Công nghệ sản xuất protein, axit amin và axit hữu cơ

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA BÀI GIẢNG MÔN HỌC CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PROTEIN, AXIT AMIN VÀ AXIT HỮU CƠ BIÊN SOẠN: TRƯƠNG THỊ MINH HẠNH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM – SINH HỌC ĐÀ NẴNG, NĂM 2006 Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 2 MỤC LỤC PHẦN I: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PROTEIN TỪ VI SINH VẬT Mở đầu - Giới thiệu chung về đường hướng sản xuất protein - Nhu cầu protein và khả năng sản xuất protein trên thế giới Chương 1: Khái niệm chung về vi sinh vật 1.1. Các vi sinh vật tổng hợp protein và a xit amin - Tảo - Nấm men và vi khuẩn - Nấm mốc và xạ khuẩn 1.2. Quá trình dinh dươĩng ở tế bào vi sinh vật 1.3. Cơ chế sinh tổng hợp protein 1.4.Các yếu tố t6ổng hợp protein Chương 2: Sơ đồ dây chuyền công nghệ thu nhận các sản phẩm protein 2.1. Nguyên liệu và phương pháp xử lý 2.2. Nuôi cấy vi sinh vật 2.3. Tách protein, cô đặc và sấy Chương 3: Sản xuất protein từ các nguồn hydrat cacbon 3.1. Nuôi cấy vi sinh vật trên dịch thủy phân các nguyên liệu thực vật 3.2. Nuôi cấy vi sinh vật trên dịch thủy phân than bùn 3.3. Nuôi cấy vi sinh vật trên dịch thủy phân gỗ 3.4. Nuôi cấy vi sinh vật trên nguyên liệu polysacarit chưa thủy phân 3.5. Nuôi cấy vi sinh vật trên bã rượu từ nguyên liệu hạt và rỉ đường - Đặc tính nguyên liệu - Xử lý nguyên liệu - Sơ đồ dây chuyền công nghệ Chương 4: Công nghệ sản xuất protein từ nguồn cacbua dầu mỏ, khí đốt 4.1. Nuôi cấy vi sinh vật trên nguyên liệu cacbua hydro lỏng 4.2. Nuôi cấy vi sinh vật trên khí cacbua hidro Chương 5: Sản xuất thức ăn protein từ vi sinh vật 5.1. Protein từ nấm men 5.2. Protein từ tảo và vi khuẩn 5.3. Protein từ nấm sợi PHẦN II: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC AXIT AMIN Chương 1: Khái quát chung về axit amin 1.1. Đặc tính của các axit amin, vai trò và ứng dụng 1.2. Cơ chế điều chỉnh sinh tổng hợp các axit amin 1.3. Các phương pháp sản xuất các axit amin Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 3 Chương 2: Sản xuất lizin 2.1. Tổng hợp lizin từ tế bào vi sinh vật 2.2.Nguyên liệu và phương pháp xử lý 2.3. Quá trình sinh tổng hợp lizin 2.4. Tách và sấy lizin 2.5. Sơ đồ công nghệ sản xuất lizin Chương 3: Sản xuất axit glutamic 3.1. Một số phương pháp sản xuất axit glutamic 3.2. Tổng hợp axit glutamic từ vi sinh vật 3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp axit glutamic từ rỉ đường Chương 4 : Sản xuất valin và triptophan 4.1. Nguồn nguyên liệu 4.2. Nguồn vi sinh vật tổng hợp 4.3. Sơ đồ dây chuyền công nghệ PHẦN III: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC AXIT HỮU CƠ Mở đầu Chương 1: Axit xitric 1.1. Một số khái niệm chung 1.2. Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men axit xitric 1.3. Giống vi sinh vật và phương pháp nuôi cấy 1.4. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 1.5. Lên men 1.5.1. Phương pháp lên men bề mặt 1.5.2. Phương pháp lên men bề sâu 1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình 1.7. Xử lý dịch lên men bằng phương pháp hóa học và thu nhận sản phẩm L: Trung hòa - Phân giải xitrat caxi - Lọc - Kết tinh - Sấy Chương 2: Axit lactic 2.1.Khái niệm chung 2.2.Vi sinh vật và nguyên liệu 2.3. Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men lactic 2.4. Sơ đồ công nghệ sản xuất axit lactic 2.4.1. Lên men lactic 2.4.2.Xử lý dịch lên men - lọc 2.4.3. Phân giải lactac canxi 2.4.4. Cô đặc Chương 3: Axit axetic 3.1. Mở đầu - Khái niêm chung 3.2. Nguyên liệu và vi sinh vật Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 4 3.3. Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men axetic 3.4. Các phương pháp lên men axetic 3.5. Chưng cất axit axetic 3.6. Sơ đồ công nghệ sản xuất axit axetic TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ vi sinh tập 2, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 2002 2. Lương Đức Phẩm, Hồ Xưởng, Vi sinh tổng hợp, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội,1978 3. TS Nguyễn Hữu Phúc, Giáo trình công nghệ vi sinh, Thành phố Hồ Chí Minh, 2001 4. PGS. TS Trần Minh Tâm, Công nghệ vi sinh ứng dụng, Nhà xuất bản nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh, 2000 5. Robert Noyes , Protein food supplement, Noyes Development corporation, Park Ridge, New Jerbey, USA (1969) 6. Richard I Matelles and Steven, Single - Cell Protein, R. Tanneebaum Editors, Cambrige, Massachusettes and London, England (1978) PHẦN 1 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PROTEIN MỞ ĐẦU 1. Vai trò của protein đối với con người: - Cơ thể người và động vật thường xuyên đòi hỏi cung cấp các chất dinh dưỡng có trong thức ăn để có thể tiến hành trao đổi chất, trước hết nhằm duy trì sự sống, tăng cường sinh trưởng và phát triển. - Thức ăn, ngoài nước còn gồm những nhóm chất: protein, chất béo, gluxit, vitamin, muối khoáng, các chất gia vị, trong đó phần quý hiếm nhất là protein. - Protein là nguồn nitơ duy nhất cho người và động vật. Trong quá trình tiêu hoá của người và động vật, protein phân giải thành khoảng 20 axit amin thành phần, trong đó có 8 axit amin không thay thế (hoặc 9 đối với trẻ em, 10 đối với lợn và 11 đối với gia cầm) cần phải có sẵn trong thức ăn. Nếu không nhận được các axit amin này cơ thể sẽ bị bệnh hoặc chết. - Thiếu protein sẽ dẫn đến nhiều bệnh tật hết sức hiểm nghèo: Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 5 + Bệnh thiếu protein lần đầu tiên được phát hiện ở Châu Phi, có tên gọi quốc tế là Kwashiokor, hiện này là bệnh phổ biến ở nhiều vùng trên thế giới. Trẻ em mắc bệnh này chậm lớn, còi cọc, kém phát triển về trí tuệ. Bệnh này có thể điều trị bằng cách thêm vào khẩu phần bệnh nhân một lượng thích đáng các loại protein có phẩm chất tốt như cazein. Tuy nhiên nhiều tài liệu cho thấy sự kém phát triển về trí tuệ vì bệnh này không phục hồi được và ảnh hưởng đến toàn bộ cuộc đời của bệnh nhân. + Về mặt sinh lý, thiếu protein dẫn đến giảm thể trọng. Hàng ngày cơ thể người trưởng thành có tới 100 tỉ tế bào chết và cần thay thế. Thiếu protein thì trước hết protein của gan, máu và chất nhày niêm mạc, ruột được huy động để bù đắp. Và như vậy sẽ dẫn đến suy gan, số lượng kháng thể trong máu giảm đi, sức đề kháng của cơ thể đối với bệnh bị yếu. + Về nhu cầu protein của người, nhiều nhà nghiên cứu cho biết dao động trong khoảng 80 – 120g/ngày. 2. Định nghĩa về sinh khối: Sinh khối là toàn bộ tế bào vi sinh vật (biomas) thu nhận được trong quá trình lên men. Nó được sử dụng như một nguồn dinh dưỡng protein cho người và động vật, đôi khi đồng nghĩa với protein đơn bào (single cell protein – SCP). 3. Protein đơn bào và đa bào: Cụm từ “ protein đơn bào” được dùng để chỉ nguồn protein mới tìm ra từ những cơ thể đơn bào (từ vi sinh vật), phân biệt nó với protein từ động vật và thực vật (protein đa bào và protein truyền thống). 3.1. Protein đa bào: là nguồn dinh dưỡng quan trọng nuôi sống loài người từ trước tới nay. Đây là nguồn cung cấp protein quan trọng nhất. Tuy nhiên, do tốc độ phát triển dân số quá nhanh nên nguồn protein này không còn đủ để cung cấp cho nhu cầu ngày càng tăng của con người. Hiện nay trên thế giói có khoảng 2/3 dân số đang đứng trước thực trạng thiếu và đói protein, còn 1/3 dân số lại được cấp số lượng protein dư thừa so với nhu cầu. Nguyên nhân: - Sự phân phối không đồng đều nguồn protein đa bào giữa các quốc gia và giữa các vùng dân cư trong một quốc gia. - Trình độ kỹ thuật về phát triển nguồn protein đa bào không đồng đều. - Sự khác nhau về điều kiện địa lý: những vùng sa mạc tự nhiên hoặc vùng có điều kiện khí hậu không thuận lợi cho trồng trọt và chăn nuôi. - Do chính con người gây ra như tình trạng ô nhiễm môi trường, ô nhiễm nguồn nước, rừng thưa, đồi trọc, sông con, sự khai thác thiếu khoa học làm các nguồn thủy hải sản ngày càng cạn kiệt v .v.. Các giải pháp tăng nhanh nguồn protein đa bào: - Cải biến hệ thống di truyền của cây trồng và vật nuôi: thực phẩm được chế biến từ nguồn động vật và thực vật biến đổi gen gọi là thực phẩm biến đổi gen. Chương trình GMO (chương trình cơ thể biển đổi gen) gặp nhiều ý kiến phản đối chỉ trích vì cho rằng thực phẩm biến đổi gen có thể tạo ra những bệnh tật cho người và Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 6 động vật. Tuy nhiên cho đến nay nhiều nước như Mỹ, Trung Quốc và một số nước vẫn phát triển mạnh các loại đậu, cà chua, bắp biến đổi gen. - Phát triển kỹ thuật di truyền nhưng vẫn không ngừng nghiên cứu nâng cao hơn nữa kỹ thuật truyền thống trong trồng trọt và chăn nuôi. 3.2. Protein đơn bào: Protein đơn bào là thuật ngữ chỉ một loại chất dinh dưỡng có trong tế bào và chỉ được sản xuất từ vi sinh vật. Thuật ngữ này không chỉ đơn giản là protein từ tế bào của cơ thể đơn bào, vì rất nhiều vi sinh vật không phải là cơ thể đơn bào mà vẫn khai thác chúng. Do đó, thuật ngữ này nên hiểu là nguồn dinh dưỡng chứa nhiều protein từ vi sinh vật (từ vi khuẩn, nấm men, nấm sợi và tảo). Protein đơn bào là hướng nghiên cứu mạnh mẽ hiện nay để giải quyết vấn đề thiếu hụt protein. 3.2.1. Lịch sử phát triển: Thuật ngữ protein đơn bào có từ những năm 50 của thế kỷ 20 nhưng thực tế loài người đã biết sử dụng loại protein này và các chất có trong tế bào vi sinh vật từ rất lâu: làm bánh mì, sữa chua, phomat, bia bằng hoạt động sống của vi sinh vật dù không hiểu vi sinh vật là gì. Mãi đến thế kỷ 17, người ta mới biết đến vi sinh vật là một sinh vật thứ ba sau động vật và thực vật. Trước thế kỷ 20, việc sử dụng vi sinh vật trong các quá trình chế biến thực phẩm hoàn toàn mang tính truyền thống và ở điều kiện tự nhiên. Việc nghiên cứu và sản xuất protein đơn bào còn xa lạ với loài người, nhất là với qui mô công nghiệp. Đầu thế kỷ thứ I, nhà máy sản xuất sinh khối nấm men được coi là nhà máy đầu tiên sản xuất protein đơn bào tại Đức với phương pháp nuôi Candida utilis còn gọi là “nấm men Torula”. Sau đó, mối quan tâm của Đức giảm đi nhưng đến năm 1930, Đức mở phục hồi và mở rộng sản xuất, năng suất nấm men là 15.000 Tấn/năm, trên cơ sở nuôi trên dịch kiềm sunfit, dịch thải của công nghiệp xenluloza, làm thực phẩm phục vụ trong quân đội và dân thường, chủ yếu là nấu canh và làm xúc xích. Sau năm 1950, phong trào sản xuất SCP lan rộng khắp Châu Âu, Mỹ. Tuy nhiên tất cả vẫn ở qui mô vừa và nhỏ, chủ yếu cho chăn nuôi và có thể chiết tách tinh sạch protein để làm thức ăn nhân tạo hoặc bổ sung vào các nguồn chế biến TP. Vào lúc diễn ra hội nghị lần thứ I về SCP tại Viện Kỹ thuật Massachusett (MIT) năm 1967, đa số các dự án chỉ mới nằm trong thực nghiệm, chỉ số hãng British Petroleum (BP) là có báo cáo về những kết quả của quá trình lên men SCP ở qui mô công nghiệp (CÔNG NGHIệP). Nhưng đến hội nghị lần thứ II họp vào năm 1973 thì nhiều hãng của nhiều nước khác nhau đã bắt đầu sản xuất SCP ở qui mô CÔNG NGHIệP. Cũng bắt đầu từ năm 1973, CÔNG NGHIệP sản xuất SCP đã có những bước phát triển nhảy vọt do việc sử dụng hidrocabon của dầu mỏ, khí đốt làm nguồn cabon và năng lượng rất có hiệu quả. Vậy nguyên nhân nào dẫn đến việc nhiều nước phải sản xuất SCP? Sản xuất SCP là nguồn protein có chất lượng cao thay thế các loại bột dinh dưỡng làm từ các hạt chứa dầu như đậu tương hoặc bột cá dành cho động vật sẽ giải quyết được 2 vấn đề: + Tăng nguồn đậu tương cá, và cả ngũ cốc cho dinh dưõng người. + Các nước Châu Âu, Nga, Nhật và một số vùng khác không trồng được đậu tương, do đó SCP sẽ giúp cho nước đó không phụ thuộc vào việc nhập khẩu protein. Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 7 + Trong tế bào vi sinh vật, ngoài hàm lượng protein tương đối lớn còn có chất béo, vitamin và các chất khoáng, năng suất của vi sainh vật vượt xa năng suất cây trồng và vật nuôi trong công nghiệp nhiều lần. 3.2.2. Đặc điểm của sản xuất Protein đơn bào: - Chi phí lao động ít hơn nhiều so với sản xuất nông nghiệp. - Có thể sản xuất ở bất kỳ địa điểm nào trên trái đất, không chịu ảnh hưởng của khí hậu thời tiết, các quá trình công nghiệp , dễ cơ khí hoá và tự động hoá. - Năng suất cao: vi sinh vật có tốc độ sinh sản mạnh, khả năng tăng trưởng nhanh. Chỉ trong một thời gian ngắn có thể thu nhận được một khối lượng sinh khối rất lớn; thời gian này được tính bằng giờ, còn ở động vật và thực vật, tính bằng tháng hoặc hàng chục năm. - Sử dụng các nguồn nguyên liệu rẻ tiền và hiệu suất chuyển hoá cao. Các nguyên liệu thường là phế phẩm, phụ phẩm của các ngành khác như rỉ đường, dịch kiềm sufit, parafin dầu mỏ v..v.. , thậm chí cả nước thải của một quá trình sản xuất nào đó. Hiệu suất chuyển hoá cao: hidrat cacbon được chuyển hoá tới 50%, cacbuahidro tới 100% thành chất khô của tế bào. - Hàm lượng protein trong tế bào rất cao: ở vi khuẩn là 60 -70%, ở nấm men là 40-50% chất khô v..v… Hàm lượng này còn phụ thuộc vào loài và chịu nhiều ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy. Cần chú ý rằng hàm lượng protein ở đây chỉ bao hàm protein chứ không gồm cả thành phần nitơ phi protein khi xác định theo phương pháp nitơ tổng số của Kjeldal, như axit nucleic, các peptit của thành phần tế bào. - Chất lượng protein cao: Nhiều axit amin có trong vi sinh vật với hàm lượng cao, giống như trong sản phẩm của thịt, sữa và hơn hẳn protein của thực vật. Protein vi sinh vật đặc biệt giàu lizin, là một lợi thế lớn khi bổ sung thức ăn và chăn nuôi, vì trong thức ăn thường thiếu axit amin này. Trái lại, hàm lượng các axit amin chứa lưu huỳnh lại thấp. - Khả năng tiêu hoá của protein: có phần hạn chế bởi thành phần phi protein như axit nucleic, peptit của thành tế bào, hơn nữa, chính thành và vỏ tế bào vi sinh vật khó cho các enzim tiêu hoá đi qua. - An toàn về mặt độc tố: Trong sản xuất protien đơn bào không dùng vi sinh vật gây bệnh cũng như loài chứa thành phần độc hoặc nghi ngờ. Vì vậy đến nay hầu như SCP chỉ dùng trong dinh dưỡng động vật. - Những vấn đề kỹ thuật: Sinh khối vi sinh vật phải để tách và xử lý. Vấn đề này phụ thuộc chủ yếu vào kích thước tế bào. Sinh khối nấm men dễ tách bằng li tâm hơn vi khuẩn. Ngoài ra, vi sinh vật nào có khả năng sinh trưởng ở mật độ cao sẽ cho năng suất cao, sinh trưởng tốt ở nhiệt độ cao (có tính chất ưa nhiệt và chịu nhiệt) sẽ giảm chi phí về làm nguội trong sản xuất, ít mẫn cảm với tạp nhiễm v..v.. sử dụng các nguồn cacbon rẻ tiền, chuyển hoá càng nhiều càng tốt .. thì sẽ được dùng trong sản xuất. Vì vậy nấm men được sử dụng chủ yếu trong sản xuất protein đơn bào. Như vậy ưu điểm của sản xuất protein đơn bào là có thể phân lập và lựa chọn các chủng vi sinh vật có ích và thích hợp cho các qui trình công nghệ, cho từng nguyên liệu 1 cách tương đối nhanh và dễ dàng. Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 8 CHƯƠNG 1 KHÁI NIỆM CHUNG VỀ VI SINH VẬT Protein của vi sinh vật chủ yếu được tổng hợp để hình thành các enzim. Vì vậy phần lớn nằm trong tế bào, một số rất ít được tách ra ngoài môi trường. Yêu cầu của các chủng vi sinh vật dùng trong sản xuất: - Thời gian nhân đôi ngắn. - Có khả năng tạo thành 40-70% protein. - Tiêu hoá tối đa các chất dinh dưỡng của môi trường. - Không gây bệnh và đem vào môi trường độc tố. - Có sức bền cao và chịu được ở điều kiện nuôi cấy không vô trùng. - Dễ tách khỏi dịch nuôi cấy trong điều kiện tuyển nổi (flotation) và li tâm tách. 1. Các nhóm vi sinh vật tổng hợp protein: 1.1. Tảo đơn bào và đa bào 1.1.1. Vai trò của tảo trong đời sống Tảo theo tiếng Latin là Algue có nghĩa là cỏ biển, nhưng thực ra trong nước ngọt cũng như trong đất, trong thân và lá cây, trong bèo hoa dâu v..v đều có tảo. Trong tự nhiên có nhiều loại tảo có hàm lượng protein cao nhưng không sử dụng cho người và gia súc vì có độc tố. Một số tảo là món ăn dân gian ở nhiều địa phương như: Trung và Đông á, Nam Mỹ hay dùng tảo lam, Bolovi và một số nước Nam Mỹ dùng loài Nostae commune (Sphaeronostos commune), Trung Quốc dùng loài Nematonostos Flagelliforme, ở Châu Phi vớt loại tảo lam đa bào Spirulina maxima ở các ao hồ giàu muối canxi làm thức ăn bồi bổ và dùng làm một số thuốc chữa bệnh như phù chân, đau răng và đường tiêu hoá. Từ đó, tảo Spirulina được nhiều nước trên thế giới đưa vào sản xuất công nghiệp. Khoảng năm 1970, những nhà khoa học người Pháp phát hiện ra tảo có khả năng phát triển nhanh và có hàm lượng protein cao nên họ đã nghiên cứu và xây dựng được những qui định công nghệ sản xuất tảo. Đến nay chỉ có 3 loại tảo đơn bào sản xuất qui mô lớn và có kinh tế cao là: + Chlorella + Spirulina + Scenedesmus. trong đó hai loài Chlorella và Spirulina được sản xuất nhiều hơn cả. 1.1.2. Ưu điểm của tảo đơn bào: - Giá trị dinh dưỡng của tảo cao và phạm vi ứng dụng rộng rãi: + Tảo đơn bào có hàm lượng protein rất cao (chiếm khoảng 40-55% chất khô), riêng tảo Spirrlina có chứa tới 70%. Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 9 + Protein của tảo thuộc loại protein hoàn hảo và có chất lượng cao. Hàm lượng axit amin của những protein trong tảo gần với qui định protein tiêu chuẩn, đặc biệt là lizin trong protein của tảo cao hơn hẳn lizin của lúa mạch. Tổng số axit amin không thay thế trong protein rất cao, có khi lên đến 42% (bảng 1 và bảng 2). + Tảo chứa nhiều protein và vitamin (VTM) (nhất là VTM B12 và C) nên được sản xuất làm thức ăn cho người, gia súc, gia cầm và tôm cá. + Giá trị dinh dưỡng của tảo còn thể hiện ở chất lượng và số lượng của các VTM có trong đó. Tảo Chlorella có nhiều VTM A, nhóm VTM B, trong tế bào tươi có rất nhiều VTM C. Ngoài ra có rất nhiều VTM B, K, axit aconitic, axit pantotenic, biotin, lencophorin trong các loại tảo. - Cho đến nay chưa tìm thấy độc tố nào nguy hiểm tồn tại trong sinh khối tảo. - Đặc điểm của tế bào các loài tảo là có chất diệp lục (chlorophyll). Chất này có vai trò quan trọng trong việc cố định năng lượng ánh sáng mặt trời của tảo. Vì vậy tảo là loài sinh vật tự dưỡng, chúng hoàn toàn có khả năng quang hợp mà các giới hiển vi sinh vật khác không có. - Tảo có kích thước tế bào lớn, hoàn toàn có thể đáp ứng tới mọi yêu cầu kỹ thuật, đặc biệt thuận lợi trong giai đoạn thu nhận. - Không bị virus tấn công, sống trong những điều kiện đơn giản. - Tảo có khả năng làm sạch các nguồn nước bẩn, giữ vệ sinh môi trường. Tảo lam có thể tham gia quá trình cố định nitơ của không khí và nhờ những tính chất đặc biệt của mình, tảo lam đã lôi cuốn sự chú ý của các nhà khoa học trong lĩnh vực di truyền, tế bào, hoá sinh, lý sinh. 1.1.3. So sánh 2 loại tảo Chlorella và Spirulina - Tảo Spirulina chứa VTM B12, caroten nhiều hơn hẳn tảo Chlorella, chứa nhiều xantophin là chất rất cần thiết cho gia cầm (để gà CÔNG NGHIệP cho trứng gà có lòng đỏ tươi, thịt gà vàng và ngon), Spirulina còn chứa nhiều loại chất kháng sinh chống vi khuẩn và các loại nấm, nên có thể bảo quản rất lâu mà không bị mốc. - Hàm lượng protein trong tảo Spirulina cao hơn nhiều so với tảo Chlorella. Protein của tế bào Spirulina là 60-70%, Chlorella là 40-50%. - Kích thước của tảo Spirulina lớn hơn kích thước của tảo Chlorella. Mặt khác, tảo Spirulina trong quá trình phát triển có xu hướng nổi lên bề mặt trong khi đó tảo Chlorella có kích thước nhỏ lại có xu hướng lắng chìm khi không khuấy trộn. Thu hoạch tảo Spirulina bằng những phưong pháp đơn giản, trong khi với tảo Chlorella thì phức tạp giống như thu hoạch sinh khối nấm men hoặc sinh khối vi khuẩn. - Thành tế bào tảo Spirulina mỏng, thành tế bào của Chlorella dày hơn. Do đó hệ số tiêu hoá khi ta dùng tảo Spirulina cao hơn tảo Chlorella. Tảo Spirulina phát triển trong môi trường kiềm còn Chlorella phát triển trong môi trường axit yếu. - Khi dùng CO2 như nguồn cacbon, mà nguồn cacbon này trong điều kiện kiềm đất dễ chuyển hoá sang dạng dễ hấp thụ theo phản ứng sau: HCO3 + OH CO32- + H2O CO32- + CO2 + H2O 2HCO3 Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 10 Spirulina hấp thụ CO2 theo chiều hướng này tốt hơn tảo Chlorella. Vì vậy, hiện nay trong sản xuất công nghiệp, tảo Spirulina đã chiếm một vị trí ưu thế. 1.2. Nấm men và vi khuẩn: 1.2.1. Nấm men: - Trong các nguồn protein sản xuất bằng con đường vi sinh vật, nấm men được nghiên cứu sớm nhất và được áp dụng rộng rãi trên thế giới. Con người đã sử dụng nấm men hoặc các sản phẩm hoạt động sống của chúng từ hàng nghìn năm nay. - Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sinh sản bằng cách nẩy chồi. Nấm men không có diệp lục và không thể sử dụng năng lượng mặt trời. Vì vậy chúng dinh dưỡng bằng các hydratcbon, các hydrocacbua, trước hết là đường. - Trong tế bào nấm men có chứa hầu hết các chất cần thiết cho sự sống (protein, gluxit, lipit, các enzim, các VTM, các axit nucleic, các chất khoáng). - Không một sản phẩm thực vật hoặc động vật nào có trong thành phần của mình một lượng các chất có tác dụng đặc hiệu như trong nấm men. Tuy nhiên thành phần các chất đặc hiệu của nấm men không phù hợp hoàn toàn với những nhu cầu sinh lý của động vật. - Nấm men được chú ý nhiều, vì không những trong tế bào của chúng có nhiều chất dinh dưỡng có giá trị, mà chúng lại có khả năng tăng sinh khối và các đặc điểm sinh lý phù hợp với điều kiện sản xuất công nghiệp. - Về đặc điểm lịch sử: Men gia súc được sản xuất đầu tiên ở Đức vào khoảng năm 1880. Lúc đó người ta dùng men bia (Saccharomyces cerevisiae). Trong thế chiến thứ I, men gia súc và men thực phẩm được sản xuất chủ yếu ở Đức là giống Torula utilis. Ở Mỹ, từ năm 1946 mới tổ chức sản xuất sinh khối nấm men. Lúc đầu, người ta nuôi cấy nấm men trên sacaroza để thu hồi sinh khối làm thức ăn cho người. Sau đó vì lý do kinh tế, dần dần người ta thay sacaroza bằng dịch thủy phân từ tinh bột và xenluza, phế liệu công nghiệp đường, bia, rượu … Năm 1968, Liên Xô là nước đầu tiên xây dụng nhà máy sản xuất nấm men từ paraphin dầu mỏ, sau đó Anh, Pháp , Nhật v…v.. đã tiến hành rất nhanh trong lĩnh vực sử dụng nguồn nguyên liệu dồi dào và rẻ tiền này vào mục đích thu protein của nấm men và đã đưa sản lượng nấm men trên thế giới ngày càng tăng. - Về giá trị dinh dưỡng: + Nấm men rất giàu protein và VTM, đặc biệt là các VTM nhóm B. + Sinh khối nấm men chứa khoảng 75-80% nước, 20-25% chất khô trong đó: cacbon 45-50%, nitơ 7-10% (tương ứng với 40-60% protein, hydro 5-7%, oxy 25- 30%, các nguyên tố vô cơ 5-10% (photpho và kali chiếm tới 95-97%) tổng lượng tro, số còn lại là canxi, magiê, nhôm, lưu huỳnh, clo, sắt, silic. Ngoài ra còn có một lượng rất nhỏ các nguyên tố mangan, kẽm, molipden, bo, cacbon ..). + Trong đó thành phần quí nhất là protein. Hàm lượng protein tuỳ thuộc vào từng loại giống, vào thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy. Dao động trong khoảng 40-60%. Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 11 + Về tính chất protein của nấm men gần giống protein nguồn gốc động vật. Protein của nấm men chứa khoảng 20 axit amin không thay thế (bảng 5). Thành phần các axit amin của nấm men cân đối hơn so với lúa mì và các hạt ngũ cốc khác, kém chút ít so với sữa, bột cá, bột xương thịt và các sản phẩm động vật nói chung. Sự thay đổi thành phần các axit amin trong thời gian nuôi cấy được nghiên cứu cho thấy thành phần của các axit amin thay đổi ở một giai đoạn phát triển: giai đoạn tiềm phát. Sau 3 giờ phát triển, tổng hàm lượng các axit amin trong protein tăng lên 17% so với thời điểm ban đầu. Sau đó tổng hợp axit amin giảm xuống và giữ ở mức độ trên 40%. Đến cuối, tế bào già, các chất dự trữ, trước hết là glucogen tiêu hao nhiều nên giảm trọng lượng, do đó tỉ lệ giữa các axit amin so với trọng lượng chung của các tế bào tăng lên gần 50% (tăng không thực chất). - Các giống nấm men dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn gia súc là: Endomyces vernalis, Hansenula anomala, Hansenula suaveolens, Saccharomyces cerevisiae, Candida arbores, Candida tropicalis, Mycotorula lipolytica, Mycotorula japonica, Torulopis utilis, Torulopis utilis var, major, Torulopsis utilis var thermophilis, Monilia candia, Oidium lactic. - Các tiêu chuẩn để lựa chọn giống nấm men để sản xuất protein từ các nguồn hydrocacon: + Có khả năng đồng hoá nhiều nguồn cacbon khác nhau, nhất là các loại pentoza (xiloza, arabinoza) và các axit hữu cơ. + Có thể phát triển tốt trên môi trường có nồng độ chất khử cao. + Có khả năng phát triển nhanh, có sức đề kháng cao đối với nồng độ CO2. + Sản lượng cao, sinh khối chứa nhiều chất dinh dưỡng có giá trị (hàm lượng protein cao, có nhiều axit amin không thay thế, vitamin ..) + Kích thước tế bào tương đối lớn để dễ tách bằng li tâm. + Chịu đựng được nhiệt độ tương đối cao, ít làm biến đổi pH môi trường. - Trong sản xuất nấm men thường dùng các chủng thuộc ba giống Saccharmyces, Candida và Torulopsis. Khả năng chuyển hoá của ba giống này rất cao và đa dạng, qui trình công nghệ tương đối đơn giản. 1.2.2. Vi khuẩn: - Vi khuẩn để sản xuất protein thường được nuôi trên cacbua hidro. Thường sử dụng các giống Pseudomonas, Flavobacterium, Mycobacterium và Nocardia. - Các giống vi khuẩn này có khả năng đồng hoá các ankal (C6-C18) , cacbua hydro béo và thơm khác. - Đối với nguyên liệu sử dụng là metan, sử dụng các giống Methylomonas, Methyllococens capsulatus. - Ngoài ra nhiều nơi còn sử dụng vi khuẩn khí nổ có các đại diện của giống Hydrogenomonas (H. facilia, H. entropha). - Đặc điểm của vi khuẩn: + Tốc độ sinh trưởng nhanh Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 12 + Dùng được nhiều cơ chất. + pH cần giữ 5-7, nếu không có thể có nguy cơ nhiễm các vi khuẩn gây bệnh. + Thu hồi bằng li tâm: khó + Thành phần các axit amin cân đối nhưng hàm lượng các axit amin chứa S hơi thấp. + Khi dùng các vi khuẩn Gram âm để sản xuất SCP cần lưu ý khả năng sản sinh độc tố của chúng. 