Đề tài Công nghệ lên men Methionine

cyanocobaltamine là vitamin. ● Chất sinh trưởng: biotin Khái niệm chất sinh trưởng ở vi sinh vật là một khái niệm rất linh động để chỉ những chất hữu cơ cần thiết cho hoạt động sống mà một vi sinh vật nào đó không thể tổng hợp ra chúng từ những chất khác. Như vậy những chất được coi là chất sinh trưởng của loại vi sinh vật này hoàn toàn có thể không phải là chất sinh trưởng đối với một loại vi sinh vật khác. Hầu như không có chất nào là chất sinh trưởng chung đối với tất cả các loại vi sinh vật. Nhu cầu về chất sinh trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào môi trường sống, kiểu trao đổi chất ( hệ thống enzyme) và điều kiện nuôi cấy. Biotin đóng vai trò là một chất sinh trưởng vì nó tham gia vào coenzyme của các phản ứng β – carboxyl hóa (có vai trò quan trọng trong chu trình Krebs). Mondal et al.1994 đã quan sát ảnh hưởng của nồng độ biotin trong sản xuất Methionine và kết quả thực nghiệm tốt nhất là 5 µg l-1 biotin. Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 8 II/ QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ: III/ GIẢI THÍCH QUY TRÌNH: 1. Chuẩn bị môi trường: ● Mục đích công nghệ: + Tạo hỗn hợp đầy đủ và cân đối về dinh dưỡng cho vi sinh vật sử dụng trong lên men. + Chỉnh pH về giá trị thích hợp ● Nguyên tắc: Xác định chính xác thành phần định tính, định lượng Ở đây môi trường lên men có thành phần như sau: Glucose: 5% Urea: 0.6% MgSO4: 0.3% K2HPO4: 0.1% KH2PO4: 0.01% Và biotin: 20µg/l ● Cách thực hiện: + Cân chính xác riêng biệt từng thành phần dinh dưỡng của môi trường theo hàm lượng đã định + Trộn lẫn tất cả các thành phần dinh dưỡng với nhau ,cho vào bồn phối trộn và thêm đủ thể tích nước cất. Vi sinh vật Nguyên liệu Nhân giống Lên men Sản phẩm Chuẩn bị môi trường Tiệt trùng Cấy giống Tinh sạch Cysteine Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 9 + Kiểm tra pH bằng máy đo và hiệu chỉnh về pH 7.0 bằng dd H2SO4 2N +Toàn bộ môi trường được giữ ở 30oC. + Thiết bị hình trụ có cánh khuấy Hình 4. Thiết bị pha chế môi trường 2. Tiệt trùng ●Mục đích công nghệ: vô trùng môi trường chuẩn bị cho quá trình lên men, hạn chế tối đa ảnh hưởng bất lợi do nhiễm vi sinh vật lạ. ●Các biến đổi: + Vi sinh vật bị tiêu diệt Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 10 + Sự bốc hơi nước + Các thành phần có thể phản ứng với nhau gây tổn thất dinh dưỡng do đó cần cho một lượng dư để bù tổn thất + Trạng thái môi trường có thể bị biến đổi nhưng không đáng kể ●Các yếu tố ảnh hưởng: + Lượng môi trường đem đi tiệt trùng + Nhiệt độ tiệt trùng + Thời gian tiệt trùng ●Thiết bị: nồi hấp tiệt trùng dạng đứng Model SA-300VF ● Thông số công nghệ: Nhiệt độ :121oC Thời gian : 20 phút. Hình 5. Thiết bị tiệt trùng 3. Nhân giống: ●Mục đích công nghệ: tạo đủ lượng vi sinh vật đồng nhất về gen và có hoạt tính cao đủ để lên men trong môi trường đã chuẩn bị. ●Các biến đổi: Vi sinh vật phát triển và tăng sinh khối, tăng số lượng tế bào. ●Sơ đồ nhân giống: 5ml -50 ml -500ml – 5lit -50 lit 4. Cấy giống: ●Mục đích công nghệ:cho vi sinh vật vào môi trường, chuẩn bị lên men ●Lượng giống cấy: 5% (v/v) ●Cách thực hiện: chuyển vi sinh vật đã được nhân giống vào môi trường trong thiết bị lên men. 5. Lên men: ●Mục đích công nghệ: tạo điều kiện để vi sinh vật sinh tổng hợp sản phẩm với hàm lượng cao nhất Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 11 ● Các biến đổi: + Vi sinh vật sử dụng các chất dinh dưỡng trong môi trường, sinh tổng hợp methionine theo các phản ứng sau: Đầu tiên vi sinh vật sẽ chuyển hoá glucose thành aspartate theo con đường: Glucose Glucose 6 phosphate Fructose 6 phosphate Oxaloacetate 3 phosphoglycerate Glyceroldehyde 3 phosphate Phosphoenol pyruvate Aspartate Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 12 + + Sau đó aspartate tiếp tục được chuyển hoá để tạo thành sản phẩm là Methionine: H O C CH2 C COO- Aspartate -O NH3 + ATP Aspartate kinase (ask) ADP 2O3P O C CH2 O H C NH3 COO- Aspartate phosphate NADPH Aspartate semialdehyde dehydrogenase (asd) NADP+ + Pi O C CH2 H H C NH3 COO- Aspartate semialdehyde NADPH Homoserine dehydrogenase (hom) NADP H CH2 CH2 C COO- Homoserine OH NH3 + Acetyl - CoA Homoserine acetyl transferase (metA) CoASH Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 13 + H CH2 CH2 C COO- O-Acetylhomoserine O Acetyl NH3 Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 14 3 + + O-Acetylhomoserine (see last page) Cystein Cystathione y-synthase (metB) Acetat H CH2 S CH2 CH2 C COO - Cystathione H C NH3 + COO- NH + direct sulfhydrylation pathway O-acetylhomoserine sulfhydrylase (metY) Cystathione ß-lyase (aecD) - Pyruvat - NH4 H HS CH2 CH2 C COO - Homocysteine NH3 N5 - Methyl - THF Homocysteine methylase (metE/metH) THF glyA (metF) H S CH2 CH2 C NH3+ COO- Methionine Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 15 Cùng với sự tổng hợp methionine, các amino acid trong họ aspartate cũng đồng thời được tổng hợp. Ở vi sinh vật bình thường thì lượng methionine sinh ra bị hạn chế bởi sự ức chế ngược của chính nó. Trong khi đó, qua quá trình đột biến, những vi sinh vật như C. lilium M-128 có khả năng sinh tổng hợp methionine cũng theo con đường này nhưng lượng methionine tạo ra là lớn hơn rất nhiều. Hình 6. Methionine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum (Ru¨ckert et al., 2003). [1] Aspartate kinase, [2] aspartaldehyde dehydrogenase, [3] homoserine dehydrogenase, [4] homoserine O- acetyltransferase, [5] O-acetylhomoserine (thiol)- lyase (cystathionine g-synthase), [6] cystathionine g- lyase, [7] homoserine S-methyltransferase (vitamin B12 independent or metH-encoded, vitamin B12 dependent), [8] homoserine kinase, [9] threonine synthase, [10] O-acetylhomoserine sulfhydrylase, [11] serine hydrooxymethyle transferase. Ngoài ra trong quá trình lên men cũng có những biến đổi khác như: + Một số phản ứng hóa học khác có thể xảy ra do sự thay đổi nhiệt độ và thành phần hóa học trong canh trường + Tăng nhiệt độ do quá trình lên men tỏa nhiệt + Sự sinh khí CO2 ● Các yếu tố ảnh hưởng: + Nhiệt độ: cần được duy trì ở nhiệt độ tối ưu cho vi sinh vật tổng hợp methionine. Cao quá hay thấp quá sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính của vi sinh vật. Nhiệt độ cao làm giảm hoạt tính bất thuận nghịch. Nhiệt độ thấp thì biến đổi là thuận nghịch nhưng nhiệt độ thấp thì thời gian lên men sẽ phải kéo dài mới đạt được một lượng sản phẩm như yêu cầu. Bản thân quá trình lên men cũng làm tăng nhiệt độ, do đó điều chỉnh nhiệt độ là yếu tố quan trọng trong suốt quá trình. Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 16 + pH đầu: pH cũng gây ảnh hưởng tương tự như nhiệt độ. Tuy nhiên chỉnh pH trong quá trình lên men là rất khó. Do đó, pH ban đầu của hỗn hợp lên men có yếu tố quyết định. Trong thời gian lên men, không có sự điều chỉnh pH. + Nồng độ chất khô: Chất khô là những thành phần cung cấp dinh dưỡng cần thiết cho vi sinh vật. Nồng độ chất khô thấp, vi sinh vật bị thiếu nguồn dinh dưỡng, thiếu cơ chất tạo sản phẩm nên hiệu suất lên men sẽ không cao. Nồng độ chất khô cao quá thì sẽ ức chế vi sinh vật. Do đó, cần phải chọ một nồng độ thích hợp nhất. + Tỷ lệ giống cấy: Tuỳ thuộc vào lượng sản phẩm, thể tích môi trường, nồng độ chất khô mà chọn tỷ lệ giống cấy cho phù hợp. Thấp quá thì thừa cơ chất và ít sản phẩm. Nhiều quá thì vi sinh vật không có được điều kiện tối ưu nên hoạt tính cũng không cao. + Lượng oxy hòa tan, tốc độ dòng khí và tốc độ khuấy trộn: C. lilium là vi sinh vật kị khí tùy tiện, do đó đòi hỏi một lượng oxi nhất định cho sự sinh trưởng. Từ đồ thị trực tuyến của DO, tốc độ dòng khí và tốc độ khuấy trộn ( Hình. 7) thể hiện rõ ràng nhu cầu mạnh mẽ của C.lilium M128 trong vòng 2 giờ đầu tiên của quá trình lên men. Vận tốc dòng khí bắt đầu tăng cho đến khi đạt giá trị tối đa là 18 lpm. Tại thởi điểm này tốc độ khuấy trộn bắt đầu tăng và thay đổi để điều khiển DO về giá trị 40%. Sau khoảng 24h, sự phát triển của tế bào đã tiến tới pha tĩnh của nó và do đó giảm nhu cầu oxi thể hiện bởi sự giảm dần giá trị của agitation and airflow rate values ( Hình. 7). Hình. 7. Cascade control of DO during methionine production by C. lilium M-128 showing the changing oxygen demand reflected by the agitation speed and air flow rate values. DO ( *), agitation speed (₃ ₃ ₃ ₃ ₃ ₃ ₃ ₃ ₃ ), airflow rate ( ₃ ₃ ₃ ₃ ₃ ₃ ₃ ). + Một yếu tố có ảnh hưởng lớn đến quá trình lên men là lượng cystein được thêm vào. Ở đây, cystein được thêm vào với hàm lượng 1-3 g/l, sai số 0.5 g/l. Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 17 Với sự có mặt của cystein, nhu cầu năng lượng dưới dạng ATP giảm đi 20% so với khi không có mặt cystein. Sự bổ sung cystein làm giảm đi sự khắc khe trong phản ứng tạo OaA (oxaloacetate) từ PEP (phosphoenol pyruvate) do đó làm tăng lượng methionine thu được. Hình 8. Metabolic flux analysis showing effect of cysteine on of methionine production by mutant strain. The flux values have been normalized based on 100 mmol g−1 h−1 of glucose. Flux values for fermentation with cysteine supplementation are given in italics [134]: Glc6P, glucose 6 phosphate; Fru6P, fructose 6 phosphate; GaP, glyceroldehyde 3 phosphate; G3P, 3 phosphoglycerate; PEP, phosphoenol pyruvate; Pyr, pyruvate; AcCoA, acetyl coenzyme A; OaA, oxaloacetate; Isocit, isocitrate; aKG, alpha keto glutarate; SucCoA, succinyl coenzyme A; Suc, succinate; Mal, malate; Asp, aspartate; O-Shs, orthoacetylhomoserine; Meth, methionine; Lys, lysine; Thr, threonine; Ribu5P, ribulose 5 Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 18 phosphate; Rib5p, ribose 5 phosphate; Xyl5p, xylulose 5 phosphate; Sed7P, sedoheptulose 7 phosphate; E4P, erythrose 4 phosphate; ADP, adenosine diphosphate; NADH, reduced nicotinamide adenine dinucleotide; FADH, reduced Flavin adenine dinucleotide; NAD, nicotinamide adenine dinucleotide; FAD, Flavin adenine dinucleotide; ATP, adenosine triphosphate Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 19 ● Thiết bị_thông số công nghệ: Qui mô phòng thí nghiệm: bình thủy tinh 15 lit 1.Stainless steel lid with equipment (electrodes, inlets, connection stirring motor to stirring shaft, cooling system, aeration, exhaust air, sampling) 2.single-wall glass vessel 3.sampling bottle 4.rotameter aeration control 5.heating / cooling plate connected with heat and cooling system 6.bottles for addition / feeding with pump system (acid, base, glucose, anti- 7.automatic control technique with display unit Hình 9: Picture of the bioreactor (company Infors, type Minifors) and the automatic control unit (controlling of temperature and cooling system, aeration rate, foam sensor, pumping systems for acids, bases, anti- foam substances and fed batch supply). Chú thích : 1. Thiết bị nắp đậy bằng thép không gỉ (điện cực, ống vào,kết nối motor cánh khuấy với cán cánh khuấy, hệ thống lám lạnh, quạt thổi CO2 vào, ống xả khí, bộ phận lấy mẫu). 2. Các ống bằng thủy tinh 3. Chai lấy mẫu 4. Điều khiển dòng khí vào bằng lưu lượng kế kiểu phao 5. Gia nhiệt/ làm nguội bản mỏng với hệ thống gia nhiệt làm nguội 6. Các chai để thêm/ châm cơ chất với hệ thống bơm (acid, base, glucose, anti- foam) 7. Bộ phận hiển thị điện tử các thông số công nghệ của quá trình. Quy mô công nghiệp : Thể tích bình lên men : thể tích sử dụng 1m3 Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 20 Hình 10 :Bình lên men Các thông số: + pH: 7.0 + Nhiệt độ: 30 oC + Nồng độ oxi hòa tan (DO): 40% so với mức bão hòa + Tốc độ khuấy trộn: 150rpm + Thời gian: 48h 6. Tinh sạch: ●Mục đích công nghệ: thu nhận và tinh sạch methionine từ canh trường sau lên men. ●Phương pháp: Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 21 a)Tách sinh khối : - Mục đích :tách bỏ xác vi sinh vật và tạp chất rắn khỏi dung dịch sau lên men -Thiết bị :ly tâm lắng . Thiết bị gồm thùng quay hình trụ có vách đục lỗ bên ngoài bọc vải lọc,moteur và trục quay. Khi thùng quay với tốc độ cao tạo ra lực li tâm làm dung dịch trong thùng quay ép sát vào vách thùng quay .Phần lỏng cùng với các cấu tử hòa tan sẽ qua vải lọc ra ngoài còn chất rắn là xác vi sinh vật bị giữ lại bên trong thùng quay. - Thông số công nghệ : tốc độ vòng quay 1000 vòng /phút , thể tích thùng quay : 2m3 Canh trường sau lên men Tách sinh khối Cô chân không Acid hoá Trao đổi ion Kết tinh Sản phẩm Sấy Xử lí than hoạt tính Li tâm Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 22 Hình 11. Thiết bị ly tâm lắng b) Xử lí than hoạt tính : -Mục đích :tách bỏ các chất màu ,mùi loại một số tập chất tan ra khỏi dung dịch lọc c) Trao đổi ion : -Mục đích : thu methionine bằng cột trao đổi ion -Cách tiến hành : cho dịch lên men vừa lọc qua cột trao đổi ion để thu Methionine .Chọn cột trao đổi ion Amberlite IR-120(H+) ,là loại cationit ,trao đổi ion dương ,kiểu acid mạnh , nhóm chức -SO3H ,cỡ hạt từ 100-200µm. Quá trình được lặp lại cho đến khi không còn methionine được phát hiện. Cột thu được đem rửa với nước cất và tách Methionine bằng cách xử lý với NH4OH 1N * Amberlit IR-120 (tên nhựa trao đổi ion) : - Kiểu nhựa : HC sulfo - Cationit loại acid mạnh (bắt các cation) - Dung lượng trao đổi : 4,2 mgđl/g - Hãng Down, Mỹ : 2,6 mgđl/ml - Acid mạnh : -SO3H - Hiệu quả trong phạm vi pH = 1 – 14. Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 23 (“Sách tra cứu hóa sinh”-Ngô Tuấn Kỳ. NXB Khoa học kĩ thuật, 1984) d) Cô chân không : -Mục đích :làm tăng nồng độ Methionine trong dung dịch sau rửa giải ,chuẩn bị cho quá trình kết tinh Hình 12 : Thiết bị cô đặc chân không e) Acid hóa : -Dùng H2SO4 , chỉnh về pH = 5.7 gần với điểm đẳng điện của Methionine để dễ kết tủa f) Kết tinh : - Mục đích :khai thác ,thu Methionine ở dạng rắn nguyên chất - Tốc độ kết tinh phụ thuộc :hiệu số nồng độ lớp dung dịch và trên bề mặt tinh thể , nhiệt độ,độ nhớt ,bề dày lớp dung dịch ,hình dạng và kích thước tinh thể - Thiết bị : thiết bị nấu dưới áp suất chân không ,cấu tạo giống thiết bị cô đặc nhưng vì nồng độ lớn nên bán kính và chiều cao thấp hơn , có bộ phận khuấy đảo tốc độ chậm để ngăn tinh thể lắng xuống đáy thiết bị và tăng tốc độ kết tinh .hệ thống thiết bị phải bao gồm cả hệ thống kiểm tra như : đo nhiệt độ , đo áp suất ,hệ số quá bão hòa ,kích thước và số lượng tinh thể - Độ tinh sạch = 99 % Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 24 Hình 13:Sơ đồ quá trình kết tinh g) Li tâm : - Mục đích :thu tinh thể Methionine - Thiết bị :li tâm lắng ,nằm ngang - Thông số công nghệ :hiệu suất thu hồi = 90 % ; độ ẩm sau li tâm 4 % Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 25 Hình 14:Thiết bị li tâm thu tinh thể h) Sấy : -Mục đích :giảm hàm ẩm để bảo quản sản phẩm -Thiết bị : chọn thiết bị sấy tầng sôi.Cấu tạo : gồm thùng dạng hộp hay trụ ,bên trong có lớp lưới để đỡ vật liệu và phân phối tác nhân sấy .Không khí nóng được thổi từ phía dưới lên với vận tốc sao cho lực đẩy của không khí cân bằng với trọng lực tác động lên hạt vật liệu làm cho vật liệu ở trạng thái lơ lửng ,diện tích tiếp xúc với tác nhân sấy lớn làm tăng hiệu quả quá trình sấy - Thông số công nghệ : +Tốc độ dòng tác nhân sấy : 1-2 m/s +Lưu lượng không khí :2.5 m3/h +Nhiệt độ không khí khi rời caloriphe :120  C +Độ ẩm vật liệu sau sấy :0.3-0.4 % +Chiều dài thân máy :2,5 m ; chiều rộng 0,9 m ; chiều cao 3,5 m +Thời gian sấy :10-15 giây +Hiệu suất thu hồi :trên 90 % Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 26 1.Quạt làm mát , 2.Xyclon thu bụi , 3.Vít tải ,4. Cụm đánh tơi , 5.Buồng sấy ,6.Cửa ra sản phẩm, 7.Quạt cấp nhiệt sấy ,8. Buồng đốt , 9.Quạt hút ẩm ,10 .Thiết bị lọc bụi ,11.Bơm hoàn lưu Hình 15: Sơ đồ thiết bị sấy tầng sôi Hình 16:Thiết bị sấy tầng sôi - Bảo quản sản phẩm ở 4 oC Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 27 IV/ SẢN PHẨM : 1. Kết quả: Hàm lượng methionine thu được sau 48h lên men tối đa là 2.3 mg ml-1. Tốc độ tăng trưởng cực đại của C. lilium là 0.18 h-1 và hệ số X / S là 0.34 gg-1. và không bị hạn chế bởi kiểu đột biến của vi sinh vật. Một trong những tính chất của thể đột biến bằng tác nhân NTG là nông độ sinh khối sau 48h lên men chìm là khoảng 17 gl-1, lượng này gấp đôi so với thể đột biến nhờ tác nhân là tia UV. Hình 17. Methionine production, growth and glucose utilisation by C. lilium M-128 showing the concentration profiles for five batch experiments. Run 1 (₃ ), Run 2 (k), Run 3 (₃ ), Run 4 (^), Run 5 (2). Average trend for five batches ( *). 