Chọn tạo dòng ớt chỉ thiên kháng bệnh héo rũ mang gen bất dục đực tế bào chất

14 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 5(102)/2019 CHỌN TẠO DÒNG ỚT CHỈ THIÊN KHÁNG BỆNH HÉO RŨ MANG GEN BẤT DỤC ĐỰC TẾ BÀO CHẤT Trần Ngọc Hùng1, Trịnh Thị Nhất Chung1, Đặng Thị Mai1 TÓM TẮT Hàng năm nước ta trồng khoảng 25 - 30.000 ha ớt, phần lớn là giống F1, quả chỉ thiên. Bất dục đực tế bào chất được ứng dụng rất hiệu quả trong sản xuất hạt lai F1, do toàn bộ các cây dòng mẹ không phải khử đực. Mặt khác, bệnh chết rũ ớt do nấm Phytophthora capsici gây hại rất phổ biến trên nhiều vùng sản xuất ớt hàng hóa mà biện pháp phòng trừ bằng thuốc hóa học rất kém hiệu quả. Hiện nay chưa ghi nhận bất kể giống ớt cay thương mại nào kháng bệnh chết rũ ở Việt Nam. Nghiên cứu này dựa vào sự trợ giúp của chỉ thị phân tử, lây bệnh nhân tạo kết hợp với chọn lọc truyền thống đã tạo được dòng ớt quả chỉ thiên kháng bệnh chết rũ có kiểu gen phục hồi (NRfRf), duy trì (Nrfrf) và dòng bất dục đực tương ứng (Srfrf) nhằm phục vụ cho tạo giống ớt ưu thế lai F1 dựa trên hệ thống bất dục đực tế bào chất. Từ khóa: Ớt (Capsicum annuum L.), bất dục đực tế bào chất, bệnh héo rũ (Phythophthora capsici) - Kết quả khảo nghiệm cơ bản cho thấy giống GL2-5 sinh trưởng, phát triển tốt, sâu bệnh hại ở mức nhẹ. Đặc biệt ở cây 3 năm tuổi chiều dài cành hoa đạt 25,3 cm, số hoa trên cành 33,8 hoa. Tỷ lệ ra mầm hoa (62,5%) và độ bền hoa (26 ngày). - Kết quả khảo nghiệm sản xuất giống GL2-5 cho thấy cây sinh trưởng, phát triển khỏe, ổn định ở các địa phương với chiều dài lá đạt 19,3 - 21,4 cm và chiều rộng lá đạt 4,9 - 5,1 cm, bệnh thối nhũn, đốm lá gây hại ở mức nhẹ, chất lượng hoa cao chiều dài cành hoa đạt từ 25,1 - 27,5 cm, số hoa/cành đạt 33 - 36 hoa, độ bền hoa đạt từ 24 - 26 ngày. 4.2. Đề nghị Hoàn thiện quy trình sản xuất cho giống lan Đai châu GL2-5 và mở rộng sản xuất ở điều kiện sinh thái miền Bắc Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2010. QCVN 01-38:2010/ BNNPTNT. Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về Phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng. Nguyễn Văn Hiển, 2000. Chọn giống cây trồng. NXB Giáo dục, Hà Nội. Trần Hợp, 1990. Phong lan Việt Nam, Tập 1 - 2. NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội. Distabanjong, K., Distabanjong, C., Ruengwiset, 2010. In vitro propagation and conservation of Rhynchostylis gigantea (Lindl.) Ridl. In Proceedings of the 48th Kasetsart University Annual Conference. Kasetsart, 3-5 March, 2010. Subject: Plants 2010 pp. Leonid V. Averyanov and Anna L. Averyanova, 2003. Updated checklist of the orchids of Vietnam. Vietnam National University Publising House, Hanoi. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Những năm gần đây nhu cầu lượng hạt giống ớt F1 của Việt Nam khoảng 5000 - 5500 kg để gieo trồng trên diện tích 25.000 - 30.000 ha. Sản xuất ớt hàng hóa tập trung ở 3 vùng chính: Đồng bằng sông Hồng với diện tích khoảng 4.000 ha, Nam Trung bộ Breeding and testing of GL2-5 rhynchostylis hybrid orchid variety Chu Thi Ngoc My, Dinh Thi Dinh, Dang Van Dong Abstract GL2-5 Rhynchostylis hybrid orchid was selected by the Research Institute of Fruit and Vegetable and developed from hybrid combination ( ĐC01 ˟ ĐC04) in the direction of new colors, healthy growth and development, less pest and disease and high yield and quality of flowers. Through the process of line evaluation, basic testing and production testing showed that the GL2-5 Rhynchostylis hybrid orchid variety had many outstanding characteristics compared to the control variety such as the number of leaves reached 7.0 - 7.1. Flowering rate was high and reached 59.5 - 65.5%; flower cluster length was 25.1 - 27.5 cm; flower diameter was 2.8 cm; flower durability was up to 24 - 26 days. Keywords: GL2-5 orchid variety, breeding, testing Ngày nhận bài: 16/4/2019 Ngày phản biện: 24/4/2019 Người phản biện: TS. Nguyễn Văn Tiến Ngày duyệt đăng: 15/5/2019 1 Viện Nghiên cứu Rau Quả 15 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 5(102)/2019 11.000 ha, và Nam bộ 14.000 ha, trong đó diện tích gieo trồng nhóm ớt chỉ thiên luôn chiếm tỉ trọng áp đảo. Ớt (Capsicum annuum L.) là cây tự thụ phấn, nhưng ở đồng ruộng tỉ lệ giao phấn là 7 - 37%, chủ yếu nhờ ong (Ahmed et al., 2001; Tanksley 1984, Odland and Poter, 1941). Do tính ưu việt của ưu thế lai nên giống F1 được sử dụng rất phổ biến. Tuy nhiên, chi phí để sản xuất hạt lai rất lớn nếu phải khử đực dòng mẹ. Bất dục đực tế bào chất (Cytoplasmic Male Sterility - CMS) do kết quả của sự tương tác gen nhân và gen tế bào chất được Peterson phát hiện ở chi Capsicum (1958). CMS là tính trạng di truyền theo hệ mẹ, cây bất dục không sản sinh ra hạt phấn. Tính ưu việt của hệ thống CMS là cây bất dục có thể tạo ra thế hệ sau bất dục đồng nhất, đây là đặc điểm vô cùng quan trọng mang ý nghĩa kinh tế quyết định trong sản xuất hạt giống lai F1 do không phải khử đực bằng tay. Tuy nhiên, đặc điểm bất dục thường không ổn định khi nhiệt độ thấp (Novak et al., 1971; Shifriss and Frankel, 1971; Shifriss and Guri, 1979). Bất dục đực tế bào chất được sử dụng rộng rãi để tạo giống ớt lai ở Ấn Độ, Trung Quốc (Kumar et al., 2009; Reddy et al., 2015). Ở Hàn Quốc, hầu hết các giống ớt cay F1 đều được sản xuất dựa trên hệ thống bất dục CMS, bao gồm 3 dòng: dòng A (Srfrf), dòng B (Nrfrf), dòng C (N(S)RfRf) (Yoo, 1990). Bệnh chết rũ ớt do nấm Phythophthora capsici được phân lập đầu tiên ở Mỹ (Leonian, 1922), nay đã phân bố ở nhiều nước, trong đó có Việt Nam. Các vùng trồng ớt tập trung tại Hải Dương, Bắc Ninh, Hải Phòng, bệnh gây chết hủy diệt trên quy mô lớn, và nấm bệnh tồn tại lâu dài trong đất. Thuốc hóa học hầu như không có hiệu quả phòng trừ bệnh này. Tạo giống kháng bệnh là hướng đi đang được ưu tiên. Nấm P. capsici có khả năng sinh sản hữu tính và rất thay đổi về độc tính nên chọn giống kháng bệnh phải thực hiện cho từng khu vực, lãnh thổ cụ thể. Tính kháng bệnh P. capsici được tìm thấy trên một số mẫu giống ớt ‘AC2258’, ‘AC311’, ‘Criollo de Morelos-334, CM334’, ‘Fyuco’, ‘Line29’, ‘P51’, ‘PI 123469’, ‘PI 201232’, ‘PI 201234’ và ‘PI 201238’ (Kimble and Grogan, 1960; Kim et al., 2010). Nhằm nâng cao hiệu quả chọn lọc dòng ớt bất dục, nhiều nghiên cứu về chỉ thị phân tử đã được thực hiện. Chỉ thị đồng trội (SCAR130/140) được xác định rất phù hợp để xác định kiểu S/N tế bào chất. Chỉ thị CRF-S870 liên kết với gen Rf. Đây là công cụ hữu hiệu để xác định kiểu gen liên quan đến bất dục đực tế bào chất (Yeh et al., 2016). Nghiên cứu chọn tạo giống ớt của Việt nam bắt đầu được thực hiện vào những năm 90, từ thu thập, đánh giá giống địa phương, chọn tạo dòng thuần, đến tạo giống lai F1. Các giống mới được tạo ra thuộc nhóm quả chỉ địa, sản xuất hạt giống lai sử dụng kỹ thuật khử đực bằng tay do đó rất hạn chế phát triển ngoài sản xuất: chi phí sản xuất hạt giống cao, chất lượng hạt giống thấp. Trước các thực trạng trên, mục đích của nghiên cứu này là tạo được dòng ớt chỉ thiên kháng bệnh héo rũ, phục vụ sản xuất hạt lai theo hệ thống bất dục đực tế bào chất (CMS). II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Thí nghiệm được thực hiện với 21 mẫu giống ớt, trong đó sử dụng giống CM334 làm đối chứng kháng bệnh. Giống ớt vàng Hà Nội và giống ớt Chìa vôi của Thừa Thiên - Huế, và các giống ớt thương mại chính cũng tham gia thí nghiệm. Các mẫu giống khác là các dòng chọn tạo theo hướng kháng bệnh đang ở F7, F9. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Xác định dòng ớt kháng bệnh héo rũ do nấm Phythophthora capsici Nấm P. capsici được phân lập từ cây ớt bị bệnh tại Viện Nghiên cứu Rau Quả. Nuôi cấy trên môi trường PDA và V8. Lây bệnh nhân tạo bằng bọc bào tử động, với nồng độ ~5 ˟ 103 bọc bào tử/ ml dịch lây bệnh. Hạt giống trước khi gieo được xử lý bằng dung dịch Javen 1%, sau đó gieo trên khay 50 lỗ, mỗi mẫu giống dùng 20 cây, lây bệnh ở giai đoạn sau gieo 30 ngày (~ 4 - 5 lá thật). Mỗi cây được lây 5 ml dung dịch bào tử. Sau khi lây bệnh 10 - 15 ngày sẽ đánh giá mức độ nhiễm bệnh từng cây theo thang sau: điểm 1- cây không có triệu chứng bệnh, điểm 2 - cây có triệu chứng lá hơi vàng nhưng không héo, điểm 3 - có trên một lá héo, điểm 4 - cây héo, chết. 2.2.2. Đánh giá tính hữu thụ Kiểm tra số lượng hạt phấn bằng phương pháp nhuộm màu sau đó soi dưới kính hiển vi. Mỗi cây nhuộm 10 - 12 bao phấn bằng dung dịch KI 1%, 20 cây/dòng. Hạt phấn hình tròn, bắt màu đậm là hạt phấn hữu dục. Trái lại, hạt phấn nhăn, dị hình bắt màu kém là hạt phấn bất dục. 16 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 5(102)/2019 2.2.3. Xác định kiểu gen nhân và tế bào chất liên quan đến bất dục đực Sử dụng bộ kít chiết DNA từ mô lá non theo phương pháp tách chiết của Kit (Plant/Fungi DNA isolation kit). DNA tinh sạch được bảo quản trong đệm TBE ở –200C để dùng cho các phản ứng PCR. Xác định gen phục hồi trong nhân (Rf) (Gulyas et al., 2006): Chỉ thị CRF-SCAR có trình tự như sau: 5’-GTACACACCACTCG-TCGCTCCT-3’, 5’-TTCTTGGGTCCCTTT-CTTCCAA-3’. Mẫu giống mang gen Rf sẽ xuất hiện band 870 bp, mẫu giống mang gen rf không xuất hiện band. Xác định gen bất dục đực tế bào chất bằng chỉ thị phân tử SCAR130, có trình tự là: 5’-TTA CGG CTC GTT ACC GCA GCG-3’, 5’-CAA TTG ACC GAC CCG CCA T-3’ (Ji et al., 2014). Phản ứng PCR được thực hiện với 10 phút biến tính DNA ở 950C, sau đó với 34 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 950C 30 giây, 550C 45 giây, 720C 45 giây. Chu kỳ kéo dài ở 720C trong 5 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên acrylamide gel 6%, trong dung dịch đệm TBE 0,5X, nhộm bằng ethidium bromide. Dòng có kiểu gen S tế bào chất sẽ xuất hiện band 130 bp, dòng có kiểu gen N xuất hiện band 140 bp. 2.2.4. Lai tạo chọn dòng ớt duy trì, dòng phục hồi, chỉ thiên, kháng bệnh héo rũ Dòng 94BS71 (94BS71-1-2-3-8-2-3-1-1) (F9) được xác định kháng cao với bệnh héo rũ, quả chỉ địa, kiểu gen dòng duy trì (Nrfrf) làm dòng mẹ lai với giống lai thương mại quả chỉ thiên. Sau đó, thế hệ F1 tạo ra được lai lại với dòng kháng bệnh (94BS71) tạo ra thế hệ BC1F1. Lây bệnh nhân tạo chọn lọc cây kháng kháng bệnh héo rũ ở thế hệ BC1F1, tự thụ các cây chọn lọc, hạt thu riêng tạo ra BC1F2. Ở thế hệ BC 1F2 xuất hiện cây mang quả chỉ thiên, lây bệnh nhân tạo để chọn cây kháng bệnh, tự thụ cây chọn lọc để tạo ra thế hệ BC 1F3. Để nâng cao độ thuần và tính ổn định của các dòng chọn lọc, các chu kỳ chọn lọc tiếp theo cũng được thực hiện tương tự đến thế hệ BC 1F6. Trong nghiên cứu này sẽ xác định kiểu gen duy trì/ phục hồi liên quan đến tính bất dục đực tế bào chất của 23 dòng BC1F6, chỉ thiên, kháng kháng bệnh héo rũ. 2.2.5. Lai tạo dòng CMS kháng bệnh héo rũ, quả chỉ thiên Cây bất dục được tế bào chất có thể dễ dàng bắt gặp trong quần thể phân ly F2 của các giống chỉ thiên, thương mại. Hạt phấn của dòng BC1F6 quả chỉ thiên, kháng bệnh kháng bệnh héo rũ, có kiểu gene duy trì bất dục, được lai với cây bất dục đực CMS. Quá trình lai này liên tục lặp lại qua 4 thế hệ và đã tạo ra 6 dòng CMS. Báo cáo này sẽ thể hiện tính ổn định bất dục đực của các dòng CMS, quả chỉ thiên, kháng P. capsici. 2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu Tính kháng bệnh của từng mẫu dòng/giống được xác định thông qua chỉ số bệnh và được tính từ kết quả trung bình của 20 cây/ mẫu dòng (giống), có xử lý thống kê sinh học. 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện  từ năm 2008 đến 2018 tại Viện Nghiên cứu Rau Quả. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định dòng ớt kháng bệnh héo rũ do nấm Phythophthora. capsici Triệu chứng bệnh bắt đầu thể hiện sau lây bệnh 5 - 7 ngày. Cây nhiễm bệnh héo rũ, cổ rễ thối đen. Số cây nhiễm bệnh ngày càng tăng và đạt ổn định sau 15 ngày lây bệnh. Biểu hiện tính kháng bệnh héo rũ của các dòng/giống được thể hiện trên bảng 1. Chỉ số bệnh trong thí nghiệm sai khác rõ rệt giữa các dòng/ giống, điều đó phản ánh tính kháng bệnh là đặc điểm di truyền. Lee và cộng tác viên (2012) cho rằng tính kháng bệnh này do đa gen quy định, trong đó có 1 gen trội. Tương tự, theo Ariadna và Paul (2008), tính kháng bệnh héo rũ do ít nhất 5 locus trong bộ gen C. annuum. Đó là cơ sở để thực hiện phương pháp chọn tạo giống kháng bệnh này. Mẫu giống CM334 không xuất hiện bệnh. Kết quả này tương tự nhiều nghiên cứu trước và đã chỉ ra rằng mẫu giống này là nguồn gen tốt phục vụ cho tạo giống kháng bệnh héo rũ (Kim et al., 2010). Tuy nhiên, mẫu giống này có rất nhiều lông trên thân, lá, và khó đậu quả ở nhiệt độ cao. Vì vậy sẽ cần nhiều thời gian lai tạo để lại bỏ tính trạng này trên các giống lai. Các dòng ớt nhóm 94B cũng thể hiện tính kháng bệnh cao, tương tự CM334. Khác với CM334 có dạng cây bụi, các dòng 94B sinh trưởng khỏe, vươn cao và rất ít lông. Các dòng ớt kháng bệnh 94B đều có quả chỉ địa. Tất cả các mẫu giống địa phương và giống lai thương mại (F1) nhiễm bệnh nặng, cây không thể sống sót. Như vậy, nghiên cứu này đã xác định được 8 dòng kháng cao với bệnh héo rũ và tiếp tục được xác định kiểu gene liên quan đến bất dục đực tế bào chất. 17 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 5(102)/2019 Bảng 1. Tính kháng bệnh héo rũ của các mẫu dòng/ giống ớt cay TT Dòng/ giống Chỉ số bệnh Tính kháng bệnh sương mai Đặc điểm quả 1 94BS71-1-2-3-8-2-1-2-2 1,0a Kháng Chỉ địa 2 94BS71-1-2-3-8-2-1-2-3 1,2a Kháng Chỉ địa 3 94BS71-1-2-3-8-2-3-1-1 1,1a Kháng Chỉ địa 4 94BS71-1-2-3-8-2-3-1-2 1,0a Kháng Chỉ địa 5 94BA19-1-1-2-3-3-2-4-2 1,2a Kháng Chỉ địa 6 94BA19-1-1-2-3-3-2-4-4 1,2a Kháng Chỉ địa 7 94BA20-1-1-3-1-1-6-4-2 1,3a Kháng Chỉ địa 8 94BS5-3-4-2-8-1-6-2-1 1,0a Kháng Chỉ địa 9 CM334 1,0a Kháng Chỉ địa 10 Vàng Hà Nội 3,8cd Nhiễm Chỉ địa 11 Chìa vôi (Huế) 4,0d Nhiễm Chỉ địa 12 Sừng bò (Thái Bình) 3,7cd Nhiễm Chỉ địa 13 PVR6 3,6c Nhiễm Chỉ địa 14 PVR11 3,7cd Nhiễm Chỉ địa 15 KC1033-1-2-1 3,6c Nhiễm Chỉ thiên 16 PBC483 3,8cd Nhiễm Chỉ thiên 17 14PE08 2,2b Chống chịu Chỉ thiên 18 DEMON (F1) 3,7cd Nhiễm Chỉ thiên 19 207 (F1) 3,6c Nhiễm Chỉ thiên 20 Tiela (F1) 3,8cd Nhiễm Chỉ thiên 21 Chánh nông 1 (F1) 4,0d Nhiễm Chỉ thiên Ghi chú: Số theo sau bởi chữ giống nhau nghĩa là không sai khác ở α = 0,05. 