Đánh giá sinh khả dụng của viên nén Ayclovir kết dính sinh học trên chó thực nghiệm

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 94 ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA VIÊN NÉN AYCLOVIR KẾT DÍNH SINH HỌC TRÊN CHÓ THỰC NGHIỆM Lê Văn Thanh*; Vũ Thị Thu Giang**; Trần Cát Đông*; Nguyễn Thị Trang** TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá sinh khả dụng của viên nén acyclovir (ACV) kết dính sinh học (KDSH)có so sánh với viên nén zovirax trên chó thực nghiệm. Phương pháp: sử dụng phương pháp chéo đôi đơn liều 2 giai đoạn; phân tích ACV trong huyết tương chó bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết quả: Tmax và AUC0-∞ của viên ACV KDSH tương đương, còn Cmax và MRT không tương đương với viên đối chiếu. Kết luận: đã xác định các thông số dược động học Cmax, Tmax, λz, MRT của viên nén ACV KDSH có so sánh viên nén zovirax. * Từ khóa: Acyclovir; Sinh khả dụng; Kết dính sinh học. Bioavailability of Acyclovir Mucoadhesive Tablets on Experimental Dogs Summary Objectives: To compare the bioavailability of ACV mucoadhesive tablets with zovirax tablets on experimental dogs. Methods: Using a single-dose, cross-over design, 2-stage method, HPLC method was used to identify and assay acyclovir concentrations in dog plasma. Results: The Tmax and AUC0-∞ of acyclovir mucoadhesive tablets were equivalent to zovirax counterparts, whereas the values of Cmax and MRT were inequivalent. Conclusion: Were recognised pharmacokinetic parameters Cmax, Tmax, λz, MRT of acyclovir mucoadhesive gastrointestinal tablets and zovirax tablets. * Key words: Acyclovir; Bioavailability; Mucoadhesive. ĐẶT VẤN ĐỀ Acyclovir là dẫn chất tổng hợp của axít nucleoxit-guanosin, có tác dụng mạnh và chọn lọc trên các virut gây bệnh ở người, bao gồm virut Herpes simplex týp 1 và 2, các virut Varicella-zoster, virut Epstien-barr và Cytomegalo. Tuy nhiên, ACV có thời gian bán thải ngắn, hấp thu chậm và không hoàn toàn [1, 2]. Để khắc phục những nhược điểm trên, trên thế giới cũng như tại Trường Đại học Dược Hà Nội đã có nhiều nghiên cứu về hệ KDSH dạ dày chứa ACV như vi cầu, viên nén nhằm cải thiện hấp thu thuốc ở đường tiêu hóa, tăng hiệu quả điều trị. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu sinh khả dụng của viên nén ACV KDSH trên chó thực nghiệm. * Học viện Quân y ** Trường Đại học Dược Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Lê Văn Thanh (levanthanh090963@yahoo.com) Ngày nhận bài: 20/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/08/2016 Ngày bài báo được đăng: 12/09/2016 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016 95 NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Nguyên liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu. * Nguyên liệu và hóa chất: Hóa chất Tiêu chuẩn Nơi sản xuất ACV chuẩn Chuẩn quốc gia Viện Kiểm nghiệm Thuốc TW Methanol HPLC Merck, Đức Axít phosphoric 85% Nhà sản xuất Merck, Đức Axít percloric Nhà sản xuất Merck, Đức Natri 1-octansulfonic Nhà sản xuất Baker, Anh Axít hydrocloric TKHH Trung Quốc Natri hydroxyd BP Merck, Đức Axít acetic băng HPLC Merck, Đức * Thuốc thử-thuốc đối chiếu: - Thuốc thử: viên nén ACV 200 mg KDSH đạt tiêu chuẩn cơ sở. - Thuốc đối chiếu: viên nén zovirax 200 mg (Hãng GlaxoSmithKline, số lô 8953, hạn sử dụng 01 - 2017). * Thiết bị: - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao SHIMADZU (Nhật). - Máy ly tâm lạnh Sartorius Sigma 2-16K (Đức). - Máy lắc xoáy Volp (Italia). - Tủ lạnh sâu (-400C) Sanyo MDF-236 (Nhật). - Micropipet và các dụng cụ thủy tinh dùng cho phân tích. * Đối tượng nghiên cứu: Chó ta khoẻ mạnh, giống đực, cân nặng 12 - 14 kg, được nuôi dưỡng trong điều kiện thí nghiệm với chế độ ăn uống đầy đủ và được kiểm soát. Chó để nhịn đói 10 giờ qua đêm trước khi tiến hành thí nghiệm. 2. Phương pháp nghiên cứu. Chia ngẫu nhiên 6 chó làm 2 nhóm (mỗi nhóm 3 con), thử theo phương pháp chéo đôi, đơn liều. Đợt đầu tiên, cho 3 con uống viên nén ACV KDSH đường tiêu hóa, 3 con còn lại uống viên nén zovirax với liều 1 viên/con. Đợt sau đổi ngược lại. Hai đợt tiến hành cách nhau 5 ngày. Thời điểm lấy mẫu: 0,5-1-1,5-2-2,5-3-3,5-4-4,5- 5-5,5-6-8-10-12 và 24 giờ sau khi uống thuốc thử; 0,5-1-1,5-2-2,5-3-3,5-4,5-6-8- 10-12 và 24 giờ sau khi uống thuốc chứng. Mỗi lần lấy khoảng 3 - 4 ml máu. * Xử lý mẫu: Mẫu huyết tương để rã đông ở nhiệt độ phòng. Lấy 1 ml huyết tương, thêm 250 µl dung dịch axít percloric 20%, lắc xoáy 15 giây, ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút. Sau đó, hút lớp dung dịch phía trên lọc qua màng lọc 0,45 µm, tiêm sắc ký. Các mẫu huyết tương trắng có pha ACV chuẩn và huyết tương chó sau khi uống thuốc đều được chiết theo quy trình trên rồi tiến hành phân tích. * Định lượng nồng độ ACV trong huyết tương chó: Mẫu huyết tương có chứa ACV sau khi chiết xuất được định lượng bằng phương pháp HPLC, tiến hành theo các điều kiện đã được khảo sát sau đây: - Cột sắc ký: C18; 250 x 4,6 mm; 5 µm. Nhiệt độ cột 400C. - Pha động: methanol:dung dịch đệm pH 3,0 (tỷ lệ 8:92) (dung dịch đệm pH 3,0 pha như sau: 0,43 g natri octansulfonic trong 1.000 ml nước, chỉnh về pH 3,0 bằng axít phosphoric). T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 96 - Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút. - Detector: PDA, bước sóng 252 nm. - Thể tích tiêm: 100 µl. - Nhiệt độ autosampler: 40C. Trước khi tiến hành đánh giá sinh khả dụng, thẩm định lại phương pháp theo hướng dẫn của US-FDA [3] về định lượng thuốc trong dịch sinh học. * Xác định các thông số dược động học: Với ][ 0AUC ∞ , Cmax, MRT: sử dụng ‘‘khoảng tin cậy 90%’’ còn gọi là phương pháp two-one-sided t-test. Các thông số cần so sánh ( ][ 0AUC ∞ , Cmax, MRT) của chế phẩm thử và chế phẩm đối chiếu thu được từ thiết kế chéo đôi, đơn liều chuyển qua dạng logarit tự nhiên và đưa vào phân tích phương sai. Khoảng tin cậy 90%CI được tính theo công thức: CI = µT - µR ± t (0,1; n).(S.2/N)1/2 Với: - µT: giá trị trung bình thu từ mẫu thử chuyển sang logarit. - µR: giá trị trung bình thu từ mẫu đối chiếu chuyển sang logarit. - t (0,1; n): kết quả tra bảng student t-test với bậc tự do n, mức ý nghĩa 0,1. - S: căn bậc hai của bình phương sai số trung bình thu được từ kết quả phân tích phương sai của thiết kế chéo đôi đơn liều. - N: tổng số động vật thí nghiệm. - Tmax: so sánh theo phương pháp thống kê phi tham số (Wincoxon Signed Rank test). Hai chế phẩm được coi là tương đương sinh học nếu CI nằm trong khoảng (0,8 - 1,25) và Tmax khác nhau không có ý nghĩa thống kê. Xác định các thông số dược động học theo phương pháp không dựa vào mô hình ngăn bằng phần mềm WinNonlin 6.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Xác định nồng độ ACV trong huyết tương chó. Tiến hành phân tích các mẫu huyết tương chó ở cả 2 nhóm (thuốc thử và thuốc đối chiếu) theo phương pháp tủa protein bằng axít percloric và định lượng ACV bằng phương pháp HPLC. Xác định nồng độ ACV có trong mẫu dựa vào đường chuẩn được tiến hành đồng thời trong ngày. Bảng 1: Nồng độ ACV trong huyết tương chó sau uống viên nén ACV 200 mg KDSH và viên nén zovirax (n = 6, X ± SD). Thời gian (giờ) Nồng độ ACV trong huyết tương chó sau uống viên ACV KDSH (µg/ml) Thời gian (giờ) Nồng độ ACV trong huyết tương chó sau uống viên zovirax (µg/ml) 0 0 0 0 0,5 0,375 ± 0,83 0,5 0,651 ± 1,31 1 1,827 ± 2,08 1 2,450 ± 2,68 1,5 2,594 ± 2,57 1,5 4,242 ± 3,00 2 3,395 ± 3,28 2 6,618 ± 3,42 2,5 3,511 ± 2,70 2,5 7,243 ± 3,44 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016 97 3 3,760 ± 2,25 3 7,701 ± 3,16 3,5 4,287 ± 1,87 3,5 7,957 ± 3,30 4 4,608 ± 1,75 - - 4,5 5,442 ± 0,62 4,5 7,319 ± 2,46 5 5,383 ± 0,59 - - 5,5 5,286 ± 1,16 - - 6 5,377 ± 0,89 6 5,097 ± 1,79 8 3,619 ± 1,33 8 3,067 ± 1,25 10 2,825 ± 1,36 10 1,522 ± 0,64 12 1,795 ± 0,89 12 0,801 ± 0,35 24 0,234 ± 0,12 24 0,081 ± 0,13 Hình 1: Đường cong nồng độ ACV - thời gian trong huyết tương chó sau uống viên nén ACV 200 mg KDSH và viên nén zovirax (n = 6). 2. Phân tích dược động học và so sánh sinh khả dụng của viên nén ACV 200 mg KDSH với viên nén zovirax 200 mg. * Xác định các thông số dược động học: Từ kết quả định lượng nồng độ ACV trong huyết tương chó (bảng 1) và bằng phương pháp xác định thông số dược động học, chúng tôi xác định một số thông số dược động học cơ bản. Viên nén KDSH Viên nén zovirax N ồn g độ AC V tro n g hu yế t t ư ơ n g (µg /m l T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 98 Bảng 2: Các thông số dược động học trên chó sau uống viên nén ACV 200 mg KDSH và viên nén zovirax (n = 6). Thông số dược động học Viên ACV KDSH ( X ± SD) Viên zovirax ( X ± SD) Tmax (giờ) 4,25 ± 1,44 3,25 ± 1,17 Cmax (µg/ml) 6,501 ± 1,40 9,278 ± 2,31 λz (1/giờ) 0,2029 ± 0,07 2,1749 ± 0,42 AUC0-∞ (giờ.µg/ml) 54,5166 ± 11,28 52,3128 ± 13,22 AUC0-24 (giờ.µg/ml) 52,2472 ± 12,10 50,4573 ± 12,79 MRT (giờ) 8,1323 ± 1,08 5,5641 ± 1,08 * Phân tích thống kê và so sánh sinh khả dụng của viên nén ACV 200 mg KDSH với viên nén zovirax: Từ kết quả xác định các thông số dược động học của thuốc thử và thuốc đối chiếu, so sánh sinh khả dụng của viên nén ACV 200 mg KDSH với viên nén zovirax. Bảng 3: Phân tích phương sai với các biến phụ thuộc: , lnCmax và lnMRT. Nguồn biến thiên Bậc tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F p Trình tự 1 0,1254 0,1254 1,7945 0,2514 Chó 4 0,2796 0,0699 2,4612 0,2022 Thuốc 1 0,0089 0,0089 0,3126 0,6059 Giai đoạn 1 0,0837 0,0837 2,9473 0,1612 Sai số 4 0,1136 0,0284 