Đặc điểm hình thái, sinh học và phân tử của nấm colletotrichum SPP gây bệnh thán thư trên cây mãng cầu ta (Annona Squamosa L) tại tỉnh Bình Thuận và Tây Ninh

Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 2/2019 25 aggressiveness and host range of Alternaria dauci in a controlled environment. Plant Pathology 61(1), 63-75. 3. CAB International., 2007. Crop Protection Compendium. CABI International, UK. . 4. George N.A. 1997. Plant pathology. Academic press, USA, pp. 300 - 302. 5. Hariprasad K., Nagaraja A. and Suresh P. 2018. Host range of Alternaria tenuisima incitant of Kodo blight. J. Mycopathol. Res. 56(2): 153 -155. 6. Karunakara M. K., Shenoi M. M. and Sreenivas S. S,. 2003. Perpetuation and host range of Alternaria alternata causing brown spot disease of tobacco. Indian phytopath 56(2): 138 - 141. 7. Manicom B., Ruggiero C., Ploetz R.C. and Goes A.D, 2003. Disease of Passion Fruit. In Disease of Tropical Fruit Crops (Ploetz R.C). CABI international, UK, pp. 413 - 441. 8. Mary E. P. and Edwin L. C., 1994. Isolation, pathogencity and partial host range of Alternaria limicola, causal agent of Mancha foliar de los Citricos in Mexico. Plant disease 78(9): 879 - 883. 9. Rajesh K. M., Sharma S. S. , 2013. Studies on host range and seed transmission nature of Alternaria alternata (Fr.) Keissler causing leaf blight of Isabgol. J biopest 6(2): 112 -116. 10. Reis A. and Boiteux L.S., 2010. Alternaria species infecting brassicaceae in the Brazilian neotropics: geographical distribution, host range and specificity. Journal of Plant Pathology 92 (3), 661-668. 11. Simmons E.G., 2007. Alternaria: An identification manual. 1 s t edition. American Society Microbiolgy, USA, pp. 582 - 587. 12. Vakalounakis D.J., 1990. Host range of Alternaria alternata f. sp. cucurbitae causing leaf spot of cucumber. Plant disease 74 (3): 227-230. Phản biện: TS. Nguyễn Thị Bích Ngọc ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ PHÂN TỬ CỦA NẤM Colletotrichum spp. GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY MÃNG CẦU TA (ANNONA SQUAMOSA L.) TẠI TỈNH BÌNH THUẬN VÀ TÂY NINH Morphological, Biological and Molecular Characteristics of Colletotrichum spp. Causing Anthracnose on Custard Apple (Annona squamosa L.) in Binh Thuan and Tay Ninh Provinces Đoàn Thị Lan Anh 1 , Nguyễn Thị Hải Hằng 2 và Lê Đình Đôn 3 Ngày nhận bài: 07.1.2019 Ngày chấp nhận: 15.3. 2019 Abstract Samples of anthracnose were collected from the diseased custard apple (Annona squamosal L.) in Binh Thuan province (15 samples) and Tay Ninh province (25 samples) in 2016 and 2017. Isolates of Colletotrichum spp. were identified based on morphological, biological characteristics and sequence analysis of ITS, ACT, TUB2, CHS, GS and GPDH. The results indicated that Colletotrichum gloeosporioides and Colletotrichum capsici (or C. truncatun) are the major pathogens of custard apple anthracnose in the studied regions. The isolates of the fungus grown well on PDA medium in the range of 25-30 o C. Conidia produced by C. gloeosporioides were colorless, cylindrical with one end round and one end slightly acute or both ends round. Conidia produced by C. capsici were colorless and falcate. Appressoria formation was observed at 24-hour after the incubation, colorless at the early stage, turned into medium to dark brown. Appressoria were