1.3. Nấm mốc và xạ khuẩn: - Nói chung người ta ít dùng nấm mốc và xạ khuẩn để sản xuất protein. Về mặt dinh dưỡng, protein của các vi sinh vật này kém giá trị hơn so vói protein của vi khuẩn, nấm men ... Về kĩ thuật nuôi cấy, do hệ sợi phát triển thành búi chằng chịt nên trở ngại đến việc sục khí và khuấy trộn. - Nấm mốc là những cơ thể đa bào, giàu vitamin nhóm B, chứa chừng 30-60% protein. Hàm lượng metionin và tryptophan thấp, còn có các axit amin khác tương tự như protein tiêu chuẩn của FAO. Các giống nấm mốc có hàm lượng protein cao là Fusarium, Rhizopus, Penicillium, Aspergillus. Trong những nghiên cứu thu nhận protein từ nấm mốc, người ta chú ý nhiều đến công trình của B.Volesky và H.Zajic. Hai người này đã phân lập được từ nước từ chủng mốc thuộc Graphium, chủng này có chứa tới 52% protein, trong đó có 16 axit amin, metionin chiếm 1% so với protein thô, lizin chiếm đến 7,7%, các axit amin không thay thế khác đều có hàm lượng tương đương với protein tiêu chuẩn, trừ izolơxin. Chủng mốc này có khả năng đồng hoá etan, metan và đã được nuôi trong môi trường chứa hỗn hợp hai nguyên liệu này để thu sinh khối. - Giá trị dinh dưỡng protein một số nấm mốc có thể xem ở bảng 14. - Như đã nói, nấm mốc ít được dùng trong sản xuất protein. Hiện nay chỉ có một số cơ sở sản xuất như United Parer rills ở Phần Lan, công suất 10.000tấn/năm, nguyên liệu chính là nước sunfit, RHM Foods ( 10.000tấn/năm ) và Tate anotty1 (4.000tấn/năm) đều ở Anh. - Cho đến nay xạ khuẩn chưa được dùng trong sản xuất protein. Tuy vậy, người ta vẫn thường thu hệ sợi của chúng và của nấm mốc, trong quá trình sản xuất các chất kháng sinh, các enzim, axit xitric … dưới dạng sản phẩm phụ của nhà máy, nhằm sử dụng protein, vitamin, enzim có trong đó vào những mục đích khác nhau. Nhược điểm của sinh khối xạ khuẩn và nấm mốc thu theo phương pháp này là chóng bị hư hỏng, vì vậy phải chú ý khâu sấy ngày sau khi đã tách sinh khối ra khỏi dây chuyền công nghệ. Trong công nghiệp kháng sinh, người ta có thể thu được sinh khối hệ sợi gần 17% các chất chứa nitơ, trong số đó các chất chứa nitơ đồng hoá khoảng 14%, gần 10% protein tiêu hoá, 2% chất béo, 2,5% chất xơ … sinh khối này có thể sử dụng trong chăn nuôi. 2. Quá trình dinh dưỡng của tế bào vi sinh vật Trong quá trình sống, tế bào vi sinh vật tiến hành trao đổi chất không ngừng với môi trường chung quanh. Các chất dinh dưỡng qua màng tế bào và được chuyển hoá để tạo thành những chất riêng biệt cần thiết để xây dựng tế bào. Các chất dinh dưỡng này khi đi qua màng tế bào sẽ tham gia vào hai loại phản ứng sinh hoá: Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 13 - Biến đổi dị hoá: làm xuất hiện những sản phẩm có cấu trúc đơn giản hơn, Một số được thải đi, một số khác làm vật liệu hoặc làm tiền chất cho các phản ứng đồng hoá. Những biến đổi này cung cấp cho vi sinh vật năng lượng chuyển hoá ở dạng ATP hoặc những hợp chất giàu năng lượng khác. - Biến đổi đồng hoá: đảm bảo sự tổng hợp của thành phần mới có cấu trúc phức tạp hơn và phân tử lượng cao hơn. Quá trình này gọi là đồng hoá hoặc phản ứng sinh tổng hợp. Khi trong môi trường có những hợp chất - vật liệu đó thì vi sinh vật sẽ trực tiếp sử dụng. Nhưng không phải bao giờ trong môi trường cũng có sẵn những hợp chất - vật liệu cần cho quá trình sinh tổng hợp. Muốn có tế bào vi sinh vật bắt buộc phải tự sản xuất bằng cách tự biển đổi dị hoá những thành phần có trong môi trường nuôi cấy. Các chất dinh dưỡng của vi sinh vật chủ yếu lấy ở môi trường chung quanh các môi trường dinh dưỡng nhân tạo cần cung cấp đầy đủ năng lượng, các vật liệu xây dựng tế bào và đảm bảo hiệu suất sinh tổng hợp cao. Thành phần của môi trường gồm các nguồn thức ăn cacbon, nitơ, chất khoáng, các nguyên tố vi lượng và các chất kích thích sinh trưởng. Việc lựa chọn các nguồn dinh dưỡng và nồng độ của chúng trong môi trường phụ thuộc vào đặc tính sinh lý của từng chủng, từng loài vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy chúng. 2.1. Dinh dưỡng cacbon: Nguồn và số nguồn cacbon: Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phân tử enzim, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất. Số nguồn cacbon đối với sinh vật vô cùng lớn. Hầu như không có hợp chất cacbon nào (trừ kim cương, than chì) mà không có nhóm vi sinh vật nhất định sử dụng. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ của các nguồn cacbon phụ thuộc vào: - Thành phần và cấu tạo hoá học, đặc biệt là mức độ oxi hoá của nguyên tử cacbon. - Đặc điểm sinh lý của vi sinh vật: + với các hợp chất có phân tử thấp như một số đường thì vi sinh vật có thể đồng hoá trực tiếp. + Với các hợp chất hữu cơ cao phân tử (tinh bột, protein …) sẽ được phân huỷ nhờ các enzim tạo thành các hợp chất phân tử thấp mà vi sinh vật có thể đồng hoá được. + Với các hợp chất không tan trong nước (lipit, xenluloza, parafin ..) thì vi sinh vật hấp thụ quanh bề mặt của chúng và phân giải chúng dần dần. Nguồn thức ăn cacbon chủ yếu của vi sinh vật: là hydrat cacbon trước hết phải kể đến glucoza. Trao đổi hydrat cacbon đáp ứng 3 nhu cầu của tế bào: + Sản sinh năng lượng + Tạo thành những tiền chất + Tạo ra các quá trình oxi hoá-khử để biến đổi những tiền chất này thành những sản phẩm trung gian hay sản phẩm cuối cùng để xây dựng tế bào, đồng thời tích tụ trong môi trường một hoặc vài sản phẩm sinh tổng hợp. Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 14 Trong công nghiệp lên men nói chung, trừ trường hợp thu sinh khối vi sinh vật đơn thuần, người ta cố gắng tạo điều kiện cho vi sinh vật có thể sử dụng nguồn dinh dưỡng cacbon để tổng hợp các sản phẩm cần thiết nhiều hơn là để tăng sinh khối và tạo thành CO2. Như vậy, cơ chất dinh dưỡng làm nguồn cacbon trong quá trình trao đổi chất và trong sản xuất lên men là các loại đường sacaroza, maltoza, lactoza, glucoza, các đường hexoza khác và các loại bột ngũ cốc như bột gạo, bột ngô, bột đại mạch … chứa chủ yếu là tinh bột. Để đồng hoá được tinh bột, các vi sinh vật phải tiết vào môi trường các enzim amilaza như α-amilaza, β-amilaza, α-glucosidaza. Hệ enzim này được sinh ra trong tế bào rồi tiết ra ngoài môi trường để phân huỷ cơ chất cảm ứng là tinh bột. Quá trình đồng hoá tinh bột ở vi sinh vật được giới thiệu trong sơ đồ sau (theo V.Lilli và G.Banettu, 1953): 2.2. Dinh dưỡng nitơ: Vi sinh vật cũng như tất cả các cơ thể sống khác rất cần nitơ trong quá trình sống để xây dựng tế bào. Tất cả các loại protein đều cấu tạo từ axit amin. Các axit amin ở dạng tự do là nguyên liệu để tổng hợp các phân tử protein. Các axit amin được tạo thành do quá trình trao đổi cacbon và nitơ. Việc tổng hợp các axit amin trải qua những hàng loạt những phản ứng phức tạp với sự xúc tác của nhiều loại enzim khác nhau, nhưng có thể qui về hai phản ứng có trong tế bào vi sinh vật là phản ứng amin hoá và phản ứng chuyền amin. Nguồn nitơ + Nitơ trong không khí rất phong phú, song nó rất bền vững về mặt hoá học, khó bị oxi hoá hoặc khử. Chỉ có một số vi sinh vật cố định nitơ mới có khả năng đồng hoá nitơ trong không khí. + Trong tất cả các môi trường nuôi cấy cần thiết phải có các loại hợp chất nitơ mà vi sinh vật có thể đồng hoá được để đảm bảo hiệu suất lên men cao. Các nguồn nitơ dùng trong công nghiệp lên men là các hợp chất nitơ hữu cơ và vô cơ. Các quá trình ngoại bào Tinh bột Maltoza Glucoza α - glucosidaza α , β- amilaza Tế bào vi sinh vật Các quá trình nội bào Glucoza Các enzim Các enzim CO2, rượu và các axit hữu cơ và các sản phẩm trao đổi hiếu khí khác CO2, rượu và các sản phẩm trao đổi hiếu kỵ khác Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 15 * Các axit amin có mặt trong môi trường thường không được vi sinh vật sử dụng trực tiếp mà phải tiến hành 2 loại phản ứng trao đổi chất: phản ứng khử amin và phản ứng khử cacboxy1. * Các axit amin ở dạng hợp chất thường là các protein của đậu tương, khô lạc .. và pepton. Muốn đồng hoá được các hợp chất này, Vi sinh vật phải tiết vào môi trường hệ enzim proteaza để thủy phân các axit amin thành các axit amin. Rất nhiều loài nấm mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn có hoạt tính proteaza cao: Asperillus, Penicillium, Fusarium, Rhizopus, Actinomyces, Clostridium, Bacillus ..v..v.. Những axit amin, purin và pirimidin là những thức ăn thích hợp hay được Vi sinh vật sử dụng. Sự dị hoá của purin và pirimidin là hai hợp chất được tạo thành trong quá trình thuỷ phân axit nucleic, nucleotit hoặc nucleozit thành cacbonic, amoniac, axit focmioc, axetic hoặc lactic và chúng có thể tham gia vào các chuỗi chuyển hoá khác nhau. * Urê được dùng tronuwg công tổng hợp có hai tác dụng: Làm nguồn N và chất điều chỉnh pH. Dưới tác dụng của ereaza, uree phân huỷ thành CO2 và NH3. (NH2)2CO + H2O 2NH3 + CO2 * Nitrat: Vi sinh vật thường không trực tiếp đồng hoá được nitrat mà phải qua các quá trình biến đổi: 4AH2 + HNO3 NH3 + 3H2O AH2 - chất khử có trong môi trường. HNO3 HNO2 (HNO)2 NH2OH NH3 Axit nitric Axit nitơ Hyponitrit Hydrolamin Quá trình này thực hiện nhờ hệ enzim nitratreductaza. Muối amon: Tất cả các loại vi sinh vật đều đồng hoá được muối amon. Việc sử dụng nguồn N hữu cơ, ure và các muối amon đều gắn liền với việc tách NH3 ra rồi hấp thụ vào tế bào. Như vậy, NH3 là trung tâm của các con đường dinh dưỡng nitơ của Vi sinh vật. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp của vi sinh vật không những chỉ phụ thuộc vào các nguồn N mà còn phụ thuộc vào tỉ số C:N trong môi trường. Tỷ số này có nhiều ý nghĩa. Nó tạo cho vi sinh vật có khả năng trao đổi chất thích hợp, khả năng tích tụ cao các sản phẩm sinh tổng hợp và tạo thành các hệ enzim để tiến hành các phản ứng hoá sinh theo chiều hướng có lợi. 2.3. Dinh dưỡng khoáng 2.3.1. Các hợp chất photpho Sự có mặt của các hợp chất photpho và nồng độ của chúng trong môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình trao đổi chất trong tế bào vi sinh vật. Ngoài ra, photpho trong môi trường còn có tác dụng điều chỉnh hoạt tính hệ enzim đồng hoá các loại thức ăn cacbon. Nguồn photpho có mặt trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật thường là các loại hợp chất photpho hữu cơ có trong bột đậu, cao ngô, bã rượu, khô dầu … và các hợp chất photpho vô cơ, các muối photpho mono hoặc dibazic của K hoặc Na, amon và super photpho. ereaza Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 16 Yêu cầu về photpho của vi sinh vật phụ thuộc vào chủng loài, vào tỉ lệ thành phần môi trường trước hết là tỉ lệ C:N và điều kiện nuôi cấy. Nồng độ các nguồn photpho quá cao cũng làm cho vi sinh vật kém phát triển và giảm hiệu suất sinh tổng hợp. Nếu trong môi trường có cacbonat canxi, khi thanh trùng, các chất photpho vô cơ kết hợp với ion Ca2+ và tạo thành kết tủa. Vi sinh vật thường sử dụng nhanh nhất các photpho vô cơ hoà tan, còn các hợp chất photpho vô cơ không tan trong môi trường thường sử dụng ít và chậm. 2.3.2. Các chất khoáng khác Trong tế bào vi sinh vật có hàng loạt các chất khoáng khác như: magiê, natri, sắt, nhôm, kali, liti, rubidi, mangan, chì v..v.. Vi sinh vật lấy chất khoáng từ môi trường dinh dưỡng, có trường hợp phải bổ sung vào môi trường một số muối khoáng hoặc có khi chúng có sẵn trong nguyên liệu pha môi trường (đường, bột, cao ngô, rỉ đường, cacbonnat canxi…) và trong nước. Những hợp chất khoáng trong môi trường có nhiều ý nghĩa sinh lý khác nhau: - Làm thay đổi trạng thái hoá keo của các tế bào chất. - Làm thay đổi tốc độ các phản ứng enzim trong tế bào chất. Ví dụ như muối ăn (NaCL) trong môi trường lên men các chất kháng sinh, ngoài tác dụng cung cấp nguồn ion Cl-, còn có tác dụng làm thay đổi sức thẩm thấu của tế bào, tạo điều kiện tiết chất kháng sinh từ các sợi mốc, xạ khuẩn vào môi trường dễ dàng. Một số kim loại (kẽm, sắt, mangan, magiê ..) là các chất hoạt hoá enzim. Một số kim loại như Zn, Cu, Mn, Mo, B, K, Mg, Ca… cũng