Đề tài Cây dừa cạn Catharanthus roseus và nhóm hợp chất Vinca alkaloid

ỹ thuật tách hỗn hợp trên cột đựoc nhồi bằng các hạt có kích thứoc ≤ 10 µm. Trong đó, ngừoi ta dùng một bơm có áp suất cao ≈ 300atm để đẩy pha động qua cột với tốc độ dòng khoảng vài ml/phút và cho phép phân giải nhanh một lựong mẫu nhỏ khoảng 20µg. Ưu điểm: Trong sắc ký khí, các hỗn hợp đựoc khảo sát trong pha hơi, vì vậy cần phải tạo một chất hơi ổn định từ hỗn hợp cần phân tích, hoặc chuyển các chất trong hỗn hợp thành các dẫn chất bền với nhiệt. Chỉ có khoảng 20% các hợp chất hoá học thích hợp cho sắc kí khí mà không cần phải biến đổi mẫu thành một dạng khác, số còn lại đều không bền với nhiệt và không bay hơi. Hơn nữa, các chất có các nhóm chức rất phân cực hay có thể ion hoá thừong có khuynh hứong kéo đuôi, không thích hợp khi áp dung sắc ký khí. Vì thế HPLC là một kĩ thuật tốt hơn đối với các đại phân tử, các loại chất vô cơ và ion hoá, các hợp chất thiên nhiên không bền, các hỗn hợp thuốc và các chất hoá sinh. Trong sắc kí khí chỉ có một pha (pha tĩnh lỏng hay rắn) là sẵn sàng tưong tác với các phân tử của mẫu. Vì pha động là một chất khí, tất cả hơi của mẫu đều tan trong chất khí này. Trong HPLC, cả pha tĩnh lẫn pha động có thể tương tác một cách chọn lọc với mẫu. Các tương tác như tạo phức hay liên kết hydrogen không có trong pha động của sắc ký khí có thể xảy ra trong pha động của HPLC. Nhiều loại tương tác chọn lọc khác nhau này cũng có thể được gia tăng bởi sự biến đổi hoá học thích hợp của bề mặt silica, vì thế HPLC là một kĩ thuật linh hoạt hơn sắc ký khí và thường có thể thực hiện được trên các phân tử tách khó hơn. Nhược điểm: Xét cả về đầu tư trang thiết bị lẫn phí tổn vận hành, HPLC là một kĩ thuật đắt tiền, hơn cả sắc ký khí. 3.5.2 Cấu tạo và hoạt động của máy sắc ký lỏng cao áp HPLC: Thiết bị cơ bản máy HPLC bao gồm: Bình chứa pha động Bơm tạo áp lực cao và hệ thống tạo ra việc rửa giải đẳng môi hay rửa giải tiệm tiến ( pump + gradient system) Bộ phận tiêm mẫu (injection unit) để đưa mẫu vào cột. Cột đựoc nhồi với pha tĩnh có hiệu quả cao. Cột có thể đựơc đặt trong một bộ phận điều nhiệt. Bộ phận phát hiện và hệ thống xử lý dữ liệu Máy ghi (recorder) hoặc máy vi tính để ghi hoặc lưu giữ sắc kí đồ Pha tĩnh trong HPLC là các phân tử có kích thứoc rất nhỏ, đựoc gọi là chất nhồi vi tiểu phân, chúng thường đồng dạng, có hình cầu hoặc hình dạng bất định, đừong kính 10, 5, hay 3 µm. Cơ chế phân tách có thể đựoc thực hiện bằng các nhóm hoá học liên kết vào bề mặt của các tiểu phân silica để tạo ra các pha liên kết. Hiện nay, pha liên kết thông dụng nhất đựoc sử dụng trong HPLC là ODS, trong đó nhóm ankyl 18 carbon được gắn vào bề mặt của các tiểu phân silica. Khi được nhồi vào cột, kích thước nhỏ của các vi tiểu phân dẫn đến sự đề kháng đáng kể với sự chảy của dung môi, vì thế pha động phải được bơm qua cột bằng một áp lực cao. Cột và toàn bộ hệ thống cột phải chịu được áp suất sử dụng và cũng phải đề kháng về mặt hoá học với các dung môi pha di động, chúng thường phải được chế tạo bằng thép không gỉ. Pha động được bơm qua cột với vận tốc vài ml/phút. Nêu thành phần pha động không đổi, phưong pháp được gọi là rửa giải đẳng môi. Ngược lại, nếu thành phần của pha động có thể được làm thay đổi theo một cách định trước trong lúc phân tách, phương pháp được gọi là rửa giải tiệm tiến. Rửa giải tiệm tiến thích hợp cho các mẫu thử nghiệm chứa các chất có độ phân cực khác nhau nhiều, cần đến sự thay đổi độ phân cực của hỗn hợp dung môi trong quá trình tách. Sau khi qua cột, các chất tan tách ra được ghi nhận bằng một bộ phận phát hiện lắp đặt trong hệ thống. Thông tin đưa ra của bộ phận phát hiện là một tín hiệu điện, sự biến đổi của tín hiệu này được biểu hiện trên một máy đo thế năng, một dụng cụ tích phân vi tính, hoặc một màn hình của máy tính. Phần lớn các bộ phận phát hiện phổ biến trong HPLC là bộ phận phát hiện chọn lọc, chúng không thể đáp ứng với tất cả chất tan có trong hỗn hợp. Do vậy, sẽ có một số chất tan không được phát hiện trong HPLC, chúng cần phải được chuyển thành một dạng khác có thể phát hiện được sau khi ra khỏi cột, phương pháp này gọi là phương pháp tạo dẫn chất sau cột ( post-column derivatisation). CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO TẾ BÀO C.roseus Nuôi cấy mô và ý nghĩa của nuôi cấy mô [2] Giới thiệu Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng. Môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường. Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên cơ sở lý luận khoa học về tính toàn năng và khả năng phân hóa, phản phân hóa của tế bào thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan (sự phát sinh cơ quan) từ các mô như: lá, thân, hoa hoặc rễ Tính ưu việt của nuôi cấy mô tế bào thực vật So với các phương pháp nhân giống tự nhiên khác thì phương pháp nuôi cấy mô đã là một động lực thúc đẩy công nghệ sinh học và nông nghiệp phát triển vì phương pháp này có những ưu điểm sau: Không phụ thuộc vào thời tiết, thời vụ, quá trình được thực hiện trên diện tích không lớn, ở bất kì địa thế nào, có thể kiểm tra khống chế các hướng nghiên cứu theo ý muốn. Tạo được một số lượng lớn cây con trong một thời gian ngắn với tính đồng nhất cao về mặt di truyền, phù hợp với nhu cầu thị trường. Là phương pháp phục tráng giống cây bị nhiễm bệnh, thoái hóa để tạo giống cây khỏe mạnh. Giúp bảo quản giống cây dễ dàng bằng cách tạo ra các thể phôi hay bảo quản lạnh. Tạo ra các dòng đột biến, các dòng siêu sản xuất, tăng tần số đột biến trong di truyền đột biến ở thực vật bậc cao. Nuôi cấy mô dung hợp protoplast có thể kết hợp nhiều tính trạng mong muốn trong chọn giống cây trồng. Giảm chi phí vận chuyển từ nơi này đến nơi khác giúp việc trao đổi giống giữa nơi này đến nơi khác được dễ dàng. Tạo ra các sản phẩm tự nhiên như ở các cây bình thường như dược phẩm, thuốc nhuộm, hương liệu… Một số kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nuôi cấy cơ quan Có thể sử dụng kỹ thuật này để nuôi cấy các bộ phận của cây như lá, rể…Tuy nhiên hướng ứng dụng này không được áp dụng rộng rãi. Kỹ thuật nuôi cấy cơ quan thường được áp dụng trong nước như: cắt lá, cành từ lô ống nghiệm đã tái sinh cây, cấy chuyền sang các lô ống nghiệm tiếp theo. Nuôi cấy mô phân sinh (meristem) Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành có kích thước 0.1mm ÷ 1cm. Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồi mới hình thành hoặc các cành non. Đối với nuôi cấy mô phân sinh sự cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trưởng rất quan trọng. Muốn kích thích tạo chồi cần bổ sung cytokinine hoặc tổ hợp cytokinine với auxin. Muốn tạo rễ thì bổ sung các auxin như NAA, IAA,... Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng để loại virus tạo cây sạch virus và nhân giống in vitro. Nuôi cấy mô phân sinh còn được sử dụng để nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan, tạo cây đa bội qua xử lý colchicin. Kỹ thuật này được dùng rất nhiều trong công tác phục tráng cây trồng bị nhiễm virus nên còn được gọi là phương pháp tạo cây sạch bệnh. Phương pháp này có từ năm 1937, tuy nhiên đến năm 1949 Linesset và Cornuet mới bắt đầu tiến hành nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ở cây thuốc lá. Sau đó, Morel và Martin đã nuôi cấy thành công đỉnh sinh trưởng cây thược dược (1952) và Cymbidium (1960). Nuôi cấy mô sẹo (callus) Mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt ( vết thương, xử lý với các chất điều hòa sinh trưởng thực vật…) Để nuôi cấy mô sẹo, người ta có thể sử dụng hầu hết các cơ quan đang còn sống của thực vật như: thân, lá, cuống…Tuy nhiên, người ta thường sử dụng các mẫu cấy còn non để quá trình cảm ứng của mẫu xảy ra dễ dàng hơn. Nuôi cấy mô sẹo được áp dụng trong nhiều trường hợp: Nhân giống in vitro đối với loài thực vật mà phương pháp nhân giống bằng đỉnh sinh trưởng có hiệu quả không cao. Làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, thu nhận các hợp chất thứ cấp. Nghiên cứu các quá trình hình thành cơ quan. Nuôi cấy huyền phù tế bào Huyền phù tế bào là một môi trường lỏng được lắc liên tục, trong đó có sự hiện diện của những tế bào soma cô lập hoặc những cụm nhỏ các tế bào có khả năng sinh phôi có thể tái sinh thành một thực vật nguyên vẹn ( Henshaw và cộng sự, 1965; Torres 1989). Sự tạo huyền phù tế bào có khả năng sinh phôi trong môi trường lỏng được lắc liên tục và sự tái sinh thực vật từ huyền phù tế bào này là hai giai đoạn quan trọng cần thiết cho phép thực hiện sự nhân giống in vitro ở mức độ công nghiệp. Ngoài ra các giai đoạn này cũng cần thiết cho việc sử dụng các tác nhân vật lý, hóa học nhằm tuyển chọn các đặc tính thích hợp để phục vụ cho nhu cầu sống cầu sống của con người mà đặc biệt là các kỹ thuật chuyển gen như bắn DNA, dung hợp tế bào…cũng như mọi thao tác ở mức tế bào. Tạo phôi soma – tạo hạt nhân tạo Trong môi trường nuôi cấy thích hợp thì mô cấy hay tế bào có thể phát triển thành phôi vô tính. Phôi được bọc bằng lớp vỏ bọc chứa nội nhũ nhân tạo thành hạt nhân tạo. Có hai cách tạo phôi vô tính là: phát sinh phôi trực tiếp và phát sinh phôi gián tiếp. Sự ghi nhận đầu tiên về nuôi cấy phôi là công trình của Charles Bonnet ở thế kỷ XVIII. Ông tách phôi Phascolus và Fagopyrum trong trong đất và nhận được cây nhưng là cây lùn. Từ đầu thế kỷ XX các công trình nuôi cấy phôi dần được hoàn thiện hơn. Từ các công trình nghiên cứu trước đó, Knudson (1922) đã nuôi cấy thành công phôi cây lan trong môi trường chứa đường và khám phá ra một điều là nếu thiếu đường thì phôi không thể phát triển thành protocorm. Raghavan (1976, 1980) đã công bố rằng phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng. Ở giai đoạn dị dưỡng (tiền phôi) cần có các chất điều hoà sinh trưởng để phát triển. Trong giai đoạn tự dưỡng sự phát triển của phôi không cần chất điều hoà sinh trưởng. Đối với nuôi cấy phôi, như đã biết đường đóng vai trò rất quan trọng. Trong nhiều trường hợp thì đường sucrose cho kết quả tốt hơn các đường khác. Ngoài ra một số chất tự nhiên như nước dừa, nước chiết malt, casein thuỷ phân, là những chất rất cần trong nuôi cấy phôi. Các chất kích thích sinh trưởng như GA3, auxin, cytokinine thường được dùng nhiều trong nuôi cấy phôi Các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi nuôi cấy in vitro. Thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ và ánh sáng thấp hơn phôi phát triển tự nhiên. Nuôi cấy hạt phấn và bao phấn đơn bội Nguyên liệu cho phương pháp này là bao phấn hoặc hạt phấn tách rời, tình trạng vật lý của cây và kiểu gen ảnh hưởng đáng kể đến sự thành công của việc nuôi cấy bao phấn. Ngoài ra, trạng thái của hạt phấn cũng rất quan trọng. Nuôi cấy tế bào trần Tế bào trần (protoplast) là tế bào đã bị loại bỏ vách cứng, chỉ còn lại màng tế bào bao bọc xung quanh. Người ta có thể tiến hành lai, dung hợp giữa các dạng tế bào trần với nhau, sau đó lại tái tạo màng và vách tế bào. Việc dung hợp tế bào trần giúp tạo các cơ thể lai mà phương pháp lai hữu tính không thể tiến hành được. Chất điều hòa sinh trưởng [2] Thuật ngữ chất điều hoà sinh trưởng thực vật (Plant growth regulator, PGR) đã được dùng rất nhiều bởi các công ty nông dược để chỉ các chất điều hoà sinh trưởng tổng hợp. Định nghĩa của Van Overbreek và cộng tác viên (1954) vẫn còn được dùng đến ngày nay. “Chất điều hoà sinh trưởng thực vật là những hợp chất hữu cơ khác với những chất dinh dưỡng, với một hàm lượng nhỏ kích thích, ức chế, hoặc bổ sung bất kỳ một quá trình sinh lý nào trong thực vật”. Trong sinh lý thực vật khái niệm về chất kích thích sinh trưởng bao gồm các hợp chất có tác dụng điều tiết các hoạt động sinh trưởng và phát triển của thực vật. Nhóm hợp chất này bao gồm các hormone tự nhiên (auxin, gibberellin, cytokinin, acid abscicic, ethylene, các hợp chất phenol điều tiết sinh trưởng, hormone ra hoa). Auxin Bản chất hóa học của auxin tự nhiên trong tế bào thực vật là acid indol acetic (IAA) và nó là dạng auxin đầu tiên, chủ yếu và quan trọng nhất trong tất cả các loại thực vật. Trong thực vật nó không chỉ tồn tại ở dạng tự do mà còn ở dạng liên kết không có hoạt tính sinh học như IAA-glucose, IAA-myoinositol, IAA-glucan, IAA-aspartate…Các dẫn suất khác của indol cũng thể hiện hoạt tính của auxin là indol tryptamine, indol acetaldehyde, indol pyruvate, indol ethanol. Auxin được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm, vi khuẩn và chủ yếu ở định chồi ngọn rồi di chuyển xuống các bộ phận non của cơ thể thực vật: lá, rễ và các mô dự trữ…Auxin gồm có auxin tự nhiên và auxin tổng hợp (IBA, NAA, 2,4-D…) Auxin có nhiều vai trò khác nhau trong đời sống thực vật, liên quan tới hàng loạt các quá trình sinh lý: tốc độ sinh trưởng, trạng thái ngủ, sự ra hoa, sự kết trái, sinh trưởng quả, sự chín của quả, sự rụng quả và rụng lá, tạo củ, sự lão hóa…Đương nhiên, do hormone thực vật tác động lên sinh trưởng thông qua mối tương quan nồng độ giữa các loại hocmone khác nhau, nên các quá trình trên đây không chỉ ảnh hưởng của auxin mà còn của các hormone khác. Tùy thuộc vào nồng độ tác dụng mà các mô thực vật có các kiểu phản ứng khác nhau đối với auxin. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào thông qua tác dụng trực tiếp lên sự giãn nở của vách tế bào. Các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin gồm một vài hợp chất đã được sử dụng từ rất lâu trong công nghiệp. Chỉ sau một thời gian ngắn sau khi IAA được tìm thấy trong tự nhiên, nó đã được tổng hợp và trở thành một hợp chất có giá trị. Nhưng IAA không có lợi để dùng trong nông nghiệp bởi nó dễ dàng bị phân hủy thành các hợp chất mất hoạt tính dưới ảnh hưởng của ánh sáng và vi sinh vật. Một trong những tác dụng của auxin là kích thích sự hình thành rễ của những lát cắt thân. Một số hợp chất tổng hợp nhân tạo có vai trò tương tự như IAA, trong đó có IBA. IBA là hợp chất có hoạt tính auxin yếu nhưng nó có khả năng ổn định và vô hiệu hệ enzyme làm mất hoạt tính của auxin. Cytokinin Phần lớn cytokinin là dẫn xuất của purine. Loại cytokinin đầu tiên phát hiện được và cũng là dạng phổ biến nhất là zeatin tách từ hạt ngô. Ngoài ra còn có hàng loạt cytokinin khác như kinetin, dihydrozeatin, benzyladenin, chlorephenylurea…, trong đó kinetin không có mặt trong tự nhiên, mà ngừơi ta thu nhận bằng cách xử lý nhiệt ADN. Chứng minh về khả năng ngăn cản sự vàng lá của benzyladenin (BA) là một phát hiện thu hút nhiều nhà sinh lý học từ những năm 1950. Những năm 1960, các nhà nghiên cứu thấy rằng BA có thể kích thích nhiều quá trình, BA được sử dụng trong nuôi cấy mô để kéo dài chồi và phát sinh phôi với các nồng độ khác nhau tùy theo đối tượng thực vật nuôi cấy và mục đích nuôi cấy. Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lượng cao nhất trong phôi và trong quả đang phát triển. Hoạt tính của chúng được tăng cường khi chúng tương tác với myo-inositol, nhưng có thể bị mất khi kết hợp trong thành phần của các glycoside. Cũng như auxin, cytokinin tham gia điều hòa các phản ứng trong cây, đồng thời làm tăng các quá trình trao đổi acid nucleic và protein. Cytokinin điều chỉnh sinh trưởng bằng nhiều cách: Điều chỉnh tốc độ tổng hợp ADN khi phân chia tế bào. Làm chậm sự lão hóa của lá. Góp phần phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, kích thích ra hoa và sinh trưởng của quả. Gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô, bao gồm mô sẹo trong nuôi cấy mô. Trong cây, cytokinin vận động từ rễ đến chồi thông qua xylem khá dễ dàng, nhưng chúng hầu như không linh động trong lá, ngoại trừ một phần được dẫn truyền định hứơng thông qua cuống lá. Gibberellin Là một nhóm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm hơn 80 hợp chất khác nhau. Các hợp chất này có điểm giống nhau ở cấu trúc hóa học đó là sườn gibbane. Gibberellin có liên quan đến nhiều quá trình sinh lý trong cây. Tuy nhiên ở những chi, loài với những yếu tố khác nhau sẽ quyết định gibberellin đặc hiệu hiệu quả nhất. Gibberellin ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như sự phát triển thân, sự nảy mầm của hột, miên trạng, trổ hoa, phân hóa giới tính, trinh quả sinh, đậu trái và lão hóa. Ảnh hưởng trên sự phát triển của thực vật sống: Các gibberellin đã biết đều có khả năng kích thích sự vươn dài của thân hay sự phân chia tế bào. Sự kích thích vươn dài của GA thể hiện rất rõ trên những cây non hoặc bộ phận non, ở cây đã trưởng thành hay cơ quan đã già thì ảnh hưởng sẽ kém đi. Nhìn chung, GA kích thích sự sinh trưởng của nhiều loài cây đặc biệt là những cây lùn. Ảnh hưởng lên tính trạng lùn: Có nhiều biến dị thiếu sinh tổng hợp GA đã được phát hiện. Đây là tính trạng đơn gene, kích thước của cây biến dị có thể chỉ bằng một phần năm cây bình thường và sự lùn chủ yếu là do lóng bị ngắn lại. Các dạng đột biến lùn như đột biến bắp lùn (Zea Mays L.) d1 và d5 và lúa lùn (Oryza Sativa L.) Tan-ginbozu và Waito-C. GA nội sinh kiểm soát hoạt động của bắp và lúa là GA1. Việc xử lý GA ngoại sinh làm cho các cây này cao trở lại bình thường. Ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hột và miên trạng: Hiện nay GA được biết là những chất có khả năng kích thích nảy mầm và phá vỡ miên trạng trên nhiều loại cây trồng. GA có thể kích thích hoạt động của các enzyme thủy phân hydrolase trong hột ngũ cốc. GA ngoại sinh tác động lên lớp aleurone của hột ngũ cốc và kích thích sự sản sinh enzyme α-amylase để tác động lên sự phân hủy tinh bột thành đường đơn. Tác động này có tác dụng kích thích nảy mầm và phá vỡ miên trạng. Ảnh hưởng lên sự trổ hoa: Gibberellin có khả năng thúc đẩy quá trình trổ hoa trong nhiều loài thực vật. Đối với những cây cần yêu cầu ngày dài hay trải qua điều kiện lạnh trước trổ hoa thì khi xử lý GA trong những điều kiện không cảm ứng chúng sẽ tượng hoa và trổ hoa. Ảnh hưởng này có liên quan đến sự kích thích quá trình phân chia tế bào và vươn dài tế bào. Ảnh hưởng lên sự phân hóa giới tính, trinh quả sinh, đậu trái và lão hóa: GA có thể làm thay đổi giới tính của hoa tương tự như auxin, cytokinin và ethylene. Tuy nhiên, GA có hiệu quả ngược với auxin và ethylene. GA làm tăng số hoa đực trên dưa leo. GA cũng gây nên hiện tượng trinh quả sinh và tạo nên trái không hột. GA cũng giúp cho trái to và trì hoãn sự lão hóa. Acid abscisic Là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật tự nhiên được tạo ra trực tiếp từ acid mevalonic hoặc do sự phân giải caroteniod. Acid abscisic được sinh tổng hợp trong các lạp thể (Neill và Horgan, 1984; Milborrow, 1974). Vai trò quan trọng của ABA như là một chất cảm ứng với stress đã được biết trong nhiều năm qua. Xử lý ABA ngoại sinh gây đóng khí khẩu trong điều kiện sáng và duy trì cho đến khi ABA bị chuyển hóa. Trong điều kiện stress do thiếu nước ABA có thể gia tăng lên 20 lần. Hàm lượng ABA gia tăng khi cây bị stress do mặn, lạnh và nóng. Những sự biến đổi này là nguyên nhân của sự thiếu nước. Việc xử lý ABA ngoại sinh có thể làm cho một số loài cây chống lại điều kiện lạnh và mặn. Trong điều kiện ngày ngắn, hàm lượng ABA gia tăng trong lá và mầm chồi đã dẫn đến sự miên trạng. Tuy nhiên cũng có trường hợp trong điều kiện ngày ngắn gây ra sự miên trạng trong vài loài lại không có sự gia tăng ABA nội sinh. Việc xử lý ABA ngoại sinh lên mầm chồi và lên hột đã kích thích miên trạng của chúng. Từ khi mới được phát hiện, ABA được xem là chất gây nên sự rụng lá, trái và hoa. Thật ra điều đó không hoàn toàn đúng và ABA không trực tiếp ảnh hưởng lên sự rụng. ABA có thể tác động gián tiếp lên quá trình lão hóa trước trưởng thành và làm gia tăng sự sản sinh ethylene và ethylene đánh thức một số gene liên quan đến sự rụng. Ngày nay người ta biết rằng ABA có nhiều ảnh hưởng về mặt sinh lý, sinh hóa và phân tử trong hột cũng như có mặt phổ biến trong lúc hột phát triển. Tuy nhiên vai trò trực tiếp của ABA đối với các quá trình này vẫn còn chưa rõ. Ethylene Những người Ai Cập đã không biết rằng ethylene chính là tác nhân gây chín trái khi họ tạo vết thương trên trái. Ngày nay, ethylene đã được biết là hormone điều hoà sự chín trái. Năm 1901, Neljubow chứng minh ethylene ức chế sự vươn dài, kích thích sự phát triển theo chiều ngang. Ngày nay, người ta biết được ethylene có khả năng kích thích hoặc ức chế sự vươn dài của thân, rễ hoặc những cơ quan khác. Ethylene cũng có biểu hiện kích thích sự vươn dài của thân hoặc rễ với tốc độ chậm. Đáp ứng bộ ba kích thích bởi ethylene có thể hoạt động như một cơ chế tồn tại trong cây con. Đáp ứng bộ ba dựa trên tính sinh trưởng ngang, sự phồng lên và ức chế sự phát triển chiều cao thân. Ví dụ: khi một cây đậu Hà Lan gặp phải bề mặt cứng của đất, đá thì nó sẽ đáp ứng với sự sinh trưởng theo kiểu bộ ba, cho phép đâm thủng hoặc đi chung quanh chướng ngại, vươn tới bề mặt đất và tiếp tục phát triển. Ethylene trong vùng móc câu của cây con giúp nó duy trì hình móc câu chặt chẽ, vượt qua áp lực vật lý khi va chạm với đất mà không bị tổn thương. Khi cây con nhận được ánh sáng đỏ, sự sản sinh ethylene sẽ giảm. Kết quả là móc mở. Điều này hoạt động như một cơ chế an toàn, ngăn cản sự mở trước của móc và giảm thương tổn đến cây con trước khi nhô lên khỏi mặt đất. Quá trình rụng rất quan trọng trong nông nghiệp bởi vì nó ảnh hưởng đến năng suất và hiệu quả sản xuất. Ethylene có vai trò tự nhiên trong việc điều hoà tốc độ rụng. Năm 1985, Reid đã đưa ra bằng chứng: ethylene sản sinh gia tăng trước khi rụng trong nhiều cơ quan của cây đang rụng; Xử lý ethylene kích thích sự rụng ở thực vật; Những chất ức chế sự sinh tổng hợp ethylene hoặc ức chế hoạt động của ethylene sẽ ức chế sự rụng. Nhiều năm qua người ta đã quan sát khói từ gỗ thúc đẩy sự trổ hoa trong cây khóm và xoài, thành phần chính của khói là ethylene. Ethylene trong phần lớn trường hợp ức chế quá trình trổ hoa; Ngược lại, đối với cây khóm, xoài và vải, ethylene kích thích trổ hoa. Cây có thể được xử lý trực tiếp với ethylene hoặc gián tiếp thông qua việc sử dụng những chất phóng thích ethylene Lão hoá được đặc trưng bởi sự phân rã diệp lục tố, protein, hoặc RNA. Cả lá và hoa khi được xử lý với ethylene ngoại sinh đều gia tăng quá trình lão hoá và gia tăng sự sản sinh ethylene nội sinh. Cần chú ý rằng có những trường hợp ngoại lệ, ethylene không đơn lẻ liên quan đến quá trình lão hoá: nhiều cây không gia tăng sản sinh ethylen trước khi lão hoá. Ethylene cũng cũng có liên quan đến quang hợp, hô hấp, vận chuyển, miên trạng, sự nảy mầm của hột, nhú chồi, ưu thế chồi ngọn, sinh trưởng tế bào, nuôi cấy mô, thành lập phôi, sự nghiêng, sự khởi sinh rễ, những cơ quan dự trữ, sự thành lập gỗ, sự ức chế mầm hoa, sự phát triển giới tính, địa hướng động, sự rỉ nhựa và sự thành lập nhựa mủ của cây. Môi trường nuôi cấy[2] Đối với kỹ thuật nuôi cấy mô, sự nuôi cấy in vitro đòi hỏi những điều kiện về môi trường nuôi cấy và môi trường xung quanh. Những điều kiện này có thể thay đổi trong quá trình nuôi cấy và điều này cho phép người ta chế ngự kỹ thuật một cách tế nhị nhất. Mặc dù thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tùy theo loại bộ phận nuôi cấy, sự phát triển phân hóa của mô cấy và tùy theo ta muốn duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ…mà thay đổi ít nhiều nhưng tất cả các môi trường nuôi cấy bao giờ cũng bao gồm 5 thành phần chính sau: Đường làm nguồn carbon. Các muối khoáng đa lượng. Các muối khoáng vi lượng. Các vitamin. Các chất kích thích sinh trưởng. Ngoài ra, các tác giả còn thêm một số chất hữu cơ có thành phần hóa học xác định ( amino acid, EDTA…) hoặc không xác định (nước dừa, nước chiết nấm men, nước chiết chuối, nước chiết khoai tây, cà chua…) Đường (nguồn carbohydrate) Trong nuôi cấy nhân tạo, đường được sử dụng như nguồn carbon để mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối của mô, ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của chồi. Hai dạng đường thường được sử dụng nhất hiện nay là saccharose và glucose, nhưng saccharose được sử dụng phổ biến hơn. Tùy theo mục đích nuôi cấy mà nồng độ đường có sự thay đổi. Nhu cầu cacbohydrate trong môi trường nuôi cấy là 2-3% đối với đường saccharose hay thấp hơn đối với đường glucose [10] 4.1.5.2 Các muối khoáng đa lượng Nhu cầu muối khoáng của mô tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần thiết là N, P, K, Fe, Ca, Mg. 4.1.5.3 Các muối khoáng vi lượng Nhu cầu muối khoáng vi lượng của mô thực vật trong nuôi cấy còn rất ít được nghiên cứu, mặc dù chúng là thành phần không thể thiếu được cho sự phát triển của mô và tế bào thực vật. Nhưng để an toàn, các tác giả cung cấp hầu hết các yếu tố vi lượng cho mô nuôi cấy. 4.1.5.4 Các vitamin và các chất kích thích sinh trưởng Để kích thích cho sự sinh trưởng phát triển của mô thực vật nuôi cấy, người ta còn bổ sung thêm một số loại vitamin: myo-inositol, vitamin PP, vitamin B1, B6…và các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin, cytokinin, gibberelin... Các chất bổ sung Agar (thạch) Agar là thành phần quyết định trạng thái vậy lý của môi trường. Hàm lượng agar dùng cho môi trường nuôi cấy dao động từ 0,6-1,0% theo khối lượng. Agar là nguyên liệu phổ biến nhất dùng cho việc pha các môi trường bán rắn hay môi trường rắn. Nếu bổ sung agar với nồng độ cao thì môi trường trở nên cứng, sự khuếch tán của các chất dinh dưỡng cũng như hấp thụ của mô gặp khó khăn (Bhojwani và Razdan; 1983). Đa số nuôi cấy phôi được thực hiện trên môi trường có agar