Đặc điểm sinh học của chủng Aspergillus Terreus VNA 05 và khả năng sinh tổng hợp Lovastatin

Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 05, 12 - 2013 44 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG Aspergillus terreus VNA 05 VÀ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP LOVASTATIN CHU THANH BÌNH, NGUYỄN THU HOÀI ĐẶT VẤN ĐỀ Aspergillus terreus là nấm mốc có tới hàng trăm thành phần dưới loài với các đặc điểm sinh học đa dạng, và thuộc loại có khả năng sinh tổng hợp lovastatin giống như một số chủng vi nấm khác như A. flavipes, Penicillium sp., Monascus ruber [2, 3, 4, 11]. Hiện nay có nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm sinh học và quá trình sinh tổng hợp lovastatin của Aspergillus terreus. Chẳng hạn, quá trình sinh tổng hợp lovastatin từ A. terreus ATCC 20542 với nguyên liệu là lúa mạch đã được nghiên cứu và có điều kiện nuôi cấy là 28oC, với thời gian nuôi cấy chìm nhỏ hơn 10 ngày [4, 6]; cấu trúc hình thái, đặc điểm sinh học A. terreus LA 4414 và sản phẩm bậc hai của chủng cũng đã được khảo sát [8]. Hiện nay, trong Bộ sưu tập vi nấm tại Phòng thí nghiệm vi sinh, Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga có chủng A. terreus VNA 05 có nguồn gốc phân lập trong nước. Bài báo này trình bày một số đặc điểm sinh học và khả năng sinh tổng hợp lovastatin của chủng A. terreus VNA 05, góp thêm thông tin về lĩnh vực nghiên cứu lên men và khả năng sinh tổng hợp lovastatin bằng chủng A. terreus. I. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1. Vật liệu nghiên cứu Chủng vi sinh vật sử dụng là A. tereus VNA 05 được phân lập tại Phòng Vi sinh vật - Phân viện Công nghệ sinh học. Các môi trường được sử dụng: - Môi trường nuôi cấy MEA (Malt Extract Agar - Merck), Czapeck - Dox và môi trường PDA (Potato Dextro Agar) sử dụng để nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào, cấu trúc sinh bào tử của chủng [1]. - Môi trường khoáng: KNO3 - 2g; KH2PO4 - 0,3g; NaH2PO4 - 0,7g; NaCl - 1g; MgSO4.7H2O - 0,4g; NH4Cl - 1g; nước cất - 1 lít, pH 6,8 - 7,0; bổ sung nguồn cácbon khác nhau (20 g/l): Glucoza, sacaroza, glycerol, mannoza, lactoza, và nguồn nitơ (8 g/l): Cao nấm men, bột đậu tương, nước chiết ngô, pepton để khảo sát đặc điểm sinh học của chủng VNA 05. - Môi trường lên men số 3: Glycerol - 10g; bột đậu tương - 8g; KH2PO4 - 1,5g; MgSO4.7H2O - 0,52g; NaCl - 0,4g; nước cất -1 lít [6]. Trong nghiên cứu đặc điểm sinh học của A. terreus VNA 05, chủng được nuôi cấy khảo sát với các môi trường sau: Môi trường sữa đã tách chất béo để xác định khả năng pepton hóa sữa; môi trường gelatin để xác định hoạt tính gelatinase; môi trường carboxymethyl xelluloza (CMC) để xác định hoạt tính xellulaza; môi trường casein để xác định hoạt tính protease và môi trường tinh bột để xác định khả năng sinh amylaza. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 05, 12 - 2013 45 1.2. Phương pháp nghiên cứu 1.2.1. Đặc điểm hình thái của chủng VNA 05 được quan sát trên kính hiển vi điện tử Olympus BX51 và được phân loại theo khóa phân loại Raper and Fennel [10]. 1.2.2. Lưu giữ và bảo quản chủng giống theo phương pháp của Viện Quốc gia về giữ giống London (National Collection Type Culture - NCTC). 1.2.3. Hoạt hóa chủng giống theo phương pháp của Viện giữ giống Hoa Kỳ (American Type Culture Collection Washington - ATCC), Viện sưu tầm giống - NRRL Collection - ARS Culture Collection. 