có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính sinh tổng hợp của vi sinh vật. Năm chất đầu cần với một lượng rất ít nên gọi là nguyên tố vi lượng và thường có sẵn trong các nguyên liệu pha trong môi trưòng. Có khi cần phải pha thêm vào trong môi trường này ở dạng muối. 3. Cơ chế sinh tổng hợp protein 3.1. Vai trò điều khiển sự tổng hợp protein của ADN. Protein có phân tử rất lớn, trong hoá học người ta gọi là đại phân tử. Đại phân tử protein được cấu tạo từ những phân tử đơn giản hơn là các axit amin đính kết kế tiếp nhau. Số lượng các axit amin trong phân tử protein có đến hàng trăm hoặc hàng nghìn đơn vị, nhưng tất cả cũng chỉ thuộc trong số 20 axit amin khác nhau. Một loại protein có thể không có đầy đủ cả 20 loại axit amin (thường là khoảng trên 10), do đó thành phần các protein của các vi sinh vật khác nhau thì khác nhau. Giá trị dinh dưỡng của các loại protein cũng hoàn toàn phụ thuộc vào thành phần và số lượng của các axit amin trong việc hình thành các chủng loại protein khác nhau. Do đó từ 20 axit amin, cơ thể sống có thể hình thành vô số các loại protein khác nhau. Trong tế bào sống thường xuyên có 2 loại axit nucleic: Ribonucleic (ARN) và dexoxyribonucleic (ADN). Chúng khác nhau về thành phần, cấu tạo hóa học và vị trí của chúng trong tế bào. ADN chỉ có hoặc chủ yếu trong nhân còn ARN thường được thấy trong tế bào chất nhiều hơn trong nhân. Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 17 Theo các thuyết về sinh tổng hợp protein, các axit nucleic quyết định cấu trúc hoá học và xác định các vị trí các axit amin trong chuỗi protein tổng hợp trong đó vai trò của ADN rất quan trọng. Nó quyết định thành phần và cấu tạo các kiểu ARN đặc biệt gọi là ARN thông tin (ARNt), do đó quyết định thành phần và cấu tạo phân tử protein. Những ARN đi vào riboxôm thực hiện chức năng làm khuôn mẫu. Các axit amin được xếp đặt vào phân tử protein theo trật tự phù hợp với cấu trúc của ARNt . Quá trình điều khiển sinh tổng hợp protein của axit nucleic có thể trình bày ở sơ đồ hình 1.1 sau: Hình 1.1. Sơ đồ tổng hợp protein và vai trò định hướng của axit dexoxyribonucleic (ADN) Theo sơ đồ này sự tổng hợp protein xảy ra ở riboxôm. Ở đây có 2 dòng hoà lại với nhau: là dòng ARNt từ nhân tới và dòng các axit amin được hoạt hoá và nhờ ARN vận tải (ARNv), chuyển đến. 3.2. Cơ chế sinh tổng hợp protein Sự tổng hợp protein có thể trình bày theo sơ đồ như sau: Theo sơ đồ này, từ nhân tế bào, ARNt chui qua màng nhân mà đi vào tế bào chất và đính vào riboxôm. Các axit amin tồn tại tự do trong tế bào chất được gắn vào một loại ARN đặc biệt gọi là ARN vận tải (ARNv), rồi ARNv chuyển các axit amin vào một riboxôm. Tại đây, ARNt đóng vai trò các khuôn mẫu. Trên các khuôn mẫu này, các axit amin đính vào một cách có lựa chọn tại các riboxôm này và quá trình tổng hợp protein được hoàn thành. Như vậy, cơ chế sinh tổng hợp protein có thể tóm tắt như sau: - Nơi tổng hợp protein trong tế bào vi sinh vật (và cả tế bào động thực vật) là các riboxôm. Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 18 - Sự tổng hợp protein cần có sự tham gia của các enzim hoạt hoá và các ARN vận tải. - Ở riboxôm xảy ra quá trình tổng hợp protein do ADN điều khiển, như vậy phải tồn tại một mắc xích trung gian giữa nhân và tế bào chất. Đó là các ARNt. - Trong tế bào vi khuẩn, ARN thông tin rất nhanh chóng bị phá huỷ, nó chỉ hoàn thành chức năng của mình trong một thời gian rất ngắn, nghĩa là xác định protein tổng hợp nên, sau đó các phân tử ARNt khác lại đi vào ribôxôm. Hình 1.2. Sơ đò tổng hợp protein trong tế bào ( theo Lobasov) 4. Các yếu tố tổng hợp protein 4.1. Riboxôm Trong tế bào chất của các vi sinh vật, có 1 loại hạt bé nhỏ nhất trong các thành phần cấu tạo nên tế bào chất, loại hạt này gọi là ribôxôm, cơ quan trung tâm tổng hợp nên mọi loại protein. Ribôxôm của vi khuẩn chứa khoảng 40-60% ARN và 60-40% protein. Ngoài ra, ribôxôm còn chứa một ít lipit, một số enzim như ribonucleaza, lexinaminopeptidaza, B-galactozidaza… và chất khoáng (điểm đặc biệt của ribôxôm là giàu magiê và ít canxi hơn các thành phần khác của tế bào). Ribôxôm là trung tâm tổng hợp protein của tế bào, nhưng không phải mọi ribôxôm đều có khả năng tham gia vào quá trình này. Số ribôxôm tham gia tổng hợp protein thường không quá 5-10% tổng số protein có trong tế bào. Những ribôxôm hoạt Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 19 động này ở dạng những tập hợp gồm 1 số ribôxôm gọi là poliribôxôm hay là polixôm. Cấu trúc này không vững chắc vì các ribôxôm liên kết với nahu chỉ bằng một sợi ARNt. 4.2. ARN thông tin Đầu tiên trong nhân tế bào xảy ra hiện tượng “sao chép” những đoạn của phân tử ADN và nhờ sự sao chép này mà một loại ARN đặc biệt được hình thành. Sự sao chép thực hiện theo nguyên tắc bổ sung nhau, nhưng có một vài ngoại lệ: Chuỗi kép gồm 2 sợi ADN tách rời nhau, một trong 2 sợi đó được dùng làm khuôn để tổng hợp nên sợi ARN. Theo nguyên tắc bổ sung nhau, tương ứng với xitozin (viết tắt là X) trong ADN là guanin (G) trong ARN. Tương ứng với timin (T) trong ADN là adenin (A) trong ARN, nhưng tương ứng với adenin trong ADN thì không phải là timin nữa mà là uraxin (U) trong ARN. Điểm ngoại lệ này không quan trọng lắm vì về mặt hoá học thì uraxin và timin cũng tương tự nhau. Khác với ADN có cấu tạo chuỗi kép (gồm hai sợi) phân tử AND có cấu tạo chuỗi đơn (chỉ có một sợi). Vì ADN được sao chép lại theo trật tự của các nucleotit (các gốc kiềm) trong khuôn ADN, nên người ta nói rằng ADN đã truyền thông tin cho ARN, còn ARN thì giữ lấy thông tin di truyền đó của ADN để thay mặt ADN điều khiển sự tổng hợp protein. Vì thế loại ARN đặc biệt này gọi là ARN môi giới hay ARN thông tin. 4.3. ARN vận chuyển ARNv là một loại axit ribonucleic đặc biệt, có phân tử lượng thấp (khoảng 25.000 đến 30.000). Trong lúc đó, ARNt có phân tử lượng cao hơn trên 10 lần (250.000 đến 500.000). Mỗi một loại axit amin trong số 20 axit amin thông thường có ít nhất một kiểu ARNv đặc thù cho mình, có khi có vài kiểu ARNv. Mỗi một ARNv, này có cấu trúc phân tử đặc biệt riêng, chỉ cho phép đính kết được với một axit amin thích hợp và mang nó đến ARNt đặt nó vào một chỗ trên ARNt dành sẵn cho axit amin đó (chứ không cho axit amin