Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (cucumber mosaic virus, tobacco mosaic virus và tomato spotted wilt virus) trên cà chua (solanum lycopersicum) ở tỉnh lâm đồng bằng kỹ thuật elisa và bước đầu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM BỆNH VIRUS (CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS VÀ TOMATO SPOTTED WILT VIRUS) TRÊN CÀ CHUA (Solanum lycopersicum) Ở TỈNH LÂM ĐỒNG BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2001-2005 Sinh viên thực hiện : LÂM NGỌC HẠNH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO TÓM TẮT ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM BỆNH VIRUS (CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS VÀ TOMATO SPOTTED WILT VIRUS) TRÊN CÀ CHUA (Solanum lycopersicum) Ở TỈNH LÂM ĐỒNG BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS BÙI CÁCH TUYẾN LÂM NGỌC HẠNH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm tạ: Gia đình là chỗ dựa về vật chất và tinh thần cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm luận văn. Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM. Ban Chủ Nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể quý Thầy Cô trong bộ môn. PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn tôi hoàn thành luận văn này. PGS. TS. Trần Thị Dân, TS. Đinh Duy Kháng, TS. Bùi Minh Trí, TS. Lê Đình Đôn, anh Nguyễn Đức Toàn đã tận tình giúp đỡ tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp này. Các thầy cô đã cho tôi nhiều kiến thức bổ ích. Anh Nguyễn Văn Sơn cùng các anh chị trong Chi Cục Bảo vệ Thực vật tỉnh Lâm Đồng đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn. Chú Nguyễn Văn Sang và các anh chị trong Phòng Nông Nghiệp huyện Đơn Dƣơng, anh Nguyễn Tấn Ngọc cùng các anh chị trong Phòng Nông Nghiệp huyện Đức Trọng đã tận tình hỗ trợ, chỉ dẫn tôi. Các thầy cô, anh chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại học Nông Lâm đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt luận văn. Tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 27 và tất cả các anh chị, bạn bè đã gắn bó, góp sức cùng tôi trong suốt thời gian học tập và làm luận văn vừa qua. iv TÓM TẮT Lâm Ngọc Hạnh. Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. ”Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua (Solanum lycopersicum) ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ thuật ELISA và bƣớc đầu xây dựng quy trình chẩn đoán virus Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT-PCR” đƣợc tiến hành tại huyện Đơn Dƣơng, huyện Đức Trọng và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm, từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005. Thí nghiệm đƣợc thực hiện gồm 3 nội dung chính. 1. Mẫu đƣợc thu theo triệu chứng bệnh virus, mỗi ruộng 5 mẫu kết hợp với điều tra sơ bộ tình hình bệnh trên cà chua ở 21 thôn và 2 thị trấn thuộc huyện Đơn Dƣơng và Đức Trọng. Từ đó, đánh giá tình hình bệnh virus trên cà chua ở địa bàn nghiên cứu. 2. Xác định tác nhân gây bệnh virus chính trên cà chua (TMV, CMV, TSWV) bằng phƣơng pháp DAS-ELISA sử dụng kháng thể đa dòng. Mẫu đƣợc phân tích là những lá cà chua có triệu chứng bệnh virus. Mỗi mẫu lá đƣợc kiểm tra trên 3 virus để xác định có virus nào trong 3 virus trên nhiễm riêng lẻ hay đồng thời lên mẫu đang nghiên cứu hay không. 3. Mẫu dƣơng tính TMV đƣợc chọn để thực hiện RT-PCR nhằm bƣớc đầu xây dựng quy trình RT-PCR để chẩn đoán TMV. Từ đó, khẳng định lại kết quả ELISA đồng thời sản phẩm thu đƣợc từ RT-PCR sẽ đƣợc dùng cho những nghiên cứu xa hơn. Kết quả thu đƣợc: - Điều tra sơ bộ tình hình bệnh ở Đơn Dƣơng và Đức Trọng cho thấy tại thời điểm nghiên cứu cà chua ở Đức Trọng bị tàn phá nặng nề bởi bệnh virus trong khi cà chua ở Đơn Dƣơng vẫn tốt. - Kết quả DAS-ELISA cho thấy dịch bệnh virus ở Đức Trọng chủ yếu là do CMV gây ra. TMV có gây bệnh nhƣng ít hơn. TSWV chƣa gây bệnh ở khu vực này vào thời điểm nghiên cứu. - Bƣớc đầu tìm đƣợc một quy trình RT-PCR tạo ra sản phẩm khá đặc hiệu nhƣng chƣa khẳng định đƣợc đó là sản phẩm khuếch đại từ khuôn mẫu nào. v SUMMARY This is Lam Ngoc Hanh studying at Nong Lam University and finishing the thesis on 9 th , 2005. The thesis entitled “Diagnosing Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus and Tomato Spotted Wilt Virus by DAS-ELISA and formulating the RT-PCR process to diagnose Tobacco Mosaic Virus in Viet Nam”. This research was conducted from 3th, 2005 to 8 th , 2005 at Don Duong, Duc Trong districts and in the laboratory of biotechnology and chemistry of Nong Lam University. The objects of this research are as follows: - Collecting the samples with the virus symptoms, 5 samples per each field and generally investigating the virus infection on tomato in Don Duong and Duc Trong districts so that the virus disease incidence in Don Duong and Duc Trong districts can be evaluated. - Diagnosing pathogens in tomato such as Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus and Tomato Spotted Wilt Virus by DAS-ELISA kit using polyclonal antibodies from rabbit. The samples tested are tomato leaves appearing the virus symptoms. Each sample is tested for Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus and Tomato Spotted Wilt Virus. - Samples of Tobacco Mosaic Virus positive are seleted to conduct the RT-PCR. We try to formulate the RT-PCR process used to both diagnose Tobacco Mosaic Virus and confirm DAS-ELISA results. The results of this research are as follows: - Through the general investigation on tomato in Don Duong and Duc Trong districts, we find out that tomato in Duc Trong have been severely destroyed by viruses. - DAS-ELISA result data show that Cucumber Mosaic Virus is the key pathogen creating virus disease epidemic in Duc Trong on 3 th , 2005 while Tobacco Mosaic Virus appears mildly and Tomato Spotted Wilt Virus is not found now in these areas. - Finding out the RT-PCR process that can amplify the pretty specific product but the product has not been confirmed yet. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Lời cảm tạ . ................................................................................................................. i Tóm tắt ...... ................................................................................................................ ii Tóm tắt bằng tiếng Anh ............................................................................................ iii Mục lục ..... ............................................................................................................... iv Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... viii Danh sách các bảng, biểu đồ .................................................................................... ix Danh sách các hình ............................................................................................... x PHẦN I. MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................ 1 1.2. Mục đích yêu cầu ..................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ......................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu ........................................................................................... 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3 2.1. Cà chua ..................................................................................................... 3 2.1.1. Sơ lƣợc về cà chua ......................................................................... 3 2.1.2. Tình hình phát triển của cà chua trên thế giới ................................ 3 2.1.3. Tình hình sản xuất cà chua ở Đà Lạt .............................................. 4 2.2. Bệnh hại trên cà chua ............................................................................... 4 2.2.1. Sơ lƣợc về Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) ........................... 6 2.2.1.1 Lịch sử của bệnh do TSWV gây ra ..................................... 6 2.2.1.2 Phân loại của TSWV .......................................................... 7 2.2.1.3 Phân bố về địa lý và tầm quan trọng về kinh tế .................. 7 2.2.1.4 Dãy kí chủ của TSWV ........................................................ 8 2.2.1.5 Cấu tạo của TSWV ....................................................................... 8 2.2.1.6 Tính chất của TSWV .......................................................... 9 2.2.1.7 Vector truyền ...................................................................... 9 vii 2.2.1.8 Điều kiện phát triển của bệnh do TSWV ............................ 10 2.2.1.9 Triệu chứng bệnh ................................................................ 11 2.2.1.10 Khống chế bệnh do TSWV ............................................... 11 Cây kháng ...................................................................... 11 Quản lý TSWV ............................................................... 12 2.2.2. Sơ lƣợc về Tobacco Mosaic Virus (TMV) ................................... 14 2.2.2.1 Lịch sử của bệnh ................................................................. 14 2.2.2.2 Phân loại của TMV ............................................................. 14 2.2.2.3 Sự phân bố của TMV .......................................................... 14 2.2.2.4 Ký chủ của TMV ................................................................ 14 2.2.2.5 Đặc điểm cấu tạo của TMV ................................................ 14 2.2.2.6 Tính chất của TMV ............................................................. 16 2.2.2.7 Đặc điểm truyền bệnh ........................................................ 17 2.2.2.8 Sự phát sinh phát triển của TMV ....................................... 17 2.2.2.9 Triệu chứng bệnh do TMV ................................................. 17 2.2.2.10 Phòng trừ .......................................................................... 19 2.2.3. Sơ lƣợc về Cucumber Mosaic Virus (CMV) ................................. 19 2.2.3.1 Lịch sử của bệnh do CMV .................................................. 19 2.2.3.2 Phân loại CMV ................................................................... 20 2.2.3.3 Phạm vi phân bố ........................................................................... 21 2.2.3.4 Ký chủ ................................................................................. 21 2.2.3.5 Đặc điểm cấu tạo của CMV ................................................ 21 2.2.3.6 Tính chất lý hóa của CMV ................................................. 23 2.2.3.7 Sự truyền bệnh .................................................................... 24 2.2.3.8 Điều kiện phát triển của bệnh ............................................. 24 2.2.3.9 Triệu chứng .................................................................................. 25 2.2.3.10 Phòng trừ ........................................................................... 25 2.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh virus trên thực vật ............................ 26 2.3.1. Phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bằng cây chỉ thị ............................ 26 viii 2.3.2. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng chỉ thị màu ..................................... 26 2.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng học ................................ 26 2.3.4. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kháng huyết thanh ..................... 27 2.3.4.1 Phƣơng pháp Direct ELISA. ............................................... 28 2.3.4.2 Phƣơng pháp Indirect ELISA ............................................ 28 2.3.4.3 Phƣơng pháp Sanwich ELISA. ........................................... 28 Direct Sanwich ELISA hay DAS-ELISA (Double antibody sandwich-ELISA) ................................ 28 Indirect Sanwich ELISA ................................................ 28 2.3.4.4 Tissue blot immunoassay (TIBA) ....................................... 28 2.3.4.5 Quartz crystal microbalance (QCM) immunosensor .......... 28 2.3.5. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào trình tự đoạn DNA. ................... 29 2.3.5.1 Phƣơng pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphirm) .................................................................. 29 2.3.5.2 Phƣơng pháp PCR hay RT-PCR đối với RNA ................... 29 2.3.5.3 Các kỹ thuật liên quan đến PCR khác ............................... 29 2.3.5.4 Phƣơng pháp sử dụng probe đánh dấu ............................... 29 2.3.5.5 Array ................................................................................... 29 2.4. Phƣơng pháp DAS-ELISA và phƣơng pháp RT-PCR ............................. 30 2.4.1. Phƣơng pháp DAS-ELISA ............................................................. 30 2.4.2. Phƣơng pháp RT-PCR ................................................................... 30 2.5. Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về bệnh do CMV, TMV và TSWV gây ra trong thời gian gần đây ...................................... 32 2.5.1. Ở nƣớc ngoài .................................................................................. 32 2.5.2. Ở Việt Nam .................................................................................... 33 PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 34 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện ............................................................... 34 3.1.1. Thời gian thực hiện đề tài .............................................................. 34 3.1.2. Địa điểm thực hiện đề tài ............................................................... 34. ix 3.2. Vật liệu ..................................................................................................... 34 3.2.1. Dụng cụ .......................................................................................... 34 3.2.2. Hóa chất ........................................................................................ 34 3.3. Phƣơng pháp ............................................................................................. 35 3.3.1. Điều tra và lấy mẫu ....................................................................... 35 3.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................ 35 3.3.2.1 Chẩn đoán bằng DAS-ELISA ............................................. 35 3.3.2.2 Chẩn đoán bằng RT-PCR ................................................... 36 Ly trích RNA ................................................................. 36 Phản ứng reverse transcriptase (RT) tạo cDNA ............ 37 Phản ứng PCR ................................................................ 38 3.3.2.3 Phân tích sản phẩm PCR ..................................................... 44 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................. 46 4.1. Phản ứng ELISA ....................................................................................... 46 4.1.1. Kết quả ELISA ............................................................................... 46 4.1.2 Tỷ lệ các mẫu nhiễm hỗn hợp virus CMV và TMV so với các mẫu nhiễm chỉ CMV hay TMV .................................................. 47 4.1.3. Tỷ lệ bệnh theo tuổi cây thể hiện trong số mẫu điều tra ................ 48 4.1.4. Tỷ lệ bệnh theo địa điểm thể hiện trong số mẫu điều tra ............... 49 4.1.5. Tỷ lệ bệnh theo giống cà thể hiện trong số mẫu điều tra .............. 51 4.1.6. Triệu chứng thực tế trong các mẫu thí nghiệm .............................. 52 4.1.7. Tỷ lệ bệnh theo loại triệu chứng quan sát đƣợc ............................. 53 4.2. Kết quả của phản ứng RT-PCR ................................................................ 57 Kết quả RT-PCR sử dụng cặp primer 1 ............................................... 57 Kết quả RT-PCR sử dụng 2 cặp primer 2 và 3 ..................................... 62 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 70 5.1. Kết luận .................................................................................................... 70 5.2. Đề nghị ..................................................................................................... 71 PHẦN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 73 1 2 x PHỤ LỤC 1 Thành phần các dung dịch trong phản ứng ELISA ............................... 76 PHỤ LỤC 2 Thành phần các chất trong kit tổng hợp iScriptTM. ............................. 77 PHỤ LỤC 3 Thành phần các hóa chất trong phản ứng PCR ..................................... 78 PHỤ LỤC 4 Hình chụp các đĩa chứa mẫu phân tích bằng ELISA ............................ 79 PHỤ LỤC 5 Bảng câu hỏi điều tra ............................................................................. 80 PHỤ LỤC 6 Danh sách các trình tự tƣơng đồng với TMV dòng ở Trung Quốc dùng để thiết kế primer. ......................................................................... 81 xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CMV: Cucumber Mosaic Virus TMV: Tobacco Mosaic Virus TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus CTV: Citrus Tristeza Virus TLCV: Tomato Leaf Curl Virus (bệnh xoăn ngọn cà chua) TYLCV: Tomato Yellow Leaf Curl Virus (bệnh xoăn vàng ngọn), TRSV: Tomato Black Ring Virus (bệnh đốm hình nhẫn) TBSV: Tomato Bushy Stunt Virus (bệnh lùn bụi cà chua) PV Y: Potato Virus Y PV X: Potato Virus X DMSO: dimethyl sufoxide ELISA: enzyme linked immunosorbent assay. DAS-ELISA: double antibody sanwich-enzyme linked immunosorbent assay RT-PCR: Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction N: Nucleoprotein cDNA: complementary DNA ssRNA : single strand RNA MP: Movement Protein (Protein di chuyển) CP: Coat Protein (Protein vỏ) ORF: open reading frame m 7 Gppp: 7- methyl guanosine triphosphate HR: Hypersensitive Response (phản ứng siêu nhạy cảm) SAR: system acquired resistance (tính kháng có hệ thống) PR protein: pathogenesis- related protein VPg : protein liên kết với genome satRNA: satellite RNAs (RNA vệ tinh) DEP : delution end point LIV : longevity invitro TIR : thermal inactivation range. xii DANH SÁCH CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ BẢNG, BIỂU ĐỒ TRANG Bảng 4.1 Kết quả ELISA đối với TSWV, TMV và CMV trên tổng số mẫu. ........................................................................... 47 Bảng 4.2 Tỷ lệ các mẫu nhiễm hỗn hợp virus CMV và TMV so với các mẫu nhiễm chỉ CMV hay TMV. .......................... 48 Bảng 4.3 Tỷ lệ (%) bệnh virus theo tuổi cây trong tổng số mẫu điều tra. ................................................................................. 49 Bảng 4.4 Tỷ lệ mẫu nhiễm bệnh TMV, CMV và TSWV giữa Đơn Dƣơng và Đức Trọng. .................................................... 50 Bảng 4.5 Tỷ lệ bệnh TMV và CMV trên 2 giống cà đƣợc trồng phổ biến ở Đơn Dƣơng và Đức Trọng. ........................ 53 Bảng 4.6 Tỷ lệ cà chua bệnh theo triệu chứng quan sát đƣợc .............. 53 Biểu đồ 4.1 Biểu diễn tỷ lệ dƣơng tính và âm tính CMV, TMV, TSWV. 47 Biểu đồ 4.2 Biểu diễn tỷ lệ phần trăm giữa các mẫu nhiễm hỗn hợp TMV và CMV và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV. ........ 48 Biểu đồ 4.3 Biểu diễn tỷ lệ phần trăm mẫu bị nhiễm virus theo tuổi cây .. 49 Biểu đồ 4.4 Biểu diễn tỷ lệ bệnh TMV và CMV trên 2 giống cà đƣợc trồng phổ biến ở Đơn Dƣơng và Đức Trọng. ................ 51 Biểu đồ 4.5 Biểu diễn tỷ lệ bệnh TMV và CMV trên 2 giống cà đƣợc trồng phổ biến ở Đơn Dƣơng và Đức Trọng. ......................... 53 Biểu đồ 4.6 Tỷ lệ cà chua bệnh theo triệu chứng quan sát đƣợc .............. 54 xiii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Chu trình sống của bọ trĩ .............................................................. 10 Hình 2.2 Amblyserus cucumeris ................................................................. 13 Hình 2.3 Amblyseius degenerans ................................................................ 13 Hình 2.4 Hypoaspis aculeifer ...................................................................... 13 Hình 2.5 Orius insidiosus ............................................................................ 13 Hình 2.6 A, B: virion của TMV; C,D: tinh thể TMV. ............................... 16 Hình 2.7 Triệu chứng điển hình của TMV ở cà chua ................................. 18 Hình 2.8 Cấu tạo của CMV ......................................................................... 22 Hình 2.9 Triệu chứng điển hình của CMV ở cà chua ................................. 25 Hình 4.1 Ruộng cà chua bị nhiễm bệnh virus ở ở Đức Trọng .................... 52 Hình 4.2 Ruộng cà chua khỏe ở Đơn Dƣơng ............................................. 52 Hình 4.3 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm TMV và CMV ................................. 55 Hình 4.4 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm TMV và CMV ........................ 55 Hình 4.5 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV .......................................... 55 Hình 4.6.1 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 55 Hình 4.6.2 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 55 Hình 4.7 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 55 Hình 4.8 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 56 Hình 4.9 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 56 Hình 4.10 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 56 Hình 4.11 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ........................................... 56 Hình 4.12 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 56 Hình 4.13 Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 2 ........................................... 58 Hình 4.14 Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 3 ........................................... 59 Hình 4.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 4 ........................................... 59 Hình 4.16 Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 5 ........................................... 60 Hình 4.17 Kết quả PCR lần 1 và 2 trên 4 mẫu ............................................. 62 xiv Hình 4.18 Kết quả PCR lần 3 ........................................................................ 64 Hình 4.19 Kết quả PCR lần 8, 9, 10, 11, 12 trên 2 mẫu 2 và 3 ..................... 66 Hình 4. 20a Kết quả RT-PCR lần thứ 13 ......................................................... 67 Hình 4.20b Kết quả RT-PCR lần thứ 13 ......................................................... 67 Hình 4.21 Mức độ tƣơng đồng của trình tự các dòng TMV trên thế giới ....................................................................................... 69 1 PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cà chua (Solanum lycopersicum) đƣợc trồng rộng rãi trên thế giới từ thế kỷ thứ 19 cho đến nay ( Đây là cây trồng thích hợp với hoạt động trồng trọt bán thời gian và qui mô nhỏ. Cà chua có giá trị thƣơng mại khá cao. Mỗi năm, nƣớc Mỹ thu về hàng tỷ đô la từ thị trƣờng xuất khẩu cà chua. Cà chua là loại rau cao cấp rất đƣợc ƣa chuộng vì nó có giá trị dinh dƣỡng cao. Các nhà khoa học Nga còn cho biết: quả cà chua có thể dùng làm vắc - xin phòng chống bệnh viêm gan siêu vi A, B, bệnh AIDS và bệnh viêm não. Nhu cầu cà chua luôn luôn lớn và kỹ thuật trồng cà chua lại không quá phức tạp hay khó khăn, không tốn nhiều trang thiết bị đặc biệt. Vì những lý do đó mà cà chua thƣờng đƣợc trồng xen canh với các cây rau màu khác trên những vùng đất thích hợp. Thế nhƣng, cà chua có thể bị ảnh hƣởng bởi rất nhiều bệnh, bao gồm bệnh do ký sinh (nhƣ nấm, vi khuẩn, virus, mycoplasma, tuyến trùng) và bệnh không do ký sinh (nhƣ độ ẩm của đất, nhiệt độ, ánh sáng không thích hợp hay bởi sự mất cân bằng dinh dƣỡng). Bệnh do virus gây ra là khó khống chế nhất và có thể tạo ra tổn thất rất nặng nề khi bệnh lan ra thành dịch. Trong 10 năm trở lại đây, bệnh virus thực vật đã lan rộng hơn và xuất hiện nhiều dịch bệnh virus hơn. Ở Việt Nam, bệnh virus trên cà chua cũng xuất hiện ở nhiều nơi trên diện tích lớn. Ví dụ nhƣ dịch virus vào tháng 3 năm 2005 ở huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng đã làm cho 27 ha cà chua ở đây thiệt hại gần nhƣ 100% (Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật tỉnh Lâm Đồng). Do đó, cần phải xác định xu hƣớng lây lan của virus trên thế giới và tiến hành những hoạt động kiểm dịch ở những nơi cần thiết đồng thời tiến hành những nghiên cứu xa hơn nhằm phục vụ cho việc phòng chống bệnh virus cho cây trồng. Xuất phát từ tình hình phát triển của cà chua và bệnh virus trên cà chua mà chúng tôi thực hiện đề tài: ”Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua (Solanum 2 lycopersicum) ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ thuật ELISA và bƣớc đầu xây dựng quy trình chẩn đoán virus Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT - PCR”. 1.2. Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích - Chẩn đoán và phát hiện CMV (Cucumber Mosaic Virus), TMV (Tobacco Mosaic Virus) và TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus) trong mẫu lá nghi ngờ bệnh virus bằng kỹ thuật DAS - ELISA (double antibody sanwich - enzyme linked immunosorbent assay). Từ đó, đánh giá tình hình bệnh ở khu vực nghiên cứu. - Bƣớc đầu xây dựng quy trình chẩn đoán TMV bằng RT - PCR. 1.2.2 Yêu cầu - Xác định tỉ lệ bệnh do các virus TMV, CMV, TSWV gây ra trên đồng ruộng. Từ đó khuyến cáo tác hại và các biện pháp khống chế bệnh do các virus này gây ra. - Nắm vững nguyên tắc và các bƣớc tiến hành của kỹ thuật ELISA và RT - PCR. 3 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cà chua 2.1.1 Sơ lƣợc về cà chua Cà chua (Solanum lycopersicum) có xuất xứ ở miền Nam và Trung Mỹ. Cà chua thuộc giới thực vật (Plantae), thuộc chi Magnoliopsida, chi phụ là Asteridae, thuộc bộ Solanales, thuộc họ Solanaceae, thuộc giống Solanum, thuộc loài Solanum lycopersicum. Tên cà chua xuất phát từ một từ trong tiếng Nahuatl là tomatl ( 2.1.2 Tình hình phát triển của cà chua trên thế giới và Việt Nam Sự xuất hiện của cà chua (Solanum lycopersicum) đƣợc xác định là từ những năm 70 trƣớc công nguyên ở Nam Mỹ. Vào thế kỉ 16, cà chua còn mọc hoang ở vùng núi Andes của Nam Mỹ và phát triển ở Mêxicô. Sau đó, những ngƣời Châu Âu khám phá vùng đất mới này và cà chua đƣợc vận chuyển về châu Âu bằng tàu. Do có hàm lƣợng Licopen cao nên cà chua nhanh chóng đƣợc trồng ở Châu Âu để sử dụng vào các bữa ăn hàng ngày và đƣa vào công nghiệp chế biến rau quả. Ngƣời phƣơng Tây đặc biệt sùng bái quả cà chua. Từ năm 1931 - 1999, ở châu Âu có khoảng 131 công trình nghiên cứu về cà chua. Sản lƣợng cà chua ƣớc tính ở một số nƣớc Châu Âu năm 2004 nhƣ sau: Tây Ban Nha (2.300 tỷ tấn) tăng 34% so với năm 2003, Italy (5.800 tỷ tấn) tăng 9% so với năm 2003, Hy Lạp (1.050 tỷ tấn) tăng 8% so với năm 2003. (Nguồn: Attaché Reports, USDA/FAS and USDA/ERS). Mỹ đã tạo ra cây khoai - cà có đặc điểm cho củ (ở dƣới đất) giống khoai tây và cho trái (ở trên cây) giống cà chua. Tại Nhật Bản, cà chua cũng đƣợc khuyến khích ăn hàng ngày để phòng chống các bệnh tim mạch và ung thƣ. Trung Quốc cũng cho phép các giống “rau quả không gian” đƣợc trồng trên diện rộng khắp đất nƣớc. Trong đó, diện tích “cà chua không gian” (tạo giống mới bằng tia vũ trụ trên không gian) chiếm hơn 2000 ha (Nguồn: "Rau quả không gian” ở Trung Quốc. Ngày 26 tháng 09 năm 2004). Chính phủ Malaysia đã thực hiện nhiều giải pháp nhằm phát triển 4 công nghệ sau chế biến rau quả, trong đó cà chua là một trong 8 loại rau đƣợc đƣa vào danh sách ƣu tiên. Ở Việt Nam, trong định hƣớng và mục tiêu phát triển nông nghiệp, nhà nƣớc ta khuyến khích trồng các loại rau quả xuất khẩu, trong đó có cà chua. Năm 2003 diện tích cà chua thu đông và vụ đông cả nƣớc ta đạt 11.936 ha. Vụ Đông 2003 ở Hà Tây - một trọng điểm cà chua cho xuất khẩu của Nam Định, huyện Hải Tây trồng 135 ha cà chua, huyện Hải Hậu đƣa diện tích cà chua lên trên 40 ha. Trên diện tích 1.450 ha cà chua vụ đông của Nam Định có 652 ha đƣợc ký hợp đồng bao tiêu sản phẩm giữa nhà máy chế biến và nông dân. Việt Nam đã đƣa ra thị trƣờng giống cà chua HT mang thƣơng hiệu Việt Nam. Đây là giống rau lai cao cấp đầu tiên ở nƣớc ta có khả năng cạnh tranh trên thị trƣờng. Nhƣ vậy, trên thế giới và cả ở Việt Nam cà chua luôn đƣợc quan tâm và khai thác nhƣ là một nguồn lợi không nhỏ, không thể thiếu đƣợc. 2.1.3 Tình hình sản xuất cà chua ở Đà Lạt Với điều kiện thiên phú về nhiệt độ, ẩm độ và bức xạ, Đức Trọng và Đơn Dƣơng là 2 huyện trọng điểm về rau và cà chua của tỉnh Lâm đồng. Hàng năm 2 huyện này trồng đến 3.500 ha cà chua (trong tổng diện tích 4.500 ha trồng rau màu của toàn tỉnh Lâm Đồng) với sản lƣợng ƣớc tính khoảng 150.000 tấn. Cà chua đã trở thành cây trồng chủ lực cho vùng rau này. Những năm trƣớc, bệnh héo rũ do vi khuẩn luôn đe dọa cà chua ở đây. Nông dân đã chuyển qua trồng giống cà ghép (ghép giống M186 với gốc cà dại) để tăng sức chống chịu với điều kiện ngoại cảnh và bệnh, trong đó chủ yếu là bệnh héo rũ do vi khuẩn. Năm 2005, do thời tiết phức tạp: nắng hạn kéo dài kết hợp với tiết trời khô hanh đã làm cho bệnh virus phát triển nhanh chóng. Ở Đức Trọng, hàng loạt cây cà chua đã bị phá bỏ vì bệnh virus. Ƣớc tính vào tháng 3 năm 2005 có khoảng 27 ha cà chua bị nhiễm bệnh virus (gần 100%) ở Đức Trọng (Nguồn: Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật Tỉnh Lâm Đồng). 2.2 Bệnh hại trên cà chua Bệnh cà chua trở thành yếu tố giới hạn trong sản xuất cà chua ở nhiều vùng trên thế giới. Gần 200 bệnh cà chua đã đƣợc biết đến do những nguyên nhân khác nhau gây ra. 5 Có 2 nhóm nguyên nhân gây bệnh chính trên cà chua là bệnh do ký sinh và bệnh không do ký sinh. Bệnh do ký sinh gồm có: bệnh do nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng. Bệnh không do ký sinh thƣờng là do độ ẩm của đất, nhiệt độ, ánh sáng không thích hợp hay bởi sự mất cân bằng dinh dƣỡng, mối quan hệ về oxy không hợp lý, hay ảnh hƣởng của thuốc trừ cỏ, thuốc trừ sâu, sấm chớp. Những triệu chứng không do ký sinh gây ra thƣờng nhẹ hơn những triệu chứng gây ra bởi ký sinh và gây khó khăn thêm cho việc chẩn đoán bệnh cho cây trồng. Riêng đối với bệnh virus thì trên cây cà chua vùng nhiệt đới có rất nhiều loại virus gây hại nhƣ CMV (Cucumber Mosaic Virus), TMV (Tobacco Mosaic Virus), TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus), CTV (Citrus Tristeza Virus). Các virus này gây ra những triệu chứng tƣơng đối giống nhau là lá vàng loang lổ, xoăn, cây nhỏ, đều lan truyền qua bọ phấn Bemisia. Mật độ bọ phấn càng cao thì tỷ lệ cây bị bệnh xoăn lá càng nhiều. Bệnh phát triển nhiều trong điều kiện thời tiết ấm áp, nhiệt độ từ 20 - 30oC, nhiều nắng, ít mƣa. Tỷ lệ mắc bệnh và tính nghiêm trọng của bệnh thay đổi từ mùa này sang mùa khác vì những mối quan hệ phức tạp (2). Bệnh virus hại cà chua Bệnh virus hại cà chua là 1 tập đoàn có rất nhiều bệnh hại, trong đó các loại virus quan trọng gây ra rất nhiều tác hại cho cà chua ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới gồm: bệnh khảm vàng (TMV: Tomato Mosaic Virus), bệnh khảm mảng lồi lõm (CMV: Cucumber Mosaic Virus), bệnh đốm héo (TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus), bệnh xoăn ngọn cà chua (TLCV: Tomato Leaf Curl Virus), bệnh xoăn vàng ngọn (TYLCV: Tomato Yellow Leaf Curl Virus), bệnh đốm hình nhẫn (TRSV: Tomato Black Ring Virus), bệnh lùn bụi cà chua (TBSV: Tomato Bushy Stunt Virus) và virus X, Y của khoai tây (5) . Bệnh virus đang gây thiệt hại nặng nề cho nền sản xuất cà chua ở nƣớc ta và ở nhiều nƣớc vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới. Cây cà chua bị bệnh thƣờng không có quả hoặc quả rất nhỏ. Nhiều trƣờng hợp bệnh rất nặng, không cho thu hoạch gây ra mất mùa cà chua. Sơ lƣợc về CMV, TMV và TSWV 6 Hiện nay, thuật ngữ “emerging plant virus” đã đƣợc hình thành. Thuật ngữ này xuất phát từ thuật ngữ “emerging virus” đƣợc đúc kết từ đầu những năm 1980 để mô tả tình cảnh bi kịch do bệnh AIDS gây ra. Sau đó, thuật ngữ này dƣờng nhƣ trở nên thích hợp với tình hình dịch bệnh virus trên cây trồng. Ba virus điển hình cho thuật ngữ này là CMV, TMV, CTV vì ba virus này phân bố rất rộng về địa lý, rất dễ gây ra dịch bệnh cho những cây trồng quan trọng về kinh tế. TSWV (có khi đƣợc gọi là “Super virus”) trong những năm gần đây lại gây dịch bệnh nghiêm trọng trên hai đối tƣợng có giá trị kinh tế cao là cà chua và thuốc lá. Ngƣời ta xếp TSWV vào loại “re - emerging plant virus”. Hiện nay, ba virus CMV, TMV, TSWV đang gây bệnh rất nguy hiểm trên cà chua. 2.2.1 Sơ lƣợc về Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) 2.2.1.1 Lịch sử của bệnh do TSWV gây ra Trƣớc đây, virus TSWV đƣợc báo cáo dƣới nhiều tên khác nhau, ví dụ: virus đồng thau cà chua (Tomato Bronzing Virus), Kromnek Virus, Pineapple Yellow Potyvirus, Makhorka Tip Chlorosis Virus, Vira Cabeca Virus và nhiều tên khác (Sakimura, 1962; Best, 1968; Smith, 1972) (1). Hiện nay, virus TSWV thƣờng đƣợc gọi là Tomato Spotted Wilt Virus hay Tomato Spotted Wilt Tospovirus hay Pineapple Yellow Spot Virus. Nó còn có các tên khác nhƣ Spotted Wilt, Bronze Leaf (ở Anh), Maladie bronze’e (ở Pháp), Bronceado (ở Tây Ban Nha). Ngoài ra, tên Lycopersicon Virus 3 cũng đƣợc sử dụng rộng rãi để chỉ virus TSWV. Sự thay đổi trong thuật ngữ phản ánh sự thay đổi nhiều của triệu chứng bệnh, tùy thuộc vào loài virus, cây chủ và vùng địa lý nơi bệnh đó đƣợc tìm thấy. Báo cáo đầu tiên về bệnh do TSWV (bệnh héo đốm cà chua) trên cà chua có từ năm 1915 ở miền Nam nƣớc Úc (Brittlebank, 1919). Bệnh gây ra thiệt hại nghiêm trọng cho cà chua ở Úc trong nhiều năm và vẫn là vấn đề nghiêm trọng ở New South Wales. Những vùng khác cũng có tổn thất nặng nhƣ Argentina, Hawaii. Sau chiến tranh thế giới thứ hai, bệnh héo đốm cà chua giảm rõ rệt ở Tây Âu và Mỹ (có thể do việc phòng trừ bọ trĩ bằng hóa chất) trong khi ở Đông Âu, Nam Mỹ và Nam Phi, virus này vẫn còn là vấn đề nghiêm trọng. Những năm đầu của thập niên 80, TSWV đã phát triển nhanh chóng và lan rộng ra nhiều vùng địa lý khác nhau (Barker, 1989; Marchoux và cộng sự, 1991; Varia và cộng sự, 1993) cùng với sự phát triển nhanh 7 chóng của vectơ bọ trĩ cẩm chƣớng (Frankliniella occidentalis) (Mantel và Van de Vrie, 1998; Brodsgaard, 1989). Từ năm 1998, TSWV đã trở thành vấn đề chính cho những ruộng cà chua (4). Bệnh do virus TSWV bộc phát trên nhiều quốc gia sản xuất nông nghiệp trên khắp các lục địa, chủ yếu trong vùng khí hậu nóng. Ở vùng khí hậu ôn đới thì TSWV phổ biến trong canh tác nhà lƣới. 8 2.2.1.2 Phân loại của virus TSWV TSWV thuộc họ Bunyaviridae, một họ lớn của những virus đƣợc mang bởi động vật chân đốt. Họ Bunyaviridae có 5 giống là Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus và Tospovirus. Trong đó, Tospovirus đƣợc xem là thuộc 10 virus gây bệnh cây nổi bật nhất. Tác động của Tospovirus rất lớn. Một thời gian dài TSWV đƣợc phân loại nhƣ là đại diện duy nhất của nhóm virus cây đơn xuất xứ từ nhóm “Tomato Spotted Wilt Virus” (Mathews, 1979). Năm 1989, TSWV đƣợc chia thành TSWV dòng L và TSWV dòng I. Giữa năm 1989 và 1992, hai dòng này đƣợc xác định là khác nhau về huyết thanh học và tên của chúng đã đƣợc thay đổi thành TSWV (TSWV dòng L) và INSV (TSWV dòng I). Nhờ sinh học phân tử, ngƣời ta nhận thấy virus TSWV có những đặc tính chung của họ Bunyaviridae. Vì vậy, hiện nay TSWV đƣợc phân loại nhƣ là nhóm nguyên thủy của chi Tospovirus mới trong họ Bunyaviridae. Sử dụng kháng huyết thanh đơn dòng và đa dòng để xác định cấu trúc nucleoprotein của TSWV, ngƣời ta thấy rằng TSWV là loài gây bệnh cho nhiều cây trồng trên thế giới (de Avila và cộng sự, 1990). Những nghiên cứu này cũng chứng minh sự tồn tại của những loài Tospovirus khác nhau là TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus (nhóm huyết thanh I), GRSV: Groundnut Ringspot Virus (nhóm huyết thanh II), TCSV: Tomato Chlorotic Spot Virus (nhóm huyết thanh III), INSV: Impatiens Necrotic Spot Virus (nhóm huyết thanh IV), GBNV: Groundnut Bud Necrosis Virus (nhóm huyết thanh V), WSMV: Wattermelon Silver Molt Virus. 2.2.1.3 Phân bố về địa lý và tầm quan trọng về kinh tế TSWV thƣờng ở vùng ôn đới và cận nhiệt đới. TSWV đã đƣợc ghi nhận ở Ấn Độ, châu Á, châu Úc, Macedonia, Nam Serbia, Nam và Bắc Mỹ. Ở châu Âu, TSWV xuất hiện ở nơi có khí hậu ấm và trong các nhà kính. Ở Yugoslavia, TSWV trãi rộng ở những vùng khô, ấm và có nắng nhiều. TSWV gây đe dọa nghiêm trọng trong sản xuất cà chua và thuốc lá. TSWV là một trong 10 virus gây hại nghiêm trọng nhất. TSWV gây thiệt hại trên toàn thế giới hơn 1 tỉ đô la hàng năm (Goldbach and Peter, 1994). 2.2.1.4 Dãy kí chủ của TSWV 9 TSWV có phổ ký chủ rất rộng. Chúng tấn công trên nhiều cây cảnh, cỏ dại và nhiều cây trồng khác nhau. Những công trình nghiên cứu về loài ký chủ mới của TSWV đƣợc xuất bản với tốc độ rất nhanh (German và cộng sự, 1992). Cho đến nay, danh sách ký chủ của TSWV là 1090 loài cây, thuộc 15 họ thực vật một lá mầm, 69 họ thực vật hai lá mầm và một họ thực vật có hoa ẩn. Ký chủ mẫn cảm với TSWV gồm nhiều cây công nghiệp quan trọng nhƣ ớt, đậu nành, khoai tây, thuốc lá, cà chua, các loại rau nhƣ cần tây, rau diếp. Hoa thƣợc dƣợc (Dahlia pinnata Cav.) rất mẫn cảm với virus này. Đậu phộng đƣợc xem là ký chủ chính của virus này ở Úc và Hoa Kỳ. Cây bồ công anh (Taraxacum officinalis L.), dền gai (Amaranthus spinosus L.), và nhiều loài cà hoang dại đều là ký chủ của TSWV. Cây cảnh và cỏ dại thƣờng là nguồn chứa TSWV. Ở những vùng có mùa đông băng giá thì cây kí chủ đa niên là nguồn chứa TSWV đáng kể, các vùng có mùa đông mát mẻ thì cây ký chủ hàng niên là nguồn chứa TSWV để lây lan cho cây trồng. Việc lây nhiễm nhân tạo trên Petunia là nhanh nhất, chính vì vậy nó là cây chỉ thị tốt cho TSWV. 2.2.1.5 Cấu tạo của TSWV Các phần tử virus bằng nhau về kích cỡ và có đƣờng kính khoảng 85nm. Đặc trƣng của những phần tử TSWV là vỏ lipid chứa 2 loại glycoprotein G1 và G2 bao quanh một genome RNA gồm ba phần đã đƣợc đóng gói chặt chẽ bởi nhiều bản sao của tiểu đơn vị nucleoprotein (N) và 10 - 20 bản sao của protein lớn (L) là polymerase của virus (Van Poelwijk và cộng sự, 1993). Bộ gen virus là RNA chia thành 3 phần, là loại ambisense ssRNA chứa 5 gen mã hóa ít nhất 6 protein cấu trúc của virus: - LRNA (dài 8.897 nucleotide) là RNA lớn nhất. Đó là sợi negative sense và là sợi đơn cistron. LRNA mã hóa cho RNA polymerase phụ thuộc RNA. - MRNA (4.821 nucleotide) mã hóa 2 protein vỏ (G1 và G2) và một protein phi cấu trúc đƣợc xem nhƣ là protein di chuyển từ tế bào đến tế bào (NSm). - SRNA (2.916 nucleotide) mã hóa nucleoprotein (N) và một protein phi cấu trúc thứ 2 (NSs). 10 RNA có những trình tự cuối bổ sung từng phần, cho phép RNA thích nghi với sự thành lập vòng giả (Elliott và cộng sự,2000). Bộ gen của virus mã hóa cho 6 protein đặc biệt: - RNA polymerase (330kDa) đƣợc mã hóa bởi LRNA. - Protein NSM (34kDa) có mặt trong sự di chuyển từ tế bào virus sang tế bào chủ, đƣợc mã hóa bởi MRNA sense. - Glycoprotein G1 (78kDa) và G2 (58kDa) nhô ra trên bề mặt của virus, đƣợc mã hóa bởi MRNA sense bổ sung. - Protein NSS (52kDa) đƣợc mã hóa bởi SRNA sense (chức năng chƣa biết). - Protein N (29kDa) là protein cấu trúc bao phủ đoạn RNA genome tạo ra nucleocapside, đƣợc mã hóa bởi sợi RNA sense bổ sung (Hull, 2002). 2.2.1.6 Tính chất của virus TSWV TSWV có nhiệt độ Q10 là 41,2oC, độ pha loãng tối thiểu (DEP) là 1: 10-5, thời gian sống trong in vitro (LIV) của nó ở 24oC từ 2 đến 5 giờ, điểm nhiệt độ virus không hoạt động (TIR) là 40 - 46oC. Virion đƣợc tìm thấy trong tất cả các phần của cây chủ, trong tế bào chất. Thể vùi có trong tế bào nhiễm, có hình dạng bất thƣờng. Những cụm viron hay không bào có thể nảy chồi từ túi chứa dịch của lƣới nội chất. 2.2.1.7 Vector truyền Tất cả virus đều kí sinh bắt buộc, có nghĩa là chúng không thể sống sót ở bên ngoài kí chủ và lan truyền bởi hạt hay côn trùng. TSWV đƣợc mang bởi bọ trĩ (thrips). Chúng là những côn trùng cực nhỏ (khoảng 0,5mm) sống ở trên hoa, lá và đất. Có chín loài bọ trĩ đƣợc xem là vector truyền TSWV. Trong đó, có những loài quan trọng nhất vì chúng phân bố rất rộng rãi, đó là: Western Flower Thrip (Frankliniella occidentalis), F. schultzei (Trybom), F. fusca (Hind), Thrips tabaci Lind. Vì sự phân bố rộng của Western Flower Thrip (Frankliniella occidentalis), Onion thrips (Thrips tabaci) nên chúng đƣợc xem là vector chính của bệnh. Sự nhiễm tự nhiên trên đồng ruộng gây ra bởi bọ trĩ theo kiểu bền vững (Hình 2.1). Bọ trĩ đẻ trứng trong những mô mềm của thân, lá hay hoa. Ấu trùng vừa nở ra (có màu vàng) bắt đầu ăn ngay. Khi ấu trùng ăn mô bị nhiễm khoảng 15 phút, chúng thu virus vào 11 bên trong. Thời gian ăn kéo dài thì khả năng mang virus tăng lên. Ấu trùng phát triển đầy đủ sẽ chui vào đất (sâu khoảng 8cm) và trở thành nhộng, không ăn nữa. Sau đó chúng trƣởng thành, có cánh, nhô lên khỏi mặt đất. Ấu trùng bọ trĩ chƣa lan truyền bệnh cho cây ngay đƣợc mà phải chờ đến khi chúng trƣởng thành. Có 2 lý do để cần thời gian này: (1) phải có thời gian để virus di chuyển bên trong cơ thể bọ trĩ, chúng đi từ miệng vào tuyến nƣớc bọt, khi đó chúng sẵn sàng cho sự truyền qua một cây khác; (2) bọ trĩ non không có cánh nên khó có cơ hội di chuyển từ cây này sang cây khác và hầu nhƣ hoàn toàn không thể tiếp cận đƣợc những cây mới trồng ra ruộng. Những con bọ trĩ trƣởng thành có thể mang virus suốt đời nhƣng không truyền cho giai đoạn trứng. Thế hệ kế tiếp mang virus bằng việc ăn cây bị nhiễm. Thời gian từ trứng đến giai đoạn trƣởng thành có thể thay đổi do nhiều yếu tố, ngƣời ta xác định đƣợc là 14 ngày ở 29,5oC đối với Western Flower Thrip. Hình 2.1 Chu trình sống của bọ trĩ (Nguồn: T.A. Zitter and M.L. Daughtrey và J.P. Sanderson, 1989.) Câu hỏi đặt ra là TSWV có đƣợc truyền qua hạt không? Ngƣời ta đã chứng minh rằng cây nhiễm TSWV không thể truyền virus sang hạt của nó và hạt nhiễm virus là do từ bên ngoài (Y. Antignus et al, 1997). 2.2.1.8 Điều kiện phát triển của bệnh do TSWV Theo Best, ánh sáng mặt trời ngăn cản sự hình thành vết hoại tử. Do đó, khi cây đƣợc chiếu sáng liên tục cây sẽ ít bệnh hơn và thời điểm xuất hiện bệnh cũng trễ hơn. Bệnh thích nghi với điều kiện thời tiết ấm áp (đối với các nƣớc nhiệt đới là thời tiết mát và ẩm). Nhiệt độ cao, ẩm độ thấp là điều kiện rất bất lợi cho bọ trĩ. Mƣa nhiều và to trong mùa đông cũng làm giảm số bọ trĩ xuống mức thấp. Thời tiết ấm áp và khô là điều kiện tốt nhất cho bọ trĩ sinh sản. Bệnh trở thành dịch trong suốt giai đoạn sinh trƣởng sinh 1. Trứ ng 2. Ấ u trùng (thu virus) 3. Nhộ ng (không ă n) 4. Nhộ ng (không ă n) 5. Bọ trĩ trư ở ng thành (truyề n virus) 12 dƣỡng của cây, giai đoạn mà virus đƣợc bọ trĩ lan truyền từ cây này sang cây kia dễ dàng. Theo nhận định của các nhà nghiên cứu thì nhiệt độ bình quân trong ngày vào khoảng 25 oC kết hợp với lƣợng mƣa giảm là điều kiện tối ƣu cho bọ trĩ lẫn TSWV phát triển. Virus này có thể qua đông trên nhiều loại cây trồng. Thrips tabaci qua đông dƣới dạng thành trùng, nằm trong đất. Vào mùa xuân khi thời tiết ấm áp, bọ trĩ di chuyển từ cỏ dại chờ cơ hội tấn công cây trồng. Ngƣời ta thấy rằng, các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của côn trùng môi giới trong việc di chuyển từ cây này sang cây khác có lẽ quan trọng hơn kích thƣớc quần thể côn trùng. Bởi vì chỉ cần một côn trùng mang mầm bệnh cũng có thể gây bệnh cho cây. Theo Selman và Grant, sự thay đổi độ dài ngày không ảnh hƣởng đến thời gian ủ bệnh của triệu chứng toàn diện nhƣng nhiệt độ thì có ảnh hƣởng. 2.2.1.9 Triệu chứng bệnh Triệu chứng cây nhiễm TSWV rất đa dạng, thay đổi tùy theo giai đoạn sinh trƣởng của cây, điều kiện môi trƣờng (nhất là nhiệt độ), mức độ lây nhiễm, số lƣợng và thành phần các nòi virus cùng phối hợp gây hại cho cây ký chủ. Cây bệnh có triệu chứng là: lá non thƣờng chuyển màu vàng và sau đó phát triển nhiều vết đen nhỏ, đốm tròn. Sau đó những đỉnh đang sinh trƣởng có thể chết và gốc có thể có sọc. Những cây bị nhiễm thƣờng phát triển một bên hay bị còi cọc (lùn) và rũ xuống. Triệu chứng này có thể giống với bệnh do nấm, vi khuẩn hay stress do môi trƣờng. Nếu chỉ dựa vào triệu chứng mà xác định bệnh thì có thể dẫn đến kết quả không chính xác. Cây bị nhiễm vào đầu mùa có thể không cho quả và những cây bị nhiễm sau khi đã tạo quả sẽ cho quả rất nhỏ. Biểu hiện triệu chứng của trái bệnh là ở trái xanh có nhiều vùng có vòng tròn đồng tâm mờ, có vết tròn mất màu xanh, ở trái chín những vòng này chuyển sang màu đỏ trắng hay đỏ vàng rất dễ quan sát. 2.2.1.10 Khống chế bệnh do TSWV Hai phƣơng pháp chung đƣợc sử dụng là sử dụng cây kháng TSWV và chiến lƣợc quản lý nhằm giảm tác hại của virus. Cây kháng Sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp cho phép thúc đẩy quá trình nhận dạng, chọn lọc và lai tạo cây mới. Những marker phân tử liên kết với tính kháng TSWV đã đƣợc tìm thấy 13 trong những dòng cà chua phát triển từ những dòng lai giữa SW 307 (Brommonschenkel, Tanksley và Cho, chƣa xuất bản) và cây kháng TSWV với những khoảng cách liên kết nhỏ nhất đƣợc chọn lọc. Trong tƣơng lai, sử dụng những cây này cùng với những marker liên kết sẽ thúc đẩy sự phát triển tính kháng cho những cây cà chua thƣơng mại khác với khoảng cách liên kết nhỏ nhất (10). Một số giống cà chua lai kháng TSWV sẵn có trong thƣơng mại: - Giống Amelia (HMX - 0800) do công ty Harris Moran Seed cung cấp. Đặc tính của giống này là trái chín khá sớm, trái to, kháng TSWV, tuyến trùng, và 3 nòi nấm fusarium gây héo. Amelia đƣợc thử nghiệm ở Mountain Horticultural Crops Research Station ở Fletcher trên 3 năm gần đây và cho kết quả tốt. - Giống EX 1405037 do công ty Seminis Seeds cung cấp. Đặc tính của giống này là trái cà chua to, chín hơi trễ. EX 1405037 không cho kết quả tốt nhƣ Amelia ở Mountain Horticultural Crops Research Station ở Fletcher vào năm 2002 vì thời gian chín lâu hơn. - Giống BHN 444 và BNN 640 do Seigers và công ty hạt Seedway cung cấp. Đặc tính của giống BHN 444 là cho trái lớn nhƣng hình dạng trái hơi thô, giống BHN 640 có tính kháng với ba nòi nấm fusarium gây héo và kháng TSWV và trái của nó nhỏ hơn nhƣng bóng hơn BHN 444. Quản lý TSWV Hiểu biết rõ về mối quan hệ giữa kí chủ - ký sinh - vectơ sẽ giúp ta phát triển những biện pháp canh tác mà làm cho tổn thất do TSWV gây ra với những cây trồng nhạy cảm là nhỏ nhất. Không có biện pháp nào có hiệu quả đáng kể nếu sử dụng riêng rẽ. Ngƣời ta thƣờng kết hợp những biện pháp với nhau để giảm mức độ thiệt hại một cách đáng kể. Chiến lƣợc quản lý hiệu quả nhất là phòng ngừa, gồm những kỹ thuật sau: 1. Bảo vệ cây con: Cây con dễ bị nhiễm TSWV khi không đƣợc bảo vệ. Bọ trĩ sẽ tấn công vào những lá có màu xanh nhạt của cây non. Vì thế cây con cần đƣợc trồng ở những nơi có cây trồng nhạy cảm với TSWV nếu không thì nên trồng cây con trong nhà kính hoặc sử dụng màng che cẩn thận. Phun thuốc diệt côn trùng đều đặn có thể làm giảm khả năng sống của bọ trĩ trong vƣờn ƣơm. 14 2. Tránh trồng độc canh: Nên hạn chế việc trồng liên tục cùng một loại cây trồng trên cùng một vùng đất. 3. Luân canh: Tránh trồng những cây nhạy cảm với TSWV trong những vùng đang bị tác động mạnh của TSWV. Trồng những cây không nhạy cảm với TSWV vào vùng này trong khoảng 3 tuần để cho bọ trĩ đi ra khỏi vùng đó sẽ làm giảm tác hại của TSWV và cho phép trồng những cây nhạy cảm với TSWV hiệu quả hơn. 4. Loại bỏ những nguồn chứa TSWV: Cày lại đất ở nơi đã thu hoạch hay nơi đã từng bị bỏ hoang để loại bỏ nguồn chứa virus và nguồn thức ăn của bọ trĩ. 5. Quản lý cỏ: Có nhiều loại cỏ là kí chủ của TSWV, chúng đóng vai trò là nguồn chứa virus. Quan trọng là loại bỏ cỏ ngay thời điểm quần thể bọ trĩ thấp để giảm tối thiểu việc bọ trĩ tích lũy và di chuyển vào đồng ruộng. 6. Trồng cỏ trên đồng ruộng sẽ kích thích bọ trĩ trƣởng thành di chuyển đến. Vì thế, cần hạn chế điều này. 7. Trồng xen cây nhạy cảm với cây không nhạy cảm. Có rất nhiều cây không nhạy cảm với TSWV nhƣ: cây bông cải xanh, cải bắp, bí, dƣa chuột, hành, cà rốt, khoai lang. 8. Loại bỏ những cây có triệu chứng bệnh ngay lập tức. 9. Khống chế bọ trĩ bằng phƣơng pháp sinh học là hiệu quả nhất và có lợi cho môi trƣờng nhất. Bốn tác nhân sinh học đã đƣợc sử dụng. 15 (Nguồn:http//:www.substratus.com/sw8529.asp.tomato spotted wilt virus fact sheet.html). 1. Amblyserus cucumeris: Ăn chủ yếu ở giai đoạn ấu trùng của bọ trĩ (Hình 2.2). 2. Amblyseius degenerans: Tƣơng tự nhƣ Amblyserus cucumeris nhƣng di chuyển nhanh hơn và có thể sống đƣợc trong điều kiện độ ẩm thấp (Hình 2.3). 3. Hypoaspisspp: Là rệp cây ăn thịt, sống trong đất, ăn nhộng của bọ trĩ (Hình 2.4). 4. Orius insidiosus: Ăn tất cả các giai đoạn mà bọ trĩ có thể di động, nhạy cảm với ngày dài và phát triển ít nhất 13 giờ chiếu sáng/ngày (Hình 2.5). 2.2.2 Sơ lƣợc về Tobacco Mosaic Virus (TMV) 2.2.2.1 Lịch sử của bệnh do TMV gây ra Bệnh khảm thuốc lá đƣợc đề cập đến từ năm 1857. Đến năm 1892 virus TMV đƣợc nhà bác học Nga Ivanopski phát hiện. Lúc đó ông đang nghiên cứu về bệnh hoa lá thuốc lá và phát hiện thấy một loại “nguồn gây bệnh” không nhìn thấy dƣới kính hiển vi quang học và có thể lọt qua ống lọc vi khuẩn. Năm