Chuyển gen ssiv vào mô sẹo phôi hóa của giống sắn KM140 thông qua vi khuẩn Agrobacterium Tumefacines

TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 68 CHUYỂN GEN SSIV V O MÔ S O PHÔI HÓA CỦA GIỐNG SẮN KM140 THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACINES Nguyễn Thị Minh Hồng1 T M TẮT Hiện nay, việc sử dụng công nghệ gen sẽ là hướng đi góp phần thúc đẩy mục tiêu cải thiện năng suất tinh bột ở cây sắn. Các starch synthase (SS) của thực vật bậc cao mã hóa bởi 5 nhóm gen ký hiệu là GBSS (granule - bound starch synthase), SSI, SSII, SSIII, và SSVI. Trong đó, mỗi biến thể enzyme SS có các cấu thành khác nhau và có vai trò nhất định trong tổng hợp amylopectin, trong đó SSIV có thể làm tăng kích thước hạt tinh bột và hàm lượng tinh bột. Trong nghiên cứu này, gen SSIV phân lập từ giống sắn KM140 được chèn vào vector pBI121-C54:SSIV:NOST và chuyển vào mô sẹo phôi hóa (FEC của giống sắn KM140 thông qua A. tumefaciens. Kết quả thu được 7 dòng cây sắn chuyển gen chứa cấu trúc mang gen chuyển SSIV. Các dòng chuyển gen tiếp tục được phân tích ở các thế hệ tiếp theo. Từ khoá: Chuyển gen, tinh bột, cây sắn, SS (starch synthase), SSIV. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Quá trình sinh tổng hợp tinh bột ở thực vật đƣợc bắt đầu từ việc chuyển hoá glucose-1-P và ATP thành ADP - glucose dƣới sự xúc tác của ADP - glucose - pyrophosphorylase (AGPase). ADP - glucose là một monomer cho quá trình sinh tổng hợp tinh bột với sự tham gia của nhiều enzyme tiếp theo. GBSS đảm nhận quá trình tổng hợp amylose và SS (I - IV) giữ vai trò sinh tổng hợp nên amylopectin. Ngoài ra, bên cạnh các enzyme SS, còn có các enzyme xúc tác quá trình phân nhánh SBE (Starch branching enzyme) hay enzyme phân huỷ tinh bột tham gia vào quá trình điều hoà hàm lƣợng tinh bột ở thực vật [4]. Các biến thể khác nhau của SS (thƣờng gọi là SS hòa tan) tạo ra các chuỗi amylopectin (1 dạng tinh bột đ polyme h a) c thể tan trong các plastic hoặc một phần hòa tan và một phần gắn với hạt tinh bột. Số liệu di truyền và sinh hóa chỉ ra rằng mỗi biến thể enzyme SS có các cấu thành khác nhau và vai trò nhất định trong tổng hợp amylopectin. Nhóm gen SS (SSI, SSII, SSIII và SSIV), trong đ các isoenzyme SSI, SSII, SSIII liên quan đến sự kéo dài các chuỗi amylopectin và SSIV c liên quan đến sự khởi đầu hình thành và kiểm soát số lƣợng hạt tinh bột. Vì vậy, SS là đối tƣợng nghiên cứu tiềm năng trong quá trình tạo ra các cây trồng c hàm lƣợng tinh bột cao với việc sử dụng công nghệ gen. Tuy nhiên, việc biểu hiện của gen SS lại đang ít khi đƣợc sử dụng để làm tăng quá trình tích lũy tinh bột. Điều này, chủ yếu là do sự hiện diện khác nhau của các lớp enzym SS trong cây trồng, chúng tƣơng tác với nhau tạo thành phức hợp protein và giữ vai trò cụ thể trong quá trình kiến tạo nên các hạt tinh bột [4; tr.1566 - 1577]. Do đ , những thay đổi trong việc biểu hiện một SS 1 Khoa Nông - Lâm - Ngư nghiệp, Trường Đại học Hồng Đức TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 69 đơn lẻ có thể dẫn đến các hiệu ứng sâu sắc và kh lƣờng không chỉ trong cấu trúc của hạt tinh bột mà còn trong hàm lƣợng tinh bột. Bên cạnh đ các đồng phân SS c vai trò đặc trƣng nhƣng phụ thuộc lẫn nhau trong quá trình tổng hợp tinh bột. Phân tích việc phân phối chiều dài chuỗi amylopectin trong các cây đột biến và cây chuyển gen mất các biến thể enzyme