Đề tài Cố định enzyme anpha – amylase bằng gel alginate

l2 Haït Calcium alginate vôùi enzyme coá ñònh 19 Phöông trình phaûn öùng : NainateACaCainateANa 2)lg()lg(2 2  Ñaëc ñieåm cuûa gel alginate Gel alginate coù khaû naêng nhoát moät löôïng lôùn teá baøo vaø enzyme, hieäu suaát nhoát enzyme cao, thao taùc vaø kyõ thuaät tieán haønh ñôn giaûn. Haït gel coù kích thöôùc coù thay ñoåi töø 0.5 4mm. Haït coù caáu truùc beàn vöõng. Ñeå oån ñònh haït gel coù theå cho haït gel khaâu maïch trong dung dòch glutaraldehyde hoaëc caùc chaát khaâu maïch khaùc. Tuy nhieân gel naøy laïi khoâng beàn trong moâi tröôøng coù phosphate.  Phöông phaùp nhoát gel trong heä sôïi Naêm 1972, Dinelli ñaõ tieán haønh moät thí nghieäm khaù ñoäc ñaùo laø nhoát enzyme trong heä sôïi vaø nhöõng nghieân cöùu naøy ñöôïc keát thuùc naêm 1978. Theo keát quaû nghieân cöùu cuûa Dinelli, enzyme khi ñöôïc nhoát vaøo heä sôïi phaùt huy khaû naêng xuùc taùc raát toát. Phöông phaùp nhoát enzyme trong heä sôïi coù khaû naêng xuùc taùc phaûn öùng toát hôn phöông phaùp nhoát enzyme trong gel. Caùc sôïi söû duïng ñeå nhoát enzyme thöôøng laø sôïi nhaân taïo. Caùc loaïi sôïi naøy coù ñoä beàn vôùi acid, kieàm, caùc loaïi ion vaø caùc loaïi dung moâi hoøa tan. Tính chaát treân phuï thuoäc raát nhieàu vaøo baûn chaát hoùa hoïc cuûa caùc polymer taïo ra loaïi sôïi naøy.  Phöông phaùp taïo vi nang (microcapsule) Khaùc vôùi phöông phaùp nhoát trong gel, ôû phöông phaùp naøy enzyme ñöôïc nhoát trong moät maøng baùn thaám, nhöng cô chaát vaø saûn phaåm deã daøng ñi qua. Vì hoaït ñoäng trong moâi tröôøng dung dòch, neân khaû naêng tieáp xuùc giöõa cô chaát vaø enzyme lôùn hôn trong tröôøng hôïp nhoát trong khuoân gel. 20 Hình 2.12: Qui trình nhoát enzyme trong microcapsule  Phöông phaùp sieâu loïc (ultrafilitration) Nguyeân taéc cuûa phöông phaùp naøy cuõng töông töï phöông phaùp micro capsule. Enzyme ñöôïc giöõ laïi trong caùc maøng, sôïi sieâu loïc. Phöông phaùp naøy ñaõ ñöôïc öùng duïng coá ñònh glucose amylase, glucose isomerase, galactosidase. c. Phöông phaùp hoùa hoïc  Lieân keát coäng hoùa trò Coá ñònh enzyme baèng lieân keát coäng hoùa trò vôùi caùc polymer ñaõ ñöôïc hoaït hoùa, laø moät trong nhöõng phöông phaùp coá ñònh enzyme phoå bieán nhaát, ñaûm baûo lieân keát vöõng chaéc cuûa enzyme vôùi vaät lieäu coá ñònh.  Öu ñieåm Do lieân keát chaët cheõ vôùi vaät lieäu coá ñònh baèng lieân keát coäng hoùa trò, neân enzyme khoâng bò ly giaûi trong suoát quaù trình söû duïng. Enzyme deã daøng tieáp xuùc cô chaát do enzyme ñöôïc gaén treân beà maët vaät lieäu coá ñònh. Enzyme coù khaû naêng oån ñònh vôùi söï thay ñoåi nhieät ñoä. Monomer öa nöôùc Pha nöôùc Pha höõu cô Monomer kî nöôùc hoùa polymer polymer 21  Nhöôïc ñieåm Enzyme coù theå bò maát hoaït tính vì caáu truùc cuûa enzyme bò thay ñoåi do quaù trình lieân keát. Giaûm khaû naêng tieáp xuùc giöõa enzyme vaø cô chaát do ñoù laøm giaûm hoaït tính enzyme coá ñònh. Vaät lieäu coá ñònh khoâng taùi söû duïng ñöôïc, phöông phaùp naøy aùp duïng cho caùc enzyme oån ñònh hoaït tính khi coá ñònh.  Enzyme coá ñònh coù theå taïo ra baèng hai caùch – Noái ñoàng hoùa trò lieân keát caùc phaân töû enzyme rieâng bieät laïi thaønh moät lieân hôïp cao phaân töû khoâng hoøa tan. Ñaây laø phöông phaùp khoâng söû duïng chaát mang. Caùc phaân töû enzyme seõ lieân keát vôùi nhau qua caùc caàu noái trung gian ñeå trôû thaønh daïng khoâng hoøa tan. Caùc caàu noái trung gian thöôøng duøng laø glutaraldehyte. – Keát hôïp phaân töû enzyme vôùi vaät lieäu coá ñònh khoâng hoøa tan baèng lieân keát coäng hoùa trò. Ñieàu cheá caùc enzyme coá ñònh loaïi 1, khi duøng caùc taùc nhaân löôõng chöùc nhö bisdiazobenzidin, bisdiazobenzidin, 2,2’ disulfur acid vaø moät soá hôïp chaát khaùc. Ñaëc bieät ngöôøi ta thöôøng duøng glutaraldehyte laøm taùc nhaân ñeå ñính caùc phaân töû enzyme laïi vôùi nhau. Caùc enzyme coá ñònh loaïi 2 thöôøng ñöôïc ñieàu cheá phoå bieán hôn. Chaát mang ñeå coá ñònh enzyme phaûi thoûa maõn nhöõng ñoøi hoûi nhaát ñònh sau : Coù ñoä hoøa tan thaáp vaø beàn vöõng ñoái vôùi caùc taùc ñoäng cô hoïc vaø hoùa hoïc nhaát ñònh … Khoâng gaây taùc duïng kìm haõm ñeán enzyme. Khoâng taïo ra hieän töôïng haáp thuï khoâng ñaëc hieäu ñoái vôùi caùc protein. Vì phaûn öùng enzyme thöôøng xaûy ra trong moâi tröôøng nöôùc, neân vaät lieäu coá ñònh toát hôn caû laø coù chaát öa nöôùc. 22 Trò soá vaø daáu ñieän tích cuûa vaät lieäu coá ñònh cuõng coù vai troø nhaát ñònh. Vieäc gaén enzyme coù hieäu quaû hôn caû khi ñieän tích cuûa enzyme vaø cuûa vaät lieäu coá ñònh coù daáu ngöôïc nhau. Vì leõ ñieän tích cuøng daáu coù theå ngaên caûn söï lieân keát. Quaù trình coá ñònh enzyme coù theå xaûy ra qua moät giai ñoaïn neáu vaät lieäu coá ñònh coá ñònh coù chöùa caùc nhoùm coù khaû naêng tham gia töông taùc tröïc tieáp vôùi nhoùm amin cuûa enzyme. Tröôøng hôïp ngöôïc laïi quaù trình xaûy ra qua 2 giai ñoaïn :  Giai ñoaïn hoaït hoùa vaät lieäu coá ñònh baèng caùch ñöa vaøo caùc nhoùm chöùc naêng coù khaû naêng phaûn öùng hôn.  Giai ñoaïn hai giai ñoaïn keát hôïp enzyme. Tröôøng hôïp khoâng caàn hoaït hoùa vaät lieäu coá ñònh theå hieän roõ trong tröôøng hôïp copolymer cuûa maleic alhydric vaø ethylen. Copolymer ñöôïc duøng phoå bieán laøm vaät lieäu coá ñònh ñeå ñieàu cheá caùc daãn xuaát khoâng tan cuûa protease vaø moät soá enzyme khaùc. Tröôøng hôïp hoaït hoùa vaät lieäu coá ñònh :  Hoaït hoùa chaát mang baèng cyanogen halogenur : Caùc chaát mang coù baûn chaát laø polysaccharide ( OH) thöôøng ñöôïc hoaït hoùa sô boä baèng cyanogen halogenur. Phaûn öùng hoaït hoùa xaûy ra trong moâi tröôøng kieàm. Chaát mang hoaït hoùa coù khaû naêng lieân keát coäng hoùa trò vôùi [ NH2] cuûa protein cuûa enzyme. Porath vaø Bar Eli laàn ñaàu tieân hoaït hoùa cellulose, agarose vaø dextran baèng phöông phaùp naøy. Quaù trình dieãn ra nhö sau: Khi xöû lyù polysaccharide baèng BrCN seõ taïo ra imidocarbonate. Carbonate beàn vöõng, coøn imidocarbonate töông taùc vôùi [ NH2] 23 NH C O O OH N CNOH OH OH CNBr + ENZYME + ENZYME OH ENZYMENHCO NH OH ENZYMENHCO O  Hoaït hoùa baèng ethyl chloroformate : Khi söû duïng phöông phaùp hoaït hoùa baèng cyanogenbromide, Cyanogenbromide vaø caùc saûn phaåm trung gian raát ñoäc. Chloroformate coù theå ñöôïc söû duïng ñeå taïo ra caùc saûn phaåm trung gian töông töï nhöng khoâng coù ñoäc tính. Phöông phaùp ñöôïc thöïc hieän nhö sau : OH ENZYMENHCO O O C O O HCClO OH OH ENZYM 522  Hoaït hoùa baèng carbodiimide Caùc chaát mang coù chöùa nhoùm carboxyl, coù theå ñöôïc hoaït hoùa baèng caùc daãn xuaát carbodiimide. Phaûn öùng xaûy ra trong moâi tröôøng acid yeáu (pH = 5), neân phöông phaùp hoaït hoùa naøy phuø hôïp vôùi caùc enzyme amylase, pepsin, cellulase … 24 ENZYMNHC O R' N C CO NH O HOC O ENZYMR'NCNR R  Hoaït hoùa baèng glutaraldehyde Caùc chaát mang coù chöùa nhoùm NH2 nhö polyacrylamide,chitin, chitosan, cellulose, tinh boät gheùp acrylamide ñeàu coù theå söû duïng phöông phaùp naøy. Glutaraldehyde laø chaát coù chöùa hai nhoùm aldehyde hoaït hoùa. Moät nhoùm seõ gaén vôùi NH2 cuûa chaát mang, nhoùm coøn laïi seõ gaén vaøo NH2 cuûa enzyme. OCH CH CH CH OCH 2 2 2 22 22 22 CHCHC OCH CHCHCHC OCH CHCHCHC OCH CH 22 22 22 CHCHCH OCH CHCHCH ENZYMNCH CHCHCH OCH NH CH  Hoaït hoùa baèng 3 aminopropyltriethoxysilane Hoaït hoùa baèng trialkoxysilane cho pheùp hoaït hoùa nhöõng vaät lieäu trô nhö thuûy tinh coù theå gaén vôùi enzyme. Thöïc hieän nhö sau : ENZYM + ENZYM 25 232 232NH)Si(CHO)H(C NH)(CHSiOSiO O O NH)(CHSiOSiO O OHSiO O OHSiO O 232352 2 CClS NCS)(CHSiOSiO O O NCS)(CHSiOiO O 32 32 + ENZYM ENZYMNHCNH)(CHSiOSiO S O O ENZYMNHCNH)(CHSiOSiO S O 32 32  Hoaït hoùa baèng azide Hieän nay phöông phaùp naøy ñöôïc xem laø phöông phaùp haøng ñaàu. Caùc chaát mang coù chöùa nhoùm chöùc COOH nhö CM Cellulose, polyacrylamide vaø nylon coù theå hoaït hoùa baèng phöông phaùp naøy. Tröôùc heát laø ester hoùa CM Cellulose. Sau ñoù chuyeån ester thaønh hydrazide, roài azide. Azide trong moâi tröôøng kieàm seõ phaûn öùng [ NH2] cuûa enzyme. Phaûn öùng xaûy ra theo sô ñoà : Glass 26 OH NHNHCOCH O NHNH OH OCHCOCH O OHCH OH COOHOCH 22 22 32 3 2 HNO2 ENZYM OH ENZYMNHCOCH O 2 OH COCH O 32  Hoaït hoùa baèng phaûn öùng diazo Nhöõng chaát mang coù nhoùm amine coù theå söû duïng phöông phaùp naøy. Muoái diazo cuûa chaát mang hoaït hoùa coù theå phaûn öùng khoâng chæ vôùi nhoùm amin maø caû nhoùm phenol, imidizol cuûa protein cuûa enzyme. Phaûn öùng coäng hoùa trò vôùi enzyme xaûy ra nhanh choùng ôû nhieät ñoä thöôøng vaø moâi tröông nöôùc trung bình. Quaù trình hoaït hoùa vaø gaén enzyme nhö sau : OH NN CHO HCl ,NaNO OH NH CHO 2 2 22 + ENZYM OH ENZYMNN CHO 2 27  Phöông phaùp lieân keát ion Döïa treân khaû naêng taïo lieân keát giöõa chaát mang vôùi enzyme. Lieân keát ion thöôøng khoâng beàn baèng söï haáp thuï giöõa enzyme vôùi chaát mang. Naêm 1956, Mitz laø ngöôøi ñaàu tieân thöïc hieän phöông phaùp lieân keát ion ñeå gaén enzyme vaøo chaát mang. OÂng ñaõ söû duïng DEAE ñeå gaén enzyme vaøo. Naêm 1966, Tosa ñaõ söû duïng DEAE sephadex nhö moät chaát mang ñeå gaén aminoacrylase trong qui trình coâng nghieäp saûn xuaát amino acid, sau ñoù laø haøng loaït nghieân cöùu theo phöông phaùp naøy vaø ñöôïc aùp duïng khaù thaønh coâng ôû qui moâ coâng nghieäp. d. Phöông phaùp khaâu maïch (cross linking) Nhöõng hôïp chaát coù hai hoaëc ña nhoùm chöùc naêng nhö glutaraldehyde, diisocyanate ñöôïc duøng laøm caàu noái khaâu maïch taïo thaønh ñaïi phaân töû khoâng tan trong nöôùc. Phöông phaùp naøy thöôøng cho hoaït tính thaáp laø do caùc hôïp chaát khaâu maïch coù theå lieân keát vaøo trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme. Treân ñaây laø moät soá phöông phaùp coá ñònh enzyme, söï löïa chon ñuùng phöông phaùp thích hôïp cho töøng enzyme vaø vaät lieäu coá ñònh chuyeân bieät laø moät yeáu toá toái quan troïng ñeå thu ñöôïc cheá phaåm enzyme coá ñònh coù hoaït tính cao. Ñoàng thôøi caàn xaùc ñònh caùc ñieàu kieän hoaït ñoäng thích hôïp cho enzyme coá ñònh. Vì vaäy ñeå cho quaù trình coá ñònh coù keát quaû neân löu yù : Enzyme phaûi oån ñònh trong nhöõng ñieàu kieän dieãn ra phaûn öùng. Caùc chaát tham gia phaûn öùng taïo lieân keát ngang chuû yeáu chæ töông taùc vôùi nhöõng nhoùm chöùc naêng naèm ngoaøi trung taâm hoaït ñoäng enzyme hoaëc taïo lieân keát ngang coù kích thöôùc lôùn khoâng cho pheùp noù xaâm nhaäp vaøo trung taâm hoaït ñoäng enzyme. Trung taâm hoaït ñoäng phaûi luoân ñöôïc “baûo veä” baèng nhieàu phöông phaùp khaùc nhau nhö : Enzyme chöùa nhoùm SH thì caàn phaûi xöû lyù sô boä noù baèng glutathinon hay cystein vaø chæ taùi hoaït hoùa enzyme sau khi ñaõ gaén noù vaøo vaät 28 lieäu coá ñònh hoaëc boå sung vaøo hoãn hôïp phaûn öùng cô chaát ñaõ ñöôïc baõo hoøa bôûi enzyme. Caàn choïn bieän phaùp thích hôïp ñeå taùch “enzyme khoâng ñöôïc gaén” leân vaät lieäu coá ñònh, maø khoâng gaây aûnh höôûng xaáu ñeán enzyme ñöôïc gaén. Khi löïa choïn heä coá ñònh caàn ñeå yù ñeán phaûn öùng cuï theå vaø thaät voâ nghóa neáu ñöa enzyme vaøo vaät lieäu coá ñònh maø baûn chaát vaät lieäu coá ñònh laø polymer bò phaân giaûi bôûi enzyme naøy xuùc taùc hoaëc ñaëc bieät neáu enzyme bò öùc cheá bôûi saûn phaåm cuûa phaûn öùng taïo ra. 2.3. ÖÙNG DUÏNG CUÛA ENZYME COÁ ÑÒNH [3] 2.3.1. Trong coâng nghieäp Ngaøy nay, nhieàu qui trình öùng duïng enzyme coá ñònh trong coâng nghieäp nhö coâng nghieäp saûn xuaát röôïu bia, nöôùc giaûi khaùt, cheá bieán söõa, saûn xuaát da, hoùa chaát. Röôïu bia : caùc enzyme amylase, teá baøo naám men coá ñònh enzyme ñöôïc söû duïng vôùi qui moâ lôùn. Cheá bieán söõa : Enzyme lactase coá ñònh ñeå thuûy phaân lactose trong söõa. Naêm 1969 Wilson ñaõ saûn xuaát lieân tuïc glucose baèng glucoamylase coá ñònh. Naêm 1971 ñaõ duøng chymotrysin lieân keát coäng hoùa trò vôùi carboximethyl cellulase laøm ñoâng tuï söõa thay cho renin ñaét tieàn.  Thu nhaän hoãn hôïp glucose fructose Naêm 1973 haõng Clinton Corn (Myõ) ñöa vaøo saûn xuaát coâng nghieäp glucoisomerase chuyeån hoùa glucose thaønh fructose vôùi tæ leä 1:1, thoâng thöôøng ñöôïc gaén vôùi caùc polymer voâ cô qua caùc lieân keát ñoàng hoùa trò.  