1. Chỉ tiêu chất lượng: Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 28 Chỉ tiêu Yêu cầu Hình dạng, cấu trúc Bột tinh thể trắng Độ đồng nhất Đạt yêu cầu Góc quay mặt phẳng phân cực + 23.0 - + 24.0o Phép thử ( assay),% 99.0 – 101.0 pH 5.6 – 6.1 Tổn thất do sấy,% ≤ 0.20 Kim loại nặng ( Pb), ppm ≤ 10 Hệ số chuyển đổi, % ≥ 98.0 Tro, % ≤ 0.10 Chloride, % ≤ 0.020 Sulphate, % ≤ 0.020 Arsenic (As2O3), ppm ≤ 1 Iron (Fe), ppm ≤ 10 Amino acid khác Không có 2. Giới thiệu về sản phẩm: *Lịch sử: Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 29 Methionine, một amino acid thiết yếu, lần đầu tiên được tách (isolate) từ protein bởi Mueller năm 1922 và cấu trúc của nó được nhận ra như là dẫn xuất з-methylthiol của amino-n-butyric acid bởi Barger và Coyne vào năm 1928. Chức năng của methionine trong transmethylation (chuyển nhóm methyl) được suy ra gián tiếp từ bằng chứng thu được trong nghiên cứu dinh dưỡng động vật của Vigneaud et al. vào năm 1939. Người đã quan sát thấy rằng homocysteine có thể thay thế methionine trong chế độ ăn của động vật nếu ta bổ sung choline hoặc betaine. Hơn một thập kỷ sau đó, năm 1953, Cantoni khẳng định chức năng xác định của methionine như là một nhân tố chính chứa nhóm methyl trong S-adenosylmethionine (SAM). Trong 1958, Tabor et al. thành lập vai trò methionine như là một precursor của các polyamine. Một chức năng quan trọng khác của methionine là sự tham gia vào quá trình dịch mã m-RNA như là amino acid cuối cùng của chuỗi peptide, đây là kết quả nghiên cứu của Adams và Capecchi năm 1966 và Clark và Marcker vào năm 1968. Những khám phá của quá trình sản xuất acid glutamic từ vi sinh vật kích thích nghiên cứu sự sản xuất các amino acid khác bằng phương pháp vi sinh. Kể từ đó, đã có nhiều báo cáo về những nỗ lực của một số nhà nghiên cứu về chủng vi sinh vật cho sản xuất methionine bằng phương pháp lên men chìm. Việc sản xuất methionine bằng canh trường chìm sản xuất ra các L- acid amin có hoạt tính sinh học. Phương pháp này sẽ có lợi thế hơn các phương pháp tổng hợp và bán tổng hợp vì có thể đạt được với một nồng độ cao. Mặc dù một số amino acid khác như: Lysine, threonine, isoleucine và histidine, đang được sản xuất thành công bằng cách lên men, vẫn chưa có ứng dụng cụ thể nào của phương pháp lên men sản xuất L-methionine theo phương pháp lên men chìm. Việc sản xuất L-Methionine bằng canh trường nuôi cấy chìm chưa được sử dụng thương mại do những vi sinh vật, hoặc được đột biến hoặc tái tổ hợp gen, sản xuất không đủ cao lượng methionine. Nhu cầu methionine mỗi năm trên toàn cầu khoảng 350.000 tấn dưới dạng DL- methionine sản xuất theo phương pháp hóa học. Hầu hết các nhu cầu methionine xuất phát từ gia cầm và thức ăn chăn nuôi công nghiệp và các nhu cầu còn lại là cho chữa trị lâm sàng. L- methionine là hình thức thu được từ quá trình racemic DL-methionine. Quá trình phát triển diễn ra thông qua nhiều giai đoạn, mỗi giai đoạn đòi hỏi một đầu tư đáng kể trong nỗ lực nghiên cứu, nguồn tài trợ và có tính kinh tế chưa được cao khi dùng phương pháp hóa học. Tuy nhiên, nhu cầu sử dụng L-methionine trong y học đã tăng lên, tạo ra một thị Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 30 trường riêng biệt cho L-methionine. Gần đây, nhờ sự phát triển trong lĩnh vực công nghệ sinh học, tính khả thi về thương mại khi sản xuất L-methionine cần phải được tái kiểm tra. *Tính chất: *Một số sản phẩm thương mại: Tính chất Lượng Phân tử lượng 149.22 Nhiệt độ phân hủy 283 Độ tan (g/100g; 25°C) 3.5 pKCO OH 2.28 pKNH 3 + 9.21 pH đẳng điện 5.74 Tỷ trọng (g/cm3) 1.34 Vị trong dung dịch với nước Có vị Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 31 *Vai trò sinh học và y học: Methionine cần thiết trong chế độ ăn uống của con người và các loài động vật có vú ở một lượng nhỏ cho tốc độ tăng trưởng bình thường và các chức năng cơ thể. Ở con người, một số bệnh di truyền như cystathioninuria và Homocystinuria được gây ra bởi khiếm khuyết của sự trao đổi methionine. Cả cystathioninuria và homocystinuria được di truyền như nhũng gen lặn. Bệnh nhân có thể có một hoặc nhiều triệu chứng như: chậm trí, động kinh, có vấn đề về tiểu cầu, bàn chân quẹo, xương dị thường, bị ảnh hưởng thị giác, thính giác… Chế độ ăn uống thiếu methionine dẫn đến các bệnh như ngộ độc máu, thấp khớp, liệt cơ, rụng tóc, trầm cảm, bệnh tâm thần phân liệt, bệnh Parkinson, tổn thương gan, và suy yếu khả năng sinh trưởng… Chức năng của methionine là xây dựng khối protein và là nguồn polyamines. Nó là một precursor của SAM, trong đó cung cấp nhóm methyl không bền và sulfur đến hơn 100 phản ứng. Nhiều trong số những phản ứng tham gia vào quá trình tổng hợp những hợp chất ảnh hưởng đến sự sống còn của tế bào và cơ quan chức năng. Nó hoạt động như là tác nhân kích thích sử dụng chất béo và ngăn chặn sự tích lũy chất béo trong gan do tăng lecithine. Methionine cần thiết cho việc hấp thu, vận chuyển và hoạt động của kẽm và selen trong tế bào. Methionine là một tác nhân chelating, nó giúp bài tiết cadmium và thủy ngân trong cơ thể. Ở người, methionine được sử dụng để sản xuất creatinine dưới sự điều khiển của não bộ. Những người mắc bệnh AIDS có một mức độ thấp methionine. Một số nhà nghiên cứu cho rằng lượng methionine thấp ở những bệnh nhân AIDS có thể giải thích một số khía cạnh của sự suy giảm xảy ra trong hệ thần kinh gây ra các triệu chứng bao gồm cả mất trí. Ngoài ra, những thử nghiệm sơ bộ còn cho thấy methionine có thể hỗ trợ chữa trị một số triệu chứng của bệnh Parkinson. Methionine còn đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh khả năng sinh lý của folate. Thiếu methionine, folate bị giữ lại trong gan dưới dạng 5-methyl-tetrahydrofolate, gây ra sự thiếu hụt folic acid tạm thời. Điều này cũng thấy trong sự thiếu hụt Vitamin B12 và có thể đây là một yếu tố quan trọng liên quan đến nguyên nhân gây ra d ị ứng và thiếu máu ở một số bệnh nhân. L-methionine được sử dụng rộng rãi trong y học với nhiều mục đích khác nhau, bao gồm cân bằng pH, parental nitrition, phụ gia cho dược phẩm, và các ứng dụng khác. Trong thực tế, nó Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 32 là một trong 800 loại thuốc đứng đầu trong y khoa. D- methionine không tốt cho con người và có thể có phản ứng dị ứng với D-methionine hoặc hỗn hợp racemic của DL-methionine . *Vai trò công nghiệp: Việc sử dụng methionine trong công nghiệp chăn nuôi gia súc, gia cầm có ảnh hưởng gián tiếp đến con người. Methionine là một acid amin giới hạn đầu tiên trong chế độ dinh dưỡng cho gia cầm. Việc tổng hợp methionine trong thức ăn chăn nuôi đã bắt đầu từ những năm 1950 ở mức độ đơn giản bằng cách thêm vào những thành phần tổng hợp. Sự thiếu methionine đã trở thành một vấn đề trong những năm gần đây do sự gia tăng việc sử dụng protein từ đậu nành. Chim biến đổi gen để tăng khả năng chịu nhiệt hay khả năng đẻ trứng. Methionine được tổng hợp cùng với cysteine và choline và cần thiết cho sản xuất keratin trong lông. Trong chăn nuôi, để nâng cao năng suất, các chế độ ăn uống phải chứa đầy đủ số lượng của tất cả các chất dinh dưỡng, bao gồm các acid amino. Sự thiếu methionine, acid amin không thay thế, sẽ làm giảm hiệu quả thức ăn, tăng trưởng chậm, và có thể dẫn đến suy dinh dưỡng. Bổ sung từng acid amin làm tăng hiệu quả thức ăn chuyển đổi, do đó làm giảm chi phí tính trên đơn vị động vật. Amino acid có thể được sử dụng trong chăn nuôi với mục đích chăm sóc sức khỏe. Methionine được sử dụng như là một tác nhân acid trong nước tiểu , bởi vì sự bài tiết ion sulfate làm giảm pH nước tiểu. Ion sulfate cũng thay thế phosphat và do đó hỗ trợ sự hòa tan và ngăn ngừa đá thận và bàng quang đá. V/ THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ: 1.Sản xuất Methionine sử dụng Corynebacterium glutamicum DSM20300 Bản thân Corynebacterium glutamicum DSM20300 thuần chủng ban đầu không có khả năng tạo ra methionine nhiều hơn nhu cầu thiết yếu của bản thân vi sinh vật. Điều này được giải thích là do cơ chế ức chế ngược thể hiện trong hình dưới đây: Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 33 Với Corynebacterium glutamicum DSM20300, người ta tiến hành nuôi cấy ba mẫu trong cùng điều kiện với thành phần môi trường cơ bản là giống nhau. *Môi trường : 100ml môi trường SMM cho mỗi thí nghiệm Cách pha chế môi trường: môi trường SMM được pha chế từ 4 dung dịch sau: Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 34 Đồng thời thêm các tiền chất sinh tổng hợp khác nhau và lần lượt vào các mẫu: + Mẫu 1: không thêm gì + Mẫu 2: thêm 0.5g/l homoserine Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 35 + Mẫu 3: thêm 0.5g/l homocystine Và kết quả như sau: Mẫu 1: 5.5 mg/l L-methionine được tạo thành sau 24h, và sau 48h thì giảm xuống còn 4 mg/l. Mẫu 2: 11 mg/l L- methionine được tạo thành sau 24h, và sau 48h thì cũng giảm xuống còn 4 mg/l. Mẫu 3: kết quả thu được xấp xỉ mẫu 1. Từ kết quả trên ta có thể đưa ra kết luận: Sự them các tiền chất sinh tổng hợp không có ảnh hưởng đáng kể đến lượng methionine thu được, chúng chỉ có tác dụng trong 24h đầu. Và giá trị 4mg/l chỉ đủ để cung cấp cho nhu cầu thiết yếu của vi sinh vật. Với Corynebacterium glutamicum DSM20300 đột biến bằng tác nhân là tia UV thì lượng methionine sản xuất được là 1g/l. Đây cũng là một giá trị triển vọng và cần thời gian để nghiên cứu sâu hơn nữa. 2.Sản xuất methionine sử dụng Corynebacterium glutamicum KY10574: Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 36 Corynebacterium glutamicum KY10574 là vi sinh vật do một công ty của Nhật Kyowa Hakko Kogyo Ltd.. thu nhận được. Những thong tin đầu tiên về môi trường và kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật này là từ công ty trên. Khi nghiên cứu sản xuất methionine trên vi sinh vật này, người ta tiến hành nuôi cấy trên các môi trường có hàm lượng glucose khác nhau. Kết quả thu được, giá trị hàm lượng glucose tối ưu cho vi sinh vật này là 60g/l. Thành phần môi trường nuôi cấy: môi trường nuôi cấy là hỗn hợp các dung dịch có thành phần như sau: Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 37 Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 38 3.Những phương pháp sản xuất methionine khác: Hiện nay có rất nhiều phương pháp để tổng hợp methionine, trong đó có 4 hướng chính: tổng hợp hóa học, thủy phân protein, tổng hợp nhờ enzyme và lên men. Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 39 chemical synthesis protein hydrolysis (extraction) H R C COOH NH2 enzymatic synthesis fermentation, cultivation (microbial overproducers) Hình 18: Pr inciple possibili ties to produce L-a mino acids or D/L-a mino acids in the case of che mical synthesis (m odif ie d according to Leuc hte nberger et al. 1988). a) Tổng hợp methionine sử dụng enzyme Để thu được L - methionine từ hỗn hợp DL- methionine ta sử dụng enzyme L – Aminoacylase. L – Aminoacylase là enzyme xúc tác cho phản ứng thuỷ phân DL-acetylated amino acid thành L-amino acid. Phản ứng này chỉ tạo sản phẩm dạng L nên rất thuận tiện cho việc tách L- methionine ra khỏi hỗn hợp. Quá trình này lần đầu tiên được đưa ra bởi the Japanese company Tanabe năm 1969 (theo Leuchtenberger et al. 1988). Một phương pháp khác được đưa ra trong những năm 1990 là quá trình chuyển hỗn hợp DL- methyl-thio-ethyl-hydantoin thành L-methionine sử dụng Arthrobacter aurescens DSM7330 (Voelkel 1993; Stehr 1996). Quá trình được miêu tả ở hình bên dưới: Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 40 Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 41 Hình 19: Descr iption of the molecular mecha nis m for the conversion from DL -methyl- thio-ethyl- hyda ntoin (MT E H) to L-methionine with Arthr obacte r aure sce ns DSM7330 (modifie d according to Ste hr 1996). Trong đó: - hydantoin-racemase: xúc tác phản ứng chuyển đồng phân D- thành L-hydantoin - hydantoinase: xúc tác phản ứng thuỷ phân lien kết amide ở vòng - N-carbamoyl-amino-acid-amidohydrolase: xúc tác phản ứng tạo amino acid bằng cách tách carbon dioxide and ammoniac từ sản phẩm trung gian. Ngoài ra, đã và đang có rất nhiều nghiên cứu khác được tiến hành như: - Sản xuất L-methionine có hoạt tính sinh học sử dụng enzyme amino acylase phá vỡ tính không gian của N-acyl-DL -methionine. - Kỹ thuật liên tục sử dụng cột cố định aminoacylases từ nấm mốc phân giải hỗn hợp DL- methionine Tosa et al.1967 - Mori-Naga et al.1984 sản xuất L-methionine từ DL-homocysteine và methanol sử dụng các tế bào đột biến kháng ethionine từ Pseudomonas FM 518. - Morinaga et al.1984 cũng đã sử dụng tế bào OM 33 của con đường ribulose-monophosphate để xúc tác cho sự hình thành methionine từ DL-homocysteine và methanol. Họ thu được 26 mM của L-methionine từ 30 mM của DL-homocysteine và 0,8 mM methanol. - Những phương pháp khác bao gồm DL- methionine được sản xuất bởi sự tổng hợp và thủy phân protein. Trong khi những quá