày tuổi theo phương pháp CTAB của Doyle (1991) [27] có cải tiến. Phản ứng PCR với cặp mồi CAPS: phản ứng PCR được thực hiện trong 10 µl, gồm 20 ng DNA, 0,2 µl dNTPs 10X (#R0182, Fermentas), 0,5 µl mồi CAPS xuôi và ngược, 0,8 µl MgCl 2 , 2 µl GoTaq Buffer 10X (#R0971, Fermentas), 0,05 µl GoTaq DNA polymerase 5 u/µl (#EP0702, Fermentas) và 5,2 µl nước Milli Q khử trùng. Chu trình nhiệt: 95°C trong 2 phút, 35 chu kỳ, 95°C - 30 giây, 57°C - 30 giây (nhiệt độ gắn mồi), 72°C - 1 phút và giữ 7 phút ở 72°C. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2,5%, rồi được soi trong buồng UV (Uvltec, Cambridge), phần mềm Fire Reader. Các thí nghiệm điện di sử dụng thang chuẩn DNA Low Gene Ruler 100 bp (#SM1163, Fermentas). Cắt sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn: các phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn được thực hiện với các kít của Hãng Thermo Fisher Scientific, mỗi phản ứng được thực hiện trong thể tích 20 µl bao gồm DNA, enzym giới hạn và dung môi. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37°C qua đêm, sau đó được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 2%. Kết quả và thảo luận Khảo sát sự đa hình của chỉ thị CAPS ở hai giống bố mẹ Trước khi sử dụng mồi CAPS để chọn lọc các dòng đồng hợp tử mang QTL9 trong quần thể F 2 , các mồi cần được kiểm tra độ đặc hiệu và sau đó là sự đa hình ở hai giống bố mẹ (2 haplotype) bằng phản ứng PCR và cắt enzym giới hạn. Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi CAPS Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR với 12 mồi CAPS ở 2 giống mẹ và bố (H1 và H2) thu được 6 cặp mồi CAPS cho kết quả đặc hiệu chỉ một băng DNA duy nhất, đúng với kích thước mong đợi ở cả 2 giống bố mẹ: CAPS#1 (357 bp), CAPS#5 (1.037 bp), CAPS#7 (1.358 bp), CAPS#8 (1.052 bp) (hình 1A), CAPS#6 (577 bp), CAPS#12 (1.103 bp) (hình 1B). Kết quả PCR với mồi CAPS#2 không đặc hiệu, xuất hiện nhiều băng DNA với kích thước khác nhau nhưng không có băng nào đúng với kích thước mong đợi (877 bp) ở cả 2 giống bố mẹ (hình 1B). Mồi CAPS#3 đặc hiệu ở giống mẹ (H1), thu được một băng duy nhất đúng kích thước mong đợi (689 bp), tuy nhiên ở giống bố (H2), ngoài băng đúng kích thước mong đợi còn xuất hiện một băng không đặc hiệu, có kích thước nhỏ hơn (khoảng gần 300 pb, hình 1B). Mồi CAPS#4 cho hai băng có kích thước khoảng 200 và 300 bp, không đúng với kích thước mong đợi (852 bp). Phản ứng PCR với mồi CAPS#9 và CAPS#10 không thu được băng nào ở cả 2 giống bố mẹ (hình 1B). Mồi CAPS#11 không đặc hiệu, xuất hiện nhiều băng DNA với kích thước khác nhau nhưng trong đó có băng đúng với kích thước mong đợi (898 bp) đậm và rõ nét nhất, kết quả giống nhau ở cả hai giống bố mẹ (hình 1B). 58 Khoa học Nông nghiệp 63(2) 2.2021 5 7 5 7 1 1 1037 pb 1358 pb 357 pb L H1 H1 H2 H2 L H1 H2 A 250 pb 500 pb L 2 3 4 6 8 9 10 11 1kb H20 H20 L L 2 3 6 8 9 4 10 11 12 12 Act Act 898 pb689 pb 577 pb 1103 pb 1052 pb 1052 pb689 pb 577 pb 898 pb H2 1103 pb 75 pb 75 pb H1 H2 H1 H2 H1 H2 B 100 pb 300 pb 500 pb 700 pb 1500 pb 1000 pb 100 pb 300 pb 500 pb 700 pb 1500 pb 1000 pb Hình 1. Hình ảnh điện di phản ứng PCR với 12 mồi CAPS ở 2 giống mẹ G6 và bố G189. A: 1: CAPS#1; 5: CAPS#5; 7: CAPS#7; L: promega 1 kb ladder; B: 2: CAPS#2; 3: CAPS#3; 4: CAPS#4; 6:CAPS#6; 8: CAPS#8; 9: CAPS#9; 10: CAPS#10; 11: CAPS#11; 12: CAPS#12; L: promega 100 pb DNA ladder, Act: actin. Như vậy, kết quả PCR với 12 mồi CAPS thu được 8 mồi CAPS có băng đúng với kích thước mong đợi ở cả 2 giống bố mẹ bao gồm: CAPS#1, CAPS#3, CAPS#5, CAPS#6, CAPS#7, CAPS#8, CAPS#11, CAPS#12. 4 cặp mồi CAPS#2, CAPS#4, CAPS#9, CAPS#10 không đặc hiệu hoặc không hoạt động. Khảo sát sự đa hình của mồi CAPS ở 2 giống bố mẹ bằng cắt enzym giới hạn Sản phẩm phản ứng PCR của 8 cặp mồi CAPS#1, CAPS#3, CAPS#5, CAPS#6, CAPS#7, CAPS#8, CAPS#11, CAPS#12 tiếp tục được xử lý cắt bằng các enzym giới hạn tương tứng (bảng 1) để kiểm tra sự đa hình giữa hai giống bố mẹ. Phân tích hình ảnh điện di sản phẩm cắt enzym giới hạn cho thấy, có 4 chỉ thị CAPS cho sự đa hình có thể phân biệt rõ ràng giữa 2 giống bố mẹ là CAPS#1, CAPS#5, CAPS#6 và CAPS#11. CAPS#1 được cắt bằng enzym giới hạn SacI, vị trí cắt của SacI trong giống mẹ không có đột biến nên sản phẩm PCR bị cắt thành 2 mảnh đúng với kích thước mong đợi (134 và 233 bp), ngược lại, đột biến xảy ra trong vị trí cắt của SacI trong giống bố nên sản phẩm PCR không bị cắt (357 bp) (hình 2A). CAPS#5 được cắt bằng enzym giới hạn EcoRV, ở giống mẹ quan sát thấy 2 băng DNA đúng với kích thước mong đợi (394 và 643 bp), trong khi ở giống bố xảy ra đột biến trong vị trí cắt của EcoRV nên sản phẩm PCR không bị cắt, do đó chỉ có 1 băng DNA duy nhất (1.037 bp) (hình 2B). Hình ảnh điện di sản phẩm cắt của CAPS#6 bằng enzym giới hạn BamHI thu được 2 băng DNA đúng với kích thước mong đợi (304 và 273 bp) ở giống bố, trong khi ở giống mẹ H1 (577 bp) không bị cắt (hình 2A). CAPS#11 chứa 2 vị trí cắt của enzym DraI, trong đó ở giống mẹ không có đột biến nào nên sản phẩm PCR của giống mẹ bị cắt thành 3 mảnh có kích thước là 226, 333 và 339 pb. Tuy nhiên, vì độ dài của 2 băng sau chỉ sai khác có 6 pb nên trên hình ảnh điện di chỉ quan sát thấy 2 băng DNA. Một vị trí cắt của DraI trong giống bố xảy ra đột biến nên sản phẩm PCR được cắt thành 2 băng có kích thước là 559 và 339 bp (hình 2D). Đối với CAPS#3 và CAPS#7, enzym cắt cả 2 giống mặc dù dự đoán có đột biến xảy ra ở giống bố (hình 2C). Ngược lại, CAPS#8 và CAPS#12 lại không bị cắt bởi enzym giới hạn, chỉ có 1 băng DNA duy nhất cùng kích thước 1.052 và 1.103 bp ở cả 2 giống bố mẹ (hình 2A). Kết quả cắt bằng enzym giới hạn của 8 chỉ thị CAPS cho thấy, có 4 chỉ thị CAPS cho sự đa hình giữa 2 giống bố mẹ và bao phủ vùng QTL9 là CAPS#1 (cắt bằng SacI), CAPS#5 (cắt bằng EcoRV), CAPS#6 (cắt bằng BamHI) và CAPS#11 (cắt bằng DraI). Các chỉ thị này có thể được sử dụng để xác định các cây F 2 mang QTL9 đồng hợp tử (hình 2). Trong số 4 chỉ thị CAPS#1, CAPS#5, CAPS#6 và CAPS#11 cho sự đa hình giữa giống bố mẹ thì vị trí của chỉ thị CAPS#5, CAPS#6 gần nhau (16961918 và 17035526) và đều nằm ở giữa vùng QTL9, trong khi chỉ thị CAPS#1 (16748183) và CAPS#11 (17254246) nằm ở 2 đầu của QTL9. 1 L 1 1 6 6 8 8 12 12 134 pb 233 pb 357 pb 1052 pb 1103 pb 273 pb 304 pb 577 pb 1052 pb 1103 pb 577 pb H1 H2 H1 H2 H1 H2 H1 H2 L 5 5 394 pb 643 pb 1037 pb L H1 H2 100 pb 200 pb 300 pb 500 pb 1000 pb 1500 pb A B L 3 3 7 7 1231 pb 127 pb 300 pb 689 pb 216 pb 473 pb H1 H2 H1 H2 L 11 11 226 pb 333 & 339 pb 559 pb 339 pb H1 H2 C D Hình 2. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn ở 2 giống mẹ G6 và bố G189. A: kết quả cắt enzym giới hạn của sản phẩm PCR với mồi CAPS#1, CAPS#6, CAPS#8 và CAPS#12; B: kết quả cắt enzym giới hạn của sản phẩm PCR với mồi CAPS#5; C: kết quả cắt enzym giới hạn của sản phẩm PCR với mồi CAPS#3, CAPS#7; D: kết quả cắt enzym giới hạn của sản phẩm PCR với mồi CAPS#11 (ghi chú các giếng: 1-CAPS#1, 3-CAPS#3, 5-CAPS#5, 6-CAPS#6, 7-CAPS#7, 8-CAPS#8, 11-CAPS#11, 12-CAPS#12; L: thang chuẩn DNA promega 1 kb ladder). Chọn lọc các dòng F2 mang QTL9 đồng hợp tử bằng chỉ thị phân tử CAPS Trong 4 chỉ thị phân tử CAPS (CAPS#1, CAPS#5, CAPS#6, CAPS#11) cho sự đa hình giữa 2 giống bố mẹ và bao phủ vùng QTL9, CAPS#5 và CAPS#6 có vị trí gần nhau nên chỉ sử dụng 3 chỉ thị CAPS (CAPS#1, CAPS#5 và CAPS#11) để chọn lọc các cây F 2 đồng hợp tử. DNA của 275 cây F 2 được tách chiết, chạy phản ứng PCR lần lượt với 3 cặp mồi của CAPS#1, CAPS#5 và CAPS#11, sau đó cắt bằng enzym giới hạn tương ứng (SacI, EcoRV và DraI). Kết quả hình ảnh điện di của CAPS#1 cho thấy, có 3 kiểu gen trong quần thể F 2 , các cá thể cho 2 băng DNA kích thước 134 và 233 bp là những cây đồng hợp tử mang QTL9 của mẹ, những cây chỉ có băng DNA duy nhất với kích thước 357 bp là cây đồng hợp mang QTL9 của bố, còn lại cây có cả 3 băng DNA là cây dị hợp tử (hình 3A). Kết quả trong tổng số 275 cây F 2 có 74 cây đồng hợp tử kiểu gen QTL9 của mẹ (G6), 66 cây đồng hợp tử kiểu gen QTL9 của bố (G189) và 135 cây dị hợp tử mang cả 2 kiểu gen QTL9 của bố và mẹ. Tương tự, khi phân tích quần thể F 2 với CAPS#5 và CAPS#11 cũng thu được kết quả hoàn toàn trùng lặp với CAPS#1 (hình 3B, C). 59 Khoa học Nông nghiệp 63(2) 2.2021 Kết luận Sự phân ly kiểu gen của QTL9 trong quần thể F 2 đã được đánh giá thành công nhờ sử dụng 3 chỉ thị phân tử CAPS. Phân tích 275 cá thể F 2 với 3 chỉ thị phân tử CAPS#1 CAPS#5 và CAPS#11 thu được 74 cây F 2 đồng hợp tử mang kiểu gen QTL9 của mẹ (G6), 66 cây F 2 đồng hợp tử mang kiểu gen QTL9 của bố (G189), chiếm tỷ lệ 50,9%. Các cây F 2 đồng hợp tử sẽ được phát triển tạo quần thể F 3 , phân tích kiểu hình cấu trúc bông của quần thể F 3 so sánh với 2 giống bố mẹ để làm sáng tỏ được vai trò của QTL9 liên quan đến cấu trúc bông và năng suất lúa. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] W. Xue, et al. (2008), “Natural variation in Ghd7 is an important regulator of heading date and yield potential in rice”, Nature Genetics, 40, pp.761-767. [2] W.H. Yan, et al. (2011), “A Major QTL, Ghd8, plays pleiotropic roles in regulating grain productivity, plant height, and heading date in rice”, Molecular Plant, 4, pp.319-330. [3] W. Yan, et al. (2013), “Natural variation in Ghd7.1 plays an important role in grain yield and adaptation in rice”, Cell Research, 23, pp.969-971. [4] K. Komatsu, et al. (2003), “LAX and SPA: major regulators of shoot branching in rice”, PNAS, 100, pp.11765-11770. [5] X. Huang, et al. (2009), “Natural variation at the DEP1 locus enhances grain yield in rice”, Nature Genetics, 41, pp.494-497. [6] M. Ashikari, et al. (2005), “Cytokinin oxidase regulates rice grain production”, Science, 309, pp.741-745. [7] X. Zha, et al. (2009), “Over-expression of the rice LRK1 gene improves quantitative yield components”, Plant Biotechnology Journal, 7, pp.611-620. [8] H. Tabuchi, et al. (2011), “LAX PANICLE2 of rice encodes a novel nuclear protein and regulates the formation of axillary meristems”, The Plant Cell, 23, pp.3276-3287. [9] A. Yoshida, et al. (2012), “TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition”, PNAS, 110, pp.767-772. [10] J. Yonemaru, et al. (2014), “Genomic regions involved in yield potential detected by genome-wide association analysis in Japanese high-yielding rice cultivars, BMC Genomics, 346, 12p. [11] W. Yang, et al. (2015), “Genome-wide association study of rice (Oryza sativa L.) leaf traits with a high-throughput leaf scorer”, Journal of Experimental Botany, 66, pp.5605-5615. [12] K. Zhao, et al. (2011), “Genome-wide association mapping reveals a rich genetic architecture of complex traits in Oryza sativa”, Nature Communications, 2, p.467. [13] S. Crowell, et al. (2016), “Genome-wide association and high-resolution phenotyping link Oryza sativa panicle traits to numerous trait-specific QTL clusters”, Nature Communications, 7, DOI: 10.1038/ncomms10527. [14] X. Bai, et al. (2016), “Genome-wide association analysis reveals different genetic control in panicle architecture between and rice”, The Plant Genome, 9, DOI: 10.3835/plantgenome2015.11.0115. [15] C. Alonso Blanco, et al. (1998), “Analysis of natural allelic variation at flowering time loci in the landsberg erecta and cape verde islands ecotypes of Arabidopsis thaliana”, Genetics, 149, pp.749-764. [16] S.B. Yu, et al. (1997), “Importance of epistasis as the genetic basis of heterosis in an elite rice hybrid”, PNAS, 94, pp.9226-9231. [17] Y.F. Tan, et al. (2000), “Genetic bases of appearance quality of rice grains in Shanyou 63, an elite rice hybrid”, Theoretical and Applied Genetics, 101, pp.823-829. [18] Y. Xing, et al. (2002), “Characterization of the main effects, epistatic effects and their environmental interactions of QTLs on the genetic basis of yield traits in rice”, Theoretical and Applied Genetics, 105, pp.248-257. [19] C. Fan, et al. (2006), “GS3, a major QTL for grain length and weight and minor QTL for grain width and thickness in rice, encodes a putative transmembrane protein”, Theoretical and Applied Genetics, 112, pp.1164-1171. [20] A. Cheng, et al. (2012), “Simple and rapid molecular techniques for identification of amylose levels in rice varieties”, International Journal of Molecular Sciences, 13, pp.6156-6166. [21] R. Yang, et al. (2012), “A putative gene sbe3-rs for resistant starch mutated from SBE3 for starch branching enzyme in rice (Oryza sativa L.)”, PLOS ONE, 7, DOI: 10.1371/journal.pone.0043026. [22] Y.Y. Tan, et al. (2013), “Functional molecular markers and high-resolution melting curve analysis of low phytic acid mutations for marker-assisted selection in rice”, Molecular Breeding, 31, pp.517-528. [23] S.H. Lim, S.H. Ha (2013), “Marker development for the identification of rice seed color”, Plant Biotechnology Reports, 7, pp.391-398. [24] Kim Nhung Ta, Ngan Giang Khong, Thi Loan Ha, Dieu Thu Nguyen, Duc Chung Mai, Thi Giang Hoang, Thi Phuong Nhung Phung, Isabelle Bourrie, Brigitte Courtois, Thi Thu Hoai Tran, Bach Yen Dinh, Tuan Nghia La, Nang Vinh Do, Michel Lebrun, Pascal Gantet, Stefan Jouannic (2018), “A genome-wide association study using a Vietnamese landrace panel of rice (Oryza sativa) reveals new QTLs controlling panicle morphological traits”, BMC Plant Biology, 18, p.282. [25] Vũ Thị Nhiên, Tạ Kim Nhung, Stefan Jouanic, Lê Hùng Lĩnh, Phạm Xuân Hội, Trần Khánh Vân, Trần Vũ Hằng, Phạm Thị Mai, Lê Thị Như, Khổng Ngân Giang (2018), “Tạo quần thể lai F1 làm vật liệu khởi đầu để đánh giá vai trò của QTL9 liên quan đến các tính trạng năng suất của tập đoàn lúa bản địa Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp, 11, tr.15-21. [26] Stefan Jouanic, Phạm Thị Mai, Lê Thị Như, Phạm Xuân Hội, Khổng Ngân Giang (2020), “Ứng dụng công nghệ gene capture để xác định SNP trong vùng QTL9 liên quan đến cấu trúc bông lúa”, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2020, tr.162-167. [27] J. Doyle (1991), DNA Protocols for Plants (Molecular Techniques in Taxonomy), Springer. L 3.1 3.2 3.5 3.6 3.7 3.9 3.10 3.11 3.13 3.14 134 pb 233 pb 357 pb 134 pb 233 pb 357 pb L 3.18 3.19 3.20 3.21 3.22 3.23 3.24 3.25 3.27 3.26 3.29 3.30 3.31 3.15 3.16 3.17 A L 19.7 19.9 19.10 19.11 19.13 19.14 19.15 19.16 19.17 19.18 19.19 19.21 19.22 19.23 G6 394 pb 643 pb 1037 pb 394 pb 643 pb 1037 pb L 3.1 3.2 3.5 3.6 3.7 3.9 3.10 3.11 3.13 3.14 3.15 3.16 G189 B L 3.24 3.25 3.29 3.30 3.38 3.39 3.41 3.42 3.43 3.44 3.45 3.46 3.47 3.49 3.50 L 3.51 3.53 3.54 3.55 3.57 3.58 3.59 3.60 3.61 3.62 3.63 3.65 3.66 3.67 3.68 226 pb 333 & 339 pb 559 pb 226 pb 333 & 339 pb 559 pb C Hình 3. Hình ảnh điện đi sản phẩm cắt enzym giới hạn của một số cây F2 với các chỉ thị phân tử CAPS. A: kết quả phân tích cây F 2 với chỉ thị CAPS#1; các cây đồng hợp tử: 3.11, 3.23, 3.25, 3.26, 3.31; B: kết quả phân tích cây F 2 với chỉ thị CAPS#5; các cây đồng hợp tử: 3.11, 3.16, 3.17, 19.10, 19.13, 19.15, 19.17, 19.21, 19.22; C: kết quả phân tích cây F 2 với chỉ thị CAPS#11; các cây đồng hợp tử: 3.25, 3.46, 3.50, 3.59, 3.62.