Taùch hoãn hôïp aminoacid nhôø aminocylase Coâng trình ñöôïc söû duïng ñaàu tieân ôû Nhaät Baûn ñeå saûn xuaát methionine. Haõng Snam Progetti (YÙ) nhoát aminoacid trong sôïi cellulose triacetat. Haõng Tanaka Cuaky (Nhaät) söû duïng phöông phaùp haáp thuï aminoacid treân DEAE Cellulose. 29  Thu nhaän l asparric acid Aspartase coá ñònh xuùc taùc quaù trình gaén nhoùm NH3 vaøo fumaric acid ñeå nhaän ñöôïc L aspartic acid (1973) hieäu suaát chuyeån hoùa laù 80%. Aspartic coá ñònh thu nhaän baèng caùch nhoát teá baøo trong gel polyacrylamide.  Thu nhaän l succinic acid Fumarase coá ñònh chuyeån hoùa fumaric acid thaønh L succinic acid ñöôïc thöïc hieän ôû qui moâ coâng nghieäp naêm 1974, phaûn öùng xaûy ra cho ñeán khi 80% fumaric acid ñöôïc chuyeån hoùa. Fumarase coá ñònh ñöôïc thu nhaän baèng caùch nhoát teá baøo trong gel polyacrylamide hoaëc sôïi triacetate cellulose.  Thu nhaän 6 amino penicillinic acid 6 APA laø baùn saûn xuaát ñeå toång hôïp caùc loaïi penicilin khaùc nhau, laàn ñaàu tieân ñöôïc haõng Snam Progetti 1975 ñaõ söû duïng penicillinamiolase coá ñònh ñeå saûn xuaát penicillin.  Thuûy giaûi lactose Lactose hay coøn goïi laø “ñöôøng söõa” coù ñoä ngoït vaø ñoä hoøa tan thaáp, bò thuûy giaûi bôûi lactase thaønh glucose vaø galactose. Caùc cheá phaåm lactase coá ñònh ñaõ ñöôïc cheá taïo theo phöông phaùp khaùc nhau: nhoát trong sôïi triacetate cellulose, lieân keát ñoàng hoùa trò vôùi caùc polymer chöùa silic, haáp thuï treân caùc chaát trao ñoåi ion.  Thu nhaän töø tinh boät Ñeå thu nhaän glucose phaûi söû duïng hai enzyme laø amylase vaø glucoamylase phaân caét tinh boät thaønh caùc oligosaccharide, coøn glucoamylase phaân caét tinh boät vaø taïo thaønh glucose. Hieän nay ngöôøi ta chuù yù taïo glucoamylase coá ñònh. Haõng Corning Glass ñaõ söû duïng glucoamylase coá ñònh ñeå saûn xuaát 450 kg glucose/ngaøy. Cheá phaåm glucoamylase coá ñònh ñöôïc thu nhaän baèng caùch gaén enzyme treân silicagel, nhoát trong sôïi triacetate cellulose haáp thuï treân DEAE Cellulose. 30 Ngoaøi ra, hieän nay voâ soá enzyme ñaét tieàn khaùc ñang ñöôïc tieán haønh coá ñònh vaø nghieân cöùu söû duïng ôû qui moâ coâng nghieäp. 2.3.2. Trong y hoïc Enzyme coá ñònh ñöôïc öùng duïng nhieàu trong y hoïc, ñeå chöõa caùc beänh di truyeàn do thieáu enzyme hoaëc hoaït ñoä enzyme yeáu. Naêm 1954 Chung ñaõ taïo ñöôïc vi tieåu caàu baùn thaám coù gaén enzyme, nhôø theá enzyme coù theå toàn taïi treân cô theå laâu daøi vì enzyme bò bieät laäp vôùi moâi tröôøng xung quanh. Nhôø theá maø cô theå taïo ñöôïc noàng ñoä cao cuûa enzyme thieáu maø khoâng bò aûnh höôûng ñeán caùc phaûn öùng phuï. Urease coá ñònh ñöôïc duøng ñeå loaïi urea trong maùu cuûa thaän nhaân taïo. Caùc tieåu caàu coù gaén catalase duøng trò thieáu catalase cô. Enzyme coá ñònh coøn ñöôïc duøng trong chaån ñoaùn beänh, ngoaøi caùc öùng duïng ñieän cöïc enzyme, trong phaân tích caùc chæ tieâu sinh hoùa cuûa maùu nhö löôïng glucose, urea, cholesterol… enzyme horse radish peroxidase coá ñònh treân polystyren cuøng vôùi khaùng theå giuùp chaån ñoaùn nhanh vaø chính xaùc (kyõ thuaät ELLISA). Enzyme 1 asparaginase coù khaû naêng öùc cheá söï phaùt trieån cuûa khoái u aùc tính, neáu ñöa tröïc tieáp enzyme naøy vaøo cô theå thì bò ñöa ra ngoaøi nhanh choùng vaø gaây hieän töôïng dò öùng, nhöng neáu ñöa caùc vi tieåu caàu coù gaén enzyme vaøo cô theå seõ coù hieäu quaû hôn. 2.3.3. Trong nghieân cöùu khoa hoïc Tröôùc tieân enzyme coá ñònh laø coâng cuï nghieân cöùu hoùa sinh raát quan troïng. Naêm 1967, ñieän cöïc enzyme ñaàu tieân ñaõ ñöôïc cheá taïo ñeå xaùc ñònh noàng ñoä glucose nhôø glucooxydase coá ñònh. Ñieän cöïc enzyme laø ñieän cöïc oxy treân beà maët coù gel poly acrylamide. Nhuùng ñieän cöïc vaøo dung dòch coù glucose thì cô chaát vaø oxy seõ khueách taùn vaøo gel chöùa enzyme. Nhö vaäy, söï bieán ñoåi doøng ñieän trong heä thoáng ñieän cöïc phuï thuoäc vaøo toác ñoä cuûa phaûn öùng vaø noàng ñoä glucose. Kaetsu ñaõ duøng ñieän cöïc urease ñeå ño noàng ñoä urea trong maùu, duøng cholesterol oxidase ño noàng ñoä cholesterol. 31 Clark duøng ñieän cöïc alcohol oxydoreductase ñeå xaùc ñònh noàng ñoä coàn. Ngoaøi ra enzyme coøn coù theå duøng vaøo nhieàu muïc ñích khaùc nhau nhö: hoaït hoùa zymogen, nghieân cöùu caáu truùc phaân töû protein, söû duïng phöông phaùp saéc kyù aùi löïc ñeå tinh cheá moät soá chaát coù khaû naêng lieân keát ñaëc bieät vôùi enzyme. Ngaøy nay coù nhieàu qui trình söû duïng cheá phaåm teá baøo coá ñònh ñeå xöû lyù nöôùc thaûi ñaït hieäu quaû. Caùc nghieân cöùu veà maøng enzyme coá ñònh ngaøy caøng taêng, nhöõng keát quaû ñaït ñöôïc cuõng phuï thuoäc nhieàu vaøo tính chaát cuûa maøng duøng ñeå gaén enzyme. Treân cô sôû nghieân cöùu tính chaát cuûa enzyme coá ñònh seõ goùp phaàn giaûi quyeát nhieàu vaán ñeà lôùn khaùc nhau nhö : – Giaûi thích toaøn dieän hôn chöùc naêng xuùc taùc sinh hoïc trong teá baøo soáng vaø ñieàu hoøa hoaït ñoäng enzyme trong teá baøo. – Ñieàu hoøa tính thaám cuûa maøng vaø khueách taùn qua maøng. – Ñaëc tính cuûa phaûn öùng enzyme ôû giôùi haïn phaân caùch giöõa caùc phase cuûa maøng, trong moâi tröôøng kî nöôùc, moâi tröôøng nöôùc trong maøng teá baøo. Ngaøy nay, vieäc nghieân cöùu enzyme coá ñònh ñöôïc tieán haønh theo höôùng ngaøy caøng phöùc taïp daàn, moâ hình töø moät enzyme rieâng leû ñeán heä thoáng nhieàu enzyme, seõ tieán ñeán taïo nhöõng caáu truùc treân phaân töû coù traät töï bao goàm nhieàu phöùc heä enzyme. Nghieân cöùu quaù trình xuùc taùc nhôø caùc heä thoáng phöùc taïp seõ giuùp hieàu bieát ñaày ñuû cô cheá caùc quaù trình trao ñoåi chaát cuûa teá baøo. 2.4. CAÙC NGHIEÂN CÖÙU VEÀ ENZYME COÁ ÑÒNH 2.4.1. Caùc nghieân cöùu trong nöôùc Vieäc nghieân cöùu vaø öùng duïng enzyme coá ñònh ôû Vieät Nam chöa phoå bieán laém vaø vaãn coøn ñöôïc xem laø höôùng môùi meû, keát quaû thu ñöôïc coøn haïn cheá. Tuy nhieân, gaàn ñaây ñaõ coù moät soá cuoäc thöû nghieäm veà vaán ñeà coá ñònh enzyme ôû teá baøo vi sinh, enzyme trích töø ñoäng vaät, thöïc vaät trong ñoù noåi baät laø : 32  Nhoùm nghieân cöùu cuûa GS TS Nguyeãn Vaên Uyeån thöû nghieäm saûn xuaát coàn baèng kyõ thuaät coá ñònh teá baøo naám men Saccharomyces Cerevisiae treân gel calcium alginate. Phöông phaùp naøy khoâng ñoøi hoûi thieát bò phöùc taïp vaø coù theå thöïc hieän nhanh choùng. Öu ñieåm phöông phaùp saûn xuaát lieân tuïc neân naêng suaát taïo coàn taêng, ít ñaàu tö voán, naám men hoaït ñoäng lieân tuïc (100 ngaøy) thay vì phaûi caáy vaø nhaân gioáng haøng ngaøy neáu theo qui trình cuõ.  