LnCmax Trình tự 1 0,0162 0,0162 0,3925 0,5650 Chó 4 0,1648 0,0412 0,7996 0,5832 Thuốc 1 0,3637 0,3637 7,0586 0,0566 Giai đoạn 1 0,1603 0,1603 3,1112 0,1525 Sai số 4 0,2061 0,0515 LnMRT Trình tự 1 0,0109 0,0109 0,1928 0,6833 Chó 4 0,2269 0,0567 4,6212 0,0837 Thuốc 1 0,4600 0,4600 37,4688 0,0036 Giai đoạn 1 0,0036 0,0036 0,2948 0,6160 Sai số 4 0,0491 0,0123 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016 99 Bảng 4: Các thông số dùng phân tích khoảng tin cậy 90% giá trị trung bình ln[AUC0-∞], ln[Cmax] và ln[MRT] của viên nén ACV 200 mg KDSH và viên nén zovirax. Số liệu ln[AUC0-∞] ln[Cmax] ln[MRT] µT 3,99851 1,87196 2,09584 µR 3,95724 2,22764 1,71634 µT - µR 0,04127 -0,35568 0,37950 Độ tự do 4 4 4 t (0,1; 4) 2,132 2,132 2,132 Căn bậc 2 trung bình bình phương sai số 0,0284 0,0515 0,0123 * Phân tích phương sai và xác định khoảng tin cậy 90% tỷ số ln[AUC0-∞] của viên nén ACV 200 mg KDSH và viên nén zovirax: Từ kết quả xác định giá trị trung bình bình phương và bậc tự do của sai số, xác định khoảng tin cậy 90% của tỷ số giữa ln[AUC0-∞] thuốc thử và ln[AUC0-∞] thuốc đối chiếu. Từ đó, tính được giới hạn dưới và giới hạn trên giá trị ln[AUC0-∞] của ACV trong viên nén ACV KDSH là: - Khoảng tin cậy 90% của ln[AUC0-∞] = 0,04127 ± 2,132 x 0,0284 x 6/2 = 0,04127 ± 0,03496. - Giới hạn dưới CI1 = 0,00631; giới hạn trên CI2 = 0,07623. - CI của ln[AUC0-∞] trong khoảng (0,00631 - 0,07623). - Antilogarit được CI: 1,006 - 1,080 hay 100,6 - 108,0%. Như vậy, khoảng tin cậy của tỷ lệ giá trị [AUC0-∞] giữa viên nén ACV 200 mg KDSH và viên nén zovirax nằm trong giới hạn khoảng từ 80 - 125%. Do đó, hai giá trị [AUC0-∞] tương đương nhau. Nghĩa là, mức độ hấp thu ACV vào máu từ viên nén ACV 200 mg KDSH và viên nén zovirax không khác nhau. * Phân tích phương sai và xác định khoảng tin cậy 90% tỷ số ln[Cmax] của viên nén ACV 200 mg KDSH và viên nén zovirax: Từ kết quả xác định giá trị trung bình bình phương và bậc tự do của sai số, xác định khoảng tin cậy 90% của tỷ số giữa ln[Cmax] thuốc thử và ln[Cmax] thuốc đối chiếu. Từ đó, tính được giới hạn dưới và giới hạn trên giá trị ln[Cmax] của ACV trong viên nén ACV KDSH là: - Khoảng tin cậy 90% của ln[Cmax] = -0,35568 ± 2,132 x 0,0515 x 6/2 = -0,35568 ± 0,06339. - Giới hạn dưới CI1 = -0,41907; giới hạn trên CI2 = -0,29229. - CI của ln[Cmax] trong khoảng (-0,41907; -0,29229). - Antilogarit được CI: 0,65766 - 0,74655 hay 65,766 - 74,655%. Như vậy, khoảng tin cậy của tỷ lệ giá trị [Cmax] giữa viên nén ACV 200 mg KDSH T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 100 và viên nén zovirax nằm ngoài khoảng giới hạn từ 80 - 125%. Do đó, hai giá trị [Cmax] khác nhau. * Phân tích phương sai và xác định khoảng tin cậy 90% tỷ số ln[MRT] của viên nén ACV 200 mg KDSH và viên nén zovirax: Từ kết quả xác định giá trị trung bình bình phương và bậc tự do của sai số, xác định khoảng tin cậy 90% của tỷ số giữa ln[MRT] thuốc thử và ln[MRT] thuốc đối chiếu. Từ đó, tính được giới hạn dưới và giới hạn trên giá trị ln[MRT] của ACV trong viên nén ACV KDSH là: - Khoảng tin cậy 90% của ln[MRT] = 0,37950 ± 2,132 x 0,0123 x 6/2 = 0,37950 ± 0,01514. - Giới hạn dưới CI1 = 0,36436; giới hạn trên CI2 = 0,39464. - CI của ln[MRT] trong khoảng (0,36436; 0,39464). - Antilogarit được CI: 1,430 - 1,484 hay 143,0 - 148,4%. Như vậy, khoảng tin cậy của tỷ lệ giá trị [MRT] giữa viên nén ACV 200 mg KDSH và viên nén zovirax nằm ngoài khoảng giới hạn từ 80 - 125%. Do đó, hai giá trị [MRT] khác nhau. * Kết quả so sánh Tmax của viên nén ACV 200 mg KDSH với viên nén zovirax: So sánh sự khác nhau giữa thời gian để đạt nồng độ ACV cực đại (Tmax) của viên nén ACV 200 mg KDSH với viên nén zovirax theo phương pháp thống kê phi tham số (theo Wilcoxon Signed-Rank test). Bảng 5: Kết quả so sánh giá trị Tmax của 2 thuốc bằng kiểm định phi tham số Wilcoxon. Người tình nguyện Tmax (giờ) Chênh lệch Thứ tự Viên ACV KDSH Viên zovirax (+) (-) (+) (-) 1 3 2,5 0,5 1 2 5 3,5 1,5 5 3 5,5 4,5 1 3 4 5,5 4,5 1 3 5 2 3 1 3 6 4,5 1,5 3 6 Tổng 18 3 Với giả thuyết: - HO: Tmax của viên nén ACV KDSH với viên nén zovirax như nhau. - HA: Tmax của viên nén ACV KDSH với viên nén zovirax không giống nhau. Kết quả cho thấy: T (+) = 21; T (-) = 3
Ttt = Tmin = 3. Tra bảng Wilcoxon được T0,05 (6) = 1. Ttt > T0,05. Như vậy, Tmax của viên nén ACV KDSH với viên nén zovirax giống nhau có ý nghĩa thống kê. Kết quả xác định nồng độ thuốc trong huyết tương chó cho thấy sự khác biệt ở 2 loại thuốc: mặc dù viên nén KDSH đạt Cmax (6,501 µg/ml) thấp hơn viên nén zovirax (9,280 µg/ml), nhưng thời gian đạt Cmax của thuốc KDSH (4,25 giờ) lâu hơn của thuốc Zovirax (3,25 giờ) và thời gian lưu trung bình của thuốc KDSH (8,1323 giờ) cao hơn hẳn thuốc zovirax (5,6541 giờ). Điều này thể hiện xu hướng giải phóng kéo dài của viên KDSH. Tác dụng T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016 101 kéo dài của thuốc KDSH còn thể hiện ở chỗ: thời gian duy trì nồng độ có tác dụng (> 1,7 µg/ml) của thuốc KDSH dài hơn, đến giờ thứ 12 vẫn còn tác dụng (nồng độ trong huyết tương bằng 1,795 µg/ml). Trong khi đó, thuốc zovirax đến giờ thứ 10, nồng độ đã thấp hơn 1,7 µg/ml. Sinh khả dụng tương đối của viên ACV KDSH so với viên zovirax với độ tin cậy 90% là 100,6 - 108,0%. KẾT LUẬN Đã tiến hành đánh giá sinh khả dụng và xác định một số thông số dược động học của viên nén ACV KDSH tự bào chế trên chó thực nghiệm, kết quả cho thấy: giá trị AUC0-∞, Tmax của viên nén ACV KDSH tương đương, trong khi đó giá trị Cmax và MRT không tương đương với viên zovirax đối chiếu. Các thông số dược động học từ viên nén ACV KDSH thể hiện rõ tính chất đặc trưng cho một chế phẩm KDSH đường tiêu hóa. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y tế. Dược thư Quốc gia Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. 2009, tr.36-40. 2. Dhaliwal S, Jain S, Singh HP, Tiwary AK. Mucoadhesive microspheres for gastroretentive delivery of ACV: In vitro and in vivo evaluation. AAPS J. 2008, 10 (2), pp.322-330. 3. U.S Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research. Guildance for Industry-Bioanalytical Method Validation. 2003. 4. U.S Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research. Bioavailability and bioequivalence studies for oral administered drug products. General Considerations. 2003.