Đánh giá khả năng tạo chất hoạt động bề mặt sinh học do các chủng vi khuẩn phân lập từ mùn khoan dầu khí Vũng Tàu và ảnh hưởng của chúng lên khả năng phân huỷ dầu

tạo ra các túi ngoại bào có tác dụng cắt hydrocacbon thành từng phần nhỏ, đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển các hydrocacbon vào trong tế bào. Các túi do chủng Acinetobacter HO1-N có đường kính 20-50 nm chứa protein, phospholipid và lipopolysaccharid, chứa 5 phần phopholipid, khoảng 350 phần polysaccharid [26]. Hầu hết các vi khuẩn phân huỷ hydrocacbon và gây độc có chứa các CHHBMSH là các thành trên bề mặt tế bào, chúng bao gồm các cấu trúc như là M protein. 3.3. Khái quát quá trình tạo CHHBMSH của vi sinh vật Để có thể biết rõ được cơ chế rõ ràng quá trình tạo chất hoạt động bề mặt sinh học ta phải theo dõi được sản phẩm của từng giai đoạn trao đổi chất của vi sinh vật. Nhưng trong phạm vi của bản khoá luận này chỉ xin được mô tả một cách sơ lược về quá trình tạo ra chất hoạt động bề mặt sinh học của vi sinh vật. Nhìn chung, mỗi một loài vi sinh vật có khả năng tạo chất hoạt động bề mặt sinh học lại có một cơ chế chuyển hoá riêng. Bởi vậy nếu nói một cách cụ thể thì phạm vi sẽ là quá rộng. Ta sẽ xét cơ chế của quá trình tạo chất hoạt động bề mặt sinh học của vi khuẩn hiếu khí. Với loại vi khuẩn hiếu khí, con đường chung là trình tự oxy hoá các hydrocacbon thành rượu, sau đó đến andehit, các axit béo, rồi đến axetyl-CoA hoặc axit pyruvic. Từ đây tiếp tục con đường chuyển hoá trong chuỗi hô hấp của vi sinh vật (chu trình TCA), tạo ra các axit sản phẩm có nhóm chức ưa nước (nhóm OH hoặc C=O). Các sản phẩm của chu trình TCA sau đó kết hợp với các thành phần của dầu thô tạo lên sản phẩm là các axit amin hoặc các lipid chung tính gồm có một đầu ưa nước (OH hoặc C=O) và một đầu ưa dầu (-CH2). Chính các cấu tử này là các chất hoạt động bề mặt sinh học. 3.4. Cỏc vi sinh vật cú khả năng tạo CHHBMSH Trong tự nhiờn cú rất nhiều cỏc vi sinh vật cú khả năng tạo CHHBMSH. Sự tạo thành CHHBMSH và chức năng của cỏc chất này thường cú liờn quan tới sự phõn huỷ cỏc hydrocacbon. Vỡ vậy, cỏc chất này chủ yếu là do cỏc vi sinh vật cú khả năng sử dụng hydrocacbon sinh ra. Tuy nhiờn, một số vi sinh vật khỏc lại sử dụng cỏc nguồn cơ chất là cỏc hợp chất hữu cơ tan trong nước (glucoz, glycerol, etanol…) cũng cú khả năng sinh ra CHHBMSH. Một số vi sinh vật dường như tạo ra chất này nhằm thớch nghi với cỏc điều kiện mụi trường sống đặc biệt của chỳng, chẳng hạn như: trong cỏc bể chứa dầu, trong đất, trong đại dương… Người ta đó phõn lập được chủng Pseudomonas aeruginosa trong nước bơm ộp vào giếng khoan dầu thụ ở Venuezuela [19]. Chủng này cú khả năng thớch nghi với cỏc điều kiện khắc nghiệt trong bể chứa dầu và hơn nữa, cỏc CHHBMSH (rhamnolipit) do chủng này sinh ra lại khụng bị cỏc điều kiện đặc biệt trong giếng khoan (pH, nhiệt độ, độ mặn, Ca2+ và Mg2+) làm mất hoạt tớnh. Chủng Bacillus SP018 cú khả năng tạo CHHBMSH ngay trong điều kiện kị khớ ở 500C và chịu được nồng độ NaCl đến 10%. Chủng Bacillus AB-2 và Y12-B được phõn lập từ cỏt nhiễm dầu cú khả năng sinh trưởng trong mụi trường cú chứa hydrocacbon ở nhiệt độ 500C. Từ cỏc mẫu đất nhiễm dầu đó phõn lập được một số chủng vi sinh vật khỏc như Rhodococcus, Bacillus pumilus [27], Arthrobacter sp. MIS 38 [33]. Từ cỏc vựng ụ nhiễm nhiờn liệu đó phõn lập được cỏc chủng như Ochrobacchum anthropii, hay từ cỏc vựng biển bị tràn dầu phõn lập được Pseudomonas aeruginosa. Cỏc chủng này khụng những cú khả năng phõn huỷ dầu mà cũn cú khả năng tạo CHHBMSH cao. Jeneman và cộng sự đó phõn lập được chủng Bacillus licheniformis JF-2 trong một giếng khoan dầu ở vựng Carter, Oklahoma. Chủng này cú khả năng phỏt triển trong mụi trường kị khớ và làm giảm sức căng bề mặt của mụi trường cũn 30mN/m. Chủng này cũng cú thể sinh trưởng trong mụi trường cú nồng độ NaCl lờn tới 10%, nhiệt độ nuụi cấy là 500C và pH dao động trong khoảng từ 4,6 đến 9,0. Hơn thế nữa, chỳng khụng bị ức chế bởi sự cú mặt của dầu thụ. Vỡ vậy, chủng này cú tiềm năng để sử dụng trong phương phỏp tăng cường thu hồi dầu nhờ vi sinh vật. Người ta ước tớnh, trong cỏc giếng dầu ở Mỹ, khoảng 50-70% cỏc vi sinh vật cú thể sinh trưởng được ở pH từ 4-8, nhiệt độ dưới 750C, nồng độ NaCl khoảng 10% và cú thể sinh trưởng được cả trong điều kiện kị khớ hoặc vi hiếu khớ [19]. CHHBMSH do vi sinh vật sinh ra cú thể là chất ngoại bào hay chớnh bản thõn tế bào, trong một số trường hợp cỏc chất này cú tớnh khỏng sinh, do đú chỳng cú thể phõn huỷ màng tế bào của một số vi sinh vật cạnh tranh nguồn cacbon với chỳng. Cooper phỏt hiện chủng Clostridium pasteurianum sinh một loại mỡ chung tớnh ngoại bào, chất này cú thể làm giảm sức căng bề mặt của mụi trường từ 72mN/m xuống cũn 55mN/m. Yakimov và cộng sự [38] đó phõn lập được chủng Bacillus licheniformis BAS50, chủng này cú thể sinh trưởng kị khớ trờn mụi trường cú bổ sung đường glucoz và 0.1% NaCl và sinh CHHBMSH cú tờn là lichenysin. Kinsinger và cộng sự [21] đó phỏt hiện một chủng Bacillus subtilis cú khả năng sinh CHHBMSH ngoại bào cú bản chất là surfactin, chất này cú khả năng khỏng vi nấm. Cỏc loài vi sinh vật khỏc nhau cú thể tạo ra cỏc loại CHHBMSH cú bản chất hoỏ học và trọng lượng phõn tử khỏc nhau. Người ta đó tỏch chiết và mụ tả được bản chất hoỏ học của một số CHHBMSH do một số chủng vi sinh vật tạo ra. Banat đó tổng kết được một số vi sinh vật cú khả năng sinh CHHBMSH và bản chất hoỏ học của từng chất do từng chủng sinh ra trong bảng sau: Tên vi sinh vật Tên CHHBMSH được tạo thành Arthrobacter RAG-1 Heteropolysaccarit Arthrobacter MIS38 Lipopeptit Arthrobacter Trechaloz, xaccaroz, fructoz Bacillus licheniformis JF-2 Lipopeptit Bacillus subtilis Surfactin Bacillus pumilus A1 Surfactin Bacillus sp. AB-2 Rhamnolipit Bacillus sp. C-14 Hiđrocacbon-lipit - protein Candida antarctica Mannosylethritol lipit Candida bombicola Sophoroz lipit Candida tropicalis Mannan Candida lipolytica Y-917 Sophoroz lipit Clostridium pasteuriannum Lipit chung tính Corynebacterium hiđrocarbolastus Protein-lipit-cacbohiđrat Corynebacterium insidiosum Photpholipit Corynebacterium lepus Axit béo Chủng MM1 Glucoz, lipit, và axit hiđroxidecanoic Nocardia erythropolis Mỡ chung tính Ochrobacchum anthropii Protein Penicillum spiculisporum Axit spiculosporic Pseudomonas aeruginosa Rhamnolipit Pseudomonas fluorescens Lipopeptit Phaffia rhodozyma Cacbohiđrat-lipit 3.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sản xuất CHHBMSH a. Nguồn cacbon Chất HHBMSH được sản xuất bởi nhiều các sinh vật khác nhau và chúng cũng có những cấu trúc rất khác nhau, tuy nhiên có một số các hiện tượng chung liên quan tới việc tổng hợp chúng: Thứ nhất là việc sản xuất CHHBMSH có thể do các hydrocacbon hoặc các cơ chất không tan trong nước. Hiện tượng này được nhắc đến bởi nhiều tác giả với nhiều CHBMSH [30,16]. Hiện tượng dễ thấy khác là sự kìm hãm tổng hợp CHHBMSM bởi gluco và một số các chất trao đổi khác [16]. Trong trường hợp của Athrobacter paraffineus I, CHHBMSH không được tạo ra khi thay thế hexan bằng gluco [22]. Một chủng thuộc loài Pseudomonas aeruginosa đã sản xuất ra một chất giống protein trên nguồn hydrocacbon nhưng không tạo ra trên gluco, glycerol, axit palmitic [22]. Loài Torulopsis petrophilum không tạo ra bất cứ một glucolipid nào khi nuôi trên môi trường đồng pha chứa bất cứ nguồn cacbon hoà tan trong nước nào. Đối với chủng P. aeruginosa khác khi nuôi trên môi trường chứa glycerol nếu thêm gluco, acetat, succinat, citrat thì sản lượng rhamnolipid giảm mạnh. Nhiều loài vi sinh vật đã được biết là sẽ tổng hợp nhiều loại CHHBM khác nhau khi nuôi trên vài nguồn cacbon [32]. Có nhiều ví dụ về việc sản xuất CHHBMSH trên các nguồn cacbon hoà tan trong nước như ở Pseudomonas sp. đã sản xuất CHHBMSH trên các nguồn cacbon hoà tan trong nước như glycerol, gluco, manitol, ethanol [30]. Nhiều tác giả đã chứng minh rằng sản lượng CHHBMSH tạo ra ít khi nuôi vi sinh vật trên các nguồn cacbon nào đó trong môi trường, chỉ khi nào nguồn cacbon này hết, khi đưa vào nguồn cacbon không hoà tan trong nước sẽ thúc đẩy tạo CHHBMSH [8]. Việc tạo glucolipid bởi Torulospos bombiloca được kích thích khi thêm dầu ăn vào trong môi trường nuôi cấy chứa 10% D – gluco [16]. Davis cùng các cộng sự đã chứng minh khi thêm ethyl este của một loại axit béo vào môi trường chứa gluco thì sản lượng sopholipid ở chủng C. bombicola CBS6009 tăng. Khi sản xuất glucolipid ở chủng T. apicola TMET73747, Stuwer cùng các cộng sự đã thu được sản lượng lên tới 90g/l trên môi trường chứa gluco và dầu hướng dương [16]. b. Nguồn nitơ Nguồn nitơ là một yếu tố quan trọng điều khiển sinh tổng hợp CHHBMSH. Nguồn nitơ NH4 thích hợp hơn nguồn NO3 cho việc tạo CHHBMSH ở chủng Athrobacter paraffineus ATCC 19558, nguồn ure cũng làm tăng sản lượng CHHBMSH. Nguồn NO3 tạo ra sản lượng lớn CHHBMSH ở P. aeruginosa và Rhodoccocus sp. [16]. Sản lượng CHHBM tăng ở A. paraffineus khi thêm các axit amin như: axit glutaric, axit asparagin, hay glycin vào môi trường. Cấu trúc của surfactin cũng bị ảnh hưởng bởi nồng độ L- aa tạo ra surfactin Val-7 hay Leu-7 [16]. Với chủng B. lichenniformis BAS50 sản lượng lichennysin A tăng gấp hai đến bốn lần khi thêm L-glutaric và L-asparagin vào môi trường. Robert cùng các cộng sự đã chứng minh rằng NO3 là nguồn nitơ tốt nhất cho việc sản xuất CHHBMSH ở chủng Pseudomonas 44TL và Rhodococus ST-5 sinh trưởng trên dầu ôliu và paraffin. Sản lượng CHHBM cũng tăng bằng việc giới hạn nguồn nitơ; P. aeruginosa, Norcardia, C. tropicalis đã tăng sản lượng CHHBM cùng với hoạt động tổng hợp glutamic khi chuyển sang giai đoạn sinh trưởng chậm lại, lúc mà môi trường hết nguồn nitơ. Syldatle cùng các cộng sự đã chứng minh rằng việc giới hạn nguồn nitơ không chỉ làm tăng sản lượng CHHBMSH mà còn làm thay đổi thành phần của CHHBMSH. Guerra-Santos cùng các cộng sự chỉ ra rằng việc tạo rhamnolipit là cực đại khi tỉ lệ C: N là 16:1 đến 18:1, không tạo ra khi tỉ lệ này là 11:1. [20] c. Các yếu tố khác Một sự thay đổi trong môi trường nuôi cấy cũng làm tăng sản lượng CHHBMSH. Kiểu loại, sản lượng và hoạt tính CHHBMSH cũng bị ảnh hưởng không chỉ bởi các nguồn cacbon khác nhau mà còn bởi nồng độ, nguồn nitơ, photpho, các ion Mg, Fe trong môi trường, điều kiện nuôi cấy, pH, nhiệt độ, tốc độ lắc và tỉ lệ pha loãng các chất trong môi trường [21]. Trong một số trường hợp, khi thêm các ion đa hoá trị vào môi trường ảnh hưởng dương tính tới sản lượng CHHBM. Một số các chất như etabutol, penicillin, cloramphenicol, EDTA cũng ảnh hưởng tới việc tạo thành CHHBM. Đó là do các yếu tố này ảnh hưởng tới độ hoà tan của các nguồn cacbon. [35] Một số trường hợp quá trình tổng hợp CHHBM lại bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, pH thông qua sự tác động của các yếu tố này tới hoạt động sinh trưởng của tế bào. pH đóng vai trò quan trọng trong việc tạo rhamnolipit ở Pseudomonas sp., CHHBMSH tạo ra cực đại ở pH = 6 đến 6,5 và giảm mạnh khi pH =7 [19]. Khả năng tạo cellobioselipit ở Ustilago maydis [18] và tạo sophorolipit ở Torulospos bombicola bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi yếu tố pH [13]. Trong trường hợp chủng Athrobacter paraffineus ATCC19558, Rhodotorula erythropolis, Pseudomonas sp. DSM2874 nhiệt độ lại đóng vai trò quan trọng. Loài Bacillus chịu nhiệt cao chỉ tạo CHHBM khi nhiệt độ trên 40oC. Tốc độ lắc cũng ảnh hưởng tới sản lượng CHHBM, ở chủng Norcardia erythropolis, sản lượng CHHBM giảm khi tăng tốc độ lắc do nó tác động tới hoạt động phân chia tế bào, còn ở nấm men sản lượng lại tăng khi tốc độ lắc và mức độ kị khí tăng [29]. Nồng độ muối cũng ảnh hưởng nhiều tới quá trình sản xuất CHHBM do ảnh hưởng tới hoạt động của tế bào. Đa số các trường hợp khi nồng độ muối tăng thì khả năng tạo CHHBM giảm. Tuy nhiên trong một số trường hợp sản lượng CHHHBM không bị ảnh hưởng khi nồng độ muối lên tới 10% mặc dù nồng độ mixen tối thiểu giảm nhẹ [6]. 3.6. Một số ứng dụng của CHHBMSH * Ưu điểm của CHHBMSH so với CHHBMHH CHHBMSH tạo ra từ con đường lên men sinh học, cấu tạo của chúng rất khác so với các CHHBMHH, tuy nhiên chúng cũng gồm hai đầu kị nước và ưa nước và hoạt tính của chúng cũng không kém CHHBMHH. Nhưng CHHBMSH lại có những ưu điểm mà CHHBMHH không thể sánh kịp, quyết định khả năng ứng dụng của nó trong rất nhiều ngành công nghiệp, và đang có xu hướng thay thế dần các CHHBMHH. Đó là các đặc điểm: - Dễ phân huỷ sinh học: CHHBMHH khi bổ sung vào trong mỏ khó bị phân huỷ trong điều kiện vỉa, gây ô nhiễm môi trường dầu khí do lẫn các cấu tử không mong muốn làm giảm chất lượng dầu. CHHBMSH tạo ra từ nguồn vi sinh vật nên độ tinh khiết cao, hoạt tính của chúng lại không kém các CHHBMHH. Ví dụ điển hình cho trường hợp này là ảnh hưởng của CHHBMSH và CHHBMHH lên sự phân huỷ các hợp chất hydrocacbon thơm mạch vòng được nghiên cứu bởi Marar và Rockne: khi thêm một số CHHBMHH vào có thể kìm hãm sự phân huỷ các hợp chất thơm do có ảnh hưởng gây độc, kích thích vi sinh vật phân huỷ CHHBMHH hay cô lập các hydrocacbon trong mạch micxen CHHBM, còn CHHBMSH cho thấy có những ảnh hưởng tốt như CHHBMHH nhưng chúng có thể bị phân huỷ, không độc và nhiều CHHBMSH không tạo cấu trúc micxen do đó rất thuận lợi cho việc kết hợp các hợp chất thơm với vi khuẩn [34]. - Các chất HHBMSH có thể sản xuất từ các nguồn vật liệu rẻ tiền, sẵn có, với số lượng lớn. Nguồn cacbon có thể là các hydrocacbon, lipit, các nguồn cơ chất phế thải của các ngành công nghiệp khác như rỉ đường, dầu cặn... do đó nó mang lại hiệu quả kinh tế cao mà lại xử lí được ô nhiễm do các phế thải này gây ra với môi trường [31]. - Việc sản xuất CHHBMSH đơn giản hơn nhiều CHHBMHH. Chúng được tạo ra bằng con đường lên men nhờ vi sinh vật cho nên thiết bị đơn giản, đỡ tốn kém mà lại không sử dụng các hoá chất độc hại như sản xuất CHHBMHH. Do không độc, dễ dàng bị phân huỷ, giá thành sản xuất rẻ nên chúng được ứng dụng trong xử lí môi trường mà CHHBMHH không thể xử lí triệt để: xử lí dầu tràn, tăng cường khả năng phân huỷ các hợp chất độc hại cho môi trường, chuyển chúng thành các yếu tố tích cực cho môi trường như sản xuất phân bón từ mùn khoan phế thải, các hợp chất thơm. Với những đặc tính không độc hại, dễ bị phân huỷ, dễ tiêu hoá mà CHHBMSH được sử dụng trong các ngành công nghiệp đặc biệt khác như mĩ phẩm, dược phẩm, thực phẩm mà CHHBMHH khó có thể bì kịp. * Một số ứng dụng của CHHBMSH CHHBMSH là một nhóm đa cấu trúc, chúng có những đặc tính hơn hẳn các CHHBMHH như đã nói ở trên cho nên chúng được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Công nghiệp dầu mỏ là một ngành ứng dụng rộng rãi các chất hoạt hoá bề mặt trong khai thác cũng như là xử lí môi trường, CHHBMSH đã tỏ ra có ưu thế và tiềm năng trong ngành công nghiệp này. Sau đây chúng tôi xin trình bày một số các ứng dụng quan trọng của nó. a. Nâng cao hiệu suất khai thác dầu (MEOR) Đây là một ứng dụng quan trọng nhất của nó trong ngành công nghiệp dầu mỏ. Cơ chế của phương pháp MEOR bao gồm: Tạo axit hoà tan phần đá bao bọc dầu, tăng độ rỗng và tính thấm của vỉa, tạo khí, do đó làm giảm độ nhớt của dầu và tăng áp suất vỉa. Tạo các axit hữu cơ hay các chất HHBM, biopolyme làm giảm sức căng bề mặt giữa dầu và nước dẫn đến làm tăng độ linh động của dầu. CHHBMSH có thể được sản xuất từ ngoài (ex situ) rồi bổ sung vào trong mỏ hay tạo ra ngay trong mỏ (in situ). Trong cả hai trường hợp, CHHBMSH đều làm tăng lượng dầu khai thác từ mỏ lên tới 60 đến 70% mà bằng phương pháp bơm ép thông thường chỉ khai thác được khoảng 30% nguồn dầu trong mỏ. Sự có mặt của CHHBM làm giảm sức căng bề mặt giữa vùng dầu nước do đó kích thích dòng dầu chảy. Để sản xuất CHHBM từ ngoài, CHHBM được tiến hành lên men, thu CHHBM hay đơn giản là cô đặc dịch nuôi cấy và sau đó là bơm xuống giếng. Quá trình sản xuất ex situ phải được tiến hành với số lượng lớn, dưới điều kiện tối ưu, cung cấp đầy đủ không khí cho quá trình lên men. Quá trình này có thể sử dụng các cơ chất rẻ tiền như các phế thải của các ngành công nghiệp nên vừa hạ giá thành sản phẩm vừa giảm ô nhiễm cho môi trường [31]. Một áp dụng hợp lí và hấp dẫn hơn là sản xuất CHHBMSH ngay trong mỏ (in situ) bằng cách cung cấp chất dinh dưỡng cho quần thể vi sinh vật nội tại trong mỏ hay nuôi giống từ bên ngoài trộn cùng với môi trường dinh dưỡng rồi bơm vào trong giếng. Tuy nhiên khi sản xuất theo cách thức này thường gặp những khó khăn nhất định ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của vi sinh vật thậm chí kìm hãm sinh trưởng và sinh tổng hợp CHHBM như: nhiệt độ mỏ quá cao, áp suất lớn, pH, độ mặn và kim loại nặng, khó khăn lớn nhất là thiếu oxy và việc luân chuyển chất dinh dưỡng trong mỏ. Do đó, để phương pháp MEOR này thành công thì phải lựa chọn được các chủng có khả năng chịu đựng được các điều kiện khó khăn trong mỏ. Phương pháp MEOR đã được nhiều nước áp dụng thành công. Clark cùng các cộng sự đã xác định có khoảng 27% mỏ dầu ở Mĩ thích hợp cho vi sinh vật phát triển và ứng dụng phương pháp MEOR. Phương pháp MEOR cũng đã được thông báo thành công trong nhiều nghiên cứu ở Nga, Cộng hoà Séc, Rumani, Mĩ, Hungary, Balan, Hà Lan, Nam Tư. Nước ta hiện đã ứng dụng phương pháp này, năm 1998 Lại Thuý Hiền cùng các cộng sự đã thử nghiệm phương pháp MEOR trên hiện trường khu vực mỏ dầu Bạch Hổ- Vũng Tàu và thu được kết quả tốt, số lượng vi khuẩn khử sunphat giảm đi, năng suất khai thác dầu tăng lên có giếng tăng tới 200%. b. Phân huỷ các hydrocacbon Một ứng dụng quan trọng khác của CHHBMSH đó là trong xử lí môi trường ô nhiễm hydrocacbon. - Phân huỷ các hydrocacbon trong đất: Các nghiên cứu về quá trình phân huỷ hydrocacbon trong đất đã được thông báo rộng dãi. Khả năng phân huỷ phụ thuộc vào sự có mặt của các vi sinh vật phân huỷ, thành phần hydrocacbon, O2, nhiệt độ, pH, nước, các chất dinh dưỡng và trạng thái vật lí của các hydrocacbon. Khi thêm CHHBM sinh học hay tổng hợp vào trong môi trường sẽ làm tăng tính lưu biến và độ hoà tan của các hydrocacbon, điều này rất cần cho quá trình phân huỷ. Các thử nghiệm khi bổ sung CHHBMSH để phân huỷ các hydrocacbon đã đem lại nhiều thành công: Lindley và Heydeman nuôi nấm Cladosporium resinae trên hỗn hợp ankan, chủng này có khả năng sản xuất ra một loại CHHBM gồm các axit béo, phospholipid, nhưng chủ yếu là axit dodecacnoic và phosphatidylcloline. Khi bổ sung phosphatidylcloline vào môi trường nuôi cấy chứa hỗn hợp các ankan này đã làm tăng tốc độ phân huỷ ankan lên 30%. Foght cùng các cộng sự đã chứng minh chất emulsan kích thích quá trình phân huỷ của dịch chứa đơn chủng vi khuẩn nhưng lại kìm hãm khi môi trường chứa hỗn hợp các chủng vi khuẩn. Oberbremer và Muller-Harting sử dụng quần thể vi sinh đất để đánh giá khả năng phân huỷ dầu thô, trong đó naphthalen bị phân huỷ đầu tiên, các thành phần khác chỉ bị phân huỷ khi các CHHBM được tạo ra làm giảm sức căng bề mặt giữa dầu và nước. Khi thêm CHHBM như một số sophorolipit vào môi trường chứa hỗn hợp các hydrocacbon thì sẽ làm tăng phân huỷ cả số loại lẫn số lượng các hydrocacbon. Một vài chủng vi khuẩn kị khí cũng sản xuất CHHBMSH nhưng khả năng làm giảm sức căng bề mặt không bằng các vi khuẩn hiếu khí. Bergetal đã sử dụng CHHBMSH do chủng P. aeruginosa UG2 làm tăng độ hoà tan của hexachlorobiphenyl lên 31% gấp 3 lần khi sử dụng CHHBM hoá học là 9,3%. Khi cả hai chất này cùng sử dụng thì hiệu quả hoà tan tăng lên 41,5%. Chủng Pseudomonas cepacia AC1100 tạo ra một loại chất nhũ hoá có khả năng tạo thể huyền phù với 2,4,5-T và cũng nhũ hoá một số các clorophenol, do đó CHHBM này được sử dụng để tăng cường khả năng phân huỷ của các chất hữu cơ chứa clo [30]. - Phân huỷ các hydrocacbon trong môi trường nước: Khi dầu bị tràn ở môi trường nước, các thành phần HRCB nhẹ bay hơi còn các HRCB không phân cực thì không hoà tan trong nước. Do có độ hoà tan thấp (<1ppm) và tỉ trọng nhỏ hơn nước nên hầu hết các thành phần HRCB tồn tại trên bề mặt nước. Các vi sinh vật có khả năng phân huỷ HRCB đã được phân lập trong môi trường nước, các vi sinh vật này bị kích thích hoạt động nhũ hoá khi môi trường nhiễm dầu. Chakrabartu đã thông báo rằng chất nhũ hoá do P. aeruginosa SB30 làm tăng khả năng thu gom dầu, rất có ích để xử lí các bờ biển bị nhiễm dầu. CHHBM từ vi khuẩn còn được ứng dụng để làm sạch các thùng, kho chứa dầu và nhiều ứng dụng khác. CHHBM emulsan do chủng Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 sinh ra sử dụng trong công nghiệp dầu khí làm giảm cặn dầu trong thùng chứa, giảm độ nhớt của dầu nặng, tạo chất nhũ hoá phục vụ nhiều lĩnh vực khác [30]. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. VẬT LIỆU 1.1. Nguyên liệu Mùn khoan lấy từ mỏ Bạch Hổ –Vũng Tàu. Các chủng vi khuẩn nhận từ phòng vi sinh vật dầu mỏ. 1.2. Hoá chất và môi trường nuôi cấy 1.2.1. Môi trường hiếu khí tổng số 1% (g/l) Thạch KH2PO4 NaCl KCl MgCl2 NH4 NO3 Glucoza Pepton Cao thịt Cao men Nước máy pH 20 1 10 0,25 1,2 2 1 5 3 0,2 1 lít 7-7,2 Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Trung Quốc Nga Đức Đức 1.2.2. Môi trường khoáng Gost cho vi khuẩn (g/l): Na2HPO4 KH2 PO4 KNO3 MgSO4 Nước máy 0,7 0,3 3 0,4 1 lít pH và nồng độ NaCl chỉnh theo từng thí nghiệm. Các loại dầu: DO, saralin, dầu thô, parafin, dầu oliu. Các môi trường được khử trùng riêng với các loại dầu ở 1 atm trong thời gian 30 phút. 1.3. Thiết bị và máy móc Kính hiển vi quang học Laborval 4 (Đức) Cân phân tích Sartorius (Đức) Máy bay hơi chân không SpeedVac (Đức) Máy li tâm Sorwal (Đức) Máy lắc Beckman (Đức) Tủ sấy (Việt Nam) Bốc cấy (Việt Nam) Các vật dụng khác của phòng vi sinh vật dầu mỏ. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Giữ giống và nhân giống * Giữ giống: các chủng sau khi lựa chọn được giữ giống trên môi trường khoáng Gost bổ sung dầu DO, giữ trong glycerin với tỉ lệ 1:1, và trên môi trường hiếu khí thạch nghiêng. Nhân giống: chủng được nhân giống trên môi trường hiếu khí thạch nghiêng, rồi từ đó được cấy sang môi trường Gost có bổ xung 5% dầu DO để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 2.2. Tuyển chọn các chủng có khả năng sử dụng dầu mạnh Các chủng sau khi phân lập từ mùn khoan dầu khí được nhân giống và và cấy chuyền ra các ống thạch nghiêng. Tiến hành nuôi lắc từng chủng trên môi trường Gost 1% NaCl chứa 5% dầu DO, pH =7,5; tốc độ lắc v =200vòng/phút với tỉ lệ 1% giống, theo dõi trong một tuần. Quan sát sự thay đổi độ đục, trạng thái của dầu trong môi trường, kết luận chủng có khả năng sử dụng dầu hay không. Nếu môi trường có độ đục cao, dầu bị nhũ hoá thì chứng tỏ chủng có khả năng sử dụng dầu mạnh. 2.3. Quan sát hình thái 2.3.1. Quan sát hình thái khuẩn lạc: cấy ria các chủng trên môi trường hiếu khí, ủ ở điều kiện 30o C sau 24h đem quan sát. 2.3.2. Quan sát hình thái tế bào: sau24h nuôi cấy, tiến hành nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào vi khuẩn bằng kính hiển vi quang học. * Xác định Gram: nhuộm Gram và thử lại bằng phương pháp KOH để làm tăng độ chính xác: lấy một ít sinh khối tế bào lên phiến kính, nhỏ một giọt dung dịch KOH 3% lên sinh khối tế bào, dùng que cấy đánh tan tế bào. Nếu dịch tạo nhớt thì kết luận vi khuẩn thuộc nhóm Gram âm, nếu không tạo nhớt chứng tỏ vi khuẩn là Gram dương * Xác định khả năng chuyển động: làm tiêu bản giọt ép và soi kính hiển vi. 2.4. Xác định các đặc điểm sinh hoá bằng các phép thử hoá sinh: nhằm mục đích xác định khả năng sử dụng một số các cơ chất của chủng nghiên cứu. 2.5. Xác định số lượng tế bào trên môi trường thạch (phương pháp Koch) Pha loãng dịch theo dãy thập phân: Chuẩn bị một loạt các lọ penicilin chứa 4,5 ml muối sinh lí vô trùng, hút 0,5 ml dịch cần pha loãng vào lọ penicilin thứ nhất và lắc đều, từ lọ thứ nhất chuyển 0,5 ml sang lọ penicilin thứ hai, cứ thực hiện liên tiếp như vậy cho đến độ pha loãng thích hợp. Sau khi pha loãng hút 0,1ml dịch ở độ pha loãng thích hợp vào đĩa chứa môi trường hiếu khí, dùng que trang gạt đều. Trong quá trình pha loãng tiến hành với hai độ pha loãng chẵn hoặc lẻ liên tiếp thích hợp, ở mỗi độ pha loãng hút vào hai đĩa peptri để giảm sai số, nuôi ở nhiệt độ 300C sau 1-2 ngày đem xác định số lượng tế bào. Công thức tính số lượng tế bào: X = n * 10 (x+1) Trong đó: X là số lượng tế bào trong 1ml dịch cần xác định. n là số lượng tế bào trung bình các đĩa x là sốthứ tự của lọ pha loãng 2.6. Đánh giá khả năng sinh CHHBM theo phương pháp Pruthi Khả năng sinh CHHBM được đánh giá thông qua chỉ só nhũ hoá E24 Chỉ số nhũ hoá E24 đặc trưng cho khả năng nhũ hoá của các sản phẩm trao đổi chất do vi sinh vật sinh ra trong dung môi xylen sau 24h trong 4oC. Cách tiến hành: Lấy 1ml dịch nuôi cấy đã ly tâm loại bỏ tế bào thêm 1 ml xylen vào ống nghiệm đem voltex trong 1 phút với vận tốc 2000 vòng/phút. Mẫu được giữ ở 4oC trong 24h rồi đem đo. Công thức xác định chỉ số E24: Chiều cao cột nhũ hoá E24 = x100% Chiều cao tổng số E24 càng cao thì khả năng nhũ hoá của sản phẩm càng lớn. 2.7. Tối ưu hoá một số các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo CHHBM theo phương pháp Gause- Zenden Phương pháp Gause-Zenden là phương pháp tối ưu đơn giản, được tiến hành bằng cách chỉ thay đổi một yếu tố tác động, cố định các yếu tố tác động còn lại. Quá trình A chịu ảnh hưởng của n yếu tố, chỉ số cần tối ưu là y. Cố định (n- 1) yếu tố và cho một yếu tố thay đổi trong khoảng xác định công nghệ của nó, ứng với mỗi một thí nghiệm ta xác định được một số liệu y. Trong dãy số liệu thu được ta xác định được một giá trị y tối ưu. Ta thu được loạt thí nghiệm thứ nhất. Loạt thí nghiệm thứ 2 ta cũng cố định (n-1) yếu tố tác động ở một giá trị nào đó, cho yếu tố thứ n thay đổi trong khoảng xác định công nghệ. Trong dãy thí nghiện thu được ta được một giá trị tối ưu của yếu tố thứ 2. Thực hiện n loạt thí nghiệm như vậy ta xác định đựoc các giá trị tối ưu của các yếu tố tác động mà tại đó y tối ưu. Phương pháp này chỉ tiệm cận tới vùng tối ưu. Trong phạm vi khoá luận này, chỉ số cần tối ưu là sản lượng CHHBM, các yếu tố tác động là nhiệt độ, pH, nồng độ muối và nguồn cacbon. 