Đánh giá mối quan hệ di truyền nguồn gen trám đen cổ loa sử dụng kỹ thuật ISSR

27 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 2(99)/2019 Study on caring techniques for in vitro ginger G10 variety in nursery Trinh Thuy Duong, Le Kha Tuong, Pham Thi Kim Hanh Abstract Tissue culture is an appropriate technique to quickly multiply free disease ginger variety G10. The survive ratio of plantlets reached highest 91% when the in vitro plantlets were acclimatized by placing culture flasks at room temperature for 3 days and on nursery for 4 days. The plantlets were transplanted on the crushing coir substrate or on alluvial soil: coconut fiber (1:1) combined with periodically spraying (every 7 to 10 days) fertilizer solution of Grown More with N : P : K ratio of 30 :20 : 10 in the first month and Grown More with N : P : K ratio of 30 : 10 : 10 in the next month. Keywords: Ginger G10, in vitro ginger, tissue culture, nursery Ngày nhận bài: 17/12/2018 Ngày phản biện: 28/12/2018 Người phản biện: PGS. TS. Ninh Thị Phíp Ngày duyệt đăng: 11/1/2019 1 Trung tâm Tài nguyên thực vật; 2 Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật ĐÁNH GIÁ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN NGUỒN GEN TRÁM ĐEN CỔ LOA SỬ DỤNG KỸ THUẬT ISSR Phạm Hùng Cương1, Phạm Thị Kim Hạnh1, Hồ Thị Loan2 TÓM TẮT Trám đen (Canarium tramdenum Dai & Yakovlev) được trồng lâu đời ở khu di tích lịch sử Thành Cổ Loa thuộc xã Cổ Loa, huyện Đông Anh, Hà Nội. Theo các thư tịch cổ và những công bố gần đây, Trám đen được ghi nhận về giá trị kinh tế, văn hóa, sinh thái. Tuy nhiên, quần thể Trám đen đang bị suy giảm về năng suất và diện tích nhưng chưa có nghiên cứu nào để bảo tồn và phát triển nguồn gen quý này. Đánh giá quan hệ di truyền của quần thể Trám đen Cổ Loa sử dụng 8 mồi ISSR với 20 mẫu Trám, kết quả 8 mồi có biểu hiện tính đa hình, 537 băng ADN được nhân bản ngẫu nhiên. Hệ số tương đồng di truyền của 20 mẫu Trám dao động từ 0,928 (Trám22) - 1. Quần thể Trám đen ở Cổ Loa có hệ số đa dạng di truyền thấp, như vậy quần thể không đa dạng di truyền và dễ bị tổn thương do điều kiện ngoại cảnh. Kết quả này là cơ sở để xây dựng giải pháp bảo tồn và phát triển Trám đen Cổ Loa. Từ khóa: Trám đen, ISSR, bảo tồn, đa dạng di truyền, quần thể, mối quan hệ di truyền I. ĐẶT VẤN ĐỀ Chi Trám ở nước ta có 8 loài, trong đó 3 loài có quả ăn được trong đó Trám đen (Canarium tramdenum Dai & Yakovlev, đồng danh: C. Nigrum; C. pimaela) được nhân dân sử dụng làm thực phẩm từ lâu đời, có giá trị kinh tế cao và được trồng nhiều nhất hiện nay ở Việt Nam (Nguyễn Tiến Bân, 2003 - 2005; Lý Quỳnh Thu, Hoàng Thanh Lộc, 2011). Những phân tích hóa sinh trong quả, lá, nụ non cho thấy giá trị dinh dưỡng của loài cây này (Maloney, 1996). Trám đen được trồng ở Khu di tích lịch sử Cổ Loa, huyện Đông Anh, thành phố Hà Nội từ lâu đời. Do có giá trị kinh tế và giá trị lịch sử nên việc bảo tồn và phát triển cây này cần được quan tâm, cần phải đánh giá mức độ đa dạng và quan hệ di truyền của quần thể cây Trám đen Cổ Loa. Trong các kỹ thuật phân tử, kỹ thuật ISSR (chuỗi lặp lại đơn giản giữa) có hiệu quả cao trong nghiên cứu đa dạng di truyền trên nhiều loài thực vật do có nhiều ưu điểm. Các markers ISSR có sự đa hình cao và hữu ích trong các nghiên cứu đa dạng di truyền, phát sinh chủng loại, đánh dấu gen, lập bản đồ gen và sinh học tiến hóa (Reddy et al., 2002). Do đó, kỹ thuật ISSR được sử dụng rộng rãi phục vụ công tác bảo tồn và phát triển các giống cây trồng, cây thuốc (Capparelli et al., 2004; Kumar A. et al. 2014). Các nghiên cứu trong nước về thực vật đã sử dụng kỹ thuật ISSR đối với cây Ba kích, Cam sành, Sơn tra, Măng cụt (Hoàng Đăng Hiếu và ctv., 2016; Vũ Văn Hiếu và ctv., 2015; Vũ Thị Thu Hiền và ctv., 2016; Trần Nhân Dũng và Trần Thị Lệ Quyên, 2012). II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Sử dụng 8 mồi cho chỉ thị ISSR (Wang et al., 2010) (Bảng 1). Vật liệu gồm 20 mẫu cành, lá của 20 cá thể được chọn ngẫu nhiên từ quần thể gồm 67 cá thể Trám đen tại Cổ Loa (Bảng 2). 28 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 2(99)/2019 Bảng 1. Trình tự các nucleotide của 8 chỉ thị ISSR được sử dụng trong nghiên cứu TT Tên mồi Trình tự Nucleotide TT Tên mồi Trình tự Nucleotide 1 ISSR1 5’- GAGAGAGAGAGAGAGAGAT -3’ 5 ISSR7 5’- GAGAGAGAGAGAGAGAGAYT-3’ 2 ISSR2 5’- GAGAGAGAGAGAGAGAGAC -3’ 6 ISSR8 5’- GAGAGAGAGAGAGAGAGAYC-3’ 3 ISSR5 5’ -AGAGAGAGAGAGAGAGAGYC-3’ 7 ISSR9 5’ –ACACACACACACACACACYG-3’ 4 ISSR6 5’- AGAGAGAGAGAGAGAGAGYA-3’ 8 ISSR10 5’-AGAGAGAGAAGAGAGAAGAGAT-3’ Bảng 2. Vị trí địa lý cây Trám đen được lấy mẫu tại Cổ Loa, Đông Anh và Hòa Bình TT Ký hiệu mẫu Tên mẫu Địa chỉ chủ cây Vị trí cây (Tọa độ số hóa: Vĩ độ N; Kinh độ E) 1 Tram1  Cây số 1 Thôn Thượng, Cổ Loa, Đông Anh 21,730oN;105,523oE 2 Tram2  Cây số 2 Thôn Thượng, Cổ Loa, Đông Anh 21,729oN;105,522oE 3 Tram9  Cây số 9 Thôn Thượng, Cổ Loa, Đông Anh 21,730oN;105,523oE 4 Tram10  Cây số 10 Thôn Thượng, Cổ Loa, Đông Anh 21,730oN;105,523oE 5 Tram14  Cây số 14 Thôn Thượng, Cổ Loa, Đông Anh 21,731oN;105,323oE 6 Tram16  Cây số 16 Thôn Thượng, Cổ Loa, Đông Anh 21,722oN;105,523oE 7 Tram19  Cây số 19 Thôn Thượng, Cổ Loa, Đông Anh 21,732oN;105,523oE 8 Tram21  Cây số 21 Thôn Thượng, Cổ Loa, Đông Anh 21,731oN;105,524oE 9 Tram22  Cây số 22 Thôn Thượng, Cổ Loa, Đông Anh 21,730oN;105,524oE 10 Tram24  Cây số 24 Thôn Thượng, Cổ Loa, Đông Anh 21,735oN;105,524oE 11 Tram25  Cây số 25 Thôn Thượng, Cổ Loa, Đông Anh 21,732oN;105,523oE 12 Tram26  Cây số 26 Thôn Thượng, Cổ Loa, Đông Anh 21,730oN;105,524oE 13 Tram27  Cây số 27 Thôn Thượng, Cổ Loa, Đông Anh 21,728oN;105,524oE 14 Tram28  Cây số 28 Thôn Thượng, Cổ Loa, Đông Anh 21,728oN;105,524oE 15 Tram32  Cây số 32 Thôn Thượng, Cổ Loa, Đông Anh 21,727oN;105,523oE 16 Tram41  Cây số 41 Thôn Thượng, Cổ Loa, Đông Anh 21,725oN;105,522oE 17 Tram44  Cây số 44 Thôn Thượng, Cổ Loa, Đông Anh 21,728oN;105,524oE 18 Tram46  Cây số 46 Thôn Thượng, Cổ Loa, Đông Anh 21,725oN;105,522oE 19 Tram47  Cây số 47 Thôn Thượng, Cổ Loa, Đông Anh 21,724oN;105,521oE 20 Trám40 Đối chứng Kỳ Phú, Nho Quan, Ninh Bình 20,114oN;105,445oE 2.2. Phương pháp nghiên cứu Tách chiết ADN tổng số sử dụng DNeasy plant mini Kit của hãng QIAgen (QIAGEN, 2016) và có cải tiến theo quy trình 9 bước. Nhân bản các đoạn ADN đích bằng kỹ thuật PCR, thành phần phản ứng PCR ở Bảng 3. Căn cứ thông số kỹ thuật của mồi do nhà sản xuất cung cấp để tối ưu hóa chu trình nhiệt PCR và thiết lập được chu trình nhiệt tốt nhất. Cuối cùng điện di ADN trên gel agarose để kiểm tra ADN tổng số. Phân tích phản ứng PCR-ISSR và số liệu: Dựa vào hình ảnh điện di sản phẩm PCR ghi nhận sự xuất hiện các băng điện di theo kích thước và thống kê với từng mồi ở từng mẫu nghiên cứu dựa trên phần mềm POPGENE 1.32 để xác định các chỉ số đa dạng di truyền (Nei, 1973; Yeh et al., 1999). Dùng phần mềm NTSYS 2.0 để xác định mức độ đa hình và lập biểu đồ hình cây, phân nhóm UPGMA (Rohlf, 1992). Bảng 3. Thành phần hỗn hợp PCR TT Thành phần Nồng độ Số lượng (µl) 1 Taq PCR Mastermix 2x 25 2 Mồi 20 pmol 2 4 ADN tổng số 10 ng 2 5 Nước cất khử ion - 19 Tổng 50 29 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 2(99)/2019 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 10/2017 đến tháng 6/2018 tại khu di tích lịch sử Cổ Loa, Trung tâm Tài nguyên thực vật và Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết ADN và phân tích hình ảnh điện di Nghiên cứu các phương pháp tối ưu hóa quy trình tách chiết ADN đã tách chiết thành công ADN của 20 mẫu Trám kết quả thể hiện ở Hình 1. Hình 1. Điện di ADN tổng số của 20 mẫu Trám 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Kết quả diện di sản phẩm PCR của 20 mẫu Trám với 6 mồi: ISSR1,ISSR2, ISSR6, ISSR7, ISSR8 và ISSR10 đều thể hiện tính đa hình, tuy nhiên không tìm thấy sự sai khác ADN giữa các mẫu Trám. Sử dụng mồi ISSR5 có 16 mẫu thể hiện tính đa hình và có 4 mẫu (Tram1; Tram19; Tram25; Tram47) không thể hiện tính đa hình. Như vậy có sự sai khác ADN giữa 4 mẫu (Tram1; Tram19; Tram25; Tram47) với các mẫu còn lại (Hình 2 phần A, B). Mồi ISSR9 có 3 phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên với các kích thước (450bp; 500bp; 650bp). Trong đó 2 phân đoạn 450bp và 650bp đều xuất hiện ở cả 20 mẫu trám, riêng phân đoạn có kích thước 500bp chỉ xuất hiện ở mẫu tram22. Như vậy có sự sai khác ADN giữa mẫu Tram22 và các mẫu còn lại (Hình 2 phần C, D). Hình 2. Hình ảnh điện di sản phẩm ISSR: Ảnh A và B sử dụng mồi ISSR5; Ảnh C và D sử dụng mồi ISSR9 Ghi chú: M: Ladder, 1: Tram1; 2: Tram2; 3: Tram9; 4: Tram10; 5: Tram14; 6: Tram16; 7: Tram19; 8: Tram21; 9: Tram22; 10: Tram24; 11: Tram25; 12: Tram26; 13: Tram27; 14: Tram28; 15: Tram32; 16: Tram40; 17: Tram41; 18: Tram44; 19: Tram46; 20: Tram47. A C B D Tổng hợp thông tin phản ứng PCR của 8 mồi ISSR được thể hiện ở bảng 4. Các mẫu ADN của Trám đen Cổ Loa đều cho tính đa hình với số phân đoạn từ 2 đến 6 phân đoạn ở tất cả các mồi ISSR nghiên cứu. Trong số 08 mồi phân tích, mồi ISSR8 cho số phân đoạn ADN được nhân bản là nhiều nhất (6 phân đoạn) với kích thước từ 200bp - 1000bp và số phân đoạn được nhân bản ít nhất là ở mồi ISSR5; ISSR9 (2 phân đoạn). Còn lại các mồi ISSR1; ISSR2 ISSR7; ISSR10 có 4 phân đoạn, mồi ISSR6 có 3 phân đoạn trong đó có 1 phân đoạn đơn hình chỉ có ở mẫu Tram22. 30 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 2(99)/2019 Bảng 4. Tổng số băng, số phân đoạn và tỷ lệ đa hình khi sử dụng 08 mồi ISSR Mồi Tổng số băng Số phân đoạn ADN Kích thước (bp) Số phân đoạn đa hình Số phân đoạn đơn hình Tỷ lệ phân đoạn đa hình (%) Na Ne h I ISSR1 80 4 400-700 4 0 100 1,00 1,00 00 00 ISSR2 60 4 400-600 4 0 100 1,00 1,00 00 00 ISSR5 36 2 300-700 0 0 100 2,00 1,47 0,32 0,50 ISSR6 40 3 350-450 2 1 66,67 1,00 1,00 00 00 ISSR7 80 4 300-550 4 0 100 1,00 1,00 00 00 ISSR8 120 6 200-1000 6 0 100 1,00 1,00 00 00 ISSR9 41 2 400-600 2 0 100 2,00 1,10 0,09 0,12 ISSR10 80 4 250-1000 4 0 100 1,00 1,00 00 00 Trung bình/ mồi 26,85 3,6 1,25 1,07 0,05 0,09 Ghi chú: Na: số alen quan sát được; Ne: số alen có ý nghĩa; h: hệ số đa dạng di truyền Nei; I: chỉ số đa dạng di truyền theo Shannon. Từ kết quả nghiên cứu này cho thấy các mẫu Trám thu được ở Cổ Loa khá đồng nhất về di truyền, chỉ số đa dạng di truyền theo Nei và theo Shannon rất thấp (h = 0,05; I = 0,09). Điều này cho phép nhận định quần thể Trám Cổ Loa không đa dạng di truyền, quần thể ít đa dạng di truyền rất dễ bị tổn thương do các tác động của điều kiện ngoại cảnh vì vậy cần có kế hoạch phù hợp để bảo tồn và cải tạo quần thể này. 3.2. Mối quan hệ di truyền của các mẫu Trám nghiên cứu Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện các phân đoạn ADN của các mẫu Trám khi điện di sản phẩm ISSR để xác định hệ số đa dạng di truyền của các mẫu Trám. Hệ số đa dạng di truyền cho biết mối tương quan về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích. Số liệu thu được từ kết quả ISSR được đưa vào xử lý bằng phần mềm NTSYSpc version 2.0 (Rohlf, 1992) để tính hệ số tương đồng di truyền và xây dựng biểu đồ quan hệ di truyền giữa các mẫu Trám. Kết quả phân tích ở bảng 5 cho thấy hệ số tương đồng di truyền theo cặp của 20 mẫu Trám nghiên cứu rất cao từ 0,928 - 1. Sự tương đồng di truyền được minh họa bằng sơ đồ hình cây (Hình 3) cho thấy mối quan hệ di truyền của 20 mẫu Trám nghiên cứu được chia làm hai nhóm chính: - Nhóm I: Gồm 19 mẫu Trám được chia thành 2 nhóm phụ: + Nhóm phụ 1: Gồm 4 mẫu Trám (Tram1; Tram19; Tram25; và Tram47) có hệ số di truyền sai khác với các giống ở nhánh phụ II 0,09 %. + Nhóm phụ 2: Gồm 15 mẫu Trám là Tram 2; Tram 14; Tram 16; Tram 46; Tram 27; Tram 32; Tram 9; Tram 10; Tram 21; Tram 24; Tram 22; Tram 40; Tram 28; Tram 44; Tram 41; Tram 19; Tram 25; Tram 26. - Nhóm II: Chỉ có 1 mẫu Tram22 (mẫu Trám thu thập ở Ninh Bình) có hệ số tương đồng di truyền giữa chúng là 0,964. Như vậy, mức độ sai khác di truyền giữa 20 mẫu Trám rất thấp. Hình 3. Sơ đồ quan hệ di truyền của 20 mẫu Trám nghiên cứu theo hệ số của Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA 31 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 2(99)/2019 Tr am 1 Tr am 2 Tr am 9 Tr am 10 Tr am 14 Tr am 16 Tr am 19 Tr am 21 Tr am 22 Tr am 24 Tr am 25 Tr am 26 Tr am 27 Tr am 28 Tr am 32 Tr am 40 Tr am 41 Tr am 44 Tr am 46 Tr am 47 Tr am 1 1, 00 0 Tr am 2 0, 96 4 1, 00 0 Tr am 9 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 Tr am 10 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 Tr am 14 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 Tr am 16 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 Tr am 19 1, 00 0 0, 96 4 0, 96 4 0, 96 4 0, 96 4 0, 96 4 1, 00 0 Tr am 21 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 Tr am 22 0, 92 8 0, 96 4 0, 96 4 0, 96 4 0, 96 4 0, 96 4 0, 92 8 0, 96 4 1, 00 0 Tr am 24 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 Tr am 25 1, 00 0 0, 96 4 0, 96 4 0, 96 4 0, 96 4 0, 96 4 1, 00 0 0, 96 4 0, 92 8 0, 96 4 1, 00 0 Tr am 26 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 Tr am 27 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 Tr am 28 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 Tr am 32 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 Tr am 40 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 Tr am 41 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 Tr am 44 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 Tr am 46 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 0, 96 4 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 1, 00 0 Tr am 47 1, 00 0 0, 96 4 0, 96 4 0, 96 4 0, 96 4 0, 96 4 1, 00 0 0, 96 4 0, 92 8 0, 96 4 1, 00 0 0, 96 4 0, 96 4 0, 96 4 0, 96 4 0, 96 4 0, 96 4 0, 96 4 0, 96 4 1, 00 0 Bả ng 5 . H ệ s ố tư ơn g đồ ng d i t ru yề n củ a 2 0 m ẫu T rá m n gh iê n cứ u 32 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 2(99)/2019 IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Trên cơ sở khảo sát quần thể Trám đen tại xã Cổ Loa, huyện Đông Anh, Hà Nội đã chọn ngẫu nhiên 20 cây Trám đen để thu thập mẫu và tách chiết thành công ADN. Sử dụng 8 mồi ISSR để phân tích đa dạng di truyền. Kết quả đã nhận được 537 băng ADN được nhân bản ngẫu nhiên với 08 mồi ISSR của 20 mẫu Trám, cả 8 mồi có biểu hiện tính đa hình. Hệ số tương đồng di truyền của 20 mẫuTrám nghiên cứu dao động từ 0,928 - 1. Trong đó, mẫu Trám 22 có hệ số tương đồng nhỏ nhất là 0,928. Các mẫu Trám có mối quan hệ di truyền rất gần gũi, chúng tập chung 1 nhánh chính trên cây phát sinh chủng loại. Quần thể Trám ở Cổ Loa có hệ số đa dạng di truyền thấp,điều này cho phép nhận định quần thể không đa dạng di truyền, do đó dễ bị tổn thương bởi các tác động của điều kiện ngoại cảnh. 4.2. Đề nghị Đề nghị cần có giải pháp duy trì quần thể Trám đen Cổ Loa khỏe mạnh tránh các tác động gây tổn thương di truyền, kết hợp với các biện pháp cải tạo quần thể nhằm bảo tồn và phát triển bền vững. TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Tiến Bân (Chủ biên), 2003 - 2005. Danh lục các loài thực vật ở Việt Nam. NXB Nông nghiệp. Hà Nội. Trần Nhân Dũng và Trần Thị Lê Quyên, 2012. Đa dạng di truyền các giống/dòng măng cụt (Garcinia mangostanal) dựa trên dấu phân tử ISRR ở Bình Dương. Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, 23a: 253-261. Hoàng Đăng Hiếu, Chu Thị Thu Hà, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Nguyễn Thị Thúy Hường, Chu Hoàng Hà, 2016. Sử dụng chỉ thị ISSR trong việc đánh giá đa dạng di truyền ở quần thể Ba kích tại Quảng Ninh. Tạp chí Sinh học, 38 (1) 89-95. Vũ Thị Thu Hiền, Trần Thị Liệu, Đinh Thị Phòng, Phí Hồng Hải, La Ánh Dương, Vũ Đức Toàn, Delia Catacutan, Đàm Việt Bắc, 2016. Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các quần thể Sơn Tra (Docynia indica Wall. Decne) bằng chỉ thị ISSR. Tạp chí KHLN 4/2016 (4603-4613). Lý Quỳnh Thu, Hoàng Thanh Lộc, 2011. Chọn giống và phát triển giống Trám lấy quả tại Hòa Bình và một số tình phía Bắc. Trung tâm Thông tin, Bộ Nông nghiệp & PTNT. Capparelli R., Visca rdi M., Amoroso M.G., Blaiotta G., 2004. Inter-simple sequence repeat markers and flow cytometry for the characterization of closely related Citrus limon germplasms. Biotechnology Letters, 26: 1295-1299. Kumar, Amit & Mishra, Priyanka & Chandra Singh, Subhash & Velusamy, Sundaresan, 2014. Efficiency of ISSR and RAPD markers in genetic divergence analysis and conservation management of Justicia adhatoda L., a medicinal plant. Plant Systematics and Evolution. 10.1007/s00606-013-0970-z. Maloney B.N., 1996. Cannarium in the Southeast Asian and Oceanic archaeobotanical and pollen records. Palaeoecology Center, The Qeen’s University. Nei M., 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 70: 3321-3323. Reddy P. M., Sarla N., Siddiq E. A., 2002. Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding. Euphytica, 128-2: 9-17. QIAGEN, 2016. DNeasy Plant Handbook. Available from: https://www.qiagen.com/jp/resources/ download.aspx?id=6b9bcd96-d7d4-48a1-9838- 58dbfb0e57d0&lang=en; assessed on 14/5/2018. Rohlf F.J., 1992. NTSYS-PC: Numerical taxonomy and multivariate analysis system version 2.0. State University of New York (Stony Brook, New York). Wang X.M., 2010. Optimization of DNA isolation, ISSR-PCR system and primers screening of genuine species of rhubarb, an important herbal medicine in China. J. Med. Plants Res. 4 (10) (2010): 904-908. Yeh F.C., Yang R.C., Boyle T., 1999. POPGENE Microsoft Windows-Based Freeware for Population Genetic Analysis. Release 1.32, University of Alberta, Edmonton. Evaluation of genetic relationship among Black Oliver at Co Loa commune by using ISSR technique Pham Hung Cuong, Pham Thi Kim Hanh, Ho Thi Loan Abstract Black Oliver has been planted in some places at Co Loa historical site, Dong Anh Dist,. Hanoi for a long time. However, its population in Co Loa has reduced in term of area and productivity. Due to the economic value as well as the historical value of the Black-Oliver population in relic area, conservation and development of this tree should be paid more attention. Eight ISSR primers were used to study the genetic relationship of 20 black oliver samples. The