Đa hình gen GH, IGFBP, PIT1 ở giống gà liên minh

DI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NUÔI KHKT Chăn nuôi số 255 - tháng 3 năm 20208 ĐA HÌNH GEN GH, IGFBP, PIT1 Ở GIỐNG GÀ LIÊN MINH Trần Thị Bình Nguyên12*, Nguyễn Thị Thanh Trà1, Phạm Thu Giang1, Lê Công Toán1, Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Diệu Thúy2, Nguyễn Mạnh Linh3, Hoàng Thị Yến4, Vũ Công Quý4, Vũ Đức Quý5 và Nguyễn Thanh Huyền1 Ngày nhận bài báo: 28/09/2019 - Ngày nhận bài phản biện: 19/10/2019 Ngày bài báo được chấp nhận đăng: 04/12/2019 TÓM TẮT Gà Liên Minh là giống gà bản địa, mang nhiều đặc tính quý, thịt thơm ngon, gắn liền với sự phát triển kinh tế của người dân thôn Liên Minh, xã Trân Châu, huyện Cát Hải, thành phố Hải Phòng. Tuy nhiên khả năng sinh trưởng của gà Liên Minh hạn chế hơn so với các giống gà công nghiệp hướng thịt khác. Mục tiêu của nghiên cứu này là phân tích các đa hình nucleotide đơn (SNPs) của các gen ứng viên, liên quan đến các đặc điểm sinh trưởng ở gà. 100 cá thể gà Liên Minh được đánh giá tần số alen/kiểu gen tại ba SNPs gồm: Gen mã hóa hormone sinh trưởng gà (GHi3), protein liên kết với yếu tố sinh trưởng giống Insulin (IGFBP2) và yếu tố phiên mã đặc hiệu tuyến yên (PIT1). Các mẫu máu được sử dụng để chiết xuất ADN và xác định kiểu gen bằng phương pháp PCR-RFLP. Các tần số alen thu được như sau: 0,97 (alen A) và 0,03 (alen G) thuộc gen GHi3; 0,47 (alen A) và 0,53 (alen G) thuộc gen IGFBP2; và 100% xuất hiện alen B tại gen PIT1. Các kiểu gen tại ba vị trí được nghiên cứu (GHi3, PIT1 và IGFBP2) phân bố tuân theo định luật Hardy- Weinberg. Đây là những kết quả ban đầu nhằm phân tích mối tương quan giữa các chỉ thị ADN và đặc điểm sinh trưởng ở gà Liên Minh. Từ khóa: Đa hình nucleotide đơn, gen ứng viên, PCR-RFLP, gà Liên Minh. ABSTRACT Genetic Polymorphism in GH, IGFBP and PIT genes of indigenous Lien Minh chickens Lien Minh Chicken is an indigenous breed, with many good characteristics, the meat quality is excellent, and contributes to the economic development of rural citizens of Lien Minh Village, Tran Chau Commune, Cat Hai District (Cat Ba Island), Hai Phong City. However, the growth rate of Lien Minh chickens is slower than other high-yield industrial breeds. The objective of the current research was to investigate the single nucleotide polymorphisms (SNPs) of candidate genes, which might be associated with growing traits. 100 Lien Minh chicken individuals were genotyped for three SNPs of chicken Growth hormone (GHi3), Insulin-like growth factor-binding protein (IGFBP2) and Pituitary-specific transcription factor (PIT1) genes. Blood samples were used for DNA extraction and then for genotyping by the PCR-RFLP method. The allele frequencies obtained were as follows: 0.97 and 0.03 for alleles A and G (GHi3), respectively; in IGFBP2, 0.47 for the A allele and 0.53 for G; in PIT1, 100% for allele B. These polymorphic loci (GHi3, PIT1 and IGFBP2) were followed Hardy-Weinberg equilibrium in the Lien Minh chicken population. These were the initial results, which could be used to analyze the correlation of molecular markers and grow traits in Lien Minh chickens. Keywords: Single nucleotide polymorphisms, candidate genes, PCR-RFLP, Lien Minh chicken. 1 Học viện Nông nghiệp Việt Nam 2 Viện Công nghệ sinh học-Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam 3 Viện Tài nguyên và Môi trường Biển 4 Sở Khoa học và Công nghệ Hải Phòng 5 University of the Chinese Academy of Sciences * Tác giả liên hệ: ThS Trần Thị Bình Nguyên, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; ĐT: 0944661010; Email: binhnguyencnsh@gmail.com DI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NUÔI KHKT Chăn nuôi số 255 - tháng 3 năm 2020 9 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Gà Liên Minh là giống gà bản địa có đặc điểm đẹp về ngoại hình và màu sắc lông, da vàng, phẩm chất thịt thơm ngon. Giống gà bản địa này đã được Viện Chăn nuôi đưa vào danh mục nghiên cứu, bảo tồn vật nuôi quý hiếm. Tuy nhiên tốc độ phát triển của gà Liên Minh khá chậm. Hiện nay với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, việc cải thiện khả năng sinh trưởng, sinh sản ở vật nuôi cũng được quan tâm nhiều hơn. Ngoài phương pháp cải thiện chất lượng thức ăn chăn nuôi thì việc áp dụng kỹ thuật di truyền phân tử trong chọn lọc giống cũng đang được nhiều nhà nghiên cứu áp dụng trên nhiều giống động vật khác nhau và mang lại nhiều kết quả khả quan. Để bảo tồn, khai thác và phát triển giống gà Liên Minh được tốt nhất thì việc cải thiện khả năng sinh trưởng của giống gà này là một mục tiêu quan trọng. Ngày nay, nhờ sự phát triển của công nghệ sinh học phân tử và các cơ sở dữ liệu QTL (Quantitative Trait Loci) có thể giúp các nhà khoa học cải thiện tính chính xác và hiệu quả trong việc cải thiện khả năng sinh trưởng ở gà. Bản đồ QLT hiện tại ở gà chứa 11340 QTLs liên quan đến 418 tính trạng khác nhau, trong đó có 172 chỉ thị liên quan đến tính trạng khối lượng cơ thể, 173 chỉ thị liên quan đến khối lượng cơ thể gà ở 84 ngày, 197 chỉ thị liên quan đến tính trạng chiều cao, 245 chỉ thị liên quan đến tính trạng chiều dài thân (http:// www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/GG/ summary, 2019). Sinh trưởng và phát triển ở gà được kiểm soát bởi trục kích thích sinh dưỡng (soma- totrophic axis) gồm các hormone sinh trưởng (GH), thụ thể của hormone sinh trưởng (GHR), các hormone liên kết với thụ thể hormone sinh trưởng (GHRH), IGFBP, gen mã hóa nhân tố phiên mã chuyên biệt tuyến yên (Pituitary- specific transcription factor-PIT1). Các đa hình gen GH, IGFBP2, PIT1, đã được chứng minh có liên quan đến khối lượng cơ thể, dài thân, dài chân, vòng ngực, khối lượng mỡ bụng, độ dày mỡ dưới da, thành phần cơ lườn, hiệu suất và đặc điểm chất lượng thịt, mức tăng trung bình hàng ngày ở gà bản địa trên thế giới (Nie và ctv, 2005; Lei và ctv, 2007; Nie và ctv, 2008; Bhattacharya và ctv, 2012; Khoa và ctv, 2012; Mehdi và ctv, 2014; Nguyen và ctv, 2015; Kazemi và ctv, 2018). Để góp phần vào bảo tồn, khai thác và phát triển giống gà Liên Minh, đề tài “Đánh giá đa hình gen ứng viên liên quan đến tính trạng sinh trưởng ở gà Liên Minh” được tiến hành. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian Tổng số 100 mẫu máu giống gà Liên Minh được thu tại nhiều hộ khác nhau nhằm hạn chế đồng huyết thống, thuộc thôn Liên Minh, từ tháng 01/2019 đến tháng 02/2019. 2.2. Phương pháp Mẫu máu gà được sử dụng để tách chiết ADN hệ gen theo phương pháp cơ bản của Ausubel và ctv (1995). ADN hệ gen sau khi tách chiết được kiểm tra trên điện di gel agarose 1% và đo quang phổ ở bước sóng 260/280nm để đánh giá độ tinh sạch. Khuếch đại đoạn gen GHi3, IGFBP2 và PIT bằng máy chu kỳ nhiệt (PCR): Phản ứng PCR (25µl) chứa các thành phần: 2,5µl Buffer 10x, 0,2µl dNTP 25x, 1,0nM mồi xuôi-ngược, 1U Taq-polymerase, 100ng DNA hệ gen. Chu trình nhiệt cho một phản ứng PCR được thực hiện ở nhiệt độ biến tính ban đầu 94°C trong 3 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ ở 94°C trong 50 giây, thời gian gắn mồi trong 50 giây, kéo dài mạch 72°C trong 45 giây, hoàn tất kéo dài mạch 72°C trong 7 phút. Các thông tin cơ bản về trình tự mồi, nhiệt độ gắn mồi, kích thước mong đợi sản phẩm PCR được trình bày trong Bảng 1. Phân tích đa hình gen bằng enzym cắt hạn chế (RE): Sản phẩm PCR của các đoạn gen được ủ với các RE tương ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất (bảng 2), sử dụng 10U enzyme cho một phản ứng 15µl. Kết quả được kiểm tra trên gel agarose 2,0%. Thông tin chi tiết về các phản ứng cắt enzyme cắt giới hạn, kích thước sản phẩm cắt tính toán theo lý thuyết, alen tương ứng được trình bày trong Bảng 2. DI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NUÔI KHKT Chăn nuôi số 255 - tháng 3 năm 202010 Bảng 2. Thông tin về phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn Locus RE Nhiệt độ cắt (°C) Alen Kích thước alen (bp) GHi3 EcoRV 37 G A 429 295/134 IGFBP2 Bsh1236I 37 G A 350/190 540 PIT1 TaqI 65 A B 599 467/132 2.3. Xử lý số liệu Các số liệu được ghi lại bằng phần mềm Excel và xử lý theo phương pháp thống kê sinh học. Tần số allele được tính theo công thức: p = (2AA + AB)/2N và q = (2BB+ AB)/2N. Trong đó, p là tần số allen A, q là tần số allen B, còn N là tổng số mẫu nghiên cứu. Cân bằng Hardy-Weinberg (HWE) được ước lượng bằng phương pháp của Rodriguez và ctv (2009). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả xác định đa hình gen tại GHi3, IGFBP2 và PIT1 3.1.1. Xác định đa hình gen GHi3 bằng phản ứng PCR-RFLP Sau khi tách chiết ADN hệ gen đạt chất lượng phù hợp cho phản ứng PCR, tiến hành tối ưu quy trình thích hợp cho phản ứng PCR đoạn ADN thuộc gen Ghi3. Tiến hành khuế- ch đại đoạn gen với các cặp mồi đặc hiệu, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% (Hình 1A). Đoạn gen GHi3 được nghiên cứu chứa một điểm cắt với EcoRV, vì vậy có thể cho ba kiểu gen tương ứng với các kích thước: AA(- 429bp), AG (429/295/134) và GG(295/134). Tuy nhiên, ở gà Liên Minh khi điện di sản phẩm cắt trên agarose 2,0% chỉ xuất hiện hai kiểu gen AA (giếng 1-3, 5-8) và AG (giếng 4), không xuất hiện kiểu gen GG ở gà Liên Minh nghiên cứu (Hình 1B). Cũng sử dụng enzyme giới hạn EcoRV (GAT/ATC) nhằm phát hiện đa hình G1705A trên gen GHi3 ở gà Thái Lan hướng thịt, nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan Anh và ctv (2015) cho thấy, các kiểu gen GHi3 có liên kết chặt chẽ với khối lượng cơ thể tại các giai đoạn 4, 6, 8, và 10 tuần tuổi; mức tăng trung bình hàng ngày từ 0-6, 0-8 và 0-10 tuần tuổi. Vì vậy đa hình tại GHi3/EcoRV có thể là ứng cử viên tiềm năng cho tính trạng sinh trưởng ở gà Liên Minh. Bảng 1. Thông tin về các mồi sử dụng Gen Vị trí Trình tự mồi (5’-3’) Ta (oC) Kích thước PCR (bp) Tài liệu tham khảo GH G1705A Intron 3 F: TCCCAGGCTGCGTTTTGTTACTC R: ACGGGGGTGAGCCAGGACTG 64 429 Nie và ctv, 2005 IGFBP G639A Exon 2 F: ACCGGTCTGAGAGCATCCTTG R: GGGAAAAAGGGTGTGCAAAAG 60 540 Lei và ctv, 2005 PIT1 Intron 5 F: GGGGATTTTGCCACTTTAGGG R: TGGGTAAGGCTCTGGCACTGT 61 599 Nie và ctv, 2008 F: Mồi xuôi; R: Mồi ngược; Ta: Nhiệt độ gắn mồi A. Sản phẩm PCR gen GHi3 trên agarose 1% (429bp) B. Sản phẩm cắt của EcoRV với gen GHi3 trên agarose 2% (429/295/134 bp) Hình 1: Sản phẩm PCR-RFLP đa hình gen GHi3 DI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NUÔI KHKT Chăn nuôi số 255 - tháng 3 năm 2020 11 3.1.2. Xác định đa hình gen IGFBP2 bằng phản ứng PCR-RFLP Hình 2 thể hiện, sản phẩm PCR là một băng ADN gọn, rõ nét và có kích thước phân tử tương ứng với tính toán lý thuyết (540 bp). Như vậy, đoạn gen mã hóa IGFBP2 đã được nhân lên thành công (Hình 2A). Theo lý thuyết enzyme Bsh1236I có một điểm cắt với đoạn gen IGFBP2 tạo 2 alen A (540bp) và G (350bp, 190bp), tương ứng với 3 kiểu gen: AA (1 băng 540bp), AG (3 băng có kích thước phân tử 540bp, 350bp và 190bp) và GG (2 băng 350bp và 190bp). Tại đa hình IGFBP2 gà Liên Minh xuất hiện cả ba kiểu gen AA (giếng 5, 10, 11), GG (giếng 6, 7) và AG (giếng 2, 3, 4, 8 và 9) (Hình 2B). Kết quả này tương đồng với các kết quả nghiên cứu của Lei và ctv (2005) và Đỗ Võ Anh Khoa và ctv (2012). 3.1.3. Xác định đa hình gen PIT1 bằng phản ứng PCR-RFLP Đoạn gen PIT1 được phân tích đa hình bằng phản ứng PCR-RFLP có kích thước 599bp (Hình 3A) được cắt bởi enzyme cắt giới hạn TaqI (Nie và ctv, 2005). Theo lý thuyết kết quả cắt gen PIT1/TaqI cho hai alen A (599) và B (467/132) và có thể tạo thành 3 kiểu gen AA (599); AB (599/467/132) và BB (467/132). Tuy nhiên, phân tích trên 100 cá thể gà Liên Minh chỉ xuất hiện một kiểu gen AA và không xuất hiện hai kiểu gen còn lại (Hình 3B). Tần số alen có sự khác nhau đáng kể giữa gà hướng thịt và gà hướng trứng, trong đó gà mang alen C tại đa hình PIT1/TaqI có lợi đối với các tính trạng sinh trưởng như: đường kính đùi, khối lượng cơ thể và chiều dài chân ở gà 84 ngày tuổi (Nei và ctv, 2005). Kết quả nghiên cứu của Zahra Rodbari và ctv (2011) cho thấy đa hình PIT1/TaqI liên kết cao với khối lượng cơ thể ở tuần thứ 6, khối lượng thịt xẻ, khối lượng cánh, khối lượng đùi và khối lượng cơ lưng ở gà thương phẩm Iran. 3.2. Tần số alen/kiểu gen tại ba đa hình gen GHi3, IGFBP2 và PIT1 ở giống gà Liên Minh Kết quả Bảng 2 cho thấy, ở cả ba locus, các kiểu gen phân bố tuân theo định luật Hardy- Weinberg. Tại GHi3 xuất hiện hai kiểu gen (AA, AG), IGFBP2 xuất hiện 3 kiểu gen (AA, AG, GG), còn tại gen PIT1 100% gà Liên Minh mang kiểu gen BB. Ở gà Liên Minh, kiểu gen AA/GHi3 xuất hiện với tần số rất cao (94%), kiểu gen AG rất A. Sản phẩm PCR gen IGFBP2 trên agarose 1% B. Sản phẩm cắt của Bsh1236I với gen IGFBP2 trên agarose 2% Hình 2. Sản phẩm PCR-RFLP đa hình gen IGFBP2 A. Sản phẩm PCR gen PIT1 trên agarose 1% B. Điện di sản phẩm cắt của TaqI với gen PIT1 trên agarose 2% Hình 3: Sản phẩm PCR-RFLP đa hình gen PIT1 DI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NUÔI KHKT Chăn nuôi số 255 - tháng 3 năm 202012 thấp (6%) tương ứng tần số alen A chiếm 97%, còn alen G chỉ chiếm 3%. Các kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy gà cho năng suất thịt cao thường có tần số xuất hiện kiểu gen GG cao còn kiểu gen AA xuất hiện với tần số thấp. Cụ thể là, tại đa hình GHi3 ở gà hướng thịt Thái Lan: Kiểu gen GG xuất hiện với tần số cao đạt 49,75%, còn kiểu gen AA chỉ xuất hiện với tần số thấp (6,62%) (Nguyen TLA và ctv, 2015). Tần số tương tự cũng được tìm thấy ở thế hệ 2 của gà White Recessive Rock và Xinghua, gà mang kiểu gen AA chỉ xuất hiện với tần số 4% (Nie và ctv, 2005). Nghiên cứu trên gà Coob500 và Hubbard cũng cho kết quả tương tự, trong đó tần số xuất hiện kiểu gen AA chỉ chiếm 7,06% trên gà Coob và 2,11% trên giống gà Hubbard (Bassam và ctv, 2016). Vì vậy, có thể thấy kiểu gen GG ở đa hình gen GHi3 được xem như chỉ thị ứng dụng trong chọn giống gà hướng thịt. Bảng 3. Tần số phân bố kiểu gen/alen ở ba locus Ghi3, IGFBP2 và PIT1 Gen Kiểu gen quan sát Alen Kiểu gen kỳ vọng Hardy-Weinberg χ2 P GHi3 AA AG GG A G AA AG GG 0,36 0,84ns (n=100) 0,94 0,06 0,00 0,97 0,03 0,94 0,06 0 IGFBP2 AA AG GG A G AA AG GG 0,05 0,98ns (n=100) 0,214 0,514 0,271 0,47 0,53 0,23 0,50 0,28 PIT1 AA AB BB A B AA AB BB 0,00 ns (n=100) 0,00 0,00 1,00 0,00 0,100 0 0 100 Đối với đa hình gen IGFBP2 ở gà Liên Minh trong nghiên cứu này, kiểu gen AG xuất hiện với tần số cao nhất (0,514), còn hai kiểu gen AA và GG có tần số xuất hiện tương đương nhau, lần lượt là 0,214 và 0,271, tần số phân bố kiểu gen này tuân theo định luật Har- dy-Weinberg. Kết quả tần số phân bố alen A, G tương tự trên quần thể gà bản địa Mazan- daran lần lượt là 0,37 và 0,63 (Khadem và ctv, 2010), quần thể gà Tàu Vàng là 0,18 và 0,82, quần thể gà Nòi là 0,15 và 0,85, quần thể gà Cobb 500 là 0,17 và 0,83 (Đỗ Võ Anh Khoa và ctv, 2012). Tuy nhiên, kết quả về tần số kiểu gen trong nghiên cứu khác với kết quả trong nghiên cứu của Đỗ Võ Anh Khoa (2012). Cụ thể kiểu gen GG có tần số cao nhất ở cả ba quần thể gà Tàu Vàng, gà Nòi và gà Cobb 500 lần lượt là 0,69; 0,71 và 0,74. Còn kiểu gen AA thì có tần số thấp hơn hẳn so với hai kiểu gen còn lại, đặc biệt ở quần thể gà Nòi không thấy xuất hiện kiểu gen AA. Điều này khác biệt này có thể là do sự khác nhau về bản chất di truyền giữa các quần thể gà. 4. KẾT LUẬN Đã đánh giá được đa hình nucleotide đơn tại 3 gen Ghi3, IGFBP2 và PIT1, trong đó, GHi3, IGFBP2 xuất hiện đa hình và sự phân bố của các kiểu gen tuân theo định luật Hardy-Wein- berg. Có thể sử dụng đa hình nucleotide đơn tại GHi3, IGFBP2 để đánh giá mối liên quan với tính trạng sinh trưởng ở gà Liên Minh. LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu này nhận được sự tài trợ từ đề mã số T2019-12-31VB – Học viện Nông nghiệp Việt Nam và hỗ trợ từ Trung tâm ứng dụng tiến bộ Khoa học và Công nghệ Hải Phòng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A. and Struhl K. (1995). Short protocols in molecular biology, third edition, John Wiley & Sons, Inc. 2. Bassam G. M. Al-khatib, Dihya H. H. Al-Hassani (2016). Effect of G1705A SNP in Growth Hormone Gene on the Productive and Physiological Performance inBroiler Chicken. Iraqi J. Biot., 15(1): 33-45. 3. Bhattacharya T.K., R.N. Chatterjee and M. Priyanka (2012). Polymorphisms of Pit-1 gene and its association with growth traits in chicken. Poult. Sci., 91: 1057-64. 4. Kazemi H, Mohammad R., Hasan H., Ghodrat R.M., and Mojtaba N. (2018). Genetic Analysis of SNPs in GH, GHR, IGF-I and IGFBPII Genes and their Association with Some Productive and Reproductive Traits in Native Breeder Hens. Gene Technol., 7(1): 1-7.