Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen cây mãng cầu ta tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu bằng chỉ thị phân tử Rapd

22 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN CÂY MÃNG CẦU TA TẠI TỈNH BÀ RỊA - VŨNG TÀU BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD Đỗ Văn Thịnh1, Phạm Thị Mười1, Trương Quốc Ánh2, Bùi Anh Xuân2, Nguyễn Đắc Thành2, Lương Thế Minh2, Chung Anh Dũng2, Mai Văn Trị1 TÓM TẮT Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen cây mãng cầu ta tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu bằng chỉ thị RAPD đã được thực hiện từ tháng 3/2018 đến tháng 10/2018. Mẫu lá của 40 cá thể mãng cầu ta qua tuyển chọn được thu thập để ly trích DNA, sản phẩm DNA được khuếch đại bằng 10 chỉ thị RAPD. Kết quả cho thấy, dựa vào sơ đồ quan hệ di truyền có thể chia 40 cá thể thu thập thành 2 nhóm với hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,76 đến 1. Trong đó, nhóm I gồm 39 cá thể, nhóm II gồm 1 cá thể. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy mức độ đa dạng di truyền của 40 cá thể thu thập, đồng thời cho thấy sự khác biệt giữa nhóm mãng cầu địa phương và mãng cầu ta du nhập mà có thể khai thác cho các chương trình chọn tạo giống. Từ khóa: Mãng cầu ta, đa dạng di truyền, RAPD, Bà Rịa - Vũng Tàu I. ĐẶT VẤN ĐỀ Mãng cầu ta (Annona squamosa L.) còn gọi là na là cây ăn quả được trồng rộng rãi ở nước ta. Bà Rịa - Vũng Tàu là một trong những tỉnh trồng nhiều mãng cầu ta. Loài cây ăn quả này dễ trồng, có giá trị kinh tế cao, có tiềm năng xuất khẩu và mang lại thu nhập tốt cho người trồng. Qua điều tra cho thấy, giống sản xuất đại trà hiện nay có nhược điểm là quả nhỏ và nhiều hạt. Do đó việc nghiên cứu chọn tạo giống để cải thiện những tính trạng trên là cần thiết. Ngày nay, với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử, nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền sử dụng chỉ thị DNA đã được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chọn lọc giống cây trồng (Nguyễn Đức Thành, 2014). Trên thế giới, nhiều nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) phân tích đa dạng di truyền trên chi na (Annona) đã được thực hiện, trong đó có cây mãng cầu ta (Ronning et al., 1995, Bharad et al., 2009; Ahmad et al., 2010; Guimarães et al., 2013; Anugari et al., 2016). Ở Việt Nam, chỉ thị phân tử RAPD đã được ứng dụng để đánh giá đa dạng di truyền của một số cây trồng nhưng chưa thực hiện trên cây mãng cầu ta. Gần đây, nguồn gen cây mãng cầu ta ở tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu (BRVT) đã được khảo sát với 40 cây cá thể trong quần thể mãng cầu ta trong sản xuất có những khác biệt hình thái được thu thập và bảo tồn (Nguyễn Tuấn Vũ và ctv., 2018). Nghiên cứu này được tiến hành để đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen cây mãng cầu ta tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu mà đại diện là 40 cá thể được thu thập nêu trên bằng chỉ thị phân tử RAPD. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu gồm 40 cá thể mãng cầu ta được tuyển chọn và thu thập từ một nghiên cứu trước đó của Nguyễn Tuấn Vũ và cộng tác viên (2018) tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu (Bảng 1). Các cây mãng cầu ta được sử dụng làm mẫu được kí hiệu lần lượt từ BRVT01 đến BRVT40. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Ly trích và kiểm tra DNA: DNA của các mẫu lá mãng cầu ta được ly trích theo phương pháp CTAB (Doyle and Doyle, 1990). Sau khi ly trích, DNA sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 2% (w/v), mẫu có vạch DNA rõ nét, không bị đứt gãy, và có độ tinh sạch cao sẽ được sử dụng cho phản ứng PCR. Phản ứng khuếch đại DNA với 10 đoạn mồi RAPD (Bảng 2), sản phẩm PCR được sử dụng để chạy điện di trên gel agarose 2%, nhuộm gel bằng ethidium bromide và chụp gel bằng tia UV, kết quả sẽ được sử dụng để xây dựng cây phân nhánh di truyền bằng phần mềm NTSYSpc 2.11a theo phương pháp UPGMA (Sneath and Sokal, 1973). Phân tích sơ đồ hình nhánh và đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các cây mãng cầu ta dựa trên ma trận hệ số tương đồng (Nei and Li, 1979). Giá trị PIC (Polymorphic information content) được sử dụng để đánh giá hiệu quả của mồi trong việc phân biệt kiểu gen đặc trưng của cây. Giá trị PIC được xác định theo công thức: PIC = 1 – Σ(Pi2); Trong đó: Pi là tần số của alen i của kiểu gene được kiểm tra, phạm vi giá trị PIC từ 0 (không đa hình) tới 1 (đa hình hoàn toàn). 1 Trung tâm Nghiên cứu Cây ăn quả miền Đông Nam bộ, Viện Cây ăn quả miền Nam 2 Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam 23 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 Bảng 1. Danh sách địa điểm thu thập 40 mẫu mãng cầu ta tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu Mẫu Tên chủ vườn và địa điểm thu thập Tọa độ* 1 - 3 Trần Văn Thêm (Ấp Phước Thới, xã Phước Long Thọ, huyện Đất Đỏ) [N10 029’52,6” E107017’10,5”] ± 10 m 4 - 6 Lê Văn Tùy (Khu phố Phước Sơn, T.T. Đất Đỏ, huyện Đất Đỏ) [N10030’19,8” E107017’4,0”] ± 11 m 7 - 8 Huỳnh Văn Tú (Ấp Phước Thới, xã Phước Long Thọ, huyện Đất Đỏ) [N10 030’50” E107017’12,4”] ± 15 m 9 - 10 Nguyễn Văn Hùng (Ấp Phước Thới, xã Phước Long Thọ, huyện Đất Đỏ) [N10 031’03” E107017’23”] ± 6 m 11 - 13 Phạm Tuấn Ngọc (Khu phố Thanh Long, TT. Đất Đỏ, huyện Đất Đỏ) [N10 030’51,9” E107016’25,8”] ± 21 m 14 - 17, 29 - 30 Võ Văn Siêng (Ấp Tân Hòa, xã Long Tân, huyện Đất Đỏ) [N10 032’15,8” E107017’48,3”] ± 12 m 18 Nguyễn Văn Nguyện (Khu phố Thanh Long, TT. Đất Đỏ, huyện Đất Đỏ) [N10 031’16,8” E107016’31,5”] ± 18 m 19 - 21 Lý Hùng Cường (Ấp Tân Hòa, xã Long Tân, huyện Đất Đỏ) [N10032’21” E107017’43,2”] ± 6 m 22 - 24 Phạm Hữu (Ấp Cây Cám, xã Láng Dài, huyện Đất Đỏ) [N10030’53,7” E107020’40,1”] ± 7 m 25 - 28 Đỗ Sung (Ấp Cây Cám, xã Láng Dài, huyện Đất Đỏ) [N10031’19,3” E107020’40,1”] ± 5 m 31, 36 - 40 Đào Văn Hiếu (Ấp Phú Lâm, xã Hòa Hiệp, huyện Xuyên Mộc) [N10 040’21,0” E107032’12,0”] ± 59 m 32** Trung tâm Nghiên cứu Cây ăn quả miền Đông Nam Bộ (Khu phố Nông Trường, phường Hắc Dịch, Tx. Phú Mỹ) [N10 038’5,0” E10708’27”] ± 11 m 33** Đặng Văn Phức (Ấp 2, xã Tóc Tiên, Tx. Phú Mỹ) [N10037’24,9” E10705’35,2”] ± 9 m 34 - 35 Nguyễn Tiến Hoàng (Ấp 2, xã Tóc Tiên, Tx. Phú Mỹ) [N10035’49,4” E10707’0,2”] ± 10 m Ghi chú: *: Tọa độ vị trí thu thập được xác định bằng App GPS Map + trên Window phone; **: giống du nhập. Bảng 2. Danh sách 10 đoạn mồi RAPD được sử dụng trong phản ứng PCR STT Tên mồi Trình tự (5’-3’) STT Tên mồi Trình tự (5’-3’) 1 OPA02 TGCCGAGCTG 6 OPB08 GTCCACACGG 2 OPA11 CAATCGCCGT 7 OPB10 CTGCTGGGAC 3 OPB01 GTTTCGCTCC 8 OPB12 CCTTGACGCA 4 OPB05 TGCGCCCTTC 9 OPB15 GGAGGGTGTT 5 OPB07 GGTGACGCAG 10 OPB17 AGGGAACGAG 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 3/2018 đến tháng 10/2018 tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học của Trung tâm Nghiên cứu Cây ăn quả miền Đông Nam bộ và phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả ly trích DNA cho thấy tất cả 40 mẫu DNA đều có độ tinh sạch cao đủ điều kiện cho phản ứng PCR. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% của 40 mẫu mãng cầu ta với 10 đoạn mồi RAPD cho thấy có tổng số 2308 alen được khuếch đại với sự đa hình rất cao, số alen trung bình của mỗi chỉ thị RAPD là 230,8. Chỉ thị OPA02 khuếch đại được số alen cao nhất là 291 alen và chỉ thị OPB10 cho số alen ít nhất là 136. Số alen ở từng mẫu qua 10 chỉ thị RAPD cũng có sự khác nhau đáng kể (Bảng 3). Tính đa hình của các chỉ thị RAPD còn được đánh giá thông qua giá trị lượng thông tin đa hình (PIC). Giá trị PIC của từng chỉ thị phụ thuộc vào số lượng alen được phát hiện ở vị trí locus đó và tần số của các alen. Giá trị PIC càng lớn thì lượng thông tin đa hình mà chỉ thị đó cung cấp càng nhiều và ngược lại. Trong tổng số 40 mẫu mãng cầu ta thực hiện phản ứng PCR với 10 chỉ thị RAPD cho thấy giá trị PIC biến thiên từ 0,727 - 0,982, cao nhất ở chỉ thị OPA11 và thấp nhất là chỉ thị OPB07, giá trị PIC trung bình là 0,838 (Bảng 3). 24 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 Bảng 3. Sự đa hình của 10 đoạn mồi RAPD trên 40 mẫu mãng cầu ta tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu thông qua số alen và giá trị PIC STT Mồi Số alen PIC 1 OPA02 291 0,874 2 OPA11 185 0,982 3 OPB01 280 0,835 4 OPB05 290 0,878 5 OPB07 226 0,727 6 OPB08 239 0,833 7 OPB10 136 0,841 8 OPB12 280 0,799 9 OPB15 228 0,749 10 OPB17 153 0,860 Trung bình 230,8 0,838 Mối quan hệ di truyền của 40 cá thể mãng cầu ta nghiên cứu được thể hiện thông qua hệ số tương đồng di truyền và sơ đồ quan hệ di truyền ở Hình 1. Kết quả cho thấy hệ số tương đồng di truyền của 40 cá thể mãng cầu ta nghiên cứu dao động từ 0,76 đến 1 và được thành 2 nhóm chính như sau: Nhóm I có mối quan hệ gần về mặt di truyền với hệ số tương đồng dao động từ 0,85 đến 1 và có thể chia nhóm này thành 2 nhóm phụ gồm nhóm I.1 có 37 cá thể là BRVT01, BRVT02, BRVT03, BRVT04, BRVT05, BRVT06, BRVT07, BRVT08, BRVT09, BRVT40, BRVT10, BRVT39, BRVT11, BRVT34, BRVT35, BRVT36, BRVT37, BRVT38, BRVT22, BRVT24, BRVT23, BRVT25, BRVT26, BRVT27, BRVT28, BRVT12, BRVT17, BRVT18, BRVT13, BRVT14, BRVT15, BRVT16, BRVT29, BRVT19, BRVT20, BRVT21 và BRVT33. Trong nhóm này 5 cá thể BRVT03, BRVT04, BRVT05, BRVT06 và BRVT07 có quan hệ chặt về mặt di truyền với hệ số tương đồng di truyền là 1; Tương tự các cá thể BRVT08, BRVT09 và BRVT34, BRVT35 cũng có mối quan di truyền chặt (hệ số tương đồng bằng 1). Nguyên nhân có thể là do các cây này được nhân từ cùng nguồn gốc nên có nền di truyền hoàn toàn giống nhau. Nhóm I.2 có 2 cá thể là BRVT30 và BRVT31, hai cá thể này có mối quan hệ rất gần nhau về mặt di truyền với hệ số tương đồng đạt 0,91. Nhóm II gồm 1 cá thể là BRVT32 có mối quan hệ di truyền với nhóm I ở mức hệ số tương đồng di truyền là 0,76. Do đó, chỉ thị RAPD với 10 đoạn mồi như Bảng 2 có thể phân nhóm được các cá thể có nguồn gốc địa phương (nhóm I) và cá thể du nhập (nhóm II) cũng như phản ánh được sự đa dạng di truyền giữa các cá thể địa phương. Ngoài ra, BRVT32 và BRVT33 là hai cá thể du nhập, tuy nhiên từ kết quả phân tích đa dạng di truyền được trình bày trong hình 1 hai cá thể này lại thuộc hai nhóm khác nhau, nguyên nhân có thể là do hai cá thể này được nhân giống từ hai nguồn có nền di truyền khác xa nhau. Bên cạnh đó, cá thể BRVT33 lại thuộc nhóm I (nhóm có nguồn gốc địa phương), có thể nguồn gốc của cá thể này có nền di truyền tương tự với nền di truyền của các cá thể địa phương và mặc dù thuộc nhóm I nhưng cá thể BRVT33 được tách thành 1 nhánh riêng với hệ số tương đồng di truyền đạt 0,86 so với các cá thể mãng cầu ta địa phương. Hình 1. Kết quả phân nhóm di truyền của 40 cá thể mãng cầu ta dựa trên hệ số tương đồng di truyền (coefficient) của 10 đoạn mồi RAPD 25 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen mãng cầu dựa vào chỉ thị phân tử RAPD đã được nhiều nghiên cứu sử dụng. Bharad và cộng tác viên (2009), đã sử dụng 26 chỉ thị phân tử RAPD để đánh giá đa dạng di truyền 11 mẫu thuộc chi Annona gồm AKCa01, AKCa02, AKCa03, AKCa04, AKCa05, AKCa06, AKCa07, AKCa08, AKCa09, AKCa10 và Balanagar thu thập tại Ấn Độ, kết quả có 19 chỉ thị phân tử RAPD là đa hình và 3 mẫu AKCa05, AKCa07 và AKCa10 là hoàn toàn khác nhau về kiểu gen, 8 kiểu gen còn lại là tương tự nhau. Kết quả nghiên cứu của Ahmad và cộng tác viên (2010), cho thấy trong tổng số 20 chỉ thị RAPD sử dụng có 14 chỉ thị khuếch đại được DNA với 48 băng, trong đó có 25 băng đa hình (52%) trong tổng số 17 kiểu gen thu thập và được chia thành 2 nhóm chính với các mức độ di truyền khác nhau. Tương tự, từ 20 kiểu gen thu thập thuộc chi Annona, Anugari và cộng tác viên (2016), sử dụng 11 chỉ thị RAPD sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền cho kết quả có 152 băng được khuếch đại (80,01% đa hình), hệ số tương đồng di truyền từ 0,44 đến 0,92 và phân thành 7 nhóm, giá trị PIC biến động từ 0,86 đến 0,92. Như vậy, kết quả phân tích đa dạng di truyền 40 cá thể mãng cầu ta trong nghiên cứu này cũng phù hợp với nghiên cứu của Bharad và cộng tác viên (2009), Ahmad và cộng tác viên (2010), Anugari và cộng tác viên (2016). IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Kết quả nghiên cứu thể hiện mức độ đa dạng di truyền của 40 cá thể thu thập tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu với hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,76 - 1 và phân thành hai nhóm chính, đồng thời cho thấy sự khác biệt giữa nhóm mãng cầu địa phương và mãng cầu ta du nhập. Dù sự khác biệt không lớn nhưng có thể ứng dụng khác biệt này trong các chương trình chọn tạo giống. 