Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất

Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1Đặt vấn đề Vi nấm (Fungi) và độc tố vi nấm (Mycotoxin) là vấn đề rất quan trọng trong công tác bảo quản nông sản, thực phẩm và trong y tế. Gần 400 độc tố vi nấm được phát hiện cho đến nay [18], trong đó, aflatoxin là độc tố được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. Aflatoxin là tên gọi một nhóm chất độc, sản phẩm của quá trình trao đổi chất của một số loài nấm mà chủ yếu là loài Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus . Trong đó, phổ biến nhất và độc nhất là aflatoxin B1, G1, B2 và G2, có thể gây bệnh ở mức vi lượng. Đối với động vật nuôi (gà, vịt, lợn ), aflatoxin gây bệnh nhiễm độc Aflatoxicosis, rất phổ biến, đặc biệt các nước nhiệt đới. Bệnh làm vật nuôi kém phát triển, sức sản xuất giảm, dễ mẫn cảm với các bệnh truyền nhiễm, bị ung thư và thậm chí bị chết. Do đó, hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi bị ảnh hưởng nghiêm trọng, chịu nhiều tổn thất lớn. Đối với người, đáng chú ý là khả năng gây ung thư gan và dị tật thai do aflatoxin nhiễm từ sữa mẹ truyền cho con. Aflatoxin có ảnh hưởng nghiêm trọng như vậy nhưng lại rất khó để loại bỏ vì aflatoxin hiện diện ở khắp nơi trong môi trường lại khó bị phân huỷ bởi nhiệt. Do vậy, việc nghiên cứu tìm ra các phương pháp phân tích tối ưu nhằm phát hiện aflatoxin trong thực phẩm và nguyên liệu thực phẩm là điều cần thiết. Quy trình phân tích aflatoxin thường phải qua nhiều giai đoạn chiết xuất, làm sạch, cô đặc, cùng với việc định tính và định lượng aflatoxin bằng các phương pháp như: sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng (TLC), sắc kí lỏng cao áp (HPLC) dễ bị sai số do phải qua nhiều thao tác, tăng thất thoát trong các công đoạn. Trước những khó khăn trên, sắc kí ái lực miễn dịch (immuno-affinity chromatography-IAC) ra đời, sử dụng trong công đoạn tinh sạch và cô đặc mẫu đồng thời, dựa trên nguyên lí gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, tạo khả năng chọn lọc cao mà các phương pháp khác không có được; quy trình chiết và tinh chế aflatoxin của phương pháp IAC lại đơn giản đã đáp ứng được nhu cầu về độ tin cậy cao trong các kết quả phân tích. Trong số các aflatoxin, aflatoxin B1 được chú ý nhiều nhất do sự hiện diện rộng khắp nhất cũng như do tính độc ngắn hạn và dài hạn của aflatoxin B1 cao hơn nhiều so với các aflatoxin khác. Từ những cơ sở trên, viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh đã tiến hành thực hiện đề tài Sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt aflatoxin B1. Giá (cột) sắc kí ái lực tạo nên đã cho hiệu quả cao trong phân tích định lượng aflatoxin B1. Bên cạnh đó, aflatoxin G1 là độc tố vi nấm chỉ đứng sau aflatoxin B1 về độc tính, cũng có khả năng gây hại cao cho người và vật nuôi, hơn nữa cấu trúc hoá học lại khá tương đồng với aflatoxin B1 nên cũng là một đối tượng quan trọng cần tiến hành nghiên cứu. Được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, sự hướng dẫn của PGS. TSKH Nguyễn Lê Trang - Viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh và TS. Nguyễn Ngọc Hải, tôi tiến hành đề tài “Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất”. MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm tắt .iv Abstract .v Mục lục vi Danh sách các chữ viết tắt .ix Danh sách các hình v Danh sách các bảng .vi Danh sách các biểu đồ .vi 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề 01 1.2 Mục đích 02 1.3 Yêu cầu 02 2. TỔNG QUAN 2.1 Đại cương về aflatoxin .03 2.1.1 Lịch sử phát hiện .03 2.1.2 Phân loại .04 2.1.3 Tính chất hoá lí .05 2.1.4 Tác động sinh học .05 2.1.4.1 Độc tính cấp 07 2.1.4.2 Độc tính mãn .08 2.1.5 Sự hiện diện trong thực phẩm .10 2.1.6 Giới hạn về hàm lượng trong thực phẩm và thức ăn gia súc .10 2.2 Các phương pháp phân tích aflatoxin 12 2.2.1 Phương pháp sinh học 12 2.2.2 Phương pháp phân tích hoá lí .12 2.2.2.1 Lấy mẫu .13 2.2.2.2 Chiết aflatoxin 13 2.2.2.3 Làm sạch mẫu .14 2.2.2.4 Cô đặc mẫu 14 2.2.2.5 Phát hiện và xác định hàm lượng .14 2.2.3 Phương pháp miễn dịch học 16 2.3 Sắc kí ái lực miễn dịch (IAC – ImmunoAffinity Chromatography) .17 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 Thời gian và địa điểm .20 3.1.1 Thời gian 20 3.1.2 Địa điểm .20 3.2 Vật liệu 20 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu .20 3.2.2 Hóa chất 20 3.2.3 Dụng cụ .20 3.2.4 Thiết bị 21 3.3 Phương pháp nghiên cứu 21 3.3.1 Các phương pháp phục vụ cho nghiên cứu 21 3.3.1.1 Quy trình tạo giá ái lực miễn dịch .21 3.3.1.2 Phương pháp quang phổ kế để xác định nồng độ AFG1 23 3.3.1.3 Quy trình chiết xuất, cô đặc và tinh chế AFG1 với cột IAC 3.3.1.4 Phương pháp dùng huỳnh quang kế đo lường lượng AFT 3.3.2 Xây dựng đường chuẩn cho AFG1 bằng huỳnh quang kế .26 3.3.3 Khảo sát các chỉ tiêu 27 3.3.3.1 Độ nhạy của cột 27 3.3.3.2 Độ lặp lại của cột 28 3.4 Phương pháp xử lí số liệu .28 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Cột IAC 2,5 do Viện Pasteur Tp. HCM sản xuất 29 4.2 Nồng độ dung dịch AFG1 chuẩn xác định bằng quang phổ kế .29 4.3 Đường chuẩn AFG1 dựa trên huỳnh quang kế 29 4.4 Độ nhạy của cột .30 4.5 Độ lặp lại của cột .31 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận .34 5.2 Đề nghị 34 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .35 Phụ lục “Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất”