Đánh giá hiệu quả hạ men gan của cao chiết nước tiểu sài hồ thang trên chuột nhắt trắng tổn thương gan bằng Ethanol

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 85 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ HẠ MEN GAN CỦA CAO CHIẾT NƯỚC TIỂU SÀI HỒ THANG TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG TỔN THƯƠNG GAN BẰNG ETHANOL Nguyễn Lê Việt Hùng* TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu được thực hiện để đánh giá hiệu quả hạ men gan của cao chiết nước (TSH-N) Tiểu Sài hồ thang trên chuột nhắt trắng bị tổn thương gan bằng ethanol, nhằm đánh giá hiệu quả và tính an toàn của bài thuốc, tiến tới mục đích bổ sung vào danh mục các thuốc hạ men gan có nguồn gốc thảo dược. Đối tượngvà phương pháp: Nghiên cứu thực nghiệm gồm 80 chuột nhắt trắng, chủng Swiss albino, trọng lượng 20 ± 2 g, được khảo sát nồng độ aspartate amino transferase (AST), alanine amino transferase (ALT), gamma glutamyl transpeptidase (GGT), số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, Hb, Hct, vi thể gan thận chuột trước và sau khi uống ethanol . Kết quả: TSH-N1 (4,3 g/kg) (1/4 Dmax) làm AST giảm 23,63% (p<0,01), ALT giảm 19,96% (p<0,05), GGT giảm 28,03% (p<0,05) trên chuột nhắt trắng bị gây độc bằng ethanol 40% (5 g/kg), có tác dụng hạ AST, ALT, GGT, tương đương silymarin (50 mg/kg, uống). Trên mô học, TSH-N1 đã cải thiện tình trạng hoại tử và thoái hóa mỡ của tế bào gan so với lô đối chứng và cũng tương tự silymarin. Dmax TSH-N = 17,2 g/kg. Kết luận: Cao chiết nước Tiểu Sài hồ thang (4,3 g/kg) có tác dụng hạ ALT, AST, GGT trên chuột nhắt trắng bị tổn thương gan bởi ethanol, đồng thời khá an toàn khi uống liên tục 2 tháng. Từ khóa: hạ men gan, ALT, AST, GGT, cao chiết nước Tiểu Sài hồ thang (TSH-N), silymarin, ethanol. ABSTRACT EFFCACY IMPROVEMENT ON TRASAMINASE ENZYMES OF THE WATER EXTRACT OF SHO-SAIKO-TO IN ETHANOL-INDUCED HEPATOTOXICITY MICE Nguyen Le Viet Hung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - *Supplement of No 1-2014: 85 - 90 Aims: This study is aimed to evaluate the efficacy improvement on transaminase of water extracts of Sho- saiko-to (SST) on ethanol-induced hepatotoxicity in mice. Study design and setting: Comparative experimental study, randomly selected, performed in the laboratory of Department of Traditional Medicine, Ho Chi Minh University of Medicine and Pharmacy, from 7/2012 to 12/2012 to assess efficacy improvement on transaminase enzymes of water extracts of Sho-saiko-to on 90 ethanol-induced hepatotoxicity micel. Results: The dose of 4.3 g/kg SST (1/4 Dmax) reduced in AST level by 23.63% (p<0.01), ALT level by 19.96% (p<0.05), GGT level by 28.03% (p<0.05) compared to silymarin (50 mg/kg). SST did not express acute toxicity in mice at the dose of 17.2 g powder/kg. In histopathological study, SST1 group showed improvement of liver cells against necrosis state and fatty degeneration, in comparison with control group, and similar with silymarin group. Conclusion: The results showed that SST has promising reducing-level of ALT, AST, GGT enzymes effects ∗ Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Lê Việt Hùng ĐT: 0909452324 Email: nguyenleviethung@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 86 in ethanol-induced mice, and quite safety after treatment for 2 months. Key words: lower liver enzymes, ALT, AST, GGT, water extracts Sho-saiko-to, silymarin, ethanol. MỞ ĐẦU Tiểu Sài hồ thang là một trong những bài thuốc thảo dược phương Đông được sử dụng rộng rãi từ lâu tại nhiều quốc gia như Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam...để điều trị các bệnh lý về Can Đởm(8,9,12). Theo quan điểm y học cổ truyền. Các nghiên cứu gần đây cho thấy bài thuốc Tiểu Sài hồ thang có tác dụng chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch, ức chế viêm gan siêu vi B, C mạn...(4,2,3,7,5, 13). Y học cổ truyền thường sử dụng bài thuốc bằng cách sắc với nước. Để có cơ sở nghiên cứu trên lâm sàng đánh giá tác dụng bảo vệ gan của bài thuốc, trong khuôn khổ nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát hiệu quả hạ men gan của cao chiết nước Tiểu Sài hồ thang trên chuột nhắt trắng bị tổn thương gan bởi ethanol và khảo sát độc tính cấp của bài thuốc. PHƯƠNG TIỆN – PHƯƠNG PHÁP Phương tiện Nguyên liệu Dược liệu được cung cấp bởi khoa Đông Dược – Cơ sở 3 – Bệnh viện Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh, đạt yêu cầu Dược điển Việt Nam IV (Bảng 1). Bảng 1. Thành phần dược liệu trong bài thuốc Tiểu Sài hồ thang (12) Dược liệu Khối lượng (g) Sài hồ - Radix Bupleuri 16 g Hoàng cầm - Radix Scutellariae 12 g Nhân sâm - Radix Ginseng 12 g Sinh khương - Rhizoma Zingiberis 12 g Bán hạ - Rhizoma Pinelliae 12 g Đại táo - Fructus Ziziphi 12 g Cam thảo - Radix Glycyrrhizae 08 g Súc vật: Chuột nhắt trắng, phái đực, chủng Swiss albino, trưởng thành, khỏe mạnh, trọng lượng 20 ± 2 g, mua tại Viện Pasteur TP.HCM, nuôi trong điều kiện ổn định về chế độ dinh dưỡng. Hóa chất: Ethanol 40%, Silymarin (chai 10 g – Sigma). Phương pháp Phương pháp bào chế cao chiết nước Tiểu Sài hồ thang (TSH-N) Sơ chế dược liệu, sắc với nước 2 lần, tập hợp dịch chiết, cô trực tiếp đến dạng cao lỏng, tiếp tục cô cách thủy và sấy ở 60 oC để thu được cao TSH-N. Thử nghiệm độc tính cấp (1) Trước khi tiến hành thí nghiệm 14 giờ, không cho chuột ăn, chỉ uống nước tự do. Chia chuột nhắt làm 5 lô, mỗi lô 10 chuột. Dùng kim đầu tù để cho chuột uống. Mỗi chuột uống 0,5 ml/10g thể trọng với các nồng độ thuốc thử nghiệm khác nhau. Theo dõi tỉ lệ chuột chết trong 48 giờ sau khi uống thuốc. Xác định liều thấp nhất không làm chết chuột và liều làm chết 100% chuột. Tính LD50 theo công thức Karber - Behrens. Phương pháp thử nghiệm tác dụng hạ men gan trên chuột nhắt trắng bị gây độc gan bằng ethanol 40% (11). Chia ngẫu nhiên chuột nhắt thử nghiệm làm 5 lô, mỗi lô 6 con chuột, cho ăn như nhau. Chuột thử nghiệm nuôi ổn định trước 1 tuần, chia chuột làm 5 nhóm (n=6). Nhóm 1 (BT): Nhóm chứng, chuột được cho uống nước cất. Nhóm 2 (BL): Gây độc bằng ethanol, uống ethanol 40% liều 5 g/kg x 3 lần mỗi 12h (7h sáng, 7h tối, 7h sáng) bằng đường uống (p.o.). Nhóm 3 (SILY): Nhóm đối chiếu, uống silymarin 50 mg/kg. Sau đó gây độc bằng ethanol giống như nhóm gây độc. Nhóm 4 (TSH-N1): nhóm thử 1, uống cao nước Tiểu sài hồ thang 2 tuần, mỗi ngày một lần vào 8 – 9h sáng, liều 4,3 g/kg. Sau đó gây độc bằng ethanol giống như nhóm gây độc. Nhóm 5 (TSH-N2): Nhóm thử 2, uống cao nước Tiểu sài hồ thang 2 tuần, mỗi ngày một lần Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 87 vào 8 – 9h sáng, liều 8,6 g/kg. Sau đó gây độc bằng ethanol giống như nhóm gây độc. 4 giờ sau khi gây ngộ độc bằng ethanol, uống liều cuối cùng, chuột được gây mê và tiến hành giải phẫu lấy máu tĩnh mạch và gan, thực hiện các xét nghiệm xác định AST, ALT, GGT, sinh thiết gan. Ngay sau khi bóc tách gan, cần lấy những miếng nhỏ của mỗi thùy gan, cố định trong dung dịch