khác). Sau khi giao được axit amin này cho ARNt, ARN v tiếp tục làm nhiệm vụ vận chuyển lần khác và có thể vận chuyển axit amin một lần liên tiếp như vậy. Trên khuôn mẫu (tức là ARNt) đã được lắp đầy axit amin cần thiết thì một chuỗi các axit amin được hình thành. Đó chính là chuỗi polipeptit. Một protein có thể gồm một chuỗi polipeptit, nhưng thường thì protein gồm một số chuỗi polipeptit khác nhau. (Sở dĩ ARNv có khả năng chuyển các phân tử của một loại axit amin nhất định đến những nơi nhất định trên ARNt là do trong ARNt có những đơn vị mã riêng biệt tức là có những bộ ba của các gốc kiềm (nucleotit). Phân tử ARNt là một chuỗi dài kế tiếp của những bộ ba như thế. Mỗi ARNv cũng có một đơn vị bộ ba của các gốc kiềm đặc biệt. Các đơn vị bộ ba những gốc kiềm kế tiếp nhau trong phân tử ARNt tương ứng theo nguyên tắc bổ sung (tức là A trong ARN này tương ứng với U trong ARN kia và ngược lại; G trong ARN này tương ứng với X trong ARN kia và ngược lại) với đơn vị bộ ba của những gốc kiềm của các ARNv, nhờ thế mà ARNv cùng với axit amin đã đính kết vào nó có thể tìm chỗ thích hợp trên ARNt. 4.4. Sự hoạt hoá axit amin Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 20 Trước khi tham gia vào tổng hợp protein, axit amin phải được hoạt hoá, nghĩa là được liên kết với một ARNv tương ứng. Chỉ sau đó axit amin này mới được vận chuyển đến ribôxôm. Quá trình hoạt hoá axit amin diễn ra qua 2 bước nhờ vào xúc tác của cùng một loại enzim axit amin –ARNv – sintetaza đặc trưng đối với mỗi axit amin: - Trước hết axit amin phản ứng với ATP thành phức hợp cao năng axit amin AMT. - Tiếp đến axit amin phức hợp được chuyển đến ARNv tương ứng. Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 21 CHƯƠNG 2 SƠ ĐỒ DÂY CHUYỂN CÔNG NGHỆ THU NHẬN CÁC SẢN PHẨM PROTEIN 1. Sản xuất sinh khối nấm men từ nguồn nguyên liệu thông thường 1.1. Nguyên liệu và xử lý nguyên liệu Các dạng nguyên liệu chứa hydrat cacbon thường là các phụ phẩm và phế phẩm sau: - Các sản phẩm chứa sacaroza của công nghiệp chế biến đường (rỉ đường mía, rỉ đường củ cải, bã mía, cặn rỉ đường, nước rửa thô ..) - Nước thải của nhà máy sữa còn chứa nhiều lactoza - Dịch kiềm sunfit có chứa nhiều pentoza, hexoza, dịch thuỷ phân gỗ. - Các nguyên liệu chứa tinh bột và xenluluza khác. Điểm chung nhất dễ nhận thấy ở các dạng nguyên liệu trên là ngoài đường, chúng còn chứa nhiều axit hữu cơ, N.P,S và các chất khác. Sự phức tạp này nảy sinh hiện tượng sinh trưởng kép làm cản trở sử dụng chúng trong nuôi cấy liên tục một giai đoạn. 1.1.1. Rỉ đường Về lý thuyết: Từ 1g C6H12O6 có thể thu được 0,5 g sinh khối nấm men khô (theo nghiên cứu của A.J.Forage): C6H12O6 (1g) + O2 (0,4g) CO2 (0,67g) + H2O (0,27g) + NH3 (0.05g) Q(1,25kcal) Sinh khối nấm men khô 0,5g Hoặc theo nghiên cứu C.L Cooorey C6H12O6 (2kg) + O2 (0,7g) Sinh khối nấm men khô (1kg) + N,P,K, Mg, S(0,1kg) + CO2 (1,1g) + H2O (0,7g) Các nguyên liệu chứa sacaroza (rỉ đường..) là dạng nguyên liệu lý tưởng nhất đến sản xuất protein đơn bào, vì các nguyên liệu này chứa nhiều yếu tố kích thích sinh trưởng, khí,biotin và sản phẩm protein thu được hầu như sạch, không độc. Rỉ đường được dùng làm các cơ chất cho nhiều quá trình lên men vì: - Giá thành rẻ hơn các nguyên liệu chứa đường khác. - Ngoài đường sacaroza, rỉ đường còn chứa một số chất vô cơ, hữu cơ và vitamin có giá trị. Thành phần của rỉ đường mía và rỉ đường củ cải có sự khác nhau được ở bàng 2.1. Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 22 Bảng 2.1. Thành phần của rỉ đường củ cải và rỉ đường mía chứa 75% chất khô Thành phần Rỉ đường củ cải Rỉ đường mía Đường tổng số % Chất hữu cơ không phải đường % Protein (Nx6,25) % K % Ca % Mg % P % Biotin mg/kg Axit pantothenic mg/kg Inozitol mg/kg Tiamin mg/kg 48 - 52 12 - 17 6 - 10 2,0 - 7,0 0,1 - 0,5 0,09 0,02 - 0,07 0,02 - 0,15 50 - 110 5000 - 8000 khoảng 1,3 48 - 56 9 - 12 2 - 4 1,5 - 5,0 0,4 - 0,8 0,06 0,6 - 2,0 1,0 - 3,0 15 - 55 2500 - 6000 1,8 Sự khác biệt cơ bản giữa 2 loại nguyên liệu này là: - Rỉ đường mía nói chung có pH thấp hơn (5,5 – 6,5) do sự có mặt của các axit béo và pH thấp dùng trong quá trình làm trong. - Rỉ đường mía có màu tối hơn đường củ cải nên khi dùng không trộn với rỉ đường củ cải thì nấm men thu được sẽ có màu tối hơn. - Rỉ đường củ cải chứa nhiều đường sacaroza hơn rỉ đường mía vì trong rỉ đường củ cải hầu như không có một loại đường chuyển hoá nào (có khi chỉ có khoảng 1%) trong khi rỉ đường mía có thể chứa tới 15-25% hidrat cacbon của nó dưới dạng đường chuyển hoá. - Nói chung, rỉ đường củ cải chứa nitơ hữu cơ năm lần cao hơn rỉ đường mía, nhưng một nửa là betain, một thành phần không được Saccharomyces đồng hoá, trong khi đó betain không có mặt trong rỉ đường mía. - Sự khác biệt về hàm lượng vitamin trong rỉ đường mía và đưòng củ cải cũng là tiêu chuẩn quan trọng: + Các chất sinh trưởng có mặt trong rỉ đường mía với hàm lượng lớn: rỉ đường mía chứa khoảng 2,5 µg biotin/g gấp 20 lần hơn rỉ đường củ cải. + Trong khi đó rỉ đường mía nghèo các chất khoáng và axit amin: rỉ đường củ cải chứa axit pantothenic gấp 2-4 lần so với rỉ đường mía. Như vậy, rỉ đường dùng nuôi cấy nấm men không những là nguồn đường mà còn cung cấp các hợp chất hữu cơ khác, các muối khoáng cần thiết và các nhân tố sinh trưởng. Tuy nhiên, ngoài các thành phần có ích cho sự sinh trưởng của nấm men, rì đường cũng có thể chứa các hợp chất có hại có thể làm hư hỏng quá trình lên men: hàm lượng canxi cao nói lên chất lượng thấp của rỉ đường và có thể gây nên những khó khăn trong việc sản xuất nấm men. Rỉ đường cũng có thể dễ dàng nhiễm các vi sinh vật và gây nên những vấn đề không có lợi trong lên men. Xử lý rỉ đường: Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 23 Rỉ đường cần được xử lý chút ít trước khi nuôi cấy. Thông thường nó được axit hoá bằng axit sunfuric tới pH = 4 và đun nóng tới 120-1500C trong 1 phút để kết tủa một số chất vô cơ và chất lơ lửng. Cần phải loại bỏ một phần các chất sinh trưởng, đồng thời bổ sung các muối khoáng cần thiết (như urê 0,15%, KH2PO4 0,35%, Mg, Ca) và có thể phải thêm hỗn hợp các axit amin dạng protein thủy phân (dịch nấm men tự phân, dịch thải trong sản xuất nước chấm, dịch bã rượu ở giai đoạn nhân giống). Khi chuẩn bị phối trộn, r