Đa dạng di truyền quần thể cá dìa công (siganus guttatus) ở vùng biển Quảng Nam–Đà Nẵng dựa trên kết quả phân tích chuỗi adn của vùng gen cytochrome oxidase I ADN ty thể

92 Nguyễn Thị Tường Vi, Võ Sĩ Tuấn, Nguyễn Văn Long ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CÁ DÌA CÔNG (SIGANUS GUTTATUS) Ở VÙNG BIỂN QUẢNG NAM – ĐÀ NẴNG DỰA TRÊN KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CHUỖI ADN CỦA VÙNG GEN CYTOCHROME OXIDASE I ADN TY THỂ GENETIC DIVERSITY OF THE ORANGE-SPOTTED SPINEFOOT (SIGANUS GUTTATUS) POPULATION IN QUANG NAM – DANANG SEA BASED ON THE ADN ANALYSIS OF THE GENETIC REGION CYTOCHROME OXIDASE I DNA IN MITOCHONDRIAL Nguyễn Thị Tường Vi1, Võ Sĩ Tuấn2, Nguyễn Văn Long2 1Trường Đại học Sư phạm- Đại học Đà Nẵng; nttvi@ued.udn.vn 2Viện Hải dương học; longhdh@gmail.com Tóm tắt - Cá dìa công (Siganus guttatus) hiện đang bị khai thác đến mức cạn kiệt, chưa kể đến các rủi ro về đa dạng sinh học do việc di chuyển giống từ nơi này đến nơi khác, việc tìm hiểu cấu trúc quần thể trong thời điểm này để có biện pháp quản lý đúng đắn là cần thiết. Mẫu cá dìa công thu được từ 3 vùng biển: Cửa sông Thu Bồn, biển Cù Lao Chàm và Đà Nẵng. Kết hợp với các trình tự từ GenBank, nghiên cứu khảo sát sự đa dạng và khác biệt di truyền. Kết quả cho thấy các quần đàn cá dìa công ở các vùng biển Cù Lao Chàm, Đà Nẵng và Cửa sông Thu Bồn có 9 kiểu gen Cytochrome Oxidase I (COI) thuộc 3 nhóm chính. Ở mức độ quần thể cả 3 quần đàn cá tại 3 khu vực nghiên cứu không có sự khác nhau về mặt di truyền. Điều này chứng tỏ cá dìa công ở vùng biển Quảng Nam – Đà Nẵng cùng một quần thể và khá đa dạng về mặt di truyền, do đó cần được bảo tồn để đảm bảo sự tồn tại của loài. Abstract - The orange-spotted spinefoot (Siganus guttatus) is a fish of great economic value. It is currently being exploited to the point of exhaustion, not to mention the biodiversity risks associated with seeds migrating from one place to another. It is essential to find out about the population structure of Siganus guttatus at this point in order to ensure better management. Fish samples are collected from three sea areas: Thu Bon estuary, Cu Lao Cham sea and Da Nang. In combination with the sequences from GenBank, the study investigates genetic diversity and differentiation. The results show that Siganus guttatus populations in Cu Lao Cham, Da Nang and Thu Bon estuary have 9 COI genotype in three groups. At the population level, 3 fish group in study area do not have different genetics.This indicates that the rabbit fish in the Quang Nam - Da Nang sea area is quite diverse in terms of genetics and should be preserved. Từ khóa - cá dìa công (Siganus guttatus); COI mtDNA; đa dạng gen; biển Đà Nẵng; biển Cù Lao chàm; cửa sông Thu Bồn Key words - orange-spotted spinefoot (Siganus guttatus); COI mtDNA; genetic diversity; Da Nang sea; Cu Lao Cham sea; Thu Bon estuary 1. Đặt vấn đề Cá dìa công là loài có kích thước nhỏ và giai đoạn cá con thường sống ở vùng cửa sông và rừng ngập mặn. Cũng như đa số các loài thuộc họ Siganidae, cá dìa công có giá trị kinh tế cáo, thịt cá trắng và ngon nên được ưa chuộng, vì vậy đối tượng này thường bị khai thác quá mức (Soliman và cộng sự (CS), 2009). Thông tin về cấu trúc quần đàn đóng vai trò quan trọng trong việc xây dựng chiến lược quản lý bền vững nguồn lợi biển (Ward và Grewe, 1994). Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu sử dụng di truyền phân tử để tìm hiểu cấu trúc quần đàn để giúp đưa ra chính sách bảo vệ nguồn lợi. Đến thời điểm này, số lượng các công bố về cấu trúc quần đàn của các loài thuộc họ cá dìa còn khá hạn chế. Mặc dù các thông tin di truyền về microsatellites, single nucleotide polymorphism và cả hệ gen có thể đưa ra thông tin tối ưu hơn, nhưng vì điều kiện chưa cho phép nên nghiên cứu này chỉ có thể sử dụng phương pháp khả thi nhất là dùng chuỗi ADN của một phần gen COI trong ty thể. COI được sử dụng rộng rãi vì có mức độ biến dị cao ở mức có thể dùng để so sánh giữa các quần đàn. Vì vậy mục tiêu của nghiên cứu này là bước đầu nghiên cứu đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể của cá dìa công (S. guttatus) ở vùng biển Quảng Nam – Đà Nẵng dùng chuỗi ADN ty thể một phần vùng gen COI. 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Thu mẫu Thu 90 mẫu cá dìa công (Siganus guttatus) từ tháng 8/2014 đến tháng 1/2015 ở ba địa điểm: Cửa sông Thu Bồn, Cù Lao Chàm và biển Đà Nẵng (mỗi địa điểm thu 30 mẫu). Mẫu cá cửa sông Thu Bồn được thu bằng nhũi. Các mẫu cá biển Đà Nẵng và Cù Lao Chàm được thu bằng lưới rạn, câu và lặn. Địa điểm thu mẫu thể hiện ở Hình 1. Cắt khoảng 1 cm2 vây ngực của các cá thể ngâm cồn 80, để trong từng lọ riêng biệt có dán nhãn và ghi rõ thông tin về nguồn gốc mẫu. Mẫu vây cá được gửi đến Trung tâm Đa dạng Sinh học Biển (MARBEC) - Đại học Université Montpellier II, Pháp phân tích. Hình 1. Sơ đồ vị trí thu mẫu cá dìa công cửa sông Thu Bồn, Cù Lao Chàm và biển Đà Nẵng ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 9(130).2018 93 2.2. Chiết xuất ADN, nhân bản gen COI và giải trình tự ADN được chiết xuất dùng Kit PureLink® Genomic DNA (Life Techomogies, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Một đoạn của vùng gen COI được nhân bản dùng phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction, gọi tắt là PCR). Phản ứng PCR được thực hiện dùng hai đoạn ADN mồi FishF1 (5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’) và FishR1 (5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA- 3’) (Durand và CS, 2012). Thể tích phản ứng PCR là 50µL, trong đó có 5 µL dung dịch đệm và 1 đơn vị enzyme GoTaq DNA polymerase (Promega), 2µL dNTPs (5 mM), 0,5 µL mỗi ADN mồi (10mM), 1,5 µL MgCl2 (25 mM) và khoảng 50 ng ADN. Điều kiện nhiệt độ cho phản ứng PCR như sau: Tách chuỗi ADN ở 92°C trong 3 phút, 35 vòng lặp của tách chuỗi 92°C trong 1 phút, gắn mồi ADN ở 52°C trong 45 giây, và tổng hợp AND ở 72°C trong 1,5 phút; và kết thúc tổng hợp ADN ở 72°C trong 5 phút (Durand và CS, 2012). 