SS đặc trƣng đ dẫn tới kết luận rằng nh m SSI, SSII, và SSIII đ ng vai trò lần lƣợt trong việc kéo dài các chuỗi ngắn, trung bình và dài [10]. Việc cải tiến các giống sắn bằng kỹ thuật chuyển gen nhằm tăng năng suất, tăng hàm lƣợng protein, hàm lƣợng tinh bột và giảm acid cyanhydric là vấn đề đang đƣợc quan tâm trên toàn thế giới. Để tạo đƣợc cây sắn chuyển gen thì việc nghiên cứu khả năng tái sinh ở các giống sắn là rất cần thiết. Bên cạnh một số hệ thống tái sinh cây sắn thông qua quá trình tạo phôi soma đ đƣợc nghiên cứu cải tiến [7; tr.731-735], phƣơng pháp nhân nhanh mô s o từ các mô sắn trên môi trƣờng bổ sung picloram đ đƣợc chứng minh là có khả năng tạo một lƣợng lớn phôi soma [8; tr.726-730]. Ngoài ra, việc thay đổi nồng độ auxin và quá trình chuyển đổi môi trƣờng giữa lỏng, rắn cũng ảnh hƣởng đến tỷ lệ sống sót các phôi soma. Bên cạnh đ mô s o phôi hóa (Friable embryogenic callus - FEC) là mô khi tái sinh sẽ tạo ra tỷ lệ chồi bình thƣờng cao nhất so với các cấu trúc mô khác. Tỷ lệ hình thành phôi soma đạt cao nhất (82 ± 1,7%) ở giống sắn KM94 trên môi trƣờng MS + 12 mg/l picloram [1; tr.527-533]. Gần đây, một số nhà khoa học trên thế giới đ sử dụng các bộ phận khác nhau trên thân cây sắn làm nguồn nguyên liệu tạo mô s o và các loại phôi soma. Mô s o phôi hóa sử dụng làm nguyên liệu trong chuyển gen thông qua A.tumefaciens cho hiệu suất chuyển gen cao [3; tr.1845-1854]. Việc tạo ra những phôi soma chất lƣợng là yếu tố rất quan trọng để cải tạo giống sắn bằng các phƣơng pháp công nghệ sinh học [6, 9]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đ c những kết quả bƣớc đầu chuyển gen SSIV vào giống sắn KM140 của Việt Nam. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu thực vật Giống sắn KM140 do Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm nông nghiệp Hƣng Lộc, Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam cung cấp. Chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn E.coli DH5α đƣợc sử dụng để nhân dòng gen SSIV và chủng vi khuẩn A.tumefaciens C58 PGV2260 do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Chuyển gen vào mô sẹo cây sắn thông qua vi khuẩn A. tumefaciens Đỉnh chồi, mảnh lá, cuống lá đƣợc đƣa vào môi trƣờng CP, CD cảm ứng tạo mô s o (2 - 3 tuần). Mô s o đƣợc chuyển sang môi trƣờng CI1-4 để tạo phôi cung cấp nguyên liệu phục vụ cho chuyển gen (4 - 8 tuần). Lựa chọn phôi ở giai đoạn phôi non, khối mô vàng tƣơi, tua dài lây nhiễm với dịch huyền phù A. tumefaciens có bổ sung 100µM AS trong TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 70 10 - 20 phút và đặt trên môi trƣờng đồng nuôi cấy CI1-4 có bổ sung 100µM AS trong 2 ngày, để tối ở nhiệt độ phòng 25 - 27oC. Sau đ chuyển phôi lên môi trƣờng nuôi cấy chọn lọc CI1-4 có bổ sung 500 mg/l cefotaxime, 40 - 100 mg/l Km, cấy chuyển hai tuần/ lần cho tới khi chồi sắn tái sinh. Phôi soma sống sót đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng tái sinh chồi CN1-4 có bổ sung 50 - 100 mg/l Km, nhiệt độ 25 - 27oC (6 - 8 tuần). Chồi sắn tái sinh đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng ra rễ chọn lọc (MR) là môi trƣờng MS bổ sung 50 - 100 mg/l Km, nhiệt độ 25 - 27oC để chọn lọc cây chuyển gen. Những chồi sống s t đƣợc chuyển sang môi trƣờng MS để cây sinh trƣởng, phát triển. Khi cây đạt chiều cao 7 - 8 cm, cây có 4 - 5 lá với bộ rễ khỏe mạnh đƣợc trồng trong bầu cùng với giá thể TN1 và đặt trong bồn sinh trƣởng. Xác định nồng độ Kanamycin thích hợp để chọn lọc cây chuyển gen Các chồi non in vitro của giống sắn KM140 cao khoảng 1 - 1,5cm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc và môi trƣờng MS bổ sung Km với các nồng độ 0, 40, 60, 80, 100mg/l. Mỗi thí nghiệm đƣợc tiến hành với 3 lần lặp lại, mỗi lần 20 mẫu. hương pháp CR phân t ch sự có mặt của gen chuyển Các dòng cây chuyển gen sau khi trồng trên giá thể đất mùn khoảng 1 tháng c 2 - 3 lá mới, tiến hành thu lá để tách DNA tổng số và thực hiện phản ứng PCR. DNA đƣợc tách theo phƣơng pháp Garvel. DNA tổng số (0,2 - 1µg) của các dòng thuốc lá chuyển gen đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Đồng thời, vector chuyển gen mang các cấu trúc gen chuyển cũng đƣợc sử dụng làm đối chứng dƣơng cho phản ứng, mồi đặc hiệu đƣợc chọn cho từng gen. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo dòng sắn chuyển gen pBI121-C54:SSIV:NOST Chủng vi khuẩn A. tumefaciens C58 mang cấu trúc vector chuyển gen pBI121- C54:SSIV:NOST đƣợc biến nạp vào các khối mô s o phôi h a (FEC) theo quy trình chuyển gen đ đƣợc mô tả ở phần phƣơng pháp nghiên cứu, kết quả biến nạp trên 1520 mẫu thu đƣợc kết quả ở bảng 1. Bảng 1. Chuyển gen pBI121-C54: SSIV:NOST vào giống sắn KM140 Lô thí nghiệm Số mẫu Số mẫu tạo mô s o trên MT CP Số mẫu tạo phôi trên MT CI Số mô sống sót trên MTCL Số chồi ra rễ trên MTMS CI CN MR ĐC 50 50 36 12 0 0 0 1 300 297 207 121 7 3 2 2 350 350 249 134 8 4 2 3 300 300 236 115 9 5 2 4 270 265 195 107 7 3 1 5 250 250 188 95 8 3 2 Tổng 1520 1512 1111 572 39 18 9 Ch th ch: ĐC: mẫu không nhiễm A. tumefaciens, MTCL: CI; CN: bổ sung 60 mg/l Km; MR: bổ sung 50 mg/l Km TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 71 Hình 1. Một số hình ảnh chuyển gen pBI121-C54: SSIV:NOST v o giống sắn KM140 Ch th ch: A: Đỉnh sinh trưởng trên môi trường tạo mô sẹo CP; B: Mô sẹo trên môi trường CI; C: Phôi làm vật liệu chuyển gen; D,E: Mẫu trên môi trường chọn lọc CI + cefo 500mg/l + Km 60mg/l; F, G: Mẫu trên môi trường tái sinh CN + Km 60 mg/l; H: Mẫu trên môi trường ra rễ MR + Km 50 mg/l Những cây sắn chuyển gen SSIV mang vector pBI121-C54: SSIV:NOST nuôi cấy ở môi trƣờng MS trong 3 - 4 tuần, c 4 - 5 lá, lá xanh đậm, cao 7 - 8 cm với bộ rễ khỏe mạnh đƣợc đƣa ra trồng trong bầu cùng với giá thể TN1 đặt vào bồn sinh trƣởng 2 - 3 tuần. Các cây chuyển gen sinh trƣởng phát triển bình thƣờng, không c sự khác biệt về hình thái khi quan sát cây chuyển gen với cây không chuyển gen (Hình 2). Sau đ chuyển những cây này sang chậu lớn, trồng trong nhà lƣới, và tiếp tục tiến hành theo d i. Hình 2. Cây sắn giống KM 140 chuyển gen SSIV mang vector pBI121-C54: SSIV:NOST đƣ c trồng ở nh lƣới Chú thích: WT: Cây sắn không chuyển gen; 1-9: Cây sắn chuyển gen 3.2. Phân tích v đánh giá các dòng sắn chuyển gen bằng kỹ thuật PCR Thu rễ từ các cây sắn chuyển gen mang cấu trúc pBI121-C54: SSIV:NOST để tách DNA tổng số và dùng để phân tích PCR. Kết quả điện di cho thấy DNA tổng số của các dòng sắn chuyển gen đạt tiêu chuẩn để dùng cho phản ứng PCR. Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi promoter C54-F/SSIV Frag-R. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR của TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 72 các dòng sắn chuyển gen mang cấu trúc pBI121-C54:SSIV:NOST đƣợc thể hiện ở hình 3. Kết quả cho thấy rằng 7/9 dòng sắn đƣợc kiểm tra c mang cấu trúc gen SSIV. Các dòng này cho kết quả PCR dƣơng tính và sản phẩm là đoạn DNA c kích thƣớc tƣơng ứng là 1289 bp. Hình 3. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR các dòng sắn chuyển gen với cặp mồi promoter C54F/ SSIV-R Chú thích: M: thang DNA chuẩn 1 kb (ThermoScientific; ĐC (-): cây không chuyển gen; ĐC(+ : Plasmid mang gen chuyển; 1-9: Các cây sắn chuyển gen SSIV. Các cây dương t nh 1,3,4,6,7,8,9. Song song với việc PCR với cặp mồi Promoter C54-F/ SSIV-R, để chắc chắn rằng các dòng sắn chuyển gen không có sự tồn tại của khuẩn A. tumefacines trong cây, chúng tôi sử dụng DNA tổng số của các dòng sắn chuyển gen này tiếp tục đƣợc dùng cho phản ứng PCR với cặp mồi virF/R (Hình 4). Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng sắn chuyển gen cho thấy rằng tất cả các dòng sắn chuyển gen đều cho kết quả âm tính với cặp mồi virF/R. Điều này chứng tỏ rằng không có sự tồn tại của A. tumefacines trong các dòng sắn chuyển gen này. Bƣớc đầu khẳng định gen SSIV đ đƣợc chuyển vào cây sắn giống KM140 thành công. Hình 4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR các dòng sắn chuyển gen với cặp mồi virF/R Chú thích: M: thang DNA chuẩn 1 kb (ThermoScientific; ĐC (-): cây không chuyển gen; ĐC(+ : Plasmid mang gen chuyển; 1-9: Các cây sắn chuyển gen SSIV. Gen SSIV đƣợc cho là c liên quan đến Pt2L4 - một protein giàu acid gluctamic ở cây sắn, sự phiên m của gen này chỉ phát hiện đƣợc ở rễ củ và không c ở lá. Kết quả cho thấy promoter C54 hoạt động chủ yếu ở mạch dây, tầng phát sinh gỗ và mạch gỗ của mô mạch ở lá, cuống lá, thân và hệ thống rễ. Đặc biệt, sự biểu hiện mạnh của β-glucuronidase đƣợc phát hiện trong các tế bào nhu mô giàu tinh bột ở rễ dự trữ của cây chuyển gen. Những kết quả này chứng minh promoter C54 liên quan đến sự biểu hiện đặc hiệu ở mô mạch và quá trình phát triển thứ cấp của rễ củ ở sắn. Nhƣ vậy, C54 là một promoter tiềm TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 73 năng trong biểu hiện gen đặc hiệu nhằm cải thiện tính trạng di truyền ở cây sắn, ví dụ nhƣ tăng giá trị dinh dƣỡng của củ. Trong nghiên cứu trƣớc, chúng tôi đ trình bày kết quả phân tích khả năng tích lũy tinh bột ở cây thuốc lá khi chuyển gen pK7WG2D-35S:SSIV:T35S và pBI121-C54:SSIV:NOST. Hàm lƣợng tinh bột trong rễ tăng 6,8 - 17,6% ở những cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S và tăng 27,7 - 65,7% ở những cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pBI121-C54:SSIV:NOST [2]. Đây chính là cơ sở tạo cây sắn chuyển gen SSIV và hứa h n ứng dụng thành công kỹ thuật chuyển gen trong tạo dòng cây sắn chuyển gen chứa cấu trúc pBI121-C54: SSIV:NOST c sự tăng tích lũy tinh bột ở củ. 4. KẾT LUẬN Cấu trúc pBI121-C54:SSIV:NOST đ đƣợc chuyển thành công vào giống sắn KM140 qua mô s o phôi h a nhờ A.tumefaciens với tỷ lệ cây chuyển gen đạt 0,46%. Các dòng cây chuyển gen tiếp tục đƣợc phân tích sự biểu hiện SSIV tái tổ hợp và đánh giá chức năng sinh học ở các thế hệ tiếp theo. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đỗ Xuân Đồng, Đỗ Hải Lan, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2012), Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây sắn (Manihot esculenta Crantz thông qua phôi soma từ đỉnh chồi, Tạp chí Công nghệ Sinh học 10 (3). [2] Nguyễn Thị Minh Hồng, Lê Thu Ngọc, Nguyễn Khắc Hƣng, Nguyễn Thị Thơm, Phạm Bích Ngọc (2017), Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột thông qua Agrobacterium tumefaciens, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa KHTN và CN, 33(1S): 224 - 230. [3] Bull SE, Owiti JA, Niklaus M, Beeching JR, Gruissem W, Vanderschuren, H. (2009) Agro - mediated transformation of friable embryogenic calli and regeneration of transgenic cassava. Nat. Protoc. 4, 1845-1854. [4] Geigenberger P (2011), Regulation of starch biosynthesis in response to a fluctuating environment, Plant physiology 15: 1566 - 1577. [5] Hennen-Bierwagen TA, Lin Q, Grimaud F (2008), Starch biosynthenic enzymes from develop Zea mays endosperm associate in multisubunit complexes, Plant Physiol 146:1892 - 1908. [6] Nyaboga EN, Njiru JM and Tripathi L (2015), Factors influencing somatic embryogenesis, regeneration, and Agrobacterium - mediated transformation of cassava (Manihot esculenta Crantz) cultivar TME14, Front Plant Sci 6: 411. [7] Schopke C, Taylor N, Ca´rcamo R, Konan NK, Marmey P, Henshaw GG, Beachy RN, Fauquet C (1996), Regeneration of trans-genic cassava plants (Manihot esculenta Crantz) from microbom - barded embryogenic suspension cultures, Nat Biotechnol 14: 731 - 735. TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 74 [8] Taylor NJ, Edwards M, Kiernan RJ, Davey CDM, Blakesley D, Henshaw GG (1996), Development of friable embryogenic callus and embryogenic suspension culture systems in cassava (Manihot esculenta Crantz), Nat Biotechnol 14: 726 - 730. [9] You-Zhi Li, Jian-Yu Zhao, San-Min Wu, Xian-Wei Fan, Xing-Lu Luo & Bao-Shan Chen (2016), Characters related to higher starch accumulation in cassava storage roots, Scientific reports. Dol:10:1038. [10] Zeeman & Samuel C (2010), Starch: Its Metabolism, Evolution, and Biotechnological Modification in Plants, Annual Review of Plant Biology 61(1). AGROBACTERIUM-MEDICATED TRANSFORMATION OF THE SSIV GENE TO FRIABLE EMBRYOGENIC CALLI FROM KM140 CASSAVA VARIETY WITH THE HELP OF BACTERIA Nguyen Thi Minh Hong ABSTRACT Currently, gene technology would be the best method to improve starch productivity in cassava. Starch synthase (SS) enzymes are coded by five gene groups, named GBSS (granule-bound starch synthase), SSI, SSII, SSIII, and SSVI. In which, each (SS) enzyme variant has different components and has a certain role in amylopectin synthesis, specifically, SSIV gene would be used to increase the size and content of starch granules. In this study, SSIV gene was isolated from KM140 cassava variety, inserted into pBI121- C54:SSIV:NOST vector and transformed to friable embryogenic callus (FEC) via Agrobacterium tumefacines. Seven transgenic cassava strains which had positive results with PCR testing were formed as the intinial results. Keywords: Gene transferation, starch, cassava, SS (starch synthase), SSIV. * Ngày nộp bài: 27/3/2019; Ngày gửi phản biện: 28/3/2019; Ngày duyệt đăng: 4/3/2020 * Lời cảm ơn: Công trình được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài “Khai thác và phân lập nguồn gen có sẵn của tập đoàn giống sắn Việt Nam nhằm phát triển các giống sắn có khả năng chống chịu bệnh và năng suất cao bằng công nghệ gen” thuộc nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ. Các thí nghiệm này được thực hiện tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.