nhưng phụ thuộc vào cây mà sử dụng cho phù hợp. [11] Than hoạt tính Than hoạt tính được sử dụng trong môi trường nuôi cấy như một chất phụ gia vì than hoạt tính có khả năng hấp phụ các chất tiết ra từ mô cấy, vỏ bao phấn…và làm tăng hiệu suất sinh phôi (Fridborg et al, 1978; Ammirato, 1983). Than hoạt tính không phải là chất điều hòa sinh trưởng nhưng có thể làm thay đổi thành phần của môi trường, hấp thu nhiều hợp chất khác nhau, mà các chất này có thể hình thành trong quá trình hấp môi trường, hấp thu các chất tiết ra từ mẫu cấy cũng như các chất điều hòa sinh trưởng khi bổ sung vào môi trường, ngăn chặn sự phát triển mô sẹo không mong đợi. Ngoài ra than hoạt tính còn góp phần đẩy mạnh sự phát sinh phôi và sự hình thành rễ. [12] Trong một số nghiên cứu về ảnh hưởng của than hoạt tính khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy, đã thấy sự hiện diện của than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy rất quan trọng trong việc làm tăng chiều cao cây, chiều dài rễ, trọng lượng tươi và trọng lượng khô, và làm giảm sự hình thành chồi nách từ mô cấy một cách rõ rệt [10]. Ngoài ra, mẫu cấy được nuôi cấy trong môi trường có than hoạt tính khỏe mạnh, có màu xanh đậm, còn ở môi trường không có than hoạt tính mẫu cấy yếu hơn và lá hơi vàng. [13] Các chất hữu cơ khác Bên cạnh các chất điều hòa sinh trưởng, người ta còn sử dụng nhiều dung dịch hữu cơ phức tạp có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết chuối xanh, khoai tây, cà chua và dịch chiết nấm men, casein thủy phân…để nhân giống nhằm tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của mô cấy. Hiệu quả thúc đẩy quá trình tăng trưởng này được giải thích bằng những vitamin, amino acid và những chất điều hòa khác chứa trong chúng (Perik, 1987). Nước dừa Năm 1941, Van Ovebeck đã xác nhận tác dụng kích thích của cây dừa trong nuôi cấy phôi họ Cà. Năm 1948, Steward cũng thu được kết quả như vậy ở mô cà rốt. Nước dừa vô trùng đã được Trung tâm Sâm Việt Nam dùng làm một thành phần trong môi trường nuôi cấy mô tạo sinh khối mô Sâm K5 thành công từ năm 1983. Ngoài ra đã sử dụng trong nuôi cấy thành công trong các loài cây khác như đảng sâm di thực, phong lan… Nhiều công trình nghiên cứu xác định trong nước dừa ngoài khối lượng nước chiếm 90% còn có các chất đường, amino acid, lipid, vitamin, các nguyên tố vi và đa lượng, acid hữu cơ, các chất kích thích sinh trưởng. Theo Tuleke, amino acid ở nước dừa xanh chiếm hơn 40% amino acid tổng số là glutamine, ở nước dừa già cũng có một số lượng lớn acid glutamic, glutamine, serin, leucin, acid amino butyric. Ngoài ra trong nước dừa còn có các acid hữu cơ có chứa acid hữu cơ có chứa acid malic, sikimic, quinic và các nguồn hydrate carbon khác như saccharose, glucose, fructose. Theo Vandebelt (1954), trong nước dừa có nhiều vitamin như acid nicotinic, acid pantotenic, biotin, riboflavin, acid folic, thiamin và pyridoxine. Theo Paris, Duhamat (1953) trong nước dừa có chứa IAA. Còn Radiey (1958) phát hiện cả gibberelin trong dịch thực vật này. Dịch chiết chuối Chuối là cây ăn quả lâu đời gắn liền với cuộc sống gia đình hàng triệu dân vùng nhiệt đới nói chung và được phổ biến ở nước ta. Hàm lượng chất dinh dưỡng trong quả chuối rất cao, đặc biệt đường chiếm 10-22% và nhiều loại vitamin khác như vitamin B1, B2, PP, C và đặc biệt vitamin A chiếm từ 250-320 đơn vị. Theo kết quả nghiên cứu của Atwater, thành phần dinh dưỡng trong quả chuối rất cao: protein 1.3%, mỡ 0.6%, bột đường 22%, tro 0.8%. Khoai tây Thành phần của khoai tây bao gồm: magnesium 10%, thyamin 15%, riboflavin 3%, vitamin C 50-70%, Dietary Fibre 10-15%, phosphorus 5%, vitamin B6 13-19%, acid forlic 7%, Fe 6-14%, protein 6.5%, iodine 14%, acid pantothenic 4-7%, calcium 6%, niacin 10%, kẽm 5% [14] Phương pháp nuôi cấy in vitro tế bào C.roseus [8] Trước đây những nguyên liệu thô dùng để sản xuất alkaloid thường được thu nhận hầu hết tại những vùng mà C.roseus xuất hiện tự nhiên hoặc tại những vùng nó được trồng trọt. Điều kiện thời tiết và đặc tính của đất ở một số nước châu Âu thì bất lợi cho việc gieo trồng C.roseus. Vì thế nó chỉ có thể được trồng như là một loại cây hàng năm trong nhà kính và những nhà mái vòng làm bằng nhựa. Mặt khác, trong khi nhu cầu về alkaloid rất lớn và giá của chúng rất cao, nhưng hàm lượng alkaloid trong nguyên liệu thô thu nhận từ cây trong tự nhiên là rất thấp. Do đó, việc thu nhận indole alkaloid từ mô và cơ quan thực vật, và từ những cây được nhân giống in vitro là những hướng đi mới cần được phát huy. Mô sẹo, huyền phù tế bào và rễ tơ được nuôi trong bioreactor đã được sử dụng trong nhiều thí nghiệm. Những mô được nuôi cấy từ những cơ quan khác nhau tổng hợp rất nhiều hợp chất thứ cấp và có tính di truyền ổn định.Nhiều triển vọng hứa hẹn bao gồm việc sản xuất những indole alkaloid như : ajmalicine trong mô sẹo, catharanthine trong lá được nuôi cấy trong bình lắc và bioreactor có sục khí, và vinblastine từ chồi và rễ tơ. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào Nhiều nghiên cứu đã được thử nghiệm trong việc thu nhận huyền phù tế bào nuôi cấy cho năng suất thu indole alkaloid cao, đặc biệt là vinblastine và vincristine . Phương pháp sản xuất catharanthine và ajmalicine trong dịch huyền phù được nuôi cấy trong bioreactor đã thành công. Moreno và cộng sự (1996) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất cảm ứng lên những con đường chuyển hóa khác nhau liên quan đến quá trình chuyển hóa hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền phù tế bào C.roseus. Dịch trích tế bào nấm Phytium aphanidermatum đã được tiệt trùng được dùng trong nghiên cứu này. Những tế bào C.roseus ngay lập tức biến đổi quá trình chuyển hóa của chúng để phản ứng lại tác động của nấm. Zhao và cộng sự (2001) đã thử nghiệm nhiều chất cảm ứng của nấm nhận được từ 12 loại nấm và ảnh hưởng của chúng lên việc cải thiện sản xuất indole alkaloid ở huyền phù tế bào C.roseus. Những kết quả này cho thấy rằng những chất chiết từ nấm khác nhau kích thích tích lũy những indole alkaloid khác nhau, có thể gấp 2 đến 5 lần ở nuôi cấy thường. Zhao và cộng sự (2001) đã tăng sản phẩm catharanthine trong tế bào nuôi cấy C.roseus bằng cách kết hợp chất cảm ứng nuôi trong bình lắc và bioreactor. Tác động tổng hợp lên sự tích lũy alkaloid trong tế bào nuôi cấy đã được theo dõi khi chúng được xử lý với một vài sự kết hợp giữa chất cảm ứng của nấm và hóa chất. Sự kết hợp giữa tetramethyl ammonium bromide và nấm sợi Aspergillum niger đã cho hiệu suất thu ajmalicine cao nhất và cải thiện sự tích lũy catharanthine. Trong khi sự kết hợp giữa chất cảm ứng malate và sodium alginate cho kết quả hiệu suất catharanthine cao nhất và cũng tích lũy ajmalicine cao trong tế bào nuôi cấy. Các tác giả sau đó đã phát triển quy trình này để nâng cao việc sản xuất catharanthine ở tế bào C.roseus nuôi trong bình lắc và bioreactor. Sau 10 ngày nuôi cấy đã thu được catharanthine với hiệu suất theo thứ tự là 25 mg/l, 32 mg/l và 22 mg/l trong bình lắc 500 ml, 1,000 ml và bioreactor dạng sục khí 20 lít. Tác giả cũng đã quan sát thấy rằng sự kết hợp giữa việc xử lý malate và alginate kích thích sự phản ứng lại, ví dụ như là sự oxy hóa lipid xảy ra ở hầu hết quá trình nuôi cấy C.roseus và điều này có thể gián tiếp sản xuất indole alkaloid thông qua con đường jasmonate. Nuôi cấy mô sẹo Những mô sẹo có thể là nguồn cung cấp alkaloid chính, phổ biến nhất, cung cấp vật liệu khởi đầu cho sự thiết lập quá trình nuôi cấy huyền phù hoặc cho việc cảm ứng những cơ quan như chồi hoặc rễ. Những khảo sát đầu tiên có liên quan đến sự hình thành của rễ từ mô sẹo C.roseus đã được công bố bởi Dhruva và cộng sự (1977). Việc tái sinh những cây C.roseus khỏe mạnh có thể thực hiện từ những mô sẹo thông qua việc làm lây nhiễm những cây này với mycoplasma-like organisms (MLOs). Mollers và Sarkar (1989) đã làm nhiễm những chỗ cắt ở đốt thân cây C.roseus với 3 loại MLOs khác nhau và nuôi chúng trên môi trường dinh dưỡng MS rắn. Mô sẹo đã được hình thành trên những mô bị nhiễm, rồi được phân vào các cây, sau đó chuyển sang môi trường MS có bổ sung 1-naphthyl acetic acid (NAA) 1.0 mg/l, 6-benzyl aminopurine (BAP) 0.25 mg/l và gentamycin 10.0 ml/l. Những cây này sau đó dễ dàng thích nghi với điều kiện trong nhà kính nơi chúng sẽ được nuôi trong 1 năm. Việc nhuộm màu lá với fluorochoromes DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) và berberine sulfate đã chứng minh sự vắng mặt của MLOs trong cây tái sinh. Ramavat và cộng sự (1978) đã mô tả quá trình hình thành chồi non C.roseus từ mô sẹo. Sự tái sinh cây từ những tế bào mô sẹo đơn bội hay lưỡng bội C.roseus cũng đang được kết hợp với việc sử dụng những chất điều hòa sinh trưởng thực vật như kinetin và β-indolylacetic acid (IAA) đã được thực hiện bởi Abou-Mandour và cộng sự (1979). Phương pháp cho tần số cây C.roseus tái sinh cao bằng cách là tạo phôi soma đã được mô tả bởi Kin và cộng sự (1994). Tác giả thu được những mô sẹo từ bao phấn của cây C.roseus sử dụng môi trường MS rắn bổ sung NAA 1.0 mg/l và kinetin 0.1 mg/l (MSNK). Những phôi soma được hình thành sau khi chuyển những mô sẹo này vào môi trường MSNK lỏng. Những cây được trồng như vậy sẽ có cùng số nhiễm sắc thể như là cây trồng từ hạt (2n=16). Pietrosiuk và cộng sự (1999) đã thành lập hai dòng mô sẹo C.roseus trắng và xanh (hình 17d, e) trên môi trường Gamborg rắn bổ sung với 0.1 mg/l kinetin và 1.0 mg/l IAA. Mô sẹo được lấy từ những đoạn trụ dưới lá mầm của cây C.roseus giống. Dòng mô sẹo trắng đã được chọn từ những mô xanh phát triển trong pha tĩnh. Trái ngược với sự rắn chắc của dòng mô sẹo màu xanh, dòng màu trắng lại mịn và mềm. Phương pháp HPLC đã phân tích các chất chiết từ mô sẹo của cả hai dòng mô sẹo xanh và mô sẹo trắng chỉ cho thấy các indole alkaloid tồn tại ở dạng vết nhưng không có dược tính. Nuôi hạt nhân tạo Krueger và cộng sự (1982) đã tạo ra được cây có lá nuôi cấy từ hạt C.roseus nảy mầm vô trùng trên môi trường Murashige và Skoogs Revised Tobacco (MS RT) có bổ sung benzyladenine (BA), với đặc điểm là nhân giống nhanh chóng và sản xuất được các alkaloid như vindoline, ajmalicine, sitsiriline, tetrahydroalstonine và serpentine. Quá trình nuôi cấy cho thấy sự phát triển và sản xuất vindole nhanh chóng và rất nhiều hỗn hợp alkaloid khác, bao gồm cả những alkaloid không được tìm thấy ở cây nguyên vẹn. Miura và cộng sự (1988) đã cô lập đựơc vinblastine từ những chồi non C.roseus nuôi cấy được lấy từ những cây con nảy mầm từ hạt. Lượng vinblastine thu đựơc là 15μg/g chất khô và cao hơn trong mô sẹo (Miura et al. 1987). Kết quả này cho thấy rằng là sự sản xuất vinblastine thì liên quan đến sự hình thành chồi. Nuôi cấy mô phân sinh Sự nhân giống cây từ những mô phân sinh hiện nay là một phương pháp hữu ích để sản xuất nhanh sinh khối phục vụ cho y học. Nó cho phép khả năng tái tạo một kiểu gen ổn định và không thay đổi. Alen và cộng sự (1995) đã đề xướng việc nhân giống in vitro C.roseus bằng cách nuôi dưỡng mô phân sinh ngọn và chồi nách từ những cây được nuôi trong nhà kính. Các tác giả đã sử dụng môi trường MS cơ bản có bổ sung BA và 2,4-D ở nồng độ thấp. Những chồi nách này sẽ hình thành chồi ngọn sau 4-5 tuần nuôi cấy. Một phần những cành đã nhân giống được chuyển vào nuôi cấy tiếp trong môi trường tự do. Sau đó chúng được cắt và cho tạo rễ in vitro trong môi trường MS được bổ sung với NAA và phát triển trong nhà kính với độ ẩm tương đối 100%. Trong cả 2 trường hợp đều thành công. Furmanowa và cộng sự (1991, 1994) đã thành công trong việc áp dụng phương pháp này cho sự nhân giống cây C.roseus. Tác giả đã tái sinh những cây con từ chồi ngọn và chồi nách. Những chồi ngọn đã được cắt từ những cây con 7 ngày tuổi và nuôi trong môi trường rắn Nitsch và Nitsch (NN) (Nitsch và Nitsch 1969) được bổ sung thêm kinetin, bezyladenine, indole-3-butyric acid (IBA) và IAA kết hợp với nhau. Sau 2 tháng nuôi cấy những cây con có rễ được cắt và chuyển vào môi trường mới. Những cây này phải gồm có chồi ngọn hoặc chồi nách. Khoảng 200 cây con đang mọc rễ (hình 17a, b) đã được thu từ một cây con. Sau đó chúng sẽ phát triển trong nhà mái vòng bằng nhựa và trong nhà kính (hình 1c). Sau 5 tháng sinh trưởng chúng được thu nhận, sấy và cân. Việc phân tích thành phần hóa học của lá được thực hiện. Vindoline và catharanthine chiếm ưu thế trong giai đoạn còn non của cây (trước khi ra hoa). Hàm lượng alkaloid tổng trong lá của những cây được nuôi cấy in vitro rồi mới chuyển sang môi trường đất thì cao hơn những cây trồng chỉ trong đất. Hình 18: Sản phẩm mô sẹo và cây mọc từ hạt nhân tạo Cây C.roseus đã mọc rễ phát triển từ mô phân sinh ngọn trên môi trường NN bổ sung với 0.1 mg/l kinetin và 0.5 mg/l IBA sau 1 tuần nuôi cấy. Cây C.roseus đang ra hoa phát triển từ mô phân sinh ngọn trên môi trường NN bổ sung với 0.1 mg/l kinetin và 0.5 mg/l IBA sau 6 ngày chuyển qua. Cây C.roseus đang ra hoa trong nhà kính được nhân giống in vitro từ mô phân sinh ngọn. Dòng mô sẹo màu trắng nuôi cấy trên môi trường B5 bổ sung với 0.5 mg/l kinetin và 1.0 mg/l IAA (sau 96 ngày chuyển qua). Dòng mô sẹo màu xanh nuôi cấy trên môi trường B5 có bổ sung 0.1 mg/l kinetin và 1.0 mg/l IAA (sau 96 ngày chuyển qua) 4.2.5 Nuôi cấy rễ tơ Trong những năm gần đây, phương pháp nuôi cấy rễ, chủ yếu là rễ tơ của C.roseus đã tăng lên đáng kể hơn cả mong đợi, như là một nguồn tiềm năng của những hợp chất có giá trị chữa bệnh này. Sự phát triển của kỹ thuật vi nhân giống cây và phương pháp để mở rộng việc nuôi cấy rễ in vitro là rất quan trọng và có thể trở thành giải pháp quan trọng để giải quyết việc thu nhận indole alkaloid từ nguyên liệu thô. Những yếu tố di truyền của rễ tơ, thu được bằng sự nhiễm với Agrobacterium rhizogenes, sản xuất hợp chất thứ cấp nhiều hơn là những cây tự nhiên. Hàm lượng alkaloid trong rễ tơ có thể tương đương hoặc cao hơn khi đối chiếu với hàm lượng đo được trong nghiên cứu ở rễ tự nhiên. Những alkaloid chiếm ưu thế trong rễ tơ là ajmalicine, serpentine, vidoline và catharanthine, được tìm thấy với hàm lượng cao hơn trong rễ tự nhiên. Hình 19: Sản phẩm rễ tơ Rễ tơ của C.roseus xuất hiện sau 7-10 ngày ở những chỗ được cảm ứng với Agrobacterium rhizogenes chủng ATCC 15843. Rễ tơ của C.roseus nuôi cấy trong môi trường lỏng ½ B5 mà không có chất điều hòa tăng trưởng (11 ngày chuyển qua) Cây C.roseus đã được chuyển gen tái sinh từ rễ tơ trong môi trường lỏng ½ B5 không có chất điều hòa sinh trưởng. Hạt nhân tạo thu được từ đoạn rễ tơ C.roseus chứa trong gel calcium alginate Rễ tơ phát triển từ hạt nhân tạo C.roseus nuôi cấy trong môi trường rắn NN có bổ sung IBA 0.5 mg/l và kinetin 0.1 mg/l Rễ tơ phát triển từ hạt nhân tạo C.roseus nuôi cấy trên môi trường rắn NN bổ sung với IBA 0.5 mg/l và BAP 0.1 mgl/l Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào C.roseus Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng Hirata và cộng sự (1994) đã chứng minh rằng phytohormone (hormone thực vật) rất quan trọng cho sự tăng trưởng và phân chia hình thái của mô, dẫn đến sự hình thành và phát triển của chồi C.roseus, và cũng làm đa dạng hóa các alkaloid và làm tăng hàm lượng của chúng Tất cả chồi non nuôi cấy của C.roseus được cảm ứng hoàn toàn với tần số cao từ những hạt nảy mầm trên môi trường Murashige và Skoog (MS) (Murashige và Skoog 1962) được bổ sung thêm BA 1.1 mg/l (Hirata và cộng sự 1987). Kết quả nuôi cấy mặc dù chỉ gồm có mô sẹo mọc trực tiếp trên môi trường rắn và có một số chồi non với một vài lá nhỏ. Theo thông số thu được từ phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC) của dịch trích nuôi cấy cho thấy rằng vindoline và catharanthine hiện diện chủ yếu trong cành non, đặc biệt là trong lá, trong khi ajmalicine (0.072 mg/g chất khô) tích lũy chính trong các mô sẹo. Hàm lượng catharanthine (0.370 mg/g chất khô) trong lá cây nuôi cấy cao hơn vài lần trong lá của những cây đối chứng (0.035 mg/g chất khô), trong khi hàm lựơng vindoline thì gần như bằng nhau trong cả hai trường hợp (lần lượt là 1.8 mg/g và 1.2 mg/g chất khô). Khi chuyển quá trình nuôi cấy vào môi trường không có BA đã kích thích sự phát triển của chồi non và dẫn đến sự gia tăng sản xuất vindoline và catharanthine đồng thời với việc ức chế sản xuất ajmalicine. Satdive và cộng sự (2003) nghiên cứu ảnh hưởng những nồng độ IAA và BA khác nhau lên sự sản xuất ajmalicine trong bình lắc (shake flasks) sử dụng chồi C.roseus để nuôi cấy. Những chồi được nuôi trong môi trường MS có bổ sung IAA ở nồng độ cao và BA ở nồng độ thấp, đã tích lũy một lượng lớn ajmalicine. Với IAA ở nồng độ thấp và BA ở nồng độ cao thì chồi sẽ giải phóng nhiều ajmalicine vào môi trường. Quá trình sản xuất ajmalicine từ chồi nuôi cấy thì không tương quan với tốc độ tăng trưởng. Vinblastine và vincristine thì không hiện diện trong chồi nuôi cấy. Sự sinh tổng hợp alkaloid xảy ra trong lục lạp. Theo đó, sự hình thành những dimeric alkaloid có thể phụ thuộc vào mức độ khác nhau của lục lạp trong tế bào nuôi cấy in vitro. Loyola-Vargas và cộng sự (1986) đã thử nghiệm những chất điều hòa sinh trưởng khác nhau và ảnh hưởng của chúng lên việc cảm ứng mô sẹo xanh trong một dòng tế bào C.roseus 3 năm tuổi. Các tác giả đã xác định được cả vinblastine và vincristine trong cả hai dòng mô sẹo trắng và xanh. Hàm lượng của những alkaloid này trong dòng màu trắng cao hơn xấp xỉ 2 lần trong dòng màu xanh. Trong môi trường có bổ sung 3 mg/l benzylaminopurine (BAP) mà không có mặt auxin đã sản xuất hàm lượng chất diệp lục cùng với việc gia tăng hàm lượng dimeric alkaloid. Điều kiện nuôi cấy mô sẹo rất quan trọng cho việc sản xuất alkaloid. Morris (1986) đã thiết lập quá trình nuôi cấy mô sẹo từ lá của những cây C.roseus sử dụng 3 loại môi trường: môi trường Gamborg (B5), môi trường MS và Zenk với những thay đổi khác nhau (B5 với 2,4-D 1.0 mg/l và kinetin 0.1 mg/l; B5 với IAA 1.0 mg/l và kinetin 0.1 mg/l; MS với NAA1.0 mg/l và kinetin 0.1 mg/l, môi trường Zenk bổ sung IAA 0.175 mg/l và BAP 1,125 mg/l, và chỉ một mình NAA, 2,4-D và zeatin 1.0 mg/l). Các tác giả cũng thử tiến hành nuôi cấy trong 2 điều kiện sáng và tối. Các mô sẹo hình thành có đặc trưng về màu sắc, hình thái và hàm lượng alkaloid. Bốn loại alkaloid: catharanthine, vindoline, ajmalicine và serpentine đã có mặt trong mô sẹo nuôi cấy trên môi trường có bổ sung IAA và BAP. Serpentine là alkaloid chính tích lũy trong điều kiện sáng và ajmalicine tích lũy trong điều kiện tối. Miura và cộng sự (1987) đã cô lập vinblastine từ mô sẹo C.roseus hình thành từ những đoạn lá non. Môi trường MS có bổ sung NAA 1.0 mg/l và kinetin 0.1 mg/l đã được sử dụng. Các mô sẹo đã được nuôi cấy trong môi trường tối. Sự hiện diện của vinblastine trong mô sẹo của những rễ khác nhau đã được xác định bằng phương pháp sắc lý lỏng cao áp (HPLC) và phép đo phổ khối lượng. Lượng vinblastine (1μg/g chất khô), thấp hơn so với cây mẹ. Marfori và Alejar (1993) đã cho thấy khả năng sản xuất alkaloid của những mô sẹo có nguồn gốc từ rễ, thân, lá và hoa của hai giống C.roseus, trắng và hồng tím. Các tác giả đã thu được tám dòng mô sẹo bằng cách sử dụng môi trường LS bổ sung BA 3.0 mg/l, 2,4-D 0.5 mg/l và nước dừa. Sau khi các mô được hình thành thì được chuyển vào môi trường LS không có chất điều hòa sinh trưởng và được nuôi trồng trong 1 năm. Hàm lượng alkaloid cao nhất là trong cây màu hồng tím và trong mô sẹo có nguồn gốc từ rễ. Theo báo cáo của Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng đăng trên tạp chí phát triển khoa học và công nghệ thì mô sẹo xanh được cảm ứng từ lá cây dừa cạn in vitro được nuôi trong môi trường MS (Murashige và Skoog) lỏng có bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau gồm có auxin và cytokinin. Ở nồng độ 1 mgl-1 ∝-naphthaleneacetic acid (NAA) và 0,5 mgl-1 kinetin (Kin) thu nhận được sinh khối và alkaloid toàn phần cao nhất trong khi cũng ở môi trường này nhưng thay thế NAA bằng 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) ở cùng nồng độ thu được sinh khối và alkaloid toàn phần thấp. Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng. Yếu tố môi trường cũng ảnh hưởng đến chúng, ví dụ như là cường độ ánh sáng hay bức xạ tử ngoại UV. Hirata và cộng sự (1991, 1992) đã phát hiện ra rằng mô sẹo xanh được cảm ứng từ lá cây dừa cạn in vitro được nuôi trong môi trường MS (Murashige và Skoog) lỏng có bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau gồm có auxin và cytokinin. Ở nồng độ 1 mgl-1 ∝-naphthaleneacetic acid (NAA) và 0,5 mgl-1 kinetin (Kin) thu nhận được sinh khối và alkaloid toàn phần cao nhất trong khi cũng ở môi trường này nhưng thay thế NAA bằng 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) ở cùng nồng độ thu được sinh khối và alkaloid toàn phần thấp. Những kết quả này có thể cho thấy rằng ánh sáng NUV rõ ràng có thể kích thích sự tổng hợp leurosine và cũng tổng hợp vinblastine từ vindoline và catharanthine nhưng với mức độ ít hơn. Ảnh hưởng của nhiệt độ Ten Hoopen và cộng sự (2002) cho thấy rằng nhiệt độ cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và sản xuất ajmalicine từ huyền phù C.roseus. Nhiệt độ tối ưu cho cả hai quá trình thu sinh khối và sản xuất hợp chất thứ cấp là 27.50 C. Yuan và Hu (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của những sự kết hợp khác nhau của auxin, cytokinin và cường độ chiếu sáng lên sự hình thành của chồi cây C.roseus trong nuôi cấy in vitro. Các tác giả đã chứng minh rằng chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA được thêm vào môi trường MS theo thứ tự là 7.0 mg/l và 1.0 mg/l có tác dụng kích thích sự hình thành chồi non, trong khi 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) ức chế sự phân hóa và hình thành của chúng. Cường độ chiếu sáng 550-700lux cho thấy là có ảnh hưởng tốt khi kết hợp đồng thời với môi trường MS bổ sung BA 2 mg/l và NAA 0-1.0 mg/l. Ảnh hưởng của nồng độ đường Theo báo cáo của Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng đăng trên tạp chí phát triển khoa học và công nghệ thì mô sẹo đặc được đưa vào môi trường MS có chất điều hòa tăng trưởng thích hợp và bổ sung các nồng độ đường khác nhau. Thí nghiệm được bố trí như bảng dưới. Bảng 1: Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose đến sự nuôi cấy huyền phù tế bào Đồ thị 1: Đường cong tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào trong môi trường có bổ sung các nồng độ đường khác nhau Theo đó ta thấy rằng ở nồng độ đường là 60g/l cho lượng sản phẩm là cao nhất KẾT LUẬN Ứng dụng nuôi cấy tế bào C.roseus để sản xuất các hợp chất thứ cấp có ích đã tạo ra một bước tiến xa trong khoa học thực vật. Do nhu cầu sử dụng các sản phẩm tự nhiên trong y dược ngày càng tăng nhưng sản lượng của chúng ở cây trồng tự nhiên lại rất thấp đã thúc đẩy sự phát triển không ngừng của công nghệ nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn. Tuy nhiên, các con đường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn trong thực vật cũng như trong nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn là rất phức tạp. Vì vậy, các thông tin ở mức độ tế bào và phân tử của các quá trình chuyển hóa là rất cần thiết cho sự phát triển của sản xuất công nghiệp. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt [1]. Viện dược liệu, 2004. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 1. Nhà xuất bản khoa học & kỹ thuật Hà Nội. [2]. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2006. Công nghệ tế bào. Nhà xuất bản đại học quốc gia TP. Hồ Chí Minh. [3]. Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng, 2006. Ảnh hường của chất điều hòa tăng trưởng thực vật và đường saccharose lê dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa cạn Catharanthus roseus. Tạp chí phát triển khoa học & công nghệ, tập 9, số 6. [4] Trần Chấn Đại, 2008. Nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù tế bào cây Mãn Đình Hồng Althaea Rosea để thu nhận hợp chất Flavonoid có hoạt tính sinh học. Luận văn thạc sĩ, đại học Bách Khoa TP.Hồ Chí Minh Tài liệu tham khảo tiếng Anh [5]. Fattorusso, E., Taglialatela, O., 2008. Modern alkaloids: structure, isolation, synthesis and biology. Wiley-VCH, Weinheim, Germany. [6]. Pahwa, D., 2008. Catharanthus alkaloids. B.Pharm Punjab University Chandigarh. [7]. Guggisberg, A., Hesse, M., . Alkaloids. The University of Zurich. [8] Pietrosiuk, A., Furmanowa, M., Lata, B., 2007. Catharanthus roseus: micropropagation and in vitro techniques. Phytochem Review, 6:459-473. [9] H.Sutarno & Rudjiman, 1999. PROSEA, 12 (1)- Medicinal and Poisionous Plant; 190. [10] Murashige T., 1980. Plant growth substances in commercial uses of tissue culture. In: Skoog F, editor. Plant Growth Substances. Berlin: Springer-Verlag, pp.426-34. [11] Daugaard, H., 2001. Nutritional status of strawberry cultivars in organic production. Journal of Plant Nutrition. Vol 24, Iss 9, pp 1337-1346. [12] Gamborg, O.L., Murashige, T., Thorpe, T.A & Vasil, i.K., 1976. Plant tissue culture media. In Vitro. 12:473-8. [13] Eymar, E., Alegre, J., Toribio, M & Lĩpez-Vela, D., 2000. Effect of activate charcoal and 6-benzyladenin on in vitro nitrogen uptake by Lagerstroemia india. Plant cell, Tissue and Organ Culture. 16:23-37. [14] Bhojwani, S.S & Razdan, M.K., 1996. Plant tissue culture: Theory and practice, a revised edition. Elsevier Science B.V. The Netherlands