2.8. Phân tích sản phẩm bằng phổ hồng ngoại Cấu trúc phân tử của chất hoạt hoá bề mặt được nghiên cứu bằng phương pháp phân tích phổ hồng ngoại nhờ sự giúp đỡ của phòng phổ hồng ngoại –Viện Công nghệ hoá học để dự đoán cấu trúc hoá học của sản phẩm. 2.9. Xác định trọng lượng khô của CHHBM Phương pháp tách chiết chất hoạt hoá bề mặt được tiến hành theo phương pháp Pruthi có cải tiến. Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau 120 giờ nuôi lắc được dùng để tách chiết chất hoạt hoá bề mặt sinh học. Dịch nuôi cấy Li tâm 8.000 v/ph 10’ Dịch huyền phù Cặn Bổ sung axeton tỉ lệ 1:4 giữ ở 4oC trong 24h Li tâm Chất kết tủa Dịch nuôi cấy và axeton Làm khô chân không Chất hoạt hoá bề mặt Trọng lượng của CHHBMSH được đo bằng cân phân tích. 2.10. Xác định độ bền hoạt tính của CHHBM Dịch nuôi cấy được li tâm 20.000 vòng/phút trong thời gian 10 phút để loại bỏ toàn bộ tế bào, thu phần dịch chứa CHHBM. Phần dịch thu được đặt ở các nhiêt độ 30oC, 55oC trong thời gian 3 ngày, 10 ngày, 15 ngày và ở nhiệt độ 100oC trong 30 phút, 60 phút; rồi đem đo hoạt tính để đánh giá độ bền của CHHBMSH. 2.11. Đánh giá ảnh hưởng của CHHBMSH lên mùn khoan * Làm giàu vi khuẩn phân huỷ saralin trong mùn khoan: Cân 10 gam mùn khoan cho vào bình 250ml chứa môi trường Gost có bổ sung 5% dầu saralin, tiến hành lắc trong 3 ngày. Sau đó cấy chuyển 2ml dịch nuôi lắc sang bình khoáng Gost thứ hai cũng bổ sung 5% dầu saralin, lắc trong 5 ngày. Hỗn hợp vi khuẩn phân huỷ dầu được dùng làm giống. * Bổ sung CHHBMSH để làm tăng khả năng phân huỷ dầu: Nuôi cấy chủng M150 để thu được lượng CHHBM cực đại. Thu CHHBM bằng cách li tâm loại bỏ tế bào, thu dịch nuôi cấy. Chuẩn bị 4 bình khoáng Gost chứa 5% saralin, bổ sung vào các bình 0,5ml dịch hỗn hợp vi khuẩn phân huỷ dầu. Bổ sung CHHBMSH vào một bình 1ml, bình 2ml, bình 3ml và một bình không bổ sung CHHBM. Đếm số lượng vi sinh vật lúc mới bổ sung và sau khi lắc 4 ngày. Sự ảnh hưởng của CHHBM lên vi sinh vật trong mùn khoan thông qua sự biến động số lượng vi sinh vật. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN SINH CHHBMSH 1.1. Tuyển chọn chủng có khả năng sử dụng dầu mạnh Từ bộ sưu tập gồm 16 chủng vi khuẩn phân lập được trong mùn khoan dầu khí mỏ Bạch Hổ –Vũng Tàu, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sử dụng dầu của chúng. Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường khoáng Gost có bổ sung 5% dầu DO, lắc ở nhiệt độ 30o C trong 7 ngày. Khả năng sử dụng dầu được đánh giá định tính thông qua độ đục của môi trường và sự thay đổi trạng thái vật lí của các giọt dầu. Từ đó, chúng tôi tìm được 3 chủng có khả năng sử dụng dầu mạnh là M150, MT3 và MX. Các chủng này lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. 1.2. Đặc điểm hình thái của một số chủng phân huỷ dầu Các chủng vi khuẩn ria trên đĩa chứa môi trường hiếu khí tổng số 1% NaCl, để trong tủ ấm 30o C. Sau 24 giờ nuôi cấy đem ra quan sát hình thái khuẩn lạc, đồng thời cũng tiến hành nhuộm Gram để xác định hình thái tế bào, làm tiêu bản giọt ép để quan sát khả năng chuyển động. Kết quả được thể hiện ở Bảng 1. Bảng 1. Đặc diểm hình thái của một số chủng vi khuẩn phân lập có khả năng phân huỷ dầu Kí hiệu chủng Đặc điểm khuẩn lạc Đặc điểm tế bào MT3 Tròn dẹt, mép không đều, màu vàng nâu, hơi dẹt, khuẩn lạc to 2,5 -3 cm. Que ngắn, Gram âm, không có khả năng chuyển động MX Tròn đều, mầu xanh lá cây, bóng, lồi, khuẩn lạc nhỏ 1cm. Que ngắn, Gram dương, không có khả năng chuyển động. M150 Tròn đều, bóng lồi, mầu vàng, nhỏ 1 cm. Que ngắn, hơi cong, Gram dương, không có khả năng chuyển động. Hình1. Hình thái khuẩn lạc chủng M150 trên môi trường hiếu khí tổng số 1% NaCl 1.3. Khả năng sinh CHHBMSH của các chủng vi khuẩn phân huỷ dầu Để lựa chọn tiếp chúng tôi tiến hành đánh giá sơ bộ khả năng tạo CHHBM của các chủng này. Khả năng tạo CHHBMSH được xác định bằng phương pháp Pruthi - xác định chỉ số nhũ hoá E24. Các chủng được nuôi lắc trên môi trường khoáng Gost chứa 5% (v/v) dầu DO. Theo dõi liên tục và đo chỉ số nhũ hoá E24 sau 5 ngày nuôi lắc, kết quả cho thấy chủng M150 có chỉ số nhũ hoá cao nhất là 69,8%, chủng MT3 là 59%, chủng MX là 63%, đặc biệt chủng M150 có tốc độ tạo CHHBM nhanh nhất chỉ sau 3 ngày nuôi lắc. Bảng 2. Khả năng sinh CHHBM của các chủng vi khuẩn Chủng E24 (%) M150 69,8 MT3 59,0 MX 63,0 Chủng M150 được lựa chọn nghiên cứu sâu hơn. Theo kết quả phân tích trình tự 16S rARN đã xác định chủng M150 thuộc loài Brevibacterium celere. Loài này mới được phát hiện vào năm 2004 [17], do đó, các nghiên cứu về chúng còn rất hạn chế. Do vậy để phục vụ cho các bước tiếp theo chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số các đặc điểm sinh lí sinh hoá của chủng này. 2. MỘT SỐ CÁC ĐẶC ĐIỂM SINH LÍ SINH HOÁ CỦA CHỦNG M150 2.1. Một số đặc điểm sinh hóa Để phục vụ cho các mục đích xây dựng môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng cũng như sự tạo CHHBM của chủng M150 trong các giai đoạn sau này chúng tôi tiến hành khảo sát sơ bộ khả năng sử dụng một số nguồn cơ chất bằng các phép thử hoá sinh. Khả năng sử dụng một số cơ chất của chủng M150 được thể hiện ở Bảng 3. Bảng 3. Khả năng sử dụng một số các nguồn cơ chất của chủng M150 STT Nguồn cơ chất Khả năng 1 NO3 + + 2 Tryptophan - 3 Gluco (kị khí) - 4 Arginin + + 5 Ure + + 6 Esculin - 7 Gelatin - 8 Gluco + + + 9 Gluconat + 10 Caprat - 11 Adipat + 12 Malat + 13 Citrat - 14 Phenylacetat - Trong đó: +++ là có khả năng sử dụng mạnh; + là sử dụng yếu ++ là sử dụng trung bình; - là không có khả năng sử dụng Vậy chủng M150 có khả năng khử nitrat thành nitrit, sử dụng arginin, ure, gluco ở điều kiện hiếu khí; sử dụng yếu gluconat, adipat, malat; chủng không có khả năng, gelatin, trytophan, escunin, caprat, ciprat và phenylacetat, gluco trong điều kiện kị khí 2.2. Động thái sinh tổng hợp CHHBM của chủng M150 CHHBMSH là một sản phẩm của quá trình trao đổi chất chúng được tạo ra trong suốt quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Theo các tác giả thì lúc đầu chất hoạt hoá bề mặt tăng dần, đến một thời điểm nào đó nó giảm dần do một số các vi sinh vật sử dụng chúng làm nguồn thức ăn, hay vi sinh vật bị chết đi (đối với CHHBMSH là chính các tế bào vi sinh vật). Để có thể thu được lượng CHHBM cao nhất chúng tôi tiến hành xác định động thái sinh tổng hợp CHHBMSH của chủng nghiên cứu. Chủng được nuôi lắc trên môi trường khoáng Gost, pH = 8, ở 30oC, bổ sung 5% dầu DO, theo dõi và đo liên tục chỉ số nhũ hoá E24. Động thái sinh tổng hợp CHHBM của chủng được thể hiện ở Hình 2. Hình 2. Động thái sinh tổng hợp CHHBM của chủng M150 Kết quả từ đồ thị cho thấy chủng bắt đầu tạo CHHBM từ 48 giờ và tăng dần lên, từ 96 giờ đến 120 giờ cao nhất đạt chỉ số nhũ hoá72.7% và không tăng nữa, đến 168 giờ giảm dần. Như vậy sau 4 ngày chủng cho lượng CHHBM cao nhất. Khoảng thời gian để sinh CHHBM cao nhất là tương đối ngắn so với các vi khuẩn Gram dương. 3. TỐI ƯU HOÁ ĐIỀU KIỆN TẠO CHHBM Sự tạo thành CHHBM của vi khuẩn chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường và dinh dưỡng. Trong phạm vi khoá luận này, chúng tôi khảo sát một số các yếu tố quan trọng như pH, nhiệt độ, độ mặn và nguồn cacbon. Các yếu tố này tác động tới quá trình phát triển và tạo CHHBMSH. Do đó chúng tôi tiến hành đo số lượng tế bào và chỉ số nhũ hoá E24 qua các thời điểm để lựa chọn được những thông số phù hợp cho sự phát triển và tạo CHHBM của chủng M150. 3.1. Khảo sát sự thay đổi của pH môi trường pH là yếu tố quan trọng và có ảnh hưởng rất lớn tới sự sinh trưởng và phát triển của các loài nên nó được chọn để nghiên cứu đầu tiên. Theo các tác giả đã thông báo thì vi khuẩn thường có khả năng phát triển tốt nhất ở pH trung tính, thêm vào đó chủng này được phân lập từ mùn khoan là một nguồn chất có tính kiềm nên chúng tôi lựa chọn dải pH khá rộng từ 6 đến 9, ngoài mục đích xác định pH phù hợp, chúng tôi còn muốn đánh giá phạm vi chịu pH của chủng để tạo điều kiện thuận lợi cho các bước nghiên cứu về sau. Chúng tôi tiến hành chuẩn bị các bình chứa môi trường với các pH 6; 7; 7,5; 8,5; 9 có bổ sung 5% (v/v) dầu DO lắc với vận tốc 200 vòng/phút ở điều kiện nhiệt độ phòng. Kết quả được thể hiện ở Bảng 4 và Hình 3. Bảng 4. Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng và tạo CHHBM Thời gian (giờ) Log số lượng tế bào (CFU/ml) Chỉ số nhũ hoá E24(%) 6 7 7,5 8,5 9 6 7 7,5 8,5 9 0 4,8 4,8 4,8 4,8 4,8 0 0 0 0 0 48 6,1 6,7 7,2 6,1 5,3 0 0 4,4 0 0 72 6,6 - 8,6 6,2 5,4 0 22,2 26,6 9,0 2,2 80 7,0 7,9 9,1 7,5 6,9 0 54,4 59,0 13,2 4,4 96 7,6 8,2 9,7 8,3 7,2 4,4 63,5 59,0 54,4 31,1 104 7,7 - 9,0 - 7,7 9,0 68,1 72,7 68,1 59,0 168 - - - - - - 50,0 59,0 54,4 - Hình 3. Ảnh hưởng pH lên sự sinh trưởng và tạo CHHBM của M150 Kết quả cho từ Bảng 4 và Hình 3 cho thấy ở pH =7,5 thì cho chỉ số nhũ hoá cao nhất E24 =72,7% (ở 104 giờ) đồng thời với số lượng tế bào cao nhất lên tới hơn 10 9 CFU/ml. pH =6 thì cho chỉ số nhũ hoá cao thấp nhất E24 = 4,4%, ở pH = 7 cũng cho chỉ số nhũ hoá khá cao E24 = 68,1% vào 104 giờ. Như vậy ở pH = 7,5 là phù hợp nhất cho sự phát triển và tạo CHHBM của chủng vi khuẩn. pH = 7,5 được sử dụng tiếp cho các thí nghiệm về sau. 3.2. Khảo sát sự thay đổi nồng độ muối NaCl môi trường Do chủng phân lập từ mùn khoan dầu khí mỏ Bạch Hổ ngoài khơi Vũng Tàu nên việc kiểm tra độ mặn có ảnh hưởng như thế nào tới sự phát triển của vi khuẩn là rất quan trọng cho việc ứng dụng về sau. Chúng tôi chọn các thí nghiệm với dải nồng độ NaCl là 0%; 0,5%; 1%; 2%; 3% với nguồn cacbon là DO, pH =7,5, ở điều kiện nhiệt độ phòng. Ảnh hưởng của việc thay đổi nồng độ muối được biểu hiện ở Hình 4 và Bảng 5. Bảng 5. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến sinh trưởng và tạo CHHBMSH Thời gian (giờ) Log của số lượng tế bào (CFU/ml) Chỉ số nhũ hoá E24 (%) C-0 C-0,5 C-1 C -2 C-3 E-0,5 E-0,5 E-1 E-2 E-3 0 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 0 0 0 0 0 24 5,4 6,3 5,8 5,2 4,8 0 0 0 0 0 48 6,3 6,8 7,0 5,4 5,0 0 0 0 0 0 72 7,0 7,9 7,3 6,0 5,4 0 26,6 0 0 0 80 7,3 8,6 7,8 7,2 6,1 0 36,5 4,4 0 0 96 8,2 8,9 8,4 7,8 6,7 4,4 59,0 13,2 0 0 Các số liệu cho thấy ở nồng độ muối C=0,5% thì số lượng tế bào là cao nhất và cũng ở chính nồng độ NaCl cho chỉ số nhũ hoá cao nhất E24= 59%. Các nồng độ muối 0%, 3% cho chỉ số nhũ hoá và lượng tế bào thấp nhất là 4,4% và 9%, nồng độ muối 1% và 2% cũng thấp hơn nhiều so vời ở nồng độ muối 0,5%. Vậy nồng độ muối 0,5% là thích hợp nhất cho sự phát triển cũng như là sự tạo CHHBM của M150. Nồng độ muối 0,5% dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. Hình 4. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên sự sinh trưởng và tạo CHHBM của chủng M150 3.3. Khảo sát sự thay đổi nhiệt độ môi trường Thí nghiệm được tiến hành ở nồng độ muối 0,5%; pH = 7,5; nguồn cacbon là dầu DO với các nhiệt độ là 22oC, 30oC, 37oC; kết quả được thể hiện ở Bảng 6 và Hình 5. Bảng 6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng vào tạo CHHBM Thời gian (giờ) Log của số lượng tế bào (CFU/ml) Chỉ số nhũ hoá E24 (%) T-22 T-30 T-37 E-22 E-30 E-37 0 4,3 4,3 4,3 0 0 0 48 6,3 7,0 5,8 0 0 0 72 7,1 7,6 6,3 0 0 0 80 7,7 8,4 6,8 0 31,1 0 96 7,5 8,4 7,5 4,4 59,0 2,2 104 7,6 8,6 7,9 13,2 72,7 4,4 168 7,7 8,3 6,6 35,5 63,4 13,2 Hình 5. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển và tạo CHHBM của chủng M150 Từ số liệu thu được ở Bảng 6 và Hình 5 cho thấy, nhiệt độ thích hợp nhất cho việc tổng hợp CHHBM là 30o C. Nhiệt độ cao hay thấp hơn cũng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và tạo CHHBM của chủng thể hiện rõ ràng ở nhiệt độ 22oC và 37oC vi khuẩn tạo sinh khối ít và chỉ số nhũ hoá thấp. Vậy nhiệt độ 30o C là phù hợp nhất cho sự sinh trưởng và tạo CHHBM trong số các nhiệt độ nghiên cứu. Nhiệt độ này đã được nhiều nhà khoa học thông báo là phù hợp cho sự phát triển của đa số các loài vi khuẩn. Nhiệt độ 30o C được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.4. Khảo sát sự thay đổi nguồn cacbon Để thu được CHHBM cao nhất, nguồn cacbon cũng là một yếu tố quan trọng. Chúng tôi lựa chọn các nguồn cacbon là DO, paraffin, dầu oliu là các nguồn cacbon được thông báo là rất phù hợp cho sự tạo CHHBMSH và dầu saralin là nguồn cacbon trong mùn khoan cần xử lí. Tiến hành thí nghiệm với các nguồn cacbon DO, dầu saralin, paraffin, dầu oliu ở điều kiện nồng độ muối 0,5%; pH=7,5; điều kiện nhiệt độ phòng. Kết quả được thể hiện ở Bảng 7 và Hình 6. Bảng 7. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sự phát triển và tạo CHHBM Thời gian (giờ) Log số lượng tế bào (CFU/ml) Chỉ số nhũ hoá E24(%) DO Saralin Parafin Oliu DO Saralin Paraffin Oliu 0 4,9 4,9 4,9 4,9 0 0 0 0 48 6,8 7,1 5,9 6,3 0 0 0 0 72 8,2 8,7 7,3 7,1 17,7 9 0 0 96 9,6 9,5 8,5 7,1 54,4 41 13,2 0 168 8,3 4,2 8,4 7,2 50,0 35,5 31,2 0 Hình 6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp CHHBM của chủng M150 Các số liệu cho thấy dầu DO là nguồn cacbon thích hợp nhất trong số các nguồn cacbon khảo sát cho sự tạo CHHBM của chủng M150 đồng thời cho sự phát triển của chủng chỉ số nhũ hoá đạt E24= 54,4 %. Như vậy ở điều kiện pH =7,5; nồng độ muối 0,5%; nhiệt độ 30oC và dầu DO là thích hợp cho chủng sinh trưởng và tạo CHHBMSH. Sự tạo thành CHHBMSH cũng song song với quá trình phát triển của chủng khi E24 tăng thì số lượng tế bào cũng tăng theo. Kết quả thu được cũng hợp lí vì CHHBM tạo ra nhằm mục đích giúp vi sinh vật sử dụng dễ dàng các nguồn cacbon không tan trong nước như các nguồn cacbon khảo sát. 4. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CHHBMSH TẠO RA TỪ CHỦNG M150 4.1. Cấu trúc CHHBMSH Cấu trúc phân tử của chất hoạt hoá bề mặt do chủng M150 được nghiên cứu bằng phương pháp phân tích phổ hồng ngoại. Kết quả thu được biểu diễn trên Hình 7 cho thấy trong cấu trúc phân tử của chất hoạt hoá bề mặt có chứa các nhóm chức -OH, CH2, CH. Nhóm – OH với các vị trí tương ứng với tần số giao động v = 1653/cm, v = 1079,09/cm, v = 3377,49/cm. Nhóm CH tương ứng với các vị trí có tần số giao động là v = 1379,29/cm Tại các vị trí có tần số giao động là v = 1735,42/cm là gốc dầu. Các nhóm chức này đều có mặt trong thành phần của chất hoạt hoá bề mặt sinh học đã được cơ quan bảo vệ môi trường của Mỹ công bố. Trong các nhóm chức nói trên thì nhóm -OH và đóng vai trò là tác nhân ưa nước. Nhóm CH, gốc dầu đóng vai trò là tác nhân kị nước. Tuy nhiên để có thể kết luận chính xác CHHBM do chủng tạo ra có thuộc nhóm trehalolipit như nhiều loài thuộc chi Brevibacterium hay không thì cần phải phân tích tiếp khối phổ. Hình 7. Phổ hồng ngoại của CHHBMSH do chủng M150 tạo ra 4.2. Hàm lượng CHHBMSH Sau khi đã xác định được điều kiện môi trường thích hợp và thời điểm sinh CHHBMSH cao nhất, chúng tôi tiến hành thu CHHBMSH để đánh giá hàm lượng cao nhất của nó trong 1ml dịch nuôi cấy. Sau khi lắc120h ở điều kiện pH =7,5; nồng độ muối 0,5%; nguồn cacbon là dầu DO; ở nhiệt độ 30oC, tiến hành thu CHHBMSH bằng cách kết tủa với acetone, sấy khô chân không rồi đem cân bằng cân phân tích được trọng lượng khô của CHHBMSH là 11,6 g/l. 4.3. Độ bền của CHHBM Do điều kiện thực tế xử lí ô nhiễm ở nhiệt độ rất cao, để có thể ứng dụng được, việc xác định khả năng chịu nhiệt của CHHBM là rất cần thiết. Độ bền của CHHBM được đánh giá thông qua nhiệt độ và thời gian lưu giữ nó. Khi tiến hành giữ ở nhiệt độ 100oC chỉ số nhũ hoá còn 92,8% sau 30 phút đun và 78% sau 1h. Độ bền còn được đánh giá ở 30oC và 55oC trong thời gian 3 ngày, 10 ngày, 15 ngày. Kết quả thể hiện ở Bảng 8. Bảng 8. Độ bền của CHHBM do chủng M150 sinh ra (%) Thời gian Nhiệt độ 3 ngày 10 ngày 15 ngày 30oC 100 100 92,8 55oC 100 89 80 Như vậy CHHBMSH tương đối bền với nhiệt: ở 30o C hoạt tính không mấy thay đổi sau 15 ngày, còn ở 55o C hoạt tính biến động hơn, ở 100oC hoạt tính còn đáng kể sau 30 phút. 5. ẢNH HƯỞNG CỦA CHHBMSH ĐẾN KHẢ NĂNG PHÂN HUỶ DẦU CỦA QUẦN THỂ VI SINH VẬT TRONG MÙN KHOAN Sau khi đã có những kết quả về đặc tính của CHHBMSH do chủng M150 tạo ra. Chúng tôi tiến hành thu CHHBM, bổ sung vào trong môi trường chứa dầu saralin cùng với các vi sinh vật sử dụng dầu trong mùn khoan để đáng giá khả năng kích hoạt các vi sinh vật này phân huỷ dầu saralin và lượng CHHBM bổ sung có ý nghĩa ảnh hưởng. Kết quả thu được sẽ định hướng cho chúng tôi trong quá trình xử lí với quy mô lớn hơn. Ảnh hưởng của CHHBM được đánh giá thông qua tác động làm thay đổi số lượng vi sinh vật trong mùn khoan. Khi số lượng vi sinh vật tăng lên có nghĩa là các chủng này đã sử dụng dầu làm nguồn dinh dưỡng và lượng dầu giảm. Đây là cách thức để xử lí ô nhiễm dầu theo phương pháp biostimulation – lấy quần xã sinh vật bản địa làm trung tâm của quá trình xử lí ô nhiễm. Sự biến động số lượng vi sinh vật được thể hiện ở Bảng 9 Bảng 9. Ảnh hưởng của CHHBMSH lên số lượng vi sinh vật mùn khoan CHHBM bổ sung (ml) Số lượng vi sinh vật (CFU/ml) Trước thí nghiệm Sau thí nghiệm 0 4,27.103 6,2.102 1 1,7.106 2 7,8.108 3 1,1.109 Kết quả cho thấy khi bổ sung CHHBM do chủng M150 vào trong môi trường chứa dầu làm tăng số lượng vi sinh vật trong mùn khoan nhiễm dầu. Số lượng vi sinh vật tăng lên rất cao tới 1 triệu lần so với ban đầu chỉ sau 4 ngày. Trong khi đó thí nghiệm không bổ sung CHHBM thì số lượng vi sinh vật giảm đi tới gần 10 lần. Khi bổ sung từ 2 đến 3ml CHHBMSH thì có ảnh hưởng làm tăng rõ rệt. Ở 2ml số lượng tế bào cũng tăng lên rất lớn bằng 70,9% so với khi bổ sung 3 ml. Lượng CHHBM bổ sung 3ml làm tăng số lượng vi sinh vật rõ nhất. Số lượng vi sinh vật tăng lên tới 109 CFU/ml. Vậy có thể kết luận CHHBM do chủng M150 sinh ra có tác động kích thích các vi sinh vật trong mùn khoan sử dụng dầu saralin. Lượng chất bổ sung là 3ml làm tăng rõ nhấtvà có ý nghĩa ứng dụng. KẾT LUẬN Từ 16 chủng vi khuẩn phân lập từ mùn khoan dầu khí Vũng Tầu đã lựa chọn được 3 chủng có khả năng sử dụng dầu cao là MT3, M150, MX. Trong đó chủng M150 có khả năng sử dụng dầu mạnh nhất có chỉ số nhũ hoá cao 72,7%. Chủng này đã được xác định là Brevibacterium celere và được lựa chọn để nghiên cứu tiếp Xác định được một số các đặc điểm sinh hoá của chủng M150: có khả năng khử NO3 thành NO2, sử dụng arginin, ure, gluco ở điều kiện hiếu khí, sử dụng yếu gluconat, adipat, malat, không có khả năng sử dụng, gelatin, trytophan, escunin, caprat, ciprat và phenylacetat, gluco trong điều kiện kị khí. Xác định được động thái sinh tổng hợp CHHBMSH của chủng nghiên cứu mạnh nhất từ 96 giờ đến 144 giờ với chỉ số nhũ hoá E24 đạt 72,8%, hoạt tính bắt đầu giảm đi ở 168 giờ chỉ còn 50%. Xác định được điều kiện tạo CHHBM cao nhất ở pH =7,5; nhiệt độ phù hợp là 30o C; nồng độ NaCl thích hợp là 0,5 %, nguồn cacbon tạo CHHBM mạnh nhất trong các nguồn cacbon nghiên cứu là dầu DO. Khả năng tạo CHHBM cao nhất ở chủng M150 là 11,6 g/l. Xác định được độ bền của CHHBM theo nhiệt độ và thời gian: sau khi xử lí nhiệt độ ở 1000 C hoạt tính còn lại 92,8% sau 30 phút và 78% sau 1 giờ, còn 100% hoạt tính sau 10 ngày giữ ở 30oC chỉ giảm còn 92,8% sau15 ngày giữ, ở 55oC thì hoạt tính giảm mạnh hơn sau 10 ngày còn 89%. Kết quả thí nghiệm cho thấy CHHBM do chủng M150 sinh ra có tác dụng tăng cường khả năng phân huỷ dầu. Tác động mạnh khi bổ sung 2 đến 3 ml. Kết luận CHHBMSH do chủng này sinh ra có khả năng ứng dụng để xử lí mùn khoan. PHỤ LỤC Hình 8. Khả năng nhũ hoá của chủng M150 với các nguồn cacbon khác nhau Hình 9. Khả năng nhũ hoá của CHHBMSH ở các nhiệt độ khác nhau Hình 10. Ảnh hưởng của pH tới khả năng phát triển và nhũ hoá dầu của chủng M150 Hình 11. Khả năng nhũ hoá của chủng M150 với các nồng độ muối khác nhau Hình 12. Hình thái tế bào của chủng M150 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Đinh Thị Ngọ,(2001), Hoá học dầu mỏ và khí, Nhà xuất bản khoa học kĩ thuật. Doãn Thái Hoà, Phan Văn Lập, Trần Đình Mấn, Nguyễn Đình Việt, Lại Thuý Hiền, (2003), “Nghiên cứu ảnh hưởng của CHHBMSH tạo ra từ chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa ASB lên tính lưu biến của dầu thô Bạch Hổ”. Lại Thuý Hiền, (1997), Giáo trình cao học vi sinh học dầu mỏ, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, chung tâm khoa học tự nhiên và tài nguyên quốc gia. Lại Thuý Hiền, Đỗ Thu Phương, Hoàng Hải, Phạm Thị Hằng, Lê Phi Nga, Lê Thị Nhi Công, Kiều Hữu Ảnh, (2003), “Chọn chủng vi sinh vật tạo CHHBMSH cao ứng dụng trong công nghiệp dầu khí và xử lí môi trường”. Tạp chí thông tin dầu khí thế giới số 7/ 2005. Tài liệu tiếng Anh Abu-Ruwaida A. S., I. M. Banat., S. Haditirto., S. Salem., and M. Kadri., (1991), “Isolation of biosurfactant production bacteria – product characterization and evaluation”. Acta. Biotechnol, pp. 315- 324. Asselineau C., Asselineau J. P., (1978), Chem. Fats Lipid, 16, pp. 59 -99. Banat I.M., (1995), “Characterrization of biosurfactant and their use in pollution removal”, Acta. Biotechnol, pp. 251-267. Barksdate L. and Kim K. S., (1977), Bacteriol. Rev., pp .217 -230. Belsky J., Gutnick D. L., Rosenberg E., (1979), “Emulsifier of Athrobacter RAG- 1: Determination and emulsifier bound fat acid”. REFBS Letts., pp. 175 -178. Borraccino R., Kharoune M., Giot R., Agathos S.N., Nyns E.J., Naveau H.P., Pauss A., (2001), “Abiotic transformation of catechol and 1 – naphthol in aqueous solution – influence of environmental factors”. Water research, 35, pp. 3729 -3737. Cameron D.R., Cooper D. G., Neufeld R. J., (1988), “The manoprotein of Sacharomyces cerevisiae is an effective bioemulsifier”. Environ. Microbiol, pp. 1420-1425. Cooper D. G., Pillon D. W., Mulligan C. N., Sheppard J. D., (1986), “Biological additives for improved mechanical dewatering for fuel- grade peal”, Fuel, pp. 255-259. Cooper D.G., Zajic J.E., Denis C., (1981), Oil Chem. Soc., pp.77-80. Davis J.B., (1967), “Petroleum microbialogy”, Amsterdam Elvevier. Publ. Co Elvervier. Desai J.D., Banat I.M. (1997), “Microbial production of surfactants and their commercial potential”, Microbiol. Biol. Rev., 61, pp. 47 -64. Elenap I., Richard C., Yulia A., (2006), “Brevibacterium celere sp. Nov., isolated from degraded thalluses of the brown algae”. Fautz B., Wagner F., (1986), Biotech. Lett, pp. 757-760. Fogt J.M., Westlake D.W., Johnson W.M., Ridgway H.F., (1996), “Environmental gasoline-utilizing isolates and clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa are taxonomically indistinguishable by chemotaxonomic and molercular techniques”, Microbiol., 142, pp. 2333-2340. Guerra-Santos L. H., Kappeli O., Feichter A., (1984), “Pseudomonas aeruginosa biosurfactant production in continuous culture with glucose carbon sources”. Appl. Environ. Microbiol, pp. 301-305. Guerra-Santos L., Kappeli O., Feichter A., (1986), Appl. Microbiol. Bioltechnol, pp. 443-448. Hauser G., Karnovsky M. L. J., (1954), Bacteriol., pp. 645-654. Health and safety laboratory, (2000), “Drilling fluid composition and use within the UK offshore drilling industry”. Ito S., Inoue S., (1982), Biotechnol. Microbiol., pp. 173 -176. Kappeli O., Fiechter A., (1977), “Chemical and structural alterations at the cell surface of Candida tropicalis, induced by hydrocacbon substrate”. J. Bacteriol., pp. 952-958. Kappeli O., Finerty W. R., (1979), “Partition of ankane by an extracellular vesile derived from hexandecane grown Acinetobacter”. J. Bacteriol, pp. 707-712. Leahy J.G., Colwell R.R., (1999), “Microbial degradation of hydrocarbon in the environment”. Microbiol. Rev., 54, pp. 305-315. Marahiel M., Danders W., Kcause M., Kleikauf H., (1979), Biochem., pp. 59 – 52. Margaritis A., ZaZic. J. E., (1979), “Production and surface active properties of microbial surfactant”. Biotechnol. Bioeng., pp. 1151-1162. Karanth N. G. K., Deo P. G., Veenadig N. K., (2000), “Microbiol production of biosurfactants and their importance”. Kosaric N., (1992), “Biosurfactant in industry”. Parkinson M., (1985), Biotechnol. Adv, pp. 65-83. Peypox F., Bonmatin J. M., (1999), “Recent trends in the biochemistry of surfactant”, Appl. Microbiol. Biotechnol, 51, pp. 553-563. Randhirs M., Karl J. R., (2003), “Comparison of synthetic surfactants and biosurfactants in enhancing biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbon”. Rubino W. C., Gutnick D. L., Appl. Environ. Microbiol., (1979), pp. 402-408. Ruhn H. J., Reiff I., (1981), Biochem. Eng., pp. 175 -216. Saferty date sheet – saralin 200, (2003). Yakimov M. M., Timmis K. N., Wray V., Fredrickson H. J., (1995), “Characterization of new lipopedtide surfactant produced by thermotolerant and halotolerant subsurface Bacillus licheniformis ABS50”, Appl. Microbiol. Biotechnol., 61, pp.1706-1713.