cylindrical, ovoid, obovoid, clavate or undefined in shape, lobed. Keywords: Annona squamosa L., Anthracnose, Colletotrichum spp., custard apple, 1. Bộ môn Bảo vệ thực vật, Khoa Nông học, Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh 2. Bộ môn Bảo vệ thực vật, Khoa Nông học, Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh 3. Bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 2/2019 26 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Cây mãng cầu ta (Annona squamosa L.) là cây ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao, có khả năng thích nghi rộng, chịu được thời tiết khắc nghiệt của các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Ngoài ra, quả mãng cầu ta có độ ngọt cao, lại có hương thơm nhẹ được nhiều người ưa thích. Bình Thuận và Tây Ninh là hai tỉnh có những đặc điểm thuận lợi về điều kiện khí hậu và đất đai, giá trị của quả mãng cầu ta được công nhận; do đó, những năm gần đây việc trồng mãng cầu ta ngày càng được quan tâm. Hiện nay, bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây ra là bệnh phổ biến và gây thiệt hại lớn nhất đối với cây mãng cầu ta. Bệnh hại cả trên lá, ngọn, hoa và quả gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất, chất lượng của cây mãng cầu ta. Nghiên cứu này nhằm xác định nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên cây mãng cầu ta tại tỉnh Bình Thuận và tỉnh Tây Ninh ở cấp độ loài dựa trên đặc điểm hình thái, sinh học và phân tử. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thu thập mẫu bệnh và phân lập nấm gây bệnh Trong nghiên cứu này, các mẫu lá và quả mãng cầu ta có triệu chứng bệnh thán thư được lấy từ 03 huyện thuộc tỉnh Bình Thuận (huyện Hàm Thuận Bắc, huyện Bắc Bình và huyện Lagi) và 03 huyện thị thuộc tỉnh Tây Ninh (huyện Tân Châu, huyện Dương Minh Châu và thành phố Tây Ninh). Các mẫu bệnh được rửa sạch, khử trùng sau đó đem cấy trên môi trường WA (water agar). Các mẫu Colletotrichum spp. sau khi cấy được để ở 27 o C, chế độ 12 giờ sáng và 12 giờ tối. Khi nấm mọc khoảng 3 – 4 ngày nhận diện vị trí điểm cấy đồng nhất đem cấy chuyền sang môi trường PDA. Nguồn nấm thuần được sử dụng để nghiên cứu đặc điểm hình thái học, sinh học, xác định tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch và kỹ thuật phân tử. 2.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của nấm Colletotrichum spp. Nguồn nấm thuần được nuôi cấy trên môi trường PDA, ủ tối ở 27 o C từ 12 - 14 ngày, sau đó làm tiêu bản và quan sát hình dạng và kích thước bào tử trên kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần. Đặc điểm phát triển của tản nấm, màu sắc và cấu trúc sợi nấm; đặc điểm hình thái của bào tử và giác bám được quan sát ở độ phóng đại 400 lần. Dựa vào các đặc điểm trên để phân loại và định danh theo khóa phân loại của Sutton (1995). 2.3 Lây bệnh nhân tạo Nhỏ dịch bào tử nấm Colletotrichum spp. ở nồng độ 10 7 bào tử/ml lên lá và quả mãng cầu ta không có dấu hiệu bệnh, không có vết thương cơ giới. Những lá và quả mãng cầu ta sử dụng trong thí nghiệm đã được lau sạch bằng cồn 70% và lau lại bằng nước cất vô trùng trước khi nhỏ dung dịch bào tử nấm. - Lây bệnh nhân tạo trên lá: thí nghiệm được bố trí 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 lá. Lá mãng cầu ta được gây 2 vết thương gần phần gân chính, sử dụng micropipet nhỏ 10 7 bào tử/ml dung dịch bào tử lên chỗ gây vết thương. Lá mãng cầu ta đối chứng được gây 2 vết thương gần phần gân chính và được nhỏ bằng nước vô trùng. Các lá sau khi lây bệnh được đặt trong hộp giữ ẩm ở nhiệt độ phòng, trong điều kiện tối. - Lây bệnh lên quả: Thí nghiệm được bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 quả. Quả mãng cầu ta lây bệnh được gây 2 vết thương, sử dụng micropipet nhỏ 10 7 bào tử/ml dung dịch bào tử lên vị trí gây vết thương. Quả mãng cầu ta đối chứng được gây 2 vết thương và được nhỏ bằng nước vô trùng. Các quả sau khi lây bệnh được đặt trong hộp giữ ẩm ở nhiệt độ phòng, trong điều kiện tối. Quan sát biểu hiện triệu chứng sau khi lây bệnh. Thời gian xuất hiện triệu chứng được tính từ khi lây nhiễm đến khi có triệu chứng xuất hiện trên lá, quả. Tính tỷ lệ bệnh sau 6 ngày sau lây bệnh. 2.4 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm Colletotrichum spp. Mỗi thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là một đĩa petri có đường kính 9 cm. Nguồn nấm thuần được nuôi cấy trên các môi trường PDA (Potato Dextrose Agar), CO, GA (Green bean agar) ở nhiệt độ phòng để quan sát các chỉ tiêu về đường kính tản nấm, màu sắc, hình thái và sự phân bố tản nấm trên các môi trường, đường kính tản nấm. Sau khi xác định được môi trường thích hợp nhất cho nấm sự sinh trưởng và phát triển của nấm Colletotrichum, lấy một khoanh nấm có Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 2/2019 27 đường kính 4 mm có cùng thời gian nuôi cấy (lấy từ mép tản nấm 2 ngày tuổi) đặt vào trung tâm của đĩa petri và dán kín xung quanh đĩa petri bằng paraffin. Các đĩa thí nghiệm được đặt trong tủ định ôn (Sanyo MIR 153) ở các mức nhiệt độ: 15, 20, 25, 30 và 35 o C. Quan sát các chỉ tiêu về đường kính tản nấm, màu sắc, hình thái và sự phân bố của tản nấm trên các môi trường, đường kính tản nấm. Đánh giá khả năng nảy mầm và hình thành giác bám của bào tử sau 12, 24, 36, 48 giờ dưới kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần. Tính tỷ lệ bào tử nảy mầm và bào tử hình thành giác bám trong 100 bào tử được quan sát. Mô tả màu sắc của tản nấm, cách mọc tản nấm, hình dạng bào tử, kích thước bào tử, hình dạng và kích thước giác bám của các mẫu phân lập được. 2.5 Xác định loài nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên mãng cầu ta bằng kỹ thuật phân tử DNA tổng số của các nguồn nấm được chiết suất và thực hiện phản ứng PCR khuếch đại các vùng gen Internal transcribed spacer (ITS), Partial actin (ACT), β – tubulin 2 (TUB2), chitin (CHS - 1), Glutamine synthetase (GS), glyceraldehyde - 3 - phosphate dehydrogenase (GAPDH) với các cặp mồi tương ứng: ITS 4 và ITS 5, ACT – 512F và ACT – 783R, Bt2a và Bt2b, CHS – 79F và CHS – 345R, GSF1 và GSR1, GD92F1 và GDR1 (Bảng 1). Các sản phẩm PCR được giải trình tự, so sánh với Ngân hàng gen và xây dựng cây phả hệ. Bảng 1. Danh sách các mồi và trình tự Tên vùng gen Cặp mồi Trình tự (5’ - 3’) Tham khảo Internal transcribed spacer (ITS) ITS 5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG White và ctv, 1990 ITS 4 TCC TCC GCT TAT TGA TATGC Partial actin (ACT) ACT – 512F ATG TGC AAG GCC GGT TTCGC Carbone và Kohn, 1999 ACT– 783R TAC GAG TCC TTC TGG CCCAT β – tubulin 2 (TUB2) Bt2a GGT AAC CAA ATC GGT GCT GCT TTC O’Donnell và Cigelnik, 1997 Bt2b ACC CTC AGT GTA GTG ACC CTT GGC Glass và Donaldson, 1995 chitin (CHS – 1) CHS – 79F TGG GGC AAG GAT GCT TGG AAG AAG Carbone và Kohn, 1999 CHS – 345R TGG AAG AAC CAT CTG TGA GAG TTG GAPDH GD92F1 GCC GTC AAC GAC CCC TTC ATTGA Peres và ctv, 2008 GDR1 GGG TGG AGT CGT ACT TGA GCATGT 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm hình thái của nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên mãng cầu ta Các mẫu bệnh thán thư được thu thập trên lá và quả mãng cầu ta ở tỉnh Bình Thuận và tỉnh Tây Ninh có triệu chứng bệnh điển hình như sau: – Trên lá: vết bệnh đầu tiên là các đốm đen nhỏ, sau đó vết bệnh mở rộng với hình dạng tròn đến oval. Các vết bệnh điển hình ở giữa có màu nâu nhạt, xung quanh có viền màu nâu đen hoặc sẫm, ngoài cùng có quầng màu xanh vàng nhạt. Khi ẩm độ không khí thấp, vết bệnh khô, màu nâu, rạn nứt và thủng. – Trên quả: vết bệnh có hình dạng bất định, màu nâu đậm đến màu đen. Vết bệnh lúc đầu là các đốm đen nhỏ, sau lan rộng thành các vết Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 2/2019 28 bệnh lớn, mô bệnh không có ranh giới rõ rệt với mô khỏe. Trong điều kiện ẩm ướt xuất hiện khối bào tử màu hồng gạch theo vòng đồng tâm trên mô bệnh. Quả non bị bệnh khô đen và rụng, quả lớn bị khô đen một phần, phần vỏ cứng. Quan sát hình thái nấm dưới kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần, đã xác định được 02 loài Colletotrichum gây triệu chứng bệnh thán thư trên cây mãng cầu ta là C. gloeosporioides và C. capsici (hay C. truncatun). Nấm C. gloeosporioides có bào tử không màu, hình trụ hai đầu tròn hoặc một đầu tròn một đầu hơi nhọn, nảy mầm sau 12 giờ; Giác bám hình thành sau 24 giờ, có dạng hơi tròn, hình chùy, hình trứng ngược hay hình dạng không xác định, có phân thùy; lúc đầu không màu chuyển dần sang nâu đến đen. Nấm C. capsici có bào tử không màu, hình lưỡi liềm, nảy mầm sàu 12 giờ; giác bám hình thành sau 24 giờ, ban đầu không màu sau có màu nâu đến nâu đen, có dạng hình hình trứng, hình trứng ngược, hình trụ, hình chùy hay hình dạng không xác đinh và có phân thùy (Hình 3). Đặc điểm tản nấm, kích thước bào tử và giác bám của nấm Colletotrichum thể hiện ở Hình 1-2 và bảng 3. Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu về nấm Colletotrichum spp. của Sutton (1995). Hình 1. Các dạng tản nấm Colletotrichum spp. phân lập được sau 6 ngày nuôi cấy A1-4: mẫu nấm C. gloeospoirioides phân lập được ở Bình Thuận B1-4: mẫu nấm C. gloeospoirioides phân lập được ở Tây Ninh C1-2, D1-2: mặt trước và mặt sau mẫu nấm C. capsici phân lập được ở Tây Ninh Sử dụng các mẫu phân lập tiến hành lây bệnh lên lá và quả mãng cầu ta theo quy tắc Koch nhận thấy các mẫu sau lây bệnh có các triệu chứng điển hình của bệnh thán thư trên cây mãng cầu ta (Hình 4). Sau 2 ngày lây bệnh, ghi nhận sự xuất hiện triệu chứng bệnh thán thư ở các mẫu lá và quả mãng cầu ta. Trên lá, ở vùng gây vết thương biểu bì bắt đầu chuyển sang màu nâu, sau đó vùng bệnh lan rộng dần và trên bề mặt xuất hiện hệ sợi nấm và những giọt dầu nhỏ màu cam; vết bệnh xuất hiện có dạng hình tròn, hơi lõm xuống. Trên quả, ở vùng gây vết thương biểu bì bắt đâu chuyển sang màu nâu đen, sau 2 ngày hệ nấm bắt đầu phát triển và xuất hiện những giọt dầu màu cam chứa bào tử. Sợi nấm xâm nhập vào phần thịt quả mãng cầu và làm cho phần thịt của quả cứng lại và thâm đen. A1 B4 B3 B2 B1 C1 C2 D1 D2 Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 2/2019 29 Bảng 2. Tỷ lệ bệnh của nấm Colletotrichum sp. trên lá và quả mãng cầu ta ở 6 ngày sau lây bệnh