đệm formalin 10%. Sau khi xử lý bằng các phương pháp thường quy, đúc tiêu bản bằng parafin, rồi cắt những lát gan dày 4µm và nhuộm trong hematoxylin eosin. Quan sát trên kính hiển vi. Phương pháp xử lý thống kê số liệu thực nghiệm Số liệu thực nghiệm thể hiện bằng số trung bình (M) ± độ lệch chuẩn (SD). Xử lý số liệu bằng phần mềm MS Excel 2007, so sánh 2 số trung bình độc lập hoặc phụ thuộc bằng phép kiểm t - student, so sánh các số trung bình ANOVA 1 yếu tố, p<0,05, p<0,01, p<0,001 được xem là sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. KẾT QUẢ Độc tính cấp của cao TSH-N Ở liều cao nhất (17,2 g/kg) có thể đưa trực tiếp qua kim đầu tù vào dạ dày chuột, cao TSH- N không gây chết súc vật thử nghiệm. Ngoài ra, tất cả chuột trong thử nghiệm trên đều không xuất hiện triệu chứng bất thường trong 24 giờ sau khi uống thuốc cũng như liên tục trong 14 ngày sau đó. Sau 14 ngày, mổ chuột ra thấy đại thể gan thận của lô chuột uống cao TSH-N cũng không khác biệt so với lô chuột uống nước cất. Vì thế, chúng tôi chọn Dmax của cao TSH-N là 17,2 g/kg để làm cơ sở tính liều cho các thử nghiệm dược lý tiếp theo (6). Tác dụng bảo vệ gan của cao chiết nước Tiểu Sài hồ thang (TSH-N) trên chuột nhắt trắng Kết quả thực nghiệm cho thấy: TSH-N1 với liều uống 4,3 g/kg thể hiện tác dụng hạ men gan AST, ALT, GGT ở chuột gây độc gan bằng ethanol 40% 5g/kg, đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý (p < 0,05) và gần tương đương với silymarin (50 mg/kg, uống). Biểu đồ 1. Nồng độ ALT (U/L) của chuột nhắt sau thử nghiệm. ** : khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô BT (p<0,01). # : khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô BL (p<0,05). ## : khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô BL (p<0,01) Biểu đồ 2. Nồng độ AST (U/L) của chuột nhắt sau thử nghiệm.**: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô BT (p<0,01). ***: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô BT (p<0,001). ## : khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô BL (p < 0,01). ###: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô BT (p<0,001) U/L ## * # TSH-N1 TSH-N2 *** **### **## **## TSH-N1 TSH-N2 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 88 Biểu đồ 3. Nồng độ GGT (U/L) của chuột nhắt sau thử nghiệm. *: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô BT (p<0,05). #: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô BT (p<0,05). ## : khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô BL (p < 0,01) Nhận xét: Cao nước TSH-N1 (4,3 g/kg) có tác dụng hạ ALT, AST, GGT tốt hơn cao nước TSH- N2 (8,6 g/kg) trong mô hình tăng men gan bằng ethanol 40% liều 5 g/kg x 3 lần mỗi 12h (7h, 19h, 7h) bằng đường uống (p.o.). Đặc điểm vi thể gan, thận của chuột nhắt sau thử nghiệm Hình ảnh vi thể gan của lô chuột uống TSH- N1 chủ yếu là mô gan phản ứng giảm glycogen (66,67%) tương đương với lô uống silymarin (66,67%), biểu hiện tình trạng tổn thương gan ở mức độ nhẹ (Hình 1) có khả năng hồi phục cao. Còn ở lô chuột uống TSH-N2, số chuột đa số gan thoái hóa mỡ (50%). Đặc điểm vi thể thận chuột nhắt sau thử nghiệm ở tất cả các nhóm biểu hiện bình thường. Kết quả thu được từ thực nghiệm của chúng tôi cũng tương tự như Dược điển Nhật Bản và nghiên cứu của nhóm Tzu Hsiang Lin (2007).(10,5) A B C D E Hình 1: Đặc điểm vi thể gan chuột nhắt trắng sau thử nghiệm A. lô BT, B: lô BL (ethanol 40% 5 g/kg), C: lô SILY (silymarin 50 mg/kg), D: lô TSH- N1 4,3 g/kg, E: lô TSH-N2 8,6 g/kg. * # ## # TSH-N1 TSH-N2 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 89 A B C D E Hình 2. Đặc điểm vi thể thận chuột sau thử nghiệm (nhuộm HE, x 40) A. lô BT, B: lô BL (ethanol 40% 5 g/kg), C: lô SILY (silymarin 50 mg/kg), D: lô TSH-N1 4,3 g/kg, E: lô TSH-N2 8,6 g/kg. . KẾT LUẬN Đã xác định Dmax của cao nước Tiểu Sài hồ thang đường uống trên chuột nhắt trắng là 17,2 g/kg. Cao chiết nước Tiểu Sài hồ thang TSH-N1 (uống liều 4,3 g/kg) làm giảm 19,96% ALT, 23,63% AST, 28,03% GGT so với lô bệnh lý và tương đồng với silymarin (uống 50 mg/kg). Đặc điểm vi thể gan chuột ở lô TSH-N1 cũng tương tự như lô silymarin, có hiện tượng giảm glycogen, tình trạng tổn thương gan ở mức độ nhẹ và có khả năng hồi phục cao. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đỗ Trung Đàm (1996). Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc. NXB Y học Hà Nội, tr. 165. 2. Kakumu S, Yoshioka K, Wakita T and Ishikawa T (1991). "Effects of TJ-9 sho-saiko-to (kampo medicine) on interferon gamma and antibody production specific for hepatitis B virus antigen in patients with type B chronic hepatitis". Int. J. Immunopharmacol., 13, pp. 141–146. 3. Kayano K, Sakaida I , Uchida K and Okita K (1998). "Inhibitory effects of the herbal medicine sho-saiko-to (TJ-9) on cell proliferation and procollagen gene expressions in cultured rat hepatic stellate cells.". J. Hepatol 29, pp. 642 – 649. 4. Lin CC, Lin LT, Yen MH, Cheng JT, Chung-Hsi Hsing, Ching- Hua Yeh (2012). "Renal Protective Effect of Xiao-Chai-Hu-Tang on Diabetic Nephropathy of Type 1-Diabetic Mice". Evid Based Complement Alternat Med, pp. 11. 5. Lin TH et al. (2007)."Hepatoprotective effects of Chai-Hu-Ching- Kan-Tang on Acetaminophen-Induced Acute Liver Injury in Rats". The American Journal of Chinese Medicine, 35(1), pp. 69 - 79. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 90 6. Nguyễn Lê Việt Hùng, Nguyễn Phương Dung, Trần Công Luận (2013). “Đánh giá tác dụng hạ men gan của cao chiết nước Tiểu Sài hồ thang trên mô hình tổn thương gan bằng paracetamol”. Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 17(2), tr. 374 - 379. 7. Nishiura T, Marukawa S, Ishida H, Machiko Orita, Hiroko Abe (1994). "Effects of saikosaponins on hepatic damage induced by halothane and hypoxia in phenobarbital- pretreated rats". Journal of Anesthesia, 8(1), pp. 87 - 92. 8. Ogihara Y, Aburada M (2004). Sho-Saiko-To Scientific Evaluation and Clinical Applications. Taylor & Francis Group, London and New York, pp. 240. 9. Oyo Y (1987). Pharmacometrics (Vol. 33). Sendai, Japan, pp. 793. 10. Society of Japanese Pharmacopoeia (2011). The Japanese Pharmacopoeia (16th ed.). Yakuji Nippo Ltd, pp. 1756 - 1758. 11. Song Z, Deaciuc I, Song M, Lee DYW, Liu Y, Ji X, McClain C. (2006). "Silymarin protects against acute ethanol-induced hepatotoxicity in mice". Clinical and Experimental Research., 30(3), pp. 407 - 413. 12. Trương Trọng Cảnh (1996). Thương hàn luận. NXB Đồng nai, tr. 43, 154 – 156. 13. Yamashiki M, Nishimura A, Suzuki H, Sakaguchi S and Kosaka Y (1997). "Effects of the Japanese herbal medicine “sho-saiko-to” (TJ-9) on in vitro interleukin-10 production by peripheral blood mononuclear cells of patients with chronic hepatitis C". Hepatology, 25, pp.1390 - 1397. Ngày nhận bài báo: 28/09/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 08/10/2013, 20/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 02/01/2014