4.2. Đề nghị Ứng dụng kết quả nghiên cứu này làm cơ sở cho chương trình chọn tạo giống mãng cầu mới theo các mục đích khác nhau. TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Đức Thành, 2014. Các kỹ thuật chỉ thị DNA trong nghiên cứu và chọn lọc thực vật. Tạp chí Sinh học, 36(3): 265-294. Nguyễn Tuấn Vũ, Lê Thị Huyền, Phạm Thị Mười, Đỗ Văn Thịnh, Huỳnh Kỳ và Mai Văn Trị, 2018. Kết quả điều tra, thu thập và bảo tồn nguồn gen cây mãng cầu ta tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu. Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 4(89): 92-98. Ahmad I., S. Bhagat, T.V.R.S. Sharma, K. Kumar, P. Simachalam and R.C. Srivastava, 2010. ISSR and RAPD marker based DNA fingerprinting and diversity assessment of Annona spp. in South Andamans. Indian Journal of Horticulture, (67): 147-151. Anugari, H., H.L. Dhaduk, S. Kumar, J.J. Dhruve, M.J. Parekh and A.A. Sakure, 2016. Molecular diversity of Annona species and proximate fruit composition of selected genotypes. Biotech., (6): 204-214. Bharad S.G., P.L. Kulwal and S.A. Bagal, 2009. Genetic diversity study in Annona squamosa by morphological, biochemical and RAPD markers. Acta Hort., (839): 615-623. Doyle J.J. and J.L. Doyle, 1990. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf material. Phytochemical Bulletin, (19): 11-15. Guimarães J.F.R., S. Nietsche, M.R. Costa, G.B.R. Moreira, M.C.T. Pereira and W. Vendrame, 2013. Genetic diversity in sugar apple (Annona squamosa L.) by using RAPD markers. Revista Ceres, 60(3): 428-431. Nei M. and W.H. Li, 1979. Mathematical models for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (76): 5269-5273. Ronning C.M., R.J. Schnell and S. Gazit, 1995. Using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers to identify Annona cultivars. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 120(5): 726-729. Sneath P.H. and R.R. Sokal, 1973. Numerical taxonomy - The principles and practice of numerical classification. W.H. Freeman and Company, San Francisco, USA. Evaluation of genetic diversity of sugar apple in Ba Ria - Vung Tau province by RAPD markers Do Van Thinh, Pham Thi Muoi, Truong Quoc Anh, Bui Thi Xuan, Nguyen Dac Thanh, Luong The Minh, Chung Anh Dung, Mai Van Tri Abstract Study on the genetic diversity of sugar apple in Ba Ria - Vung Tau province was carried out from March - October, 2018 by using RAPD markers. Leaf samples of 40 selected sugar apple genotypes were collected for DNA extraction and DNA extracts were amplified by 10 RAPD primers. The results showed that these selected sugar apple genotypes were divided into two main groups with the genetic similarity coefficient from 0.76 to 1. The first group consisted of