Địa điểm Colletotrichumn sp. Tỷ lệ bệnh (%) Trên lá Trên quả Bình Thuận C. gloeosporioides 69,33 100 Tây Ninh C. gloeosporioides 75,00 71,22 C. capsici (hay C. truncatun) 72,20 66,70 Bảng 3. Đặc điểm hình thái của nấm Colletotrichum Địa điểm Loài Colletotrichu mn Đặc điểm hình thái Sợi nấm Tản nấm Bào tử Giác bám Bình Thuận C. gloeosporioides Sợi nấm mảnh, màu trắng đục đến nâu nhạt, đơn bào, trong suốt và phân nhánh, có vách ngăn, trong mỗi tế bào của sợi nấm có nhiều hạt dầu; - Tản nấm màu trắng đến trắng xám, mép tròn đều. Trên bề mặt tản nấm xuất hiện giọt dầu màu cam chứa ổ bào tử bên trong và có gai. - Mặt sau tản nấm có màu trắng đục hoặc cam nhạt, mọc vòng thành những đường tròn đồng tâm màu cam hoặc xanh đậm, đen. - Đường kính tản nấm sau 6 ngày nuôi cấy là 90 mm - Bào tử đơn bào, không màu, tế bào có dạng hình trụ, bên trong có giọt dầu hình tròn không màu. - Bào tử xuất hiện sau 3 ngày với mật độ thấp. - Kích thước trung bình 9,24 – 21,25 x 3,75 – 7,5 µm. - Có dạng hình trứng ngược, hình chùy, hơi tròn hay hình dạng không xác định, có phân thùy, lúc đầu không màu chuyển dần sang nâu đến đen; - Kích thước trung bình 3,33 – 1,67 x 2,5 – 7,92 µm Tây Ninh C. gloeosporioides Sợi nấm mảnh, màu trắng, mọc bung. - Tản nấm màu trắng đến trắng xám, mép tròn đều. Trên bề mặt tản nấm xuất hiện giọt dầu màu cam chứa ổ bào tử bên trong và có gai. - Mặt sau tản nấm có màu trắng đục, mọc vòng thành những đường tròn đồng tâm. - Đường kính tản nấm sau 6 ngày nuôi cấy là 90 mm - Bào tử trong suốt có dạng hình trụ hai đầu tròn hoặc một đầu tròn một đầu hơi nhọn. - Kích thước trung bình 14,01 – 4,29 x 4,97 – 6,68 µm. - Có dạng hình trứng ngược, hình chùy, hơi tròn hay hình dạng không xác định, có phân thùy, lúc đầu không màu chuyển dần sang nâu đến đen; - Kích thước trung bình 7,81 – 7,78 x 6,25 – 11,65 µm C. capsici (hay C. truncatun) Sợi nấm mảnh, màu trắng lúc đầu mọc bung cao về sau sát mặt thạch. - Tản nấm màu trắng, hơi xù, về sau chuyển sang màu vàng nâu. Trên bề mặt tản nấm xuất hiện nhiều búi nấm đen mọc thành những đường tròn đồng tâm, mép hơi gợn sóng. Trên bề mặt tản nấm xuất hiện giọt dầu màu cam chứa ổ bào tử bên trong và có gai. - Mặt sau của tan nấm có màu vàng nâu đến nâu. - Đường kính tản nấm sau 6 ngày nuôi cấy là 90 mm - Bào tử không màu, hình lưỡi liềm, nảy mầm sau 12 giờ; - Kích thước trung bình 25,51 - 38,55 x 3,65 - 4,69 µm. - Có dạng hình trứng ngược, hình chùy, hơi tròn hay hình dạng không xác định, có phân thùy, lúc đầu không màu chuyển dần sang nâu đến đen; - Kích thước trung bình 9.34 - 23.96 x 6.25 - 9.34 µm Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 2/2019 30 Hình 2. Đặc điểm hình thái của nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên mãng cầu ta A1-3: nấm Colletotrichum gloeosporioides B1-3: nấm Colletotrichum capsici (hay C. truncatun) Hình 3. Hình dạng giác bám của các dòng Colletotrichum spp. trên môi trường PDA A1-4: mẫu nấm C. gloeospoirioides phân lập được ở Bình Thuận B1-4: mẫu nấm C. gloeospoirioides phân lập được ở Tây Ninh C1-4: mẫu nấm C. capsici phân lập được ở Tây Ninh A1 A2 A3 B2 B3 B1 Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 2/2019 31 Hình 4. Triệu chứng bệnh do nấm C. gloeospoirioides phân lập được ở Tây Ninh sau 6 ngày trên mãng cầu ta A1-3: Triệu chứng trên lá, quả, thịt quả mẫu có lây bệnh B1-3: Triệu chứng trên lá, quả, thịt quả mẫu đối chứng 3.2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm Colletotrichum spp Quan sát nguồn nấm thuần được nuôi cấy trên các môi trường PDA, CO, GA ở nhiệt độ phòng cho thấy, trong 03 môi trường thí nghiệm nuôi cấy thì trên môi trường PDA tốc độ tăng trưởng của các mẫu nấm phát triển nhanh nhất và mọc dày, phân bố đều trên bề mặt thạch, có sự khác biệt màu sắc rõ ràng, dễ nhận biết và xuất hiện những búi nấm, giọt dầu màu cam chứa bào tử sau 5 - 12 ngày. Trên môi trường CO, sợi nấm mọc yếu, không mọc bung mà mọc rất sát mặt thạch, khó nhận biết được sự tăng trưởng của sợi nấm. Trên môi trường GA, sợi nấm phát triển ở mức trung bình, tản nấm bung nhẹ trên bề mặt thạch, mọc thưa hơn so với mẫu được nuôi cấy trên môi trường PDA. Như vậy, trong 03 môi trường thí nghiệm, PDA là môi trường phù hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm Colletotrichum (hình 5). Kết quả nghiên cứu cho thấy bào tử bắt đầu nảy mầm sau 12 giờ và đạt tỉ lệ cao sau 48 giờ trên môi trường PDA. Các mẫu nấm phân lập được nuôi cấy trên môi trường PDA để đánh giá ảnh hưởng của 05 mức nhiệt độ 15 o C, 20 o C, 25 o C, 30 o C, 35 o C đến quá trình sinh trưởng và phát triển của mẫu nấm. Trong 5 mức nhiệt độ thí nghiệm thì các mẫu phân lập sinh trưởng tốt nhất ở 25 o C, tiếp đến là 30 o C (Bảng 5). Kết quả trên phù hợp với các nghiên cứu trước đây về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng phát triển của nấm Colletotrichum spp. Ngoài ra, trong quá trình thử nghiệm nhận thấy, ở các mức nhiệt độ khác nhau, hình dạng và màu sắc tản nấm của các nhóm phân lập cũng có sự khác biệt. A1 A2 A3 B1 B2 B3 Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 2/2019 32 Hình 5. Đặc điểm tản nấm của các dòng Colletotrichum spp. sau 4 ngày trên 3 môi trường dinh dưỡng ở nhiệt độ 27 o C trong điều kiện tối. A1-3: mẫu nấm C. gloeospoirioides phân lập được ở Bình Thuận B1-3: mẫu nấm C. gloeospoirioides phân lập được ở Tây Ninh C1-3: mẫu nấm C. capsici phân lập được ở Tây Ninh Bảng 4. Đường kính tản nấm Colletotrichum spp. phân lập từ mãng cầu ta trên các môi trường dinh dưỡng ở 27 o C trong điều kiện tối Địa điểm Colletotrichumn sp. Ngày sau cấy Đường kính tản nấm (mm) PDA CO GA Bình Thuận C. gloeosporioides - 2NSC 28,19±3,32 26,14±1,89 26,71±0,65 - 4NSC 57,99±2,44 53,04±2,68 53,21±1,58 Tây Ninh C. gloeosporioides - 2NSC 33,07±3,02 19,54±1,31 21,63±1,88 - 4NSC 60,13±2,48 44,77±1,31 51,22±3,25 C. capsici (hay C. truncatun) - 2NSC 22,28±2,19 17,67±0,72 16,28±1,62 - 4NSC 37,56±2,11 35,61±1,68 36,89±0,87 Các giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại ±SD Bảng 5. Đường kính tản nấm của các dòng nấm Colletotrichum spp. được phân lập từ mãng cầu ta trên môi trường PDA ở các mức nhiệt độ khác nhau trong điều kiện tối Địa điểm Loài Colletotrichumn Ngày sau cấy Đường kính tản nấm (mm) 15oC 20oC 25oC 30oC 35oC Bình Thuận C. gloeosporioides - 2NSC 11,73±1,04 25,03±1,84 27,63±1,65 28,01±2,47 14,01±1,42 - 4NSC 22,28±3,35 45,73±3,38 53,19±2,44 57,01±3,33 23,33±2,73 Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 2/2019 33 Địa điểm Loài Colletotrichumn Ngày sau cấy Đường kính tản nấm (mm) 15oC 20oC 25oC 30oC 35oC Tây Ninh C. gloeosporioides - 2NSC 3,52±0,52 33,10±1,01 34,57±3,42 35,89±2,08 7,08±1,05 - 4NSC 18,25±1,31 56,53±3,86 70,97±3,46 69,27±3,64 19,42±1,35 C. capsici (hay C. truncatun) - 2NSC 