2.3. Phân tích số liệu Phần mềm MEGA phiên bản 6.0 (Tamura và CS, 2013) được dùng để xem và sắp xếp vị trí của các nucleotides. MEGA cũng được dùng để tính mức độ khác nhau và xây dựng mối quan hệ tiến hóa giữa các kiểu gen. Sự khác nhau giữa các quần đàn được kiểm tra dùng “exact test” dựa trên tần số kiểu gen, và so sánh giữa từng cặp quần đàn dùng phân tích sai khác di truyền phân tử (analysis of molecular variance, hay AMOVA) (Excoffier và CS, 1992) dùng 1.000 lần hoán vị của số liệu có được. 3. Kết quả nghiên cứu Trong số 90 mẫu phân tích, 34 mẫu được giải trình tự thành công đoạn gen COI dài 629 basepairs (bp). Gồm có 11 mẫu vùng cửa sông Thu Bồn, 12 mẫu vùng biển Cù Lao Chàm và 11 mẫu từ biển Đà Nẵng. Trong số mẫu giải trình tự thành công, có tổng cộng 9 kiểu gen, và có 11 vị trí có nucleotide thay đổi. Thành phần nucleotide trung bình là A = 24,8%, C = 27,4%, T = 29,1% và G = 18,7%. Sự khác nhau giữa 9 kiểu gen ở 11 vị trí có nucleotide thay đổi và phân bố kiểu gen ở các quần đàn được trình bày ở Bảng 1. Kiểu gen 1 và 4 khá phổ biến (41,7% và 25,0%) ở quần đàn Cù Lao Chàm, trong khi đó kiểu gen 1 và 5 lại phổ biến (mỗi kiểu gen chiếm 25%) ở quần đàn biển Đà Nẵng. Các kiểu gen 4, 5, 6 nhìn thấy nhiều ở quần đàn Cửa sông Thu Bồn. Kiểu gen 9 chỉ phát hiện ở quần đàn Cửa sông Thu Bồn với tần suất thấp (10,0%). Trong ba quần đàn, Cù Lao Chàm có ít số kiểu gen và biến đổi nucleotide nhất (Bảng 1). Bảng 1. Tần số các kiểu gen COI ở ba địa điểm thu mẫu và các tham số đa dạng nucleotide, số kiểu gen, đa dạng kiểu gen, và số nucleotide thay đổi trong từng quần đàn Kiểu gen Vị trí Cù Lao Chàm Biển Đà Nẵng Cửa sông Thu Bồn 34 73 169 220 262 268 313 319 547 556 622 Kiểu gen 1 A C C C T A G A A G G 0,417 0,250 0,100 Kiểu gen 2 . . . . . . . . . . A 0,167 0,100 Kiểu gen 3 G . . . C . . G . . . 0,083 0,083 Kiểu gen 4 G . T . . G . . G . . 0,250 0,083 0,200 Kiểu gen 5 G . . T C . . G . . . 0,083 0,250 0,200 Kiểu gen 6 G T T . . G . . G . . 0,083 0,200 Kiểu gen 7 . . . . . . . . . A . 0,167 0,100 Kiểu gen 8 G . . . C . A G . . . 0,083 Kiểu gen 9 G . T . . . . . G . . 0,100 Số kiểu gen 5 7 7 Số vị trí nucleotide thay đổi 8 10 10 Chú thích: Các con số viết dọc là vị trí nucleotide thay đổi. Dấu chấm có nghĩa là nucleotide giống với kiểu gen 1. Bảng 2. Mức độ khác nhau giữa các quần đàn dựa trên tần số kiểu gen của gen COI (Số trong ngoặc là P-value của “exact test”) Quần đàn Cù Lao Chàm Vịnh Đà Nẵng Cửa sông Thu Bồn Cù Lao Chàm - Vịnh Đà Nẵng 0,002 (0,34) - Cửa sông Thu Bồn 0,025 (0,32) 0,016 (0,80) - Mức độ khác nhau giữa các quần đàn thông qua chỉ số 𝐹𝑆𝑇được thể hiện ở Bảng 2. Giữa 3 quần đàn thì khoảng cách di truyền giữa quần đàn Cù Lao Chàm và Cửa sông Thu Bồn là lớn nhất (𝐹𝑆𝑇=0,025). Sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê (P>0,05, (Bảng 2)). Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài Siganus và các mẫu S. guttatus thu được trong nghiên cứu này được trình bày ở Hình 2. Khoảng cách di truyền giữa các kiểu gen COI được tóm tắt ở Bảng 3. Nhìn chung về mặt di truyền, S. guttatus có hai nhóm: nhóm 2 có ba kiểu gen 3, 5 và 8, các kiểu gen còn lại thuộc nhóm 1 (Hình 2), tuy nhiên sự phân chia này không hoàn toàn rõ ràng do tỷ lệ bootstrap support thấp (30%). Khoảng cách di truyền trung bình giữa hai nhóm này là 0,007. Nhóm 1 cũng được chia làm hai nhóm với tỷ lệ bootstrap cao (84%): Nhóm 1.1 và nhóm 1.2, và khoảng cách di truyền trung bình giữa hai nhóm này cũng là 0,007. Giữa các nhóm 1.1, 1.2 và 2 thì khoảng cách di truyền giữa nhóm 1.1 và 2 là lớn nhất (0,009). 94 Nguyễn Thị Tường Vi, Võ Sĩ Tuấn, Nguyễn Văn Long Bảng 3. Khoảng cách di truyền giữa các kiểu gen COI tìm thấy ở các mẫu cá dìa công. Kiểu gen 1 2 3 4 5 6 7 8 2 0,002 3 0,005 0,006 4 0,006 0,008 0,008 5 0,006 0,008 0,002 0,010 6 0,008 0,010 0,010 0,002 0,011 7 0,002 0,003 0,006 0,008 0,008 0,010 8 0,006 0,008 0,002 0,010 0,003 0,011 0,008 9 0,005 0,006 0,006 0,002 0,008 0,003 0,006 0,008 Hình 2. Quan hệ di truyền tiến hóa giữa các loài thuộc giống Siganus dựa trên chuỗi ADN của một phần gen COI Chú thích: CSTB = Cửa sông Thu Bồn, VĐN = Biển Đà Nẵng, CLC = Cù Lao Chàm. Các ký tự trong ngoặc là GenBank Accession Number. Các số ở nhánh của cây tiến hóa là bootstrap support ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 9(130).2018 95 Ngoài số mẫu phân tích trong nghiên cứu này, chuỗi COI của một số mẫu Siganus guttatus từ Philippines, Trung Quốc và Thái Lan cũng được tải về từ ngân hàng gen để so sánh. Ngoài ra, chuỗi COI của một số loài Siganus khác cũng dùng để xây dựng mối quan hệ tiến hóa giữa các loài. 4. Thảo luận Thông thường các quần đàn phân bố ở các vùng địa lý khác nhau của các loài ở biển không khác biệt nhiều. Nghiên cứu của Bernardi và CS (2001) công bố rằng các quần đàn của loài Dascyllus trimaculatus phân bố cả vùng biển Indo – Tây Thái Bình Dương không có sự khác biệt dù chúng sống ở các vùng đảo cách xa nhau đến 750 km. Đây là do đặc tính đẻ trứng trôi nổi hoặc khả năng di cư của cá làm cho các quần đàn cá có thể di chuyển qua lại giữa các khu vực khác nhau. Khá nhiều nghiên cứu nhận thấy không có sự khác biệt giữa các quần đàn cách nhau cả hàng trăm đến hàng nghìn km (Mukai và CS, 2009; Visram và CS, 2010; DiBattista và CS, 2011). Kết quả của nghiên cứu này cho thấy, các quần đàn cá dìa S. guttatus ở các vùng Cù Lao Chàm, Vịnh Đà Nẵng và Cửa sông Thu Bồn mặc dù đa dạng về kiểu gen (9 kiểu gen) nhưng ở mức độ quần thể thì các quần đàn không có sự khác nhau về mặt di truyền, nghĩa là cá dìa S. guttatus ở 3 khu vực đều cùng một quần thể. Tuy nhiên, để đưa ra biện pháp quản lý phù hợp nguồn lợi S. guttatus cần tiến hành thu mẫu với quy mô rộng hơn. Việc nghiên cứu trên quy mô rộng sẽ giúp có thêm thông tin tổng thể về loài cá quý này ở Việt Nam. Hơn thế nữa, hiện nay giống cá dìa công đang được thu mua ở vùng Cửa sông Thu Bồn và bán ở các tỉnh phía nam miền Trung để nuôi cá thịt, việc di chuyển giống như thế có thể gây ảnh hưởng không tốt đối với nguồn lợi hiện có nếu quần đàn tự nhiên nơi nhập giống khác với quần đàn nơi xuất giống. Nghiên cứu này tìm thấy 9 kiểu gen COI cá dìa công thuộc 3 nhóm chính. Điều này chứng tỏ cá dìa công ở vùng biển Quảng Nam – Đà Nẵng khá đa dạng về mặt di truyền. Tính đa dạng này cần được bảo tồn để đảm bảo sự tồn tại của loài. Nếu cá dìa công giống vùng Cửa sông Thu Bồn bị tiếp tục khai thác, sự đa dạng này sẽ mất đi và gây rủi ro cho việc tồn tại của loài cá quý này tại vùng biển Quảng Nam – Đà Nẵng. Loài này được thuần hóa và đưa vào sinh sản nhân tạo và sản xuất giống phục vụ nuôi trồng thủy sản, sự đa dạng này sẽ là cơ sở ban đầu rất tốt cho công tác chọn giống. 5. Kết luận Phân tích trình tự ADN ở một phần gen COI ty thể của cá dìa công thu được ở vùng biển Quảng Nam – Đà Nẵng, cho thấy các quần đàn Cửa sông Thu Bồn, Cù Lao Chàm và Vịnh Đà Nẵng không khác nhau, có nghĩa là thuộc một quần đàn di truyền. Tuy nhiên đây mới chỉ là nghiên cứu bước đầu và dùng một loại thông tin là ADN ty thể, vì vậy cần có một nghiên cứu rộng ở nhiều vị trí khác dọc vùng biển Việt Nam và sâu hơn (thêm thông tin về ADN trong nhân) để có thể đưa ra chiến lược quản lý nguồn lợi quý giá này cho Việt Nam nói chung. Sự vận chuyển giống cá dìa từ vùng Quảng Nam – Đà Nẵng đến nơi khác cần được lưu ý (hạn chế / nghiêm cấm) khi cấu trúc quần đàn tổng thể chưa xác định được. Điều này sẽ giảm thiểu rủi ro về mặt sinh học cho cá dìa công tự nhiên nơi nhập giống, cũng như bảo tồn tính đa dạng cá vùng xuất giống. Lời cảm ơn: Tác giả xin chân thành cảm ơn Dr. Jean- Dominique Durand (Institut de Recherche pour le Développement, France) và Dr. Nguyễn Thị Thu Thủy (Department of Agriculture, Victoria, Australia) đã giúp đỡ trong việc giải trình tự ADN. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bernardi, G., Holbrook, S.J., Schmitt, R.J., 2001. Gene flow at three spatial scales in a coral reef fish, the three-spot dascyllus, Dascyllus trimaculatus. Marine Biology 138, 457-465. [2] Excoffier, L., Smouse, P.E., Quattro, J.M., 1992. Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics 131, 479-491. [3] DiBattista, J.D., Wilcox, C., Craig, M.T., Rocha, L.A., Bowen, B.W., 2011. Phylogeography of the Pacific Blueline Surgeonfish, Acanthurus nigroris, reveals high genetic connectivity and a cryptic endemic species in the Hawaiian archipelago. Journal of Marine Biology 2011, 1-17. [4] Durand, J.D., Shen, K.N., Chen, W.J., Jamandre, B.W., Blel, H., Diop, K., Nirchio, M., Garcia de León, F.J., Whitfield, A.K., Chang, C.W., Borsa, P., 2012. Systematics of the grey mullets (Teleostei: Mugiliformes: Mugilidae): molecular phylogenetic evidence challenges two centuries of morphology-based taxonomy. Molecular Phylogenetics and Evolution 64, 73-92. [5] Mukai, T., Nakamura, S., Nishida, M., 2009. Genetic population structure of a reef goby, Bathygobius cocosensis, in the northwestern Pacific. Ichthyology Research 56, 380-387. [6] Soliman, V., Bobiles, R.U., Yamaoka, K., 2009. Overfishing in three siganid species (Family: Siganidae) in Lagonoy Gulf, Philippines. Kuroshio Science 2, 145-150. [7] Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S., 2013. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Molecular Biology and Evolution 30, 2725-2729. [8] Visram, S., Yang, M.C., Pillay, R.M., Said, S., Henriksson, O., Grahn, M., Chen, C.A., 2010. Genetic connectivity and historical demography of the blue barred parrotfish (Scarus ghobban) in the western Indian Ocean. Marine Biology 157, 1475-1487. [9] Ward, R.D., Grewe, P.M., 1994. Appraisal of molecular genetic techniques in fisheries. Review of Fish Biology and Fisheries 4. (BBT nhận bài: 10/8/2018, hoàn tất thủ tục phản biện: 17/9/2018)