3.2. Xác định kiểu gen liên quan đến bất dục đực tế bào chất các dòng ớt kháng bệnh héo rũ 3.2.1. Khảo sát chỉ thị phân tử Trước khi kiểm tra các gen liên quan đến bất dục đực các dòng ớt chọn tạo, chỉ thị SCAR130 và chỉ thị CRF đã được khảo sát trên các dòng ớt có kiểu hình hữu dục và bất dục. Hình 1. Khảo sát chỉ thị phân tử SCAR130 và CRF trên các dòng ớt hữu dục và bất dục Ghi chú: Giếng 1: ladder, từ giếng 2 - 9 với chỉ thị SCAR130, từ giếng 10 - 17 với chỉ thị CRF, giếng 5 - 6 và 13 - 14 là dòng CMS. Qua hình 1 cho thấy: với chỉ thị SCAR130 các giếng 2, 4, 7, 9 xuất hiện band 140 bp. Mặt khác, các giếng 3, 5, 6, 8 xuất hiện band 130 bp. Đối với chỉ thị CRF, chỉ có giếng 13 và 14 không xuất hiện band 870 bp, đây là 2 giếng tương ứng với mẫu của giếng 5 và 6. Điều đó chứng tỏ các dòng bất dục có kiểu gen là S/rfrf. Trái lại, các dòng hữu dục có 2 kiểu gen là N/RfRf hoặc S/RfRf. Sự thống nhất giữa kết quả xác định kiểu gen bằng chỉ thị phân tử và kiểu hình cho thấy độ chính xác của 2 chỉ thị trên và được ứng dụng để đánh giá các mẫu giống nghiên cứu. 3.2.2. Kiểu gen tế bào chất và gen nhân liên quan đến bất dục đực tế bào chất của các dòng ớt kháng bệnh sương mai và giống ớt lai thương mai Ảnh điện di thu được từ sản phẩm PCR của chỉ thị SCAR130 cho thấy các giống lai thương mại xuất hiện band 130 bp, nghĩa là có kiểu gen tế bào chất là S. Trái lại, tất cả các dòng kháng bệnh héo rũ đều có kiểu gen N. Kết hợp với kết quả xác định gen nhân trong bảng 2 cho thấy các giống lai F1 đều có kiểu gen là SRf-, phần lớn các dòng kháng bệnh héo rũ có kiểu gen phục hồi (NRfRf), chỉ có 2 dòng 94BS71-1-2-3-8-2-3-1-1 và 94BS71-1-2-3-8-2-3-1-2 có kiểu gene duy trì Nrfrf. 18 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 5(102)/2019 Hình 2. Kiểu gen S/N của giống ớt lai thương mại và dòng ớt kháng bệnh héo rũ Ghi chú: Từ trái qua phải - giếng 1, 2, 3: Giống ớt lai thương mại (Demon, 207, Tiela), 4 - 11: 8 dòng ớt kháng PC, giếng cuối cùng bên phải: Ladder. Bảng 2. Kiểu gen liên quan đến bất dục đực tế bào chất của các dòng ớt kháng bệnh héo rũ TT Tên mẫu giống Chỉ thị SCAR130 Chỉ thị CRF Kiểu gene 1 Demon (F1) 130 bp 870 bp SRf- 2 207 (F1) 130 bp 870 bp SRf- 3 Tiela (F1) 130 bp 870 bp SRf- 4 94BS71-1-2-3-8-2-1-2-2 140 bp 870 bp NRfRf 5 94BS71-1-2-3-8-2-1-2-3 140 bp 870 bp NRfRf 6 94BS71-1-2-3-8-2-3-1-1 140 bp - Nrfrf 7 94BS71-1-2-3-8-2-3-1-2 140 bp - Nrfrf 8 94BA19-1-1-2-3-3-2-4-2 140 bp 870 bp NRfRf 9 94BA19-1-1-2-3-3-2-4-4 140 bp 870 bp NRfRf 10 94BA20-1-1-3-1-1-6-4-2 140 bp 870 bp NRfRf 11 94BS5-3-4-2-8-1-6-2-1 140 bp 870 bp NRfRf 3.3. Chọn tạo dòng ớt chỉ thiên phục hồi, duy trì bất dục đực, kháng bệnh héo rũ Từ kết quả xác định kiểu gen liên quan đến bất dục đực tế bào chất, tính kháng bệnh héo rũ và đặc điểm quả (chỉ thiên/chỉ địa), dòng 94BS71-1-2-3-8- 2-3-1-1 có kiểu gene duy trì bất dục (dòng B), kháng cao với bệnh sương mai, quả chỉ địa được lai với giống lai thương mại quả chỉ thiên. Do quả chỉ địa là tính trạng trội hoàn toàn nên tất cả các cá thể trong thế hệ F1 đều có quả chỉ địa. Thông qua lây bệnh nhân tạo chọn cây kháng bệnh héo rũ có nhiều đặc điểm hình thái tương tự giống thương mại sẽ lai lại với dòng 94BS71-1-2-3-8-2-3-1-1 (94BS71) tạo ra quần thể BC1F1. Tiếp tục chu kỳ chọn lọc cây kháng bệnh héo rũ. Cây có nhiều đặc điểm tương tự giống lai thương mại được tự thụ tạo ra quần thể BC1F2. Chọn cây chỉ thiên trong quần thể này, tự thụ để tạo ra các dòng BC1F3, BC1F4, BC1F5, BC1F6. Dưới đây là kết quả xác định kiểu gen liên quan đến bất dục đực tế bào chất của 23 dòng BC1F6. Bảng 3. Kiểu gen liên quan đến bất dục đực tế bào chất của các dòng ớt chỉ thiên kháng bệnh héo rũ TT Dòng Chỉ thị SCAR130 Chỉ thị CRF Kiểu gene 1 17-BC-01 140 bp 870 bp NRfRf 2 17-BC-02 140 bp 870 bp NRfRf 3 17-BC-03 140 bp 870 bp NRfRf 4 17-BC-04 140 bp 870 bp NRfRf 5 17-BC-05 140 bp 870 bp NRfRf 6 17-BC-06 140 bp 870 bp NRfRf 7 17-BC-07 140 bp 870 bp NRfRf 8 17-BC-08 140 bp 870 bp NRfRf 9 17-BC-09 140 bp 870 bp NRfRf 10 17-BC-10 140 bp 870 bp NRfRf 11 17-BC-11 140 bp 870 bp NRfRf 12 17-BC-12 140 bp 870 bp NRfRf 13 17-BC-13 140 bp 870 bp NRfRf 14 17-BC-14 140 bp 870 bp NRfRf 15 17-BC-15 140 bp 870 bp NRfRf 16 17-BC-16 140 bp 870 bp NRfRf 17 17-BC-17 140 bp 870 bp NRfRf 18 17-BC-18 140 bp - Nrfrf 19 17-BC-19 140 bp - Nrfrf 20 17-BC-20 140 bp - Nrfrf 21 17-BC-21 140 bp - Nrfrf 22 17-BC-22 140 bp - Nrfrf 23 17-BC-23 140 bp - Nrfrf 24 Tiela 130 bp 870 bp SRf- 25 Demon 130 bp 870 bp SRf- Hình 3. Kiểu gen S/N của các dòng ớt chỉ thiên BC1F6 kháng bệnh héo rũ Ghi chú: 2 giếng ngoài cùng bên phải: Ladder, tiếp theo tương ứng với số thứ tự các dòng, giống ở bảng 3. 19 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 5(102)/2019 Hình 4. Kiểu gen Rf của các dòng ớt chỉ thiên BC1F6 kháng bệnh héo rũ Ghi chú: Từ trái qua phải tương ứng với số thự tự các dòng, giống ở bảng 3, giếng cuối cùng: Ladder. Kết quả bảng 3 và hình 3, 4 cho thấy đã tạo được 17 dòng phục hồi (R), chỉ thiên, kháng bệnh héo rũ, và 6 dòng duy trì (B). Các dòng duy trì được lai với cây bất dục để tạo ra dòng CMS. 3.4. Xác định tính bất dục ổn định của các dòng CMS Các dòng có kiểu gen duy trì (Nrfrf) được xác định bằng chỉ thị phân tử lai hồi quy liên tục 4 lần với cây bất dục đực tế bào chất (Srfrf). Bảng 4 cho thấy hạt phấn có hình tròn, bắt màu đậm xuất hiện ở 4 dòng CMS tạo ra từ các dòng duy trì 17BC18, 17BC19, 17BC21, 17BC23, chỉ có dòng 17-BC-20 và 17-BC-22 tạo ra dòng bất dục tuyệt đối. Nhiều nghiên cứu cũng cho rằng yếu tố nhiệt độ có liên quan đến tính bất dục dực (Novak et al., 1971; Shifriss and Frankel, 1971; Shifriss and Guri, 1979). Như vậy dòng duy trì 17-BC20, 17BC22 và dòng