3,83±0,81 18,17±2,02 22,33±1,15 19,28±1,86 13,17±2,92 - 4NSC 15,17±3,61 29,00±3,22 38,17±3,68 36,11±2,01 24,50±2,18 Các giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại ±SD 3.3 Xác định loài nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên mãng cầu ta bằng kỹ thuật sinh học phân tử Ở Bình Thuận, dựa trên kết quả định danh bằng sinh học phân tử trên 05 vùng gen Internal transcribed spacer (ITS), Partial actin (ACT), β – tubulin 2 (TUB2), Glutamine synthetase (GS), Glyceraldehyde – 3 – phosphate dehydrogenase (GAPDH) xác định được sự tồn tại của các loài C. aenigma, C. endophytica, C. fructicola, C. gloeosporioides, C. siamense, C. melanocaulon và C. musae thuộc phức hợp loài Colletotrichumn gloeosporioides. Ở Tây Ninh, dựa trên kết quả định danh bằng sinh học phân tử trên 05 vùng gen Internal transcribed spacer (ITS), Partial actin (ACT), β – tubulin 2 (TUB2), chitin (CHS – 1), Glyceraldehyde – 3 – phosphate dehydrogenase (GAPDH) xác định được sự tồn tại của các loài C. aenigma, C. fructicola, C. gloeosporioides, C. melanocaulon, C. siamense, C. tropicale và C. viniferum thuộc phức hợp loài Colletotrichumn gloeosporioides. 4. KẾT LUẬN Dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh học và kết quả sinh học phân tử (trên trình tự các vùng gen ITS, ACT, TUB2, GS và GPDH) đã xác định được loài Colletotrichum gloeosporioides là tác nhân gây bệnh thán thư trên cây mãng cầu ta ở Bình Thuận. Dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh học và kết quả phân tích trình tự các vùng gen ITS, ACT, TUB2, CHS – 1 và GPDH, đã xác định được loài Colletotrichum gloeosporioides và Colletotrichum capsici (hay C. truncatun) là 02 tác nhân gây bệnh thán thư trên cây mãng cầu ta Tây Ninh. Cả nấm C. gloeosporioides và C. capsici đều phát triển tốt trên môi trường PDA trong khoảng nhiệt độ từ 25 đến 30 o C. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ann P. J., Chen M. F., and Hwang R. C.,1997. Effect of Environmental Factors on Disease Incidence of Mango Anthracnose and Bacterial Black Spot. In: Proceedings of the Symposium on Climatic Effects on the Occurrence of Plant Disease and Insects, p. 29 – 40. Tu C. C. and C. M. Yang, Eds. Society of Agrometeorology, wufeng, Taichung, Taiwan, R.O.C. 2. Cannon PF, Buddie AG, Bridge PD, 2008. The typification of Colletotrichum gloeosporioides. Mycotaxon 104: 189 – 204 3. Chen ZJ, Ribeiro A, Silva MC, Santos P, Guerra – Guimara ˜ es L, Gouveia M, Fernandez D, Rodrigues CJ Jr, 2003. Heat shock – induced susceptibility of green coffee leaves and berries to Colletotrichum gloeosporioides and its association to PRs and hsp70 gene expression. Physiol. Molec. Plant Pathol. 63: 181 – 189. 4. Du M, Schardl CL, Vaillancourt LJ. Using mating – type gene sequences for improved phylogenetic resolution of Colletotrichum species complexes. Mycologia, 2005. 97 (3): 641 – 658. 5. Sharma M., Kulshrestha S., 1998. Colletotrichum gloeosporioides: An anthracnose causing pathogen of fruits and vegetables. Biosci Biotechnol Res Asia 2015; 12 (2) 6. Sutton B.C., 1995. The Coelomycetes fungi Imperrecti with pycnidia Acervuli and Stromaea. Principal Mycologist. Common wealth Mycologycal Institute, pages 523 – 537. 7. Weir B.S., Johnston P.R., Damm U., 2012. The Colletotrichum gloeosporioides species complex. Stud Mycol 73:115–180. Phản biện: TS. Trịnh Xuân Hoạt