1.2.4. Định tính lovastatin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (Boris Lisec, Ivan Radez & cs., 2012) [5]. Dịch lên men được thu nhận qua màng lọc Milipore 0,45 μm. 1.2.5. Quá trình lên men lovastatin từ chủng A. terreus VNA 05 trong môi trường số 3 (g/l). Điều kiện lên men với pH = 6,5; tốc độ lắc 250 vòng/phút, nhiệt độ 30oC và thời gian 120 h. 1.2.6. Sắc ký bản mỏng (Boris Lisec, Ivan Radez & cs., 2012) [5]. Rửa dịch lên men nhiều lần bằng nước cất vô trùng, đưa qua màng lọc Milipore 0,45 μm. Lovastatin được định tính bằng phương pháp sắc ký bản mỏng. II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 2.1. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp lovastatin của chủng VNA 05 Nuôi cấy A. terreus VNA 05 trên môi trường nuôi cấy số 3, trong thời gian 8 ngày ở nhiệt độ 30oC. Dịch lên men được chiết bằng dung môi etylaxetat với tỷ lệ 1:1 theo thể tích. Kết quả được kiểm tra bằng phương pháp sắc ký bản mỏng và được biểu thị ở hình 1. Hình 1 cho thấy, phổ của mẫu (ký hiệu Lo) có vị trí tương đương với phổ lovastatin chuẩn (ký hiệu M). Như vậy, sản phẩm lên men chính của A. terreus VNA 05 là lovastatin. M: Lovastatin chuẩn; Lo: Dịch chiết lên men A. terreus VNA 05 Hình 1. Sắc ký bản mỏng của dịch lên men và lovastatin chuẩn Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 05, 12 - 2013 46 2.2. Đặc điểm hình thái của chủng VNA 05 Đặc điểm cấu trúc sinh bào tử và hình thái khuẩn lạc A. terreus VNA 05 được thể hiện trên hình 2. a b a. Cấu trúc sinh bào tử của A. terreus VNA 05 trên kính hiển vi điện tử BX51, 400X b. Hình thái khuẩn lạc trên môi trường MEA Hình 2. Đặc điểm cấu trúc sinh bào tử và hình thái khuẩn lạc A. terreus VNA 05 Có thể thấy, cuống sinh bào tử có kích thước 100 - 250 μm, sợi nấm mọc thẳng, bào tử có màu nâu nhạt, có hình trứng kích thước 6 - 8 μm. Trên môi trường MEA ở nhiệt độ 24 - 26oC, khuẩn lạc có đường kính 3 - 3,5 cm, ban đầu có màu vàng chanh, dần dần chuyển sang màu nâu nhạt, màu nâu sẫm. 2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá chủng A. terreus VNA 05 * Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến khả năng phát triển của chủng A. terreus VNA 05 Kết quả khảo sát đặc điểm sinh lý và sinh hóa của A. terreus VNA 05 được nuôi trên môi trường Czapeck - Dox ở các điều kiện pH và nhiệt độ khác nhau được trình bày trong bảng 1. Bảng 1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến khả năng sinh trưởng của A. terreus VNA 05 Nhiệt độ Khả năng Sinh trưởng pH Khả năng Sinh trưởng 15 ± 4,0 ± 20 + 5,0 ± 25 ++ 5,5 + 30 ++ 6,0 + 35 + 6,5 ++ 40 ± 7,0 + 45 - 7,5 + 50 - Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 05, 12 - 2013 47 ++ : Sinh trưởng tốt; + : Sinh trưởng bình thường; ± : Sinh trưởng kém; - : Không sinh trưởng. Có thể thấy, A. terreus VNA 05 có thể sinh trưởng trong dải nhiệt độ từ 25 - 45oC và kém phát triển với nhiệt độ 45oC trở lên. Ngoài ra, A.terreus VNA 05 sinh trưởng được trong khoảng pH từ 5,5 - 7,5 và tốt nhất ở pH = 6,5. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu chủng A. terreus LA4414 của Zhihua Jia và A. terreus ATCC 20542 của Bizukojc [4, 8]. * Khả năng sử dụng nguồn cacbon và nitơ của A. terreus VNA 05 Để nghiên cứu khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ khác nhau, A.terreus VNA 05 được nuôi trong môi trường khoáng có bổ sung các nguồn cacbon và nitơ (bảng 2). Bảng 2. Khả năng sử dụng một số nguồn cacbon và nitơ của A. terreus VNA 05 Khả năng sử dụng nguồn cacbon Nguồn cac bon Sinh trưởng Glucoza ++ Lactoza + Sacaroza ++ Glycerol ++ Manoza ± Khả năng sử dụng nguồn nitơ Nguồn nitơ Sinh trưởng Cao nấm men ++ Bột đậu tương ++ Nước chiết ngô (corn steep liquor) + Pepton ++ ++ : Sinh trưởng tốt; + : Sinh trưởng bình thường; ± : Sinh trưởng kém Có thể thấy A.terreus VNA 05 có khả năng sử dụng hầu hết các nguồn đường thông dụng để tăng sinh. Với đường manoza, A. terreus VNA 05 tăng sinh kém nhất, còn glucoza, sacaroza, glycerol là những nguồn cacbon giúp A. terreus VNA 05 đồng hóa tốt nhất, và đây là những nguồn cacbon rất sẵn. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 05, 12 - 2013 48 Việc khảo sát khả năng sử dụng các nguồn nitơ khác nhau cho thấy A. terreus VNA 05 sinh trưởng tốt trên môi trường với nguồn nitơ là cao nấm men, bột đậu tương, pepton. Nhằm lựa chọn những nguồn nguyên liệu sẵn có và rẻ tiền tại chỗ, trong nghiên cứu tiếp theo chúng tôi lựa chọn glycerol và bột đậu tương làm nguồn cacbon và nitơ cho quá trình sinh tổng hợp lovastatin từ A. terreus VNA 05. Đây là giải pháp hợp lý trong triển khai tổng hợp lovastatin từ những nguồn nguyên liệu phổ biến bằng con đường sinh học. Bizukojc, J. L Casas Lopez và cs. cũng lựa chọn glycerol cho quá trình sinh tổng hợp lovastatin [4, 6]. * Các đặc điểm sinh học khác của A. terreus VNA 05 Trong các nghiên cứu về đặc điểm sinh học tiếp theo, có thể thấy A. terreus VNA 05 có khả năng sinh một số enzym ngoại bào thủy phân cơ chất nghiên cứu (bảng 3). Bảng 3. Một số đặc điểm sinh học của A. terreus VNA 05 Đặc điểm sinh học Khả năng Sinh bào tử ++ Phân giải casein ++ Phân giải CMC ++ Thủy phân tinh bột ++ Pepton hóa sữa ++ Phân giải gelatin ++ Nhiệt độ tối ưu 30oC ± 2 pH tối ưu 6,5 ++ : Sinh trưởng tốt Đây là điều rất thuận lợi cho việc lựa chọn thành phần môi trường lên men và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sau này. Các kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu của Zhihua Jia, Lai, Liu G., Xu Z. và cs. [8, 9]. Theo một số tác giả Bizukojc và cs., 2007; Barios - Gonzalez., J Miranda 2010 [3, 4, ] sinh tổng hợp lovastatin phụ thuộc rất nhiều vào chủng giống, các yếu tố lên men như pH, nhiệt độ, tỷ lệ C:N. Những kết quả nghiên cứu thu được về đặc điểm sinh học A. terreus VNA 05 đã góp phần rút ngắn thời gian nghiên cứu thành phần môi trường và điều kiện lên men, đồng thời theo dõi được mức độ ổn định của A. terreus VNA 05 trong quá trình nuôi cấy, giữ hoạt tính và tránh tạp nhiễm. Trong khuôn khổ bài báo này, tính ổn định chủng giống đã được bảo đảm, 6 tháng một lần được kiểm tra lại hoạt tính, hoạt hóa, lựa chọn, cấy chuyền và sử dụng phương pháp đông khô. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 05, 12 - 2013 49 IV. KẾT LUẬN 1. Chủng A. terreus VNA 05 có khả năng sinh tổng hợp lovastatin. 2. Chủng A. terreus VNA 05 phát triển tốt ở pH từ 5-7,5; nhiệt độ 28oC - 30oC, sử dụng tốt các nguồn cacbon (glucoza, sacaroza, glycerol, mannoza, lactoza) và các nguồn nitơ thông dụng (cao nấm men, bột đậu tương, nước chiết ngô, pepton). 3. Chủng A. terreus VNA 05 có khả năng sinh các enzym thủy phân tinh bột, casein, gelatin, xelluloza. Đây là điều kiện thuận lợi cho việc lựa chọn nguồn dinh dưỡng khi lên men sản xuất lovastatin. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Lân Dũng dịch, EGOROV, Thực tập vi sinh vật học, NXB Giáo dục, 1995. 2. Alberts AW, Chen J, Kuron G, Hunt V, Huff J, Hoffman C, Rothrock J, Lopez M, Joshua H, Harris E, Patchett A, Monaghan G, Currie S, Stapley E, Mevinolin: a highly potent competitive inhibitor of hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase and cholesterollowering agent, Poc Natl Acad Sci USA, 1980, 77: 3957-3961. 3. Barrios-Gonzalez J, Miranda RU, Biotechnological production and applications of statins, Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 85: 869-883. 4. Bizukojc M., Pecyna M., Lovastatin and geodin formation by Aspergillus terreus ATCC 20542 in a batch culture with the simultaneous use of lactose and glycerol as carbon sources, Eng. Life Sci., 2011, 11: 272-282. 5. Boris Lisec, Ivan Radez, Ljudmila Fele Zilnik, Solvent extraction of lovastatin from a fermentation broth, Separation and Purification Technology, 2012, 96: 187-193. 6. Casas Lopez J.A., Sanchez Perez J.M., Fernandez Sevilla F.G., Acien Fernandez E., Molina Grima Y., Chisti, Production of lovastatin by Aspergillus terreus: effects of the C:N ratio and the principal nutrients on growth and metabolite production, Enzyme and Microbial Technology, 2003, 33:270-273. 7. Drug Invention Today, 2011, 3(6): 75-77. 8. Zhihua Jia, Long-Shan T. Lai, Tai-Her Tsai, Te Chi Wang, Tsung-Yao Cheng, The influence of culturing enviroments on lovastatin production by Aspergillus terreus in submerged cultures, Enzyme and Microbial Technology, 2005, 36: 737-748. 9. Liu G., Xu Z., Cen P., A morphologically structured model for mycelial growth and secondary metabolite formation, Chin. J Chem. Eng., 2000, 8:46-51. 10. Raper and Fennel, Compendium of soil fungi, Institute of Soil Biology Federal Agricultural Research Centre Braunschweig of Germany, 1980. 11. Valera J., Gomes S., Lakshmi R., Gururaja, Lovastatin production by solid state fermentation using Aspergillus flavipes, Enzyme and Microbial Technology, 2005, 37: 521-526. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 05, 12 - 2013 50 SUMMARY BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF THE STRAIN Aspergillus terreus VNA 05 AND THEIR LOVASTATIN BIOSYNTHESIS CAPABILITY This paper presents some biological features and lovastatin biosynthesis capability of strain A. terreus VNA 05. It is found that the strain is capable of lovastatin biosynthesis and develops well in pH from 5 to 7.5 and at temperature 28oC - 30oC. The train consumes some commonly used carbon sources (glucose, saccharose, glycerol, mannose, lactose) and nitrogen sources (yeast extract, soybean powder, corn extracted water, peptone). A. terrus VNA 05 also yields enzyme activities hydrolyzing starch, casein, gelatin, xelluloza, which are favorable conditions for selecting nutrients during lovastatin fermentation. Từ khoá: Aspergillus terreus VNA 05, lovastatin, biological characterization. Nhận bài ngày 05 tháng 11 năm 2013 Hoàn thiện ngày 26 tháng 12 năm 2013 Phân viện Công nghệ sinh học, Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga