Đánh giá khả năng phân loại của vùng gen ITS-RDNA đối với loài Hoàng liên ô rô lá dày (Mahonia bealei (Fortune) Pynaert)

1262(12) 12.2020 Khoa học Y - Dược Mở đầu Hoàng liên ô rô lá dày hay còn gọi là hoàng mộc, hoàng liên ô rô, hoàng bá gai, mật gấu là loài cây bụi thường xanh, cao 2-3 m, thuộc chi Mã hồ (Mahonia Nutt., 1818), họ Hoàng liên gai (Berberidaceae) đã được Fortune Robert mô tả và công bố vào năm 1850 với tên khoa học là Berberis bealei Fortune, 1850. Đến năm 1875, Pynaert Edouard- Christophe đã xác định lại loài này thuộc chi Mahonia và đặt lại tên khoa học là M. bealei (Fortune) Pynaert. Đến nay, họ Hoàng liên gai được xác định có 17 chi và gần 650 loài [1]. Các nghiên cứu về phân bố cho thấy, các loài thuộc họ Hoàng liên gai chủ yếu phân bố ở khu vực ôn đới phía bắc và vùng núi á nhiệt đới. Theo Bùi Văn Hướng và cs (2017) [2], Hoàng liên ô rô lá dày được ghi nhận ở Trung Quốc (An Huy, Phúc Kiến, Quảng Đông) và ở Việt Nam (Lào Cai, Hà Giang, Lai Châu). Hoàng liên ô rô lá dày có tính thanh nhiệt, nên có tác dụng thanh lọc và loại bỏ độc tố, được sử dụng làm thuốc điều trị các bệnh như tiêu chảy, kiết lỵ, vàng da, viêm loét dạ dày, áp xe, đau răng, viêm họng [3]. Trong tự nhiên, loài này phát triển ở những nơi có lượng mùn ít như dưới các tán rừng thưa, các trảng cây bụi hoặc sườn núi đá vôi, do vậy rất thích hợp để sử dụng trong công tác trồng rừng ở những khu vực nghèo dinh dưỡng hoặc địa hình hiểm trở (như ở các vách núi). Tuy nhiên hiện nay, loài này do bị khai thác và buôn bán quá mức nên đã bị suy giảm mạnh cả về số lượng và chất lượng. Sách đỏ Việt Nam 2007 xếp Hoàng liên ô rô lá dày ở mức nguy cấp (EN). Ở Việt Nam, chi Mahonia được biết đến với 3 loài gồm, Mahonia japonica, Mahonia bealei và Mahonia nepalensis, trong đó loài Mahonia bealei - Hoàng liên ô rô lá dày được coi là bị đe doạ ở mức độ cao nhất so với 2 loài còn lại do có số lượng cá thể của nó còn rất ít trong tự nhiên [4]. Đến nay, các nghiên cứu của Việt Nam về loài này chủ yếu chỉ tập trung vào mô tả hình thái, đặc điểm sinh học, Đánh giá khả năng phân loại của vùng gen ITS-rDNA đối với loài Hoàng liên ô rô lá dày (Mahonia bealei (Fortune) Pynaert) của Việt Nam Nguyễn Thị Phương Trang1*, Vũ Thị Huế2, Nguyễn Hùng Mạnh1, Bùi Văn Thanh1 1Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam 2Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Ngày nhận bài 28/8/2020; ngày chuyển phản biện 7/9/2020; ngày nhận phản biện 21/10/2020; ngày chấp nhận đăng 6/11/2020 Tóm tắt: Hoàng liên ô rô lá dày (Mahonia bealei (Fortune) Pynaert) là loài dược liệu quý có nhiều giá trị sử dụng và phạm vi phân bố hẹp, là một trong những vị thuốc được dùng nhiều trong y học cổ truyền. Trong tự nhiên, loài này trước đây khá phong phú nhưng do bị khai thác và buôn bán quá mức nên đã bị suy giảm mạnh cả về số lượng và chất lượng. Hoàng liên ô rô lá dày được Sách đỏ Việt Nam xếp ở mức nguy cấp (EN). Hiện nay, mã vạch DNA được xem là kỹ thuật phổ biến có tính chính xác cao trong xác định, nhận dạng loài bằng cách giải mã các đoạn DNA đặc trưng cho loài. Trong nghiên cứu này, các tác giả đã phân tích đặc điểm phân tử vùng gen ITS-rDNA và đánh giá khả năng phân loại của vùng gen này đối với loài Hoàng liên ô rô lá dày của Việt Nam. Kết quả cho thấy, vùng gen ITS dài 700 bp có chứa 24,1% Thymine, 28,4% Guanine, 23,4% Adenine và 24,1% Cytosine, là vùng gen phù hợp, có thể sử dụng như một mã vạch DNA để xác định loài Mahonia bealei và nghiên cứu mối quan hệ di truyền cho các loài thuộc họ Berberidaceae. Sự khác biệt di truyền trung bình giữa chi Mahonia và Berberis dựa trên phân tích trình tự gen ITS là 2,36%, trong khi với các chi khác là 17-22%. Cặp mồi đặc hiệu khuếch đại vùng gen ITS dài 300 bp loài M. bealei cũng đã được phát triển và tổng hợp, góp phần hữu ích cho công tác giám định và bảo tồn loài. Trình tự vùng gen ITS-300 của Hoàng liên ô rô lá dày cũng đã được gửi vào Ngân hàng gen thế giới (Genbank) với mã số truy cập là MT 008067. Từ khóa: bảo tồn nguồn gen, Hoàng liên ô rô lá dày, ITS, Mahonia bealei. Chỉ số phân loại: 3.4 *Tác giả liên hệ: Email: nptrang@gmail.com 1362(12) 12.2020 Khoa học Y - Dược sinh thái, phân bố, giá trị tài nguyên và các phương pháp nhân giống mà chưa hề có công trình nào nghiên cứu về đặc điểm phân tử, hệ thống học phân tử hay phát triển mồi khuếch đại vùng gen đặc hiệu phục vụ cho công tác giám định và bảo tồn loài. Mã vạch DNA (DNA barcoding) là kỹ thuật hiện đại, sử dụng đoạn DNA chứa thông tin đặc trưng cho loài để phân biệt [5, 6]. Chúng đã trở thành công cụ hiệu quả cho công tác phân loại loài, giám định mẫu vật, đánh giá mối quan hệ di truyền, phát hiện loài mới, quản lý nguồn gốc, xuất xứ, bản quyền của sản phẩm từ sinh vật [7]. Ở thực vật bậc cao, một số chỉ thị lục lạp (matK, rbcL, psbA-trnH, atpF-atpH) và gen nhân (ITS, 18S) đã và đang được sử dụng rộng rãi trong việc phân loại loài, nghiên cứu về mối quan hệ di truyền và nhận dạng loài hay xác định/lựa chọn cây giống trên cơ sở phân tích các trình tự nucleotide. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện giải mã trình tự nucleotide vùng gen ITS của loài Hoàng liên ô rô lá dày phân bố ở Việt Nam, với mục tiêu là tìm hiểu về đặc điểm phân tử cũng như đánh giá khả năng phân loại của vùng gen này, góp phần bổ sung cơ sở dữ liệu về di truyền cho loài; tiếp theo là phát triển cặp mồi đặc hiệu phục vụ cho công tác giám định, bảo tồn nguồn gen loài Hoàng liên ô rô lá dày của Việt Nam. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Vật liệu Hai mẫu lá loài Hoàng liên ô rô lá dày được nhóm nghiên cứu của Phòng Dân tộc học thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật thu tại Hà Giang năm 2018 (ký hiệu mẫu SM02) và thu tại Bát Xát (Lào Cai) năm 2011 (ký hiệu mẫu BLC03). Ngoài ra, 4 mẫu khác thuộc họ Berberidaceae gồm: - B. hypoxantha thu tại Sa Pa, Lào Cai năm 2016 (ký hiệu mẫu B1). - B. julianae thu tại Sa Pa, Lào Cai năm 2007 (SB01). - M. jingxiensis thu tại Hàm Yên, Tuyên Quang năm 2018 (C307). - M. klossii thu tại Đà Lạt, Lâm Đồng năm 2017 (DL02). 4 mẫu trên được sử dụng để làm mẫu đối chứng cũng như để xây dựng cây phát sinh chủng loại nhằm so sánh về khoảng cách di truyền với loài M. bealei thu tại Hà Giang và Lào Cai. Phương pháp nghiên cứu Tách chiết DNA tổng số: DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp của J.J. Doyle và J.L. Doyle (1990) [8] Assessment of classification ability of ITS-rDNA region on Mahonia bealei (Fortune) Pynaert in Vietnam Thi Phuong Trang Nguyen1*, Thi Hue Vu2, Hung Manh Nguyen1, Van Thanh Bui1 1Institute of Ecology and Biological Resources, VAST 2Hanoi National University of Education Received 28 August 2020; accepted 6 November 2020 Abstract: Mahonia bealei is a valuable medicinal plant with high economic value and a narrow range of distribution. It is one of the most widely used medicinal herbs in traditional medicine. In the past, this species was plentiful but due to over-exploitation and trading, it has sharply declined in both quantity and quality. At present, M. bealei is listed on Vietnam’s Red List at the endangered level (EN). DNA barcoding is considered a popular technique with high accuracy for species identification by sequencing of specific DNA fragments. In this research, the authors studied molecular characteristics of the ITS-rDNA region and assessed of classification ability of this DNA marker on M. bealei in Vietnam. The result showed that the ITS with 700 bp in length contained 24.1% Thymin, 28.4% Guanine, 23.4% Adenine, and 24.1% Cytosine. The average genetic difference between the Mahonia genus and Berberis genus is 2.36% while other genera are from 17 to 22%. The result also demonstrated this ITS-rDNA region might be suitable for identification for Mahonia bealei as well as studying the phylogenetic of Berberidaceae. Specific primer to amplify the ITS genome in the length of 300 bp of M. bealei species has also been developed and synthesised, usefully contributing to M. bealei identification and conservation. The ITS-300 sequence of M. bealei was registered on the Genbank with accession number MT 008067. Keywords: Berberidaceae, gene conservation, ITS, Mahonia bealei. Classification number: 3.4 1462(12) 12.2020 Khoa học Y - Dược (có hiệu chỉnh để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam). Nhân bản gen ITS bằng kỹ thuật PCR: vùng gen ITS dài 700 bp của cả 6 mẫu nghiên cứu được nhân bản bằng PCR với cặp mồi ITS1/ITS2 (5’-CCTTATCAYTTAGAG GAAGGAG-3’/5’-CCGCTTAKTGATATGCTTAAA-3’ [9]. Mỗi phản ứng PCR có thể tích 30 µl với các thành phần: 15 µl PCR Master mix kit (2X), 0,5 µl mồi xuôi (10 pmol/ µl), 0,5 µl mồi ngược (10 pmol/µl), 1 µl ADN (10-20 ng) và cuối cùng là 13 µl H 2 O deion. Phản ứng được thực hiện trên máy PCR model SimpliAmp của Hãng Applied Biosystems- Life Technologies-Thermo Fisher Scientic (Hoa Kỳ). Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với 35 chu kỳ gồm: biến tính DNA ở 94oC trong 3 phút; 94°C trong 45 giây, bắt cặp mồi ở 55oC trong 30 giây, kéo dài sợi DNA ở 72oC trong 30 giây; kết thúc phản ứng nhân gen ở 72oC trong 5 phút và giữ sản phẩm ở 15oC. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1%. Giải trình tự và xử lý số liệu: quá trình xác định trình tự nucleotide được thực hiện tại Công ty Firstbase (Malaysia). Trình tự DNA thu được sau đó được kiểm tra và ghép nối bằng phần mềm Chromas-Pro2.1.6 (Technelysium Pty Ltd, Úc). Trình tự nucleotide vùng gen ITS của mẫu Hoàng liên ô rô lá dày (SM02 và BLC03) sau khi ghép nối và loại bỏ phần nhiễu được đưa vào BLAST (NCBI) để so sánh với các trình tự sẵn có trên Genbank nhằm kiểm tra tính chính xác của vùng gen được khuếch đại. Các trình tự phân tích được sắp xếp thẳng hàng bằng phần mềm Bioedit v7.0.5.2 [10]. Các vùng nucleotide bị nhiễu hoặc không tương ứng với nhau sẽ bị loại bỏ trước khi tiến hành phân tích. Xây dựng cây phát sinh chủng loại: cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên phương pháp xác suất tối đa ML (Maximum Likelihood). Thực hiện với 1.000 lần lặp lại để xác định giá trị ủng hộ (bootstrap). Khoảng cách di truyền (P) giữa các loài trong chi được tính toán bằng phần mềm Mega 7.0 [11] theo mô hình Kimura hai tham số. Kết quả và thảo luận Kết quả tách chiết DNA tổng số DNA tổng số của 6 mẫu nghiên cứu sau khi tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% (hình 1). Kết quả điện di kiểm tra cho thấy, vạch DNA thu được rõ nét chứng tỏ DNA tổng số ít bị đứt gãy và tương đối sạch. Kết quả đo OD cũng cho thấy chỉ số OD 260 /OD 280 của các mẫu đều từ 1,81 đến 1,83, chứng tỏ hàm lượng DNA thu được có độ tinh khiết cao. Hình 1. Kết quả kiểm tra DNA tổng số 6 mẫu nghiên cứu trên gel agarose 1% (giếng số 1-6: thứ tự các mẫu lần lượt là SM02, BLC03, B1, SB01, C307, DL02). Kết quả nhân bản trình tự gen ITS bằng PCR Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy cả 6 mẫu đều xuất hiện 1 vạch rõ nét có kích thước khoảng 700 bp (hình 2), chứng tỏ cặp mồi ITS1/ITS2 đã nhân bản thành công ở nhiệt độ gắn mồi là 55°C cho cả 6 mẫu nghiên cứu. Sản phẩm PCR sáng đậm, rõ nét, đủ tiêu chuẩn để giải mã trình tự nucleotide trực tiếp. Hình 2. Sản phẩm PCR 6 mẫu nghiên cứu khi kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% (M: marker phân tử DNA 1 kb ladder; giếng 1-6: thứ tự các mẫu nghiên cứu lần lượt là SM02, BLC03, B1, SB01, C307, DL02). Kết quả phân tích trình tự gen ITS Kết quả kiểm tra tính tương đồng trình tự vùng gen ITS của mẫu Hoàng liên ô rô lá dày với các trình tự sẵn có trên Genbank cho thấy, trình tự vùng gen ITS của cả 2 mẫu M. bealei SM02 và BLC03 giống hệt nhau và đều cho kết quả tương đồng 100% với loài B. bealei mã số MG730545 (loài của Trung Quốc). Điều này chứng tỏ mẫu nghiên cứu là loài B. bealei và kết quả PCR đã nhân bản chính xác vùng gen ITS. Thông thường, kết quả BLAST không cho kết luận chính xác về loài, nhưng với những trường hợp BLAST có độ bao phủ và tương đồng cao (trên 98%) thì có thể đưa ra 1562(12) 12.2020 Khoa học Y - Dược gợi ý về những loài gần gũi với mẫu nghiên cứu. Kết quả so sánh vùng gen ITS của 4 mẫu nghiên cứu còn lại trên Genbank cũng đều cho thấy sự gần gũi với các loài trong chi Berberis, cụ thể mẫu DL02 (M. klossii) gần gũi 93% với loài B. bealei (mã số MG730545); C307 (M. jingxiensis) gần gũi 97% với loài B. dictyophylla (mã số X83829.1); SB01 (B. julianae) gần gũi 97,27% với loài B. hemsleyana (mã số KY 624390); và B1 (B. hypoxantha) gần gũi 97,89% với loài B. bealei (mã số MG730545). Điều đó cho thấy chúng tôi đã khuếch đại thành công vùng gen ITS cho tất cả 6 mẫu nghiên cứu. Kết quả kiểm tra trình tự nucleotide vùng gen ITS dài 700 bp của loài M. bealei cho thấy tỷ lệ phần trăm các nucleotide T, G, A và C lần lượt là 24,1, 28,4, 23,4 và 24,1%. Trong đó, có 59 vị trí biến đổi (variable) và 27 vị trí nucleotide có giá trị mang thông tin di truyền (Parsimony). Khoảng cách di truyền và vị trí phân loại của loài Hoàng liên ô rô lá dày Trình tự nucleotide vùng gen ITS của mẫu SM02 và BLC03 sau khi loại bỏ tất cả các vị trí trống thì được so sánh với 20 loài khác của họ Berberidaceae, trong đó có 17 loài lấy dữ liệu trên Genbank, gồm 16 loài họ Berberidaceae (7 loài thuộc chi Berberis, 1 loài thuộc Mahonia, 2 loài thuộc Epimedium, 2 loài thuộc Diphylleia, 2 loài thuộc Dysosma, 2 loài thuộc Podophyllum) và 1 loài Tinh diệp thảo (Circaeaster agrestis) được sử dụng là loài ngoài nhóm (bảng 1); 4 loài khác là các mẫu B1 (B. hypoxantha), SB01 (B. julianae), C307 (M. jingxiensis) và DL02 (M. klossii). Bảng 1. Danh sách 17 loài lấy dữ liệu từ Genbank dùng để so sánh với 6 mẫu nghiên cứu. TT Tên loài Mã số Genbank 1 B. hemsleyana MH258097.1 2 B. vulgaris KX268517.1 3 B. fortune MK524268 4 B. wallichiana KC575611.1 5 B. poiretii JF421477.1 6 B. julianae KM580586.1 7 M. jingxiensis KU221049.1 8 B. bealei MG730545.1 9 Epimedium baojingense MG837277.1 10 Epimedium dewuense MG837288.1 11 Diphylleia sinensis KC494674.1 12 Diphylleia cymosa KC494676.1 13 Dysosma difformis KC494661.1 14 Dysosma pleiantha KC494652.1 15 Podophyllum peltatum KC494685.1 16 Podophyllum hexandrum AF328965.1 17 Circaeaster agrestis AF328965.1 Sơ đồ mối quan hệ di truyền của 23 loài họ Berberidaceae đã được xây dựng theo phương pháp ML. Theo đó, 23 loài nghiên cứu chia thành 2 nhánh chính lớn: nhánh chính lớn 1 gồm các loài của chi Berberis và Mahonia; nhánh chính lớn 2 gồm các loài của chi Epimedium, Diphylleia, Dysosma và Podophyllum. Trong đó, nhánh chính lớn 1 lại chia thành 2 nhánh phụ, gồm nhánh phụ số 1 (các loài thuộc chi Berberis) và 2 (các loài thuộc chi Mahonia). Nhánh chính lớn 2 cũng chia thành 4 nhánh phụ nhỏ hơn tương ứng với các chi khác nhau (nhánh phụ số 3, 4, 5, 6) (hình 3). Điều đó cho thấy, Berberis và Mahonia là 2 chi có quan hệ rất gần gũi với nhau, cụ thể khoảng cách di truyền trung bình của 2 chi này là 0,0236 (≈2,3%) (tính trung bình trên 7 mẫu Mahonia và 8 mẫu Berberis nghiên cứu), trong khi đó khoảng cách di truyền trung bình giữa chi Mahonia với Dysosma lên đến 0,223 (≈22,3%), với chi Epimedium là 0,198 (≈19,8%) và Podophyllum là 0,214 (≈21,4%). Ở nhánh chính lớn số 2 kết quả phân tích bảng khoảng cách di truyền cho thấy, chi Podophyllum có quan hệ gần gũi với Dysosma với khoảng cách di truyền (P) là 0,041 (≈4,1%) (tính trung bình trên 4 mẫu nghiên cứu) (hình 4). Hình 3. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của 6 mẫu nghiên cứu với 17 loài khác trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA bằng phương pháp ML [loài Tinh diệp thảo (Circaeaster agrestis) được sử dụng làm loài ngoài nhóm]. 1662(12) 12.2020 Khoa học Y - Dược Hình 4. Bảng khoảng cách di truyền giữa 24 mẫu nghiên cứu. Thiết kế cặp mồi khuếch đại đặc hiệu vùng gen ITS- 300 cho loài M. bealei Trình tự vùng gen ITS dài 700 bp của loài Hoàng liên ô rô lá dày sau khi được so sánh với trình tự gen ITS của 22 loài khác đã phát hiện ra một đoạn trình tự dài khoảng 300 nucleotide nằm giữa vùng Spacer 2 và 26S có chứa đến 35 vị trí biến đổi, trong đó có 19 vị trí nucleotide có giá trị mang thông tin di truyền (có ý nghĩa Parsimony) (hình 5). Điều này gợi ý cho chúng tôi có thể xác định được một vùng ITS đặc hiệu cho loài M. bealei. Hình 5. Bảng tổng hợp các vị trí nucleotide biến đổi trong đoạn 300 nucleotide thuộc vùng gen ITS. Chúng tôi đã tiến hành thiết kế cặp mồi theo nguyên tắc mồi xuôi có trình tự cùng trình tự với mạch gốc DNA, trong đó 2/3 trình tự mồi nằm trong vùng bảo thủ, 1/3 trình tự mồi nằm trong vùng siêu biến đổi (là vùng ITS dài 300 bp); mồi ngược có trình tự bổ sung với mạch DNA gốc, cũng có 2/3 đoạn trình tự nằm trong vùng bảo thủ bao 2 đầu của đoạn gen chứa nhiều vị trí biến đổi và 1/3 đoạn trình tự nằm trong vùng siêu biến đổi (hình 6). Hai đầu mỗi mồi đều có chứa G, C đảm bảo độ bắt cặp chắc chắn cho mồi trong quá trình khuếch đại gen bằng PCR. Mỗi mồi (xuôi và ngược) gồm 21 nucleotide, trong đó có 10 GC (chiếm 48%) và và 11 AT (chiếm 52%). Hình 6. Sơ đồ đoạn mồi thiết kế để khuếch đại vùng chứa nhiều vị trí biến đổi dài 300 bp của gen ITS. Trình tự mồi thiết kế như sau (ký hiệu mồi ITS-300): mồi xuôi (F): 5’- GCA-ATT-CAC-ACC-AAG-TAT-CGC- 3’; mồi ngược (R): 5’- GCG-ATA-CTT-GGT-GTG-AAT-TGC -3’. Nhiệt độ bắt cặp Tm được tính theo công thức: Tm = 4(G+C) + 2(A + T), theo đó nhiệt độ bắt cặp lý thuyết của cả 2 mồi xuôi và mồi ngược đều 62ºC. Cặp mồi sau đó đã được kiểm tra bằng PCR cho 2 mẫu nghiên cứu SM02, BLC03 (M. bealei), và 4 mẫu đối chứng gồm B1 (B. hypoxantha), SB01 (B. julianae), DL02 (M. klossii) và C307 (M. jingxiensis). Phản ứng trùng hợp (PCR) khuếch đại gen ITS-300 được thực hiện với 35 chu kỳ, bắt cặp ở 58ºC trong 30 giây. Kết quả PCR sau đó được kiểm tra trên gel agarose 1% cho thấy 2 mẫu M. bealei (SM02 và BLC03) đều cho một vạch sắc nét có kích thước ≈300 bp, trong khi 4 mẫu đối chứng (gồm B1, SB01, DL02 và C307) đều không có vạch (hình 7). Điều đó cho thấy, khả năng cặp mồi ITS-300 là đặc hiệu cao cho loài M. bealei. Sản phẩm PCR này sau đó đã được đọc trình tự và kết quả so sánh trên BLAST cho thấy đây đúng là đoạn gen ITS của loài M. bealei. Trình tự đoạn gen ITS-300 này của loài M. bealei đã được chúng tôi đăng ký lên Genbank và được cấp mã số là MT 008067. Hình 7. Kết quả PCR kiểm tra tính đặc hiệu của mồi ITS-300 trên 6 mẫu nghiên cứu (giếng số 1, 2: mẫu SM02, BLC 03, M: DNA 1 kb ladder, Lane 3, 4, 5, 6 lần lượt là các mẫu B1, SB01, DL02, C307). Nghiên cứu của Y.D. Kim và cs năm 1996 [12] (dựa trên trình tự vùng gen rbcL, ITS) và nghiên cứu năm 2004 [13] (dựa trên trình tự gen ndhF) đều cho thấy, chi Berberis và Mahonia tách thành 2 nhóm riêng biệt dù có quan hệ rất gần gũi với nhau. Trong nghiên cứu này của chúng tôi, dựa trên phân tích trình tự vùng gen ITS cũng cho thấy mặc dù khoảng cách di truyền trung bình giữa các loài của chi Berberis và Mahonia chỉ là 0,0236 nhưng chúng vẫn sắp xếp thành các nhóm riêng rẽ, điều này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu về hình thái và phân tử trước đó. 1762(12) 12.2020 Khoa học Y - Dược Việc phát triển cặp mồi khuếch đại được vùng gen ITS đặc hiệu sẽ giúp cho công tác giám định loài Hoàng liên ô rô lá dày ở Việt Nam trở nên nhanh chóng, bởi xác định loài với thông tin chính xác là một trong những chìa khóa để cải thiện công tác quản lý và bảo tồn loài [14]. Kết luận Kết quả phân tích trình tự gen ITS loài M. bealei cho thấy vùng gen này không chỉ được sử dụng hiệu quả như một mã vạch để xác định các loài thuộc chi Mahonia, mà còn là vùng gen rất hữu ích cho phân tích phát sinh chủng loại các loài thuộc họ Berberidaceae nói chung, chi Mahonia nói riêng. Việc phát triển cặp mồi khuếch đại vùng gen ITS dài 300 bp đặc hiệu của loài M. bealei góp phần đưa ra phương pháp nhanh chóng và chính xác để xác định loài này, đây là vấn đề rất hữu ích, góp phần quan trọng cho công tác bảo tồn nguồn gen một loài dược liệu quý. LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu này được hỗ trợ kinh phí từ đề tài của Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (mã số 106- NN.03-2016.49) và của Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật (mã số IEBR ĐT.13-20). Các tác giả xin chân thành cảm ơn. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] J.M. He, Q. Mu (2015), “The medicinal uses of the genus Mahonia in traditional Chinese medicine: an ethnopharmacological, phytochemical and pharmarcological review”, Journal of Ethnopharmacol., 175, pp.668-683. [2] Bui Van Huong, Ngo Duc Phuong, Nguyen Trung Thanh, Tran Van Tu, Nguyen Thai Son, Nguyen Thi Van Anh, Bui Van Thanh (2017), “Biological and ecological characteristics of Mahonia bealei (Fortune) Pynaert in Vietnam”, Journal of Science and Technology, 33, pp.51-57. [3] Do Tat Loi (2004), Vietnamese medicinal plants and herbs, Medicine Publishing House. [4] Bui Van Huong, Bui Van Thanh, Nguyen Thi Van Anh, Pham Huyen (2017), “Research on cutting propagation of Mahonia bealei (Fortune) Pynaert”, National conference on ecology and biological resources. [5] W.J. Kress (2005), “Use of DNA barcodes to identify flowering plants”, PNAS 102, pp.8369-8374. [6] R. Lahaye (2008), “DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots”, PNAS, 105, pp.2923-2928. [7] S. Chen (2010), “Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species”, PLOS ONE, 5, p.e8613. [8] J.J. Doyle, J.L. Doyle (1990), “Isolation of plant DNA from fresh tissue”, Focus, 12, pp.13-15. [9] T. Cheng (2016), “Barcoding the kingdom plantae: new PCR primer for ITS region of plants with improved universality and specificity”, Molecular Ecology Resources, 16, pp.138-149. [10] T.A. Hall (1999), “BioEdit v7.0.5.2: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/ NT”, Nucleic Acids Symposium Series, 41, pp.95-98. [11] S. Kumar, G. Stecher, K. Tamura (2016), “MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets”, Molecular Biology and Evolution, 33, pp.1870-1874. [12] Y.D. Kim, K.J. Robert (1996), “Phylogenetic implications of rbcL and ITS sequence variation in the Berberidaceae”, Systematic Botany., 21, pp.381-396. [13] Y.D. Kim (2004), “Phylogeny of Berberdaceae based on sequences of the chloroplast gene ndhF”, Biochemistry Systematics and Ecology, 32, pp.291-301. [14] A.T. Blasi, M. Vorontsova (2015), “Plant identification is key to conservation”, Nature, 521, p.161.