bất dục đực tương ứng 17-BC20-CMS, 17-BC22-CMS được tạo ra có thể ứng dụng trong chọn tạo giống ớt lai, chỉ thiên kháng bệnh héo rũ. Bảng 4. Độ bất dục của các dòng CMS được duy trì bằng dòng ớt chỉ thiên kháng bệnh héo rũ TT Dòng CMS Tỉ lệ hạt phấn hữu dục (%) Mức độ bất dục 1 17-BC-18-CMS 24,5 ± 5,2 Không hoàn toàn 2 17-BC-19-CMS 12,3 ± 2,3 Không hoàn toàn 3 17-BC-20-CMS 0,0 Hoàn toàn 4 17-BC-21-CMS 5,7 ± 0,5 Không hoàn toàn 5 17-BC-22-CMS 0,0 Hoàn toàn 6 17-BC-23-CMS 10,5 ± 1,5 Không hoàn toàn IV. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã tạo được các dòng ớt chỉ thiên, kháng bệnh héo rũ do nấm P. capsici, trong đó: 17 dòng phục hồi có kiểu gene NRfRf và 2 dòng duy trì Nrfrf . Dòng 17-BC20-CMS và 17-BC22-CMS bất dục hoàn toàn ổn định được tạo từ 2 dòng duy trì. Đây là cơ sở tiền đề để tạo hệ thống sản xuất hạt giống ớt lai 3 dòng dựa trên hệ thống bất dục đực tế bào chất. TÀI LIỆU THAM KHẢO Ahmed E A, Daubeze A M, Lafortune D, IDepestre T, Nono- Womdim R, Duranton C, Berke T, Gaddagimath N B, Nemouchi G, Phaly T, Palloix A., 2001. Constructing multiresistant genotypes of sweet pepper for cultivation in the tropics. In: XIth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Capsicum and Eggplant. Antalya (Turquie). pp. 296-297. Ariadna M B. and Paul W. B., 2008. Genetic analysis of phytophthora root rot race specific resistance in chile pepper. J. Amer. Soc.Hort. Sci., 133(6): 825-829. Gulyas G, Pakozdi K, Lee JS, Hirata Y., 2006. Analysis of fertility restoration by using cytoplasmic male sterile red pepper (Capsicum annuum L.) lines. Breeding Science, 56: 331-334. Jiao-Jiao Ji, Wei Huang, Yan-Xu Yin, Zheng Li, Zhen- Hui Gong, 2014. Development of a SCAR marker for early identification of S-cytoplasm based on mitochondrial SRAP analysis in pepper (Capsicum annuum L.). Mol Breeding (2014) 33: 679-690. Kim JS, Kim WI, Jee HJ, Gwang JG, Kim CK, Shim CK., 2010. Evaluation of resistance in hot pepper germplasm to Phytophthora blight on biological assay. Kor. J. Hort. Sci. Technol., 28: 802-809. Kimble KA, Grogan RG., 1960. Resistance to Phytophthora root rot in pepper. Plant Dis. Rep. 44: 872-873. Kumar R, Kumar S, Dwivedi N, Rai A., 2009. Validation of SCAR markers, diversity analysis of male sterile (S-) cytoplasms and isolation of an alloplasmic S-cytoplasm in Capsicum. Sci Hort 120: 167-172. Lee J., Lee W.P, Kang B.C, Yoon J.B., 2012. Inheritance of resistance to phytophthora root rot in chili pepper depending on inoculum density and parental genotypes. Kor. J. Breed. Sci., 44(4): 503-509. Leonian, L.H., 1922. Stem and fruit blight of peppers caused by Phytophthora capsici. Phytopathology, 12: 401-408. Novak, F., Betlach, J. and Dubovsky, J., 1971. Cytoplasm male sterility in sweet pepper (Capsicum annuum L.). Z. Pflanzenzcht, 65: 129-140.