Nhoùm nghieân cöùu cuûa Vieän Sinh Hoïc Nhieät Ñôùi keát hôïp vôùi boä moân sinh hoùa tröôøng Ñaïi hoïc Khoa Hoïc Töï nhieân naêm 1994 nghieân cöùu thöû nghieäm taïo pepsin coá ñònh vaø naêm 1995 thöû nghieäm taïo pancreatin coá ñònh treân cytochrom. Keát quaû thu ñöôïc môû ra höôùng nghieân cöùu tieáp theo cho caùc enzyme khaùc.  Phoøng nghieân cöùu coâng ngheä böùc xaï Vieän Nghieân Cöùu Haït Nhaân Ñaø Laït coù nhieàu coâng trình nghieân cöùu enzyme coá ñònh treân teá baøo vi sinh vaø caùc chaát coù hoaït tính sinh hoïc baèng kyõ thuaät böùc xaï nhö coá ñònh glucoamylase, protease, vi khuaån taû (Vibrio Cholerae), teá baøo naám men (Saccharomyces Serevisae), vi khuaån xöû lyù nöôùc thaûi (Pseudomonas Maltophila) vaø progesteron treân caùc giaù theå polymer toång hôïp.  Nghieân cöùu cuûa Nguyeãn Anh Duõng taïi Vieän Nghieân Cöùu Haït Nhaân Ñaø Laït naêm 1999 öùng duïng kyõ thuaät böùc xaï theo 2 höôùng chính laø : cheá taïo vaät kieäu töông hôïp sinh hoïc vaø coá ñònh caùc chaát coù hoaït chaát sinh hoïc leân caùc vaät lieäu polymer gheùp baèng böùc xaï. Ñeå cheá taïo vaät lieäu töông hôïp sinh hoïc thöôøng duøng phöông phaùp copolymer hoùa caùc monomer vôùi polymer vaø phöông phaùp khaâu maïch böùc xaï. Ñeå coá ñònh caùc chaát coù hoaït chaát coù hoaït tính sinh hoïc baèng caùch taïo lieân keát vôùi polymer hoaëc nhoát trong polymer. Taùc giaû ñaõ coá ñònh ñöôïc trypsin trong gel chitosan g.co HEMA traùnh söï taùc ñoäng tröïc tieáp cuûa böùc xaï coù theå ñaùp öùng ñöôïc yeâu caàu öùng duïng trong coâng nghieäp. 33 2.4.2. Caùc nghieân cöùu ngoaøi nöôùc  Enzyme coá ñònh ñaõ ñöôïc caùc nhaø khoa hoïc quan taâm vaø ñöa ra nhieàu höôùng nghieân cöùu töø raát laâu. Naêm 1916 khi Nelson vaø Griffin quan saùt khaû naêng thuûy phaân ñöôøng saccharose baèng invertase ôû naám men haáp thuï treân than hoaït tính.  Sau ñoù ñeán naêm 1953, Grubhofer vaø Schleith coá ñònh carboxipeptidase, pepsin, ribonuclease baèng lieân keát coäng hoùa trò treân nhöïa polyaminostyren ñöôïc diazo hoùa.  Vaøo naêm 1963 Bernfeld vaø Wan ñaõ moâ taû phöông phaùp nhoát. Caùc enzyme trypsin, papain, amylase vaø ribonuclease trong gel polyacrylamide.  Vaøo naêm 1964, Richard laàn ñaàu tieân duøng glutaraldehyde 1% ñeå ñieàu cheá ra carboxypeptidase axit amin ôû daïng tinh theå khoâng tan, sau khixöû lyù enzyme vaãn khoâng thay ñoåi hình daïng vaø giöõ ñöôïc 30% hoaït ñoä ban ñaàu. Cuøng naêm naøy Chang ñaõ nhoát enzyme hydratase trong caùc vi haït.  Naêm 1970, Mosbach ñaõ coá ñònh 3 loaïi enzyme : galactosidase, hexokinase vaø gluco 6 phosphate dehydrogenase ñöôïc gaén baèng lieân keát ñoàng hoùa trò leân haït sephadex vaø hieäu quaû cuûa phaûn öùng ñöôïc xuùc taùc bôûi enzyme lieân keát laø cao hôn nhieàu.  Cuøng naêm naøy Bernty ñaõ duøng glucooxidase gaén baèng lieân keát ñoàng hoùa trò ôû trong coät polystirol ñeå xaùc ñònh töï ñoäng glucose.  Naêm 1971, ngöôøi ta ñaõ thaønh coâng trong vieäc duøng chymotrypsin lieân keát ñoàng hoùa trò vôùi caùc carboximethyl cellulose ñeå laøm ñoâng tuï söûa thay cho renin ñaét tieàn.  Naêm 1974, Ichiro Chibata vaø 1976 Koro Yamoto laàn ñaàu tieân thaønh coâng trong vieäc saûn xuaát enzyme coá ñònh ñem öùng duïng trong saûn xuaát coâng nghieäp, taïo ra saûn xuaát laø L– malic vaø acid fumaric ngöôøi ta duøng vaät lieäu coá ñònh laø polyacryllamide vaø carrageenan ñöôïc hoaït hoùa bôûi glutaraldehyde vaø hexamethyl enediamine ñeå coá ñònh teá baøo vi sinh. Duøng carrageenan ñeå coá ñònh nhieàu loaïi teá 34 baøo vi sinh thì coù keát quaû toát hôn duøng gel polyarylamide trong saûn xuaát coâng nghieäp.  Naêm 1978 Sten Ohlsan, Per Olof Larsson vaø Klaus Mosbach coá ñònh teá baøo vi sinh Artbrobacter simplex baèng gel calcium alginate.  Naêm 1979 Yodogawaku (Japan) ñaõ söû duïng teá baøo B. Flavum coá ñònh treân carrageenan ñeå thöïc hieän phaûn öùng chuyeån töø L– fumaric taïo ra saûn phaåm L – malic vôùi hieäu suaát thu saûn phaåm cao hôn.  Ngaøy nay, nhöõng enzyme ñaét tieàn ñang ñöôïc chuù yù ñaëc bieät ñeå nghieân cöùu vaø ñöa vaøo öùng duïng trong saûn xuaát coâng nghieäp vôùi daïng enzyme coá ñònh. Ngoaøi vieäc coá ñònh teá baøo vi sinh, ngöôøi ta coøn coá ñònh luïc laïp, ty theå, treân caùc vaät lieäu coá ñònh khaùc nhau. Töø ñoù môû ra moät höôùng môùi trong vieäc söû duïng teá baøo vi sinh vaät vaø cao hôn nöõa laø cô quan cuûa thöïc vaät, ñoäng vaät ñeå saûn xuaát caùc hôïp chaát thöù caáp coù hoaït tính sinh hoïc vaø coù giaù trò kinh teá hôn. 2.5. GIÔÙI THIEÄU TOÅNG QUAN VEÀ ENZYME AMYLASE amylase coù khaû naêng phaân caét caùc lieân keát 1,4 glucoside naèm phía trong phaân töû cô chaát moät caùch ngaãu nhieân khoâng theo moät traät töï naøo caû. Quaù trình thuûy phaân tinh boät bôûi amylase laø moät quaù trình ña giai ñoaïn. ÔÛ giai ñoaïn ñaàu (giai ñoaïn dextrin hoùa) chæ moät soá phaân töû cô chaát bò thuûy phaân taïo thaønh moät löôïng lôùn dextrin phaân töû thaáp ( dextrin), ñoä nhôùt cuûa hoà tinh boät giaûm nhanh. Sang giai ñoaïn hai (giai ñoaïn ñöôøng hoùa) caùc dextrin phaân töû thaáp vöøa ñöôïc taïo thaønh bò thuûy phaân tieáp tuïc taïo ra caùc tetra trimaltose khoâng baét maøu vôùi iodine. Caùc chaát naøy bò thuûy phaân raát chaäm bôûi amylase cho tôùi di vaø monosaccharide. Döôùi taùc duïng cuûa amylase, tinh boät bò phaân giaûi khaù nhanh thaønh oliigosaccharide goàm 6 7 goác glucose. Sau ñoù caùc polyglucose naøy laïi bò phaân caét tieáp neân caùc maïch polyglucose colagen cöù ngaén daàn vaø bò phaân giaûi chaäm ñeán maltotetrose vaø matotriose. Qua moät thôøi gian taùc duïng daøi, saûn phaåm thuûy phaân bôûi amylase chöùa 13% glucose vaø 87% maltose, taùc duïng cuûa 35 amylase khoâng phaân caét ñöôïc lieân keát 1,6 glucoside ôû choã maïch nhaùnh trong phaân töû amylopectin neân duø coù chòu taùc duïng laâu daøi thì trong saûn phaåm cuoái cuøng, ngoaøi caùc ñöôøng noùi treân (72% maltose, 19% glucose) coøn coù dextrin phaân töû thaáp vaø izomaltose (8%).toùm laïi döôùi taùc duïng cuûa amylase, tinh boät coù theå chuyeån thaønh maltotetrose, maltose, glucose vaø dextrin phaân töû thaáp. 2.5.1 Ñaëc tính Trung taâm hoaït ñoäng cuûa amylase coù chöùa nhoùm [ COOH] vaø [NH2]. amylase deã tan trong nöôùc, trong caùc dung dòch muoái vaø röôïu loaõng. Protein cuûa amylase coù tính acid yeáu vaø tính chaát cuûa globulin. Ñieåm ñaúng ñieän naèm trong vuøng pH 4.2–5.7. Phaân töû löôïng cuûa amylase töø caùc nguoàn goác khaùc nhau raát khaùc nhau (cuûa naám moác 45.000 50.000, cuûa malt 59.000) (Knin 1956; Fisher, Stein 1970). amylase laø moät metaloenzyme (enzyme cô kim). Caùc amylase ñeàu chöùa töø 1 30 nguyeân töû gam Ca/mol. Song khoâng ít hôn 1 6 nguyeân töû gam Ca/mol. Khi taùch hoaøn toaøn Ca ra khoûi protein cuûa enzyme thì amylase maát heát khaû naêng thuûy phaân cô chaát. Vaø Ca tham gia vaøo söï hình thaønh vaø oån ñònh caáu truùc baäc ba cuûa enzyme, duy trì caáu hình hoaït ñoäng cuûa enzyme (Molodova, 1956) . Ca coøn coù taùc duïng ñaûm baûo cho amylase coù ñoä beàn cöïc lôùn ñoái vôùi caùc taùc ñoäng gaây bieán tính vaø söï phaân huûy bôûi caùc enzyme phaân giaûi protein. amylase beàn nhieät hôn so vôùi caùc loaïi amylase khaùc. Ngöôøi ta cho raèng ñaëc tính naøy cuûa amylase coù lieân quan ñeán haøm löôïng cuûa Ca trong phaân töû cuûa noù ( amylase cuûa caùc vi khuaån öa nhieät coù chöùa Ca nhieàu hôn amylase cuûa naám moác 3 4 laàn neân noù beàn nhieät hôn). Taát caû nhöõng amylase ñeàu bò kìm haõm bôûi nhöõng kim loaïi naëng nhö : Cu 2+ , Li + , Mg 2+ , Cr 3+, Mn 2+ , Zn 2+ , Co 2+ , Sn 2+,… 36 amylase töø caùc nguoàn goác khaùc nhau coù thaønh phaàn amino acid khaùc nhau. Moãi loaïi amylase coù moät toå hôïp amino acid ñaëc hieäu rieâng song chuùng ñeàu khaù giaøu tyrosine vaø tryptophan. Caùc glutamic acid vaø aspatic chieám ¼ toång löôïng amino acid caáu thaønh phaân töû enzyme. Trong amylase raát ít methionine vaø chæ coù khoaûng 7 10 goác cysteine, tröø amylase cuûa Bac. Subtilis khoâng coù caùc lieân keát sulfhydryl vaø disulfhydryl. Ñieàu kieän hoaït ñoäng cuûa amylase töø caùc nguoàn khaùc nhau cuõng khaùc nhau. pH toái thích cho hoaït ñoäng cuûa amylase töø naám sôïi laø 4,5 4,8 (coù theå hoaït ñoäng toát trong vuøng pH 4,5 4,8) cuûa ñaïi maïch naåy maàm laø 5,3 vaø cuûa vi khuaån laø 5,8 6,0 (hoaït ñoäng toát trong vuøng pH 5,8 7,0). Ñoä beàn ñoái vôùi taùc duïng acid cuõng khaùc nhau. amylase cuûa naám sôïi beàn vöõng vôùi acid toát hôn laø cuûa malt vaø vi khuaån. ÔÛ pH 3,6 vaø 0 0 C amylase cuûa malt bò voâ hoaït hoaøn toaøn sau 15–30 phuùt, amylase cuûa vi khuaån bò voâ hoaït 50% trong khi ñoù hoaït löïc cuûa amylase cuûa naám sôïi haàu nhö khoâng giaûm bao nhieâu (Fenilxova, Rmoshinoi, 1989). ÔÛ pH <4,0 amylase cuûa vi khuaån bò voâ hoaït hoaøn toaøn (Virits, 1971) amylase cuûa naám sôïi raát nhaïy vôùi nhieät (nhieät ñoä toái thích 50 0 C) Amylase cuûa thoùc maàm vaø cuûa malt beàn nhieät hôn vaø hoaït ñoäng toái thích ôû 58 60 0 C, amylase cuûa vi khuaån coù ñoä beàn cao hôn caû. 2.5.2. Giôùi thieäu veà enzyme Termanyl Termanyl laø cheá phaåm enzyme daïng nöôùc chöùa amylase chòu ñöôïc nhieät ñoä cao vaø ñöôïc saûn xuaát bôûi chuûng men Bacillus Licheniformis (enzyme naøy laø moät amylase thuûy phaân lieân keát) 1.4 glucosidic thaønh amylose vaø amylosepectin. a. Moät soá öùng duïng cuûa termamyl trong coâng nghieäp (thoâng tin do haõng Novo cung caáp) : 37 Trong kyõ ngheä tinh boät : Termamyl ñöôïc duøng cho vieäc dòch hoùa lieân tuïc tinh boät trong noài hôi hoaëc trong nhöõng thieát bò töông töï hoaït ñoäng ôû nhieät ñoä töø 105 110 0 C vaø vì vaäy lôïi duïng ñöôïc tính oån ñònh nhieät ñoä cao cuûa enzyme. Trong kyõ ngheä naáu coàn : Termamyl ñöôïc duøng ñeå phaân taùn tinh boät khi nghieân cöùu vaø chöng caát. Vaø ôû giai ñoaïn naøy, cuõng lôïi duïng ñöôïc ñoä oån ñònh nhieät cuûa enzyme Trong kyõ ngheä naáu bia : Termamyl ñöôïc duøng ñeå giuùp cho vieäc dòch hoùa ñöôïc deã daøng. Do ñoä oån ñònh nhieät ñoä cao cuûa enzyme. Trong kyõ ngheä ñöôøng : Termamyl ñöôïc söû duïng ñeå phaù vôõ löôïng tinh boät hieän dieän trong mía. Trong kyõ ngheä deät : Termamyl ñöôïc söû duïng ôû toác ñoä cao, nhieät ñoä cao ñeå ruû hoà tröôùc khi nhuoäm. Loaïi enzyme kyõ thuaät ñöôïc aùp duïng cho coâng ngheä naøy. b. Hoaït tính cuûa enzyme thöông phaåm Caùc thoâng soá veà hoaït tính AÛnh höôûng cuûa pH vaø nhieät ñoä ñeán hoaït tính cuûa enzyme trong ñieàu kieän thöû nghieäm : – Chaát neàn : 0,5% tinh boät. – Chaát oån ñònh : 30 – 60 ppm Ca. 300 225 150 75 4 6 8 10 90 0 C 60 0 C 37 0 C H o a ït t ín h ( K n u /g ) 38 Hình 2.13: AÛnh höôûng cuûa pH leân hoaït tính cuûa enzyme Termanyl taïi caùc nhieät ñoä 39 – Chaát neàn : 0,5% tinh boät. – Chaát oån ñònh : 30 – 60 ppm Ca. – pH : 5.7 Hình 2.14: AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân hoaït tính cuûa enyme Termamyl Ñoä oån ñònh cuûa Termamyl AÛnh höôûng cuûa calci Trong boät nhaõo, tính oån ñònh cuûa Termamyl ñöôïc thoûa maõn vôùi söï hieän dieän töø 50 70 ppm ion Ca 2+ . Ngoaøi ra hoaït tính cuûa enzyme cuõng coù theå bieåu thò baèng toác ñoä gia taêng ban ñaàu cuûa DE (ñöông löôïng Dextrose) vôùi noàng ñoä enzyme ñaõ cho saún. Toác ñoä gia taêng trung bình ñöông löôïng DE treân moät thôøi gian cho saún seõ tuøy thuoäc vaøo ñoä oån ñònh toác ñoä ban ñaàu ñoái vôùi haøm löôïng Termamyl 0.1% treân troïng löôïng nhö sau : Nhieät ñoä 90 0 C 95 0 C 100 0 C 105 0 C Ñoä gia taêng ban ñaàu ñöông löôïng DE/giôø 5.1 5.5 5.9 6.2 Ñoä gia taêng trung bình ñöông löôïng DE 5.1 5.3 5.3 4.3 sau 1 giôø ñaàu tieân (ñieàu kieän tieâu chuaån) 100 75 50 25 40 50 60 70 80 90 % hoaït tính töông ñoái 0 C 40 Phaàn 3. VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP 3.1. VAÄT LIEÄU  Enzyme – amylase Trong quaù trình tieán haønh thí nghieäm, söû duïng enzyme amylase thöông phaåm: Termamyl do haõng Novo saûn xuaát.  Gel calcium alginate Alginate söû duïng trong quaù trình thí nghieäm laø muoái sodium alginate do haõng Kanto cuûa Nhaät saûn xuaát. Saûn phaåm ôû daïng boät mòn hoøa tan hoaøn toaøn trong nöôùc. 3.2. PHÖÔNG PHAÙP THÍ NGHIEÄM 3.2.1. Phöông phaùp coá ñònh enzyme a. Chuaån bò duïng vuï & hoùa chaát coá ñònh enzyme Duïng cuï – Bercher 500ml, 1000ml. – Pipet. – Que khuaáy. – Xilanh taïo gioït. Hoùa chaát – Sodium alginate daïng boät mòn do Nhaät saûn xuaát. – CaCl2 0.2M – Enzyme Termamyl thöông phaåm daïng loûng. b. Qui trình coá ñònh enzyme –Taïo dung dòch sodium alginate 3%. –Troän ñeàu enzyme vaø dung dòch sodium alginate theo tæ leä 1:1 taïo ra hoå hôïp enzyme–sodium alginate 41 –Cho hoån hôïp treân nhoû töøng gioït xuoáng dung dòch Ca 0.2M töø khoaûng caùch 20cm taïo thaønh caùc haït coù kích thöôùc töø 0.5–4 mm. Ñeå yeân trong 2 giôø ñeå caùc haït gel tuûa laïi. Enzyme ñaõ ñöôïc bao boïc beân trong haït gel.  Sô ñoà thöïc hieän: Sodium alginate Nöôùc Khuaáy, ñeå yeân trong 30 phuùt Dung dòch enzyme tæ leä 1:1 Khuaáy. Loaïi boû boït khí Glutaraldehyde Ñeå yeân trong 6giôø Xilanh nhoû gioït CaCl2 0.2M Loaïi enzyme dö. Ñeå yeân trong 2 giôø Gel 42 3.2.2. Phöông phaùp ñaùnh giaù hoaït tính enzyme amylase coá ñònh Chæ tieâu theo doõi, ñaùnh giaù hoaït tính enzyme amylase döïa treân ñònh löôïng ñöôøng maltose sinh ra sau phaûn öùng thuûy phaân tinh boät theo phöông phaùp Wihstatetter Schudel : a. Duïng cuï vaø hoaù chaát Duïng cuï Buret 2 ml , 5 ml , 10 ml Erlen 250 ml Hoùa chaát Dung dòch tinh boät 0.5% trong dung dòch ñeäm pH 5.6 Na2S2O3 N/20 NaOH N/10 Dung dòch iod N/10 b. Ñònh löôïng ñöôøng maltose Laáy 2 erlen 250 ml Erlen thöù nhaát : (Thöû thaät): Cho vaøo 5 ml hoãn hôïp caàn xaùc ñònh ñöôøng maltose, 10ml dung dòch iod N/10, 15 ml dung dòch NaOH N/10. Thôøi gian nhoû dung dòch NaOH N/10 phaûi keùo daøi gaàn 2 phuùt (nhoû töøng gioït). Ñeå yeân trong toái 15 20 phuùt. Sau ñoù laáy ra cho theâm vaøo 2 ml H2SO4 2N. Ñònh phaân löôïng thöøa baèng dung dòch Na2S2O3 N/20 (duøng hoà tinh boät cho theâm vaøo luùc cuoái phaûn öùng ñònh phaân ñeå laøm chaát chæ thò maøu) . Erlen thöù hai : (thöû khoâng) : thay 5 ml hoãn hôïp caàn xaùc ñònh löôïng ñöôøng maltose baèng 5 ml nöôùc caát. Caùc böôùc tieán haønh thöïc hieän töông töï nhö ôû bình thöù nhaát. 43 c. Tính keát quaû  Löôïng ñöôøng maltose sinh ra do taùc duïng phaân giaûi cuûa amylase 2.10.20 342).( )( 3 0 tVVgX (*) V0 : laø theå tích Na2S2O3 N/20 duøng ñònh phaân cho bình thöû khoâng. Vt : laø theå tích Na2S2O3 N/20 duøng ñònh phaân cho bình thöû thaät. 342 : troïng löôïng phaûn öùng cuûa maltose.  Hoaït tính cuûa amylase (UI) ñöôïc tính theo coâng thöùc ).(. . IUK tm X A Hñ (**) X : Löôïng ñöôøng maltose sinh ra do taùc duïng thuûy phaân cuûa amylase. m : Löôïng maãu enzyme söû duïng. K : Heä soá pha loaõng. 3.2.3. Phöông phaùp khaûo saùt hoaït tính enzyme coá ñònh a. Khaûo saùt hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh so vôùi enzyme hoøa tan – Söû duïng 25 ml enzyme Termamyl ñaõ ñöôïc pha loaõng vôùi nöôùc caát (heä soá pha loaõng laø 2) tieán haønh qui trình coá ñònh vôùi 25ml dung dòch alginate 3% nhö treân taïo ra ñöôïc 50 ml enzyme coá ñònh. – Laáy 10 erlen 250 ml chia thaønh hai loâ, moãi loâ 5 erlen. Moät loâ tieán haønh thí nghieäm vôùi enzyme coá ñònh, moät loâ tieán haønh vôùi dòch enzyme hoøa tan vôùi heä soá pha loaõng laø 2 ñeå laáy giaù trò trung bình. – Tieán haønh theo baûng sau : 44 Loâ thöù 1 Loâ thöù 2 100 ml hoà tinh boät 0.5% 100 ml hoà tinh boät 0.5% 10 ml enzyme coá ñònh 5 ml dòch enzyme hoøa tan Ñaët teân treân maùy laéc ôû nhieät ñoä thöôøng trong 1 giôø Ñem ñònh löôïng ñöôøng maltose sinh ra ÔÛ moãi erlen laáy ra 25 ml hoãn hôïp, theâm 10 ml dung dòch NaOH 0.5N ñeå laøm baát hoaït amylase, theâm nöôùc cho ñuû 50 ml . Laáy 5 ml hoãn hôïp vöøa pha loaõng ñeå ñònh löôïng ñöôøng maltose sinh ra sau phaûn öùng thuûy phaân tinh boät theo phöông phaùp Wilistatettet Schudel. b. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán enzyme coá ñònh – Söû duïng 45 ml enzyme Termamyl ñaõ ñöôïc pha loaõng vôùi nöôùc caát (heä soá pha loaõng laø 2) tieán haønh qui trình coá ñònh vôùi 45ml dung dòch alginate 3% nhö treân taïo ra ñöôïc 90 ml enzyme coá ñònh. – Boá trí thí nghieäm theo 3 loâ thí nghieäm, moãi loâ 3 maãu tieán haønh theo doõi hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh ôû caùc nhieät ñoä khaùc nhau. – Tieán haønh theo baûng sau : Tieán haønh thí nghieäm Loâ 1 Loâ 2 Loâ 3 Dung dòch tinh boät 0,5% (ml) 100 100 100 Enzyme coá ñònh (ml) 10 10 10 Nhieät ñoä uû ( 0 C) 50 60 70 Thôøi gian uû (h) 1 1 1 Sau thôøi gian uû 1 giôø ôû moãi loâ thí nghieäm laáy ra 25 ml hoãn hôïp, theâm vaøo 10 ml dung dòch NaOH 0.5N ñeå laøm baát hoaït – amylase, theâm nöôùc cho ñuû 50 ml. Laáy ra 5ml hoãn hôïp vöøa pha loaõng ñeå ñònh löôïng löôïng ñöôøng maltose sinh ra sau phaûn öùng thuûy phaân tinh boät theo phöông phaùp Wilistatettet Schudel. 45 c. Khaûo saùt hoaït tính enzyme coá ñònh theo thôøi gian – Söû duïng 75 ml enzyme Termamyl ñaõ ñöôïc pha loaõng vôùi nöôùc caát (heä soá pha loaõng laø 2) tieán haønh qui trình coá ñònh vôùi 75ml dung dòch alginate 3% nhö treân taïo ra ñöôïc 150 ml enzyme coá ñònh Boá trí thí nghieäm theo 5 loâ thí nghieäm, moãi loâ 3 maãu, tieán haønh theo doõi hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh ôû caùc khoaûng caùch thôøi gian khaùc nhau. Tieán haønh theo baûng sau : Tieán haønh thí nghieäm Loâ 1 Loâ 2 Loâ 3 Loâ 4 Loâ 5 Dòch hoà tinh boät 0.5% (ml) 100 100 100 100 100 Enzyme coá ñònh (ml) 10 10 10 10 10 Thôøi gian uû ôû nhieät ñoä thöôøng (h) 1.5 2 2.5 3 3.5 Sau thôøi gian uû nhaát ñònh ôû moãi loâ thí nghieäm laáy ra 25 ml hoãn hôïp, theâm vaøo 10 ml dung dòch NaOH 0.5N ñeå laøm baát hoaït – amylase, theâm nöôùc cho ñuû 50 ml. Laáy ra 5ml hoãn hôïp vöøa pha loaõng ñeå ñònh löôïng löôïng ñöôøng maltose sinh ra sau phaûn öùng thuûy phaân tinh boät theo phöông phaùp Wilistatettet Schudel. d. Thí nghieäm söû duïng enzyme coá ñònh trong thieát bò doøng chaûy lieân tuïc tuaàn hoaøn Tieán haønh khaûo saùt hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh trong coät coá ñònh hình truï troøn vôùi theå tích 300 ml , chieàu cao 40 cm , tieán haønh phaûn öùng thuûy phaân tinh boät theo daïng thieát bò tuaàn hoaøn lieân tuïc. – Nhoài vaøo coät 150 ml enzyme coá ñònh. Tieán haønh chaïy thieát bò vôùi löu löôïng nguyeân lieäu ñaàu vaøo 50 ml/ 1 giôø; Löu löôïng saûn phaåm 50 ml/ 1 giôø; Löu löôïng doøng tuaàn hoaøn 30 ml/ 1 giôø. – Sau nhöõng khoaûng thôøi gian nhaát ñònh tieán haønh xaùc ñònh haøm löôïng ñöôøng maltose sinh ra trong saûn phaåm thu ñöôïc, ñaùnh giaù hoaït tính enzyme coá ñònh, ñoàng thôøi khaûo saùt thôøi gian söû duïng ñöôïc enzyme moät caùch lieân tuïc. Tuy nhieân do thôøi gian ôû phoøng thí nghieäm khoâng cho pheùp khaûo saùt lieân tuïc trong nhieàu giôø do 46 ñoù sau moãi laàn söû duïng enzyme coá ñònh ñöôïc röûa qua dung dòch CaCl2 0,2 M vaø sau ñoù ñöôïc ngaâm trong dung dòch CaCl2 0,2 M ñaët ôû nhieät ñoä laïnh. Hình 3.1: Moâ hình thieát bò tuaàn hoaøn lieân tuïc 47 Phaàn 4 KEÁT QUAÛ VAØ THAÛO LUAÄN 4.1. Keát quaû khaûo saùt hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh so vôùi enzyme hoøa tan Sau khi tieán haønh khaûo saùt hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh so vôùi enzyme hoaø tan theo phöông phaùp ñaõ ñöôïc trình baøy ôû phaàn III.3, thu ñöôïc keát quaû nhö sau (Baûng 4.1; Baûng 4.2) : Baûng 4.1: Keát quaû hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh ôû nhieät ñoä thöôøng LOÂ THÖÙ NHAÁT (E. COÁ ÑÒNH) STT V0(ml) Vt(ml) X(g) Hoaït tính (UI) 1 22,5 19,9 0.0222 0.0062 2 22,5 20.5 0.0171 0.0048 3 22,5 20.4 0.0180 0.0050 4 22,5 21 0.0128 0.0036 5 22,5 19.9 0.0222 0.0062 Tb 22,5 20.34 0.0185 0.0052 Baûng 4.2: Keát quaû hoaït tính cuûa enzyme hoøa tan ôû nhieät ñoä thöôøng LOÂ THÖÙ HAI (E. HOØA TAN) STT V0(ml) Vt(ml) X(g) Hoaït tính (UI) 1 22,5 19.3 0.0274 0.0077 2 22,5 18.9 0.0308 0.0086 3 22,5 19.4 0.0265 0.0074 4 22,5 20 0.0214 0.0060 5 22,5 18.9 0.0308 0.0086 Tb 22.5 19.3 0.0274 0.0077 48 Trong ñoù : Vo : theå tích Na2S2O3 N/20 duøng ñònh phaân cho bình thöû khoâng. Vt : theå tích Na2S2O3 N/20 duøng ñònh phaân cho bình thöû thaät. X : Khoái löôïng ñöôøng maltose sinh ra ñöôïc tính theo coâng thöùc (*) Hoïat tính enzyme ñöôïc tính theo coâng thöùc (**)  Nhaän xeùt Hoaït tính enzyme – amylase coá ñònh giaûm 32,5% so vôùi hoaït tính enzyme hoøa tan. Ñieàu naøy laø do : – Haïn cheá khaû naêng tieáp xuùc giöõa enzyme vaø cô chaát. – Tinh boät laø nguoàn cô chaát cao phaân töû do ñoù khaû naêng thaåm thaáu qua maøng alginate thaáp daãn ñeán haïn cheá chaát löôïng saûn phaåm taïo ra. 4.2. Keát quaû khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán hoaït tính enzyme coá ñònh Keát quaû khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán enzyme coá ñònh ñöôïc trình baøy trong baûng 4.3 Baûng 4.3: Keát quaû hoïat tính cuûa enzyme coá ñònh ôû caùc nhieät ñoä khaùc nhau Nhieät ñoä Loâ 1 (50 0 C) Loâ 2 (60 0 C) Loâ 3 (70 0 C) Vt Bercher thöù1 (ml) 19.0 18.5 17 Vt Bercher thöù 2 (ml) 18.0 18.7 16.3 Vt Bercher thöù 3 (ml) 19.3 18.4 15.5 Giaù trò Vt trung bình (ml) 19.03 18.53 16.27 Haøm löôïng ñöôøng maltose X(g) 0.03 0.034 0.053 Hoaït tính enzyme (UI) 0.0083 0.0095 0.0149 Vo : theå tích Na2S2O3 N/20 duøng ñònh phaân cho bình thöû khoâng (22.5ml) Vt : theå tích Na2S2O3 N/20 duøng ñònh phaân cho bình thöû thaät. X : Khoái löôïng ñöôøng maltose sinh ra ñöôïc tính theo coâng thöùc (*) Hoaït tính enzyme ñöôïc tính theo coâng thöùc (**) 49 50  Nhaän xeùt Hoaït tính enzyme taêng roõ reät khi ta gia taêng nhieät ñoä phaûn öùng ñeán 70 0 C. ÔÛ nhieät ñoä naøy, hieäu suaát söû duïng cao hôn, mang laïi hieäu quaû söû duïng cao hôn. Tuy nhieân, theo nhaän ñònh cuûa caûm quan, ta khoâng theå tieáp tuïc gia taêng nhieät ñoä, vì ôû nhieät ñoä cao hôn haït gel seõ khoâng beàn vöõng, haït gel bò meàm ñi khi ñoù enzyme seõ thoaùt ra ngoaøi. Ñaây cuõng laø moät trôû ngaïi raát lôùn khi ta söû duïng gel alginate ñeå coá ñònh enzyme coù nhieät ñoä toái öu cao nhö enzyme – amylase. 4.3. Keát quaû khaûo saùt hoaït tính enzyme coá ñònh theo thôøi gian Baûng 4.4 : Keát quaû khaûo saùt hoaït tính enzyme coá ñònh theo thôøi gian Thôøi gian Loâ 1 Loâ 2 Loâ 3 Loâ 4 Loâ 5 Vt Bercher thöù1 (ml) 19,2 18,7 18,1 18,3 18,2 Vt Bercher thöù 2 (ml) 19,3 18,6 17,8 18,1 18,2 Vt Bercher thöù 3 (ml) 19,3 18,9 18,2 17,9 18,0 Giaù trò Vt trung bình (ml) 19,27 18,73 18,03 18,10 18,13 Haøm löôïng ñöôøng maltose X(g) (*) 0,0276 0,0322 0,0382 0,0376 0,0373 Hoaït tính enzyme (**) 0,0052 0,0045 0,0043 0,0035 0,0030 Vo : theå tích Na2S2O3 N/20 duøng ñònh phaân cho bình thöû khoâng(22.5ml) Vt : theå tích Na2S2O3 N/20 duøng ñònh phaân cho bình thöû thaät. X : Khoái löôïng ñöôøng maltose sinh ra ñöôïc tính theo coâng thöùc (*) Hoaït tính enzyme ñöôïc tính theo coâng thöùc (**) Töø baûng keát quaû treân, ta ruùt ra ñöôïc söï thay ñoåi hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh theo thôøi gian nhö sau: Baûng 4.5 : Söï thay ñoåi hoaït tính cuûa enzyme theo thôøi gian Thôøi gian (giôø) 1 1.5 2 2.5 3 3.5 Hoaït tính amylase 0.0052 0.0052 0.0045 0.0043 0.0035 0.0030 51 Hình 4.1 :Söï thay ñoåi hoïat tính enzyme coá ñònh theo thôøi gian Vaäy sau khoaûng hôn 3,5 giôø hoaït tính enzyme seõ giaûm ñi 50% – Heä soá töông quan giöõa thôøigian (X) vaø hoaït tính amylase (Y) r = 0,97 Thôøi gian phaûn öùng thuûy phaân tinh boät vaø hoaït tính amylase coù töông quan nghòch. – Phöông trình hoài qui tuyeán tính giöõa X vaø Y : y = 0.0092 x + 0,0022  Nhaän xeùt – Thôøi gian maát hoaït tính enzyme dieãn ra nhanh, vì vaäy cho thaáy ñeå taêng hieäu quaû söû duïng enzyme caàn taêng ñieàu kieän nhieät ñoä gaàn vôùi ñieàu kieän nhieät ñoä toái öu cuûa enzyme ñeå taêng khaû naêng thuûy giaûi cuûa enzyme. Yeáu toá nhieät ñoä, yeáu toá hoaït hoùa quan troïng cuûa enzyme. 4.4 Thí nghieäm söû duïng enzyme coá ñònh trong thieát bò doøng chaûy lieân tuïc tuaàn hoaøn Vì ñaây laø thí nghieäm böôùc ñaàu öùng duïng enzyme coá ñònh vôùi doøng chaûy lieân tuïc do ñoù chöa coù nhöõng khaûo saùt saâu saéc veà thieát bò coù doøng chaûy tuaàn hoøan lieân tuïc. Keát quaû ban ñaàu thu ñöôïc chæ mang tính tham khaûo, möùc ñoä chính xaùc chöa cao. 0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 1 2 3 4 5 6 1.5 2 2.5 3 3.5 1 52  Laàn chaïy thieát bò ñaàu tieân : (vôùi dung dòch tinh boät 0,5%). Sau 1 giôø laáy 25 ml hoãn hôïp saûn phaåm theâm vaøo 10 ml dung dòch NaOH 0.5N ñeå laøm baát hoaït – amylase, theâm nöôùc cho ñuû 50 ml. Laáy ra 5ml hoãn hôïp vöøa pha loaõng ñeå ñònh löôïng löôïng ñöôøng maltose sinh ra sau phaûn öùng thuûy phaân tinh boät theo phöông phaùp Wilistatettet Schudel. Keát quaû thu ñöôïc : Vt : 21 ml. V0 : 22,5 ml. Haøm löôïng ñöôøng maltose sinh ra : 0,013 g. Hoaït tính enzyme coá ñònh : 0.0036 Sau 2 giôø tieán haønh ño löôïng ñöôøng maltose nhö treân ta thu ñöôïc keát quaû : Vt : 20,7 ml. V0 : 22,5 ml. Haøm löôïng ñöôøng maltose sinh ra X : 0,015 g. Hoaït tính enzyme coá ñònh : 0.0043  Laàn chaïy thieát bò thöù hai Sau 1 giôø tieán haønh ño löôïng ñöôøng maltose nhö treân ta thu ñöôïc keát quaû : Vt : 21,3 ml. V0 : 22,5 ml. Haøm löôïng ñöôøng maltose X : 0,01 g. Hoaït tính enzyme coá ñònh : 0.0029 Sau 2 giôø tieán haønh ño löôïng ñöôøng maltose nhö treân ta thu ñöôïc keát quaû : Vt : 19,8 ml. V0 : 22,5 ml. Haøm löôïng ñöôøng maltose X : 0,023 g. Hoaït tính enzyme : 0.0065 53  Laàn chaïy thieát bò thöù ba Sau 1 giôø tieán haønh ño löôïng ñöôøng maltose nhö treân ta thu ñöôïc keát quaû : Vt : 21,1 ml. V0 : 22,5 ml. Haøm löôïng ñöôøng maltose sinh ra : 0,012 g. Hoaït tính enzyme : 0.0034. Sau 2 giôø tieán haønh ño löôïng ñöôøng maltose nhö treân ta thu ñöôïc keát quaû : Vt : 21 ml. V0 : 22,5 ml. Haøm löôïng ñöôøng maltose sinh ra : 0,013 g. Hoaït tính enzyme : 0.0036 Sau 3 giôø tieán haønh ño löôïng ñöôøng maltose nhö treân ta thu ñöôïc keát quaû : Vt : 21 ml. V0 : 22,5 ml. Haøm löôïng ñöôøng maltose sinh ra : 0,013 g. Hoaït tính enzyme : 0.0036 Nhö vaäy, sau ba laàn söû duïng trong khoaûng thôøi gian 2 giôø thì hoaït tính enzyme khoâng oån ñònh. Töø keát quaû treân cho thaáy hieäu quaû söû duïng enzyme raát thaáp coù theå do nguyeân nhaân sau : – Kích thöôùc coät coá ñònh chöa phuø hôïp, vaän toác doøng chaûy nhanh chöa ñuû thôøi gian thuûy phaân tinh boät. – Coät ñöôïc nhoài quaù nhieàu enzyme, caùc haït enzyme coá ñònh choàng chaát leân nhau quaù khít haïn cheá dieän tích tieáp xuùc giöõa cô chaát vaø enzyme. 54 Phaàn 5. KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ 5.1 KEÁT LUAÄN Enzyme coá ñònh laø moät böôùc phaùt trieån cao cuûa ngaønh coâng ngheä enzyme, noù laøm taêng cao hieäu quaû söû duïng enzyme deã daøng taùch ra khoûi phaûn öùng, coù theå ngöng quaù trình ôû baát cöù giai ñoaïn naøo, söû duïng ñöôïc nhieàu laàn, coù ñoä beàn vöõng cao, hoaït tính oån ñònh hôn khi coù söï thay ñoåi cuûa nhieät ñoä, pH, ñieàu naøy thuaän lôïi trong quaù trình töï ñoäng, lieân tuïc vaø saûn xuaát coâng nghieäp. Vieäc nghieân cöùu coá ñònh enzyme – amylase baèng kyõ thuaät nhoát “gel” ñaõ mang laïi nhöõng keát quaû ban ñaàu ñeå ñaùnh giaù hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh. ÔÛ nhieät ñoä thöôøng, tieán haønh phaûn öùng vôùi dung dòch hoà tinh boät 0.5% sau 1 giôø, hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh giaûm ñi 32.5% so vôùi hoaït tính cuûa enzyme hoøa tan. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh ñöôïc ghi nhaän theo baûng sau : Nhieät ñoä ( 0 C) Nhieät ñoä phoøng 50 60 70 Hoaït tính enzyme (UI) 0.0052 0.0083 0.0095 0.0149 Söï thay ñoåi hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh theo thôøi gian trong thí nghieäm theo baûng sau : Thôøi gian (giôø) 1 1.5 2 2.5 3 3.5 Hoaït tính (UI) 0.0052 0.0052 0.0045 0.0043 0.0035 0.0030 – Trong noäi dung cuûa khoùa luaän, cuõng ñaõ tieán haønh khaûo saùt ban ñaàu khaû naêng öùng duïng cuûa haït gel coá ñònh enzyme trong thieát bò tuaàn hoaøn lieân tuïc. 55 Keát quaû thu ñöôïc :  Laàn chaïy thieát bò ñaàu tieân Thôøi gian Sau 1 giôø Sau 2 giôø Haøm löôïng ñöôøng maltose 0,013 0,015 Hoaït tính enzyme 0,0036 0,0043  Laàn chaïy thieát bò thöù hai Thôøi gian Sau 1 giôø Sau 2 giôø Haøm löôïng ñöôøng maltose 0,010 0,023 Hoaït tính enzyme 0,0029 0,0065  Laàn chaïy thieát bò thöù ba Thôøi gian Sau 1 giôø Sau 2 giôø Sau 3 giôø Haøm löôïng ñöôøng maltose 0,012 0,013 0,.013 Hoaït tính enzyme 0,0034 0,0036 0,0036 – Ñoái vôùi daïng thieát bò tuaàn hoaøn lieân tuïc, keát quaû khaûo saùt cho thaáy möùc ñoä chính xaùc chöa cao. Do nhöõng giôùi haïn veà thôøi gian vaø söï tham khaûo keát quaû thí nghieäm cuûa caùc nhaø nghieân cöùu tröôùc. Vì vaäy chöa ñöa ra ñöôïc nhöõng soá lieäu töông öùng giöõa kích thöôùc thieát bò vaø vaän toác doøng chaûy. 5.2. ÑEÀ NGHÒ – Caàn coù nhöõng nghieân cöùu saâu saéc hôn veà hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh, caùc yeáu toá aûnh höôûng nhö nhieät ñoä, pH ñeán hoaït tính cuûa enzyme. Ñaëc bieät laø ñoái vôùi daïng thieát bò lieân tuïc caàn coù nhöõng khaûo saùt veà kích thöôùc thieát bò, vaän toác doøng chaûy, theå tích haït gel. Töø ñoù coù theå ñöa ra ñöôïc moâ hình thí nghieäm caân ñoái höôùng tôùi nhöõng öùng duïng roäng raõi ôû qui moâ coâng nghieäp. 56 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO PHAÀN TIEÁNG VIEÄT 1. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, 2002.Coâng ngheä vi sinh taäp 2, vi sinh vaät hoïc coâng nghieäp. NXB ñaïi hoïc quoác gia TP. Hoà Chí Minh. 2. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Cao Cöôøng, Nguyeãn AÙnh Tuyeát, Leâ Thò Thuûy Tieân, Taï Thu Haèng, Huyønh Ngoïc Oanh, Nguyeãn Thuùy Höông, Phan Thò Huyeàn, 2004, Coâng ngheä enzyme. NXB ñaïi hoïc quoác gia Tp. HCM. 3. Nguyeãn Thò Tieát, 2000, Enzyme coá ñònh. Chuyeân ñeà nghieân cöùu sinh, Vieän Sinh Hoïc Nhieät Ñôùi. 4. Nguyeãn Quoác Hieán, Voõ Taán Thieän, Leâ Xuaân Thaùm 1995. Nghieân cöùu cheá taïo cheá phaåm Progesteron thaûi chaäm baèng kyõ thuaät polymer hoùa böùc xaï. Taïp chí döôïc hoïc soá 239. 5. Leâ Ngoïc Tuù, Laâm Chi, 1983. Nhöõng hieåu bieát môùi veà enzyme. NXB KHKT Noâng Nghieäp. 6. Leâ Ngoïc Tuù, La Vaên Chöù, Nguyeãn Laân Duõng 1982. Enzyme vi sinh vaät taäp I. NXB KHKT Haø Noäi. PHAÀN TIEÁNG ANH 7. R. Lafferty, 1983. Enzyme technology 8. D. Trevan, 1980. Immobilized enzyme 9. W. Gerhartz, 1990. Enzyme in industry