trình hóa học sử dụng những nguyên liệu nguy hiểm, sự sản xuất methionine bởi thủy phân protein yêu cầu vài giai đoạn để tách hỗn hợp amino acid. 4.Sản xuất methionine bởi những vi sinh vật đột biến dinh dưỡng-sinh trưởng và điều chỉnh. Vấn đề nghiêm trọng nhất trong sản xuất methionine trong canh trường lên men chìm là là sự ức chế ngược trong bản thân vi sinh vật. Thông thường vi sinh vật hoang dại không sản xuất một lượng lớn acid amin, đặc biệt là methionine vì lý do này. Các thể đột biến thay đổi cơ chế, có thể cho một lượng lớn hơn cho sản xuất methionine. Các đồng phân methionine đã được sử dụng rộng rãi để cô lập các thể đột biến bởi vì chúng thật sự có hiệu quả với chức năng ức chế ngược mà không tham gia vào các chức năng hữu ích khác trong tế bào. Những thể đột biến kháng những đồng phân này có các enzyme không chịu tác động của sự ức chế ngược và do đó tạo ra nhiều methionine hơn. Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 42 Hình 20. Methionine biosynthesis in C. glutamicum [83]: [1 ] aspartate kinase; [2 ] aspartaldehyde dehydrogenase; [3 ] homoserine dehydrogenase; [4 ] homoserine O -acetyltransferase; [5 ] O - acetylhomoserine (thiol)- lyase (cystathionine ₃ -synthase); [6 ] cystathionine ₃ - lyase; [7 ] homoserine S-methyltransferase (Vitamin B12 independent or metH-encoded, Vitamin B12 dependent); [8 ] homoserine kinase; [9 ] threonine synthase; [10 ] O -acetylhomoserine sulfhydrylase; [11 ] serine hydrooxymethyle transferase. Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 43 Hầu hết các amino acid được sản xuất ở quy mô công nghiệp từ những vi sinh vật đột biến điều chỉnh dinh dưỡng-sinh trưởng. Những sinh vật đột biến dinh dưỡng-sinh trưởng này nói chung hữu ích cho sự sản xuất các sản phẩm trung gian ở mạch thẳng của con đường chuyển hóa nhưng cũng hữu ích cho sự sản xuất các acid amin ở nhánh như lysine và methionine. Như trong trường hợp của sự sản xuất methionine sử dụng những sinh vật đột biến dinh dưỡng-sinh trưởng ( sinh vật dị tăng trưởng threonine, lysine và sinh vật dị tăng trưởng kép threonine) Có hai lợi thế (i) kìm hãm những hiệu ứng được loại trừ và (ii) phân tán dòng carbon tới những nhánh bị cắt đứt. Vậy thì, aspartate kinase và homoserine dehydrogenase không b ị ức chế bởi lysine và threonine, và điều này dẫn tới sự sản xuất lượng lớn methionine. Những vi sinh vật đột biến điều chỉnh sự sản xuất methionine có thể được cô lập nhờ sử dụng những dẫn xuất methionine. Những dẫn xuất kìm hãm sự phát triển của chủng hoang dại trong môi trường dinh dưỡng tối thiểu. Trước đó, người ta đã thấy được những dẫn xuất này kìm hãm sự phát triển bằng sự kết hợp vào protein và do đó sản xuất những protein không chức năng. Điều này có thể tốt ở một số trường hợp, nhưng trong phần lớn trường hợp, nguyên nhân chính của sự kìm hãm có vẻ là các dẫn xuất bắt chước con đường mà các amino acid điều chỉnh sự sản xuất của chính nó. Như vậy các dẫn xuất có thể liên kết và làm biến đổi hình dạng tại vị trí có hiệu quả kìm hãm và ngừng sự tổng hợp của acid amin đó. Nó ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật vì sự thiếu hụt acid amin đó. Bởi vậy, những dẫn xuất của amino acid đóng vai trò những giả nhân tố ức chế ngược. Chỉ những vi sinh vật đột biến có sự chống cự với những dẫn xuất mới có thể sản xuất amino acid trong sự thừa, những thể đột biến này sẽ được tách khỏi canh trường. Những vi sinh vật đột biến này có thể chống lại những dẫn xuất bởi vì một sự thay đổi trong cấu trúc enzyme hay một sự thay đổi trong hệ thống enzyme. Trong trường hợp của methionine, những dẫn xuất như ethionine, seleno- methionine, norleucine và methionine hydroxamate đã được sử dụng để phát triển những vi sinh vật có khả năng sản xuất thừa methionine. Những kiểu chống cự dẫn xuất bao gồm: (1) Thay đổi ở một vị trí quan trọng , dẫn đến kìm hãm hoạt tính sinh học của enzyme; (2) Thay đổi trong một gen cấu trúc của enzyme làm mất khả năng ức chế; (3) Thay đổi trong gen cấu trúc acyltransfer RNA synthase, dẫn đến có sự phân biệt giữa amino acid và dẫn xuất của nó; (4) thay đổi trong gen cấu trúc của chất giúp amino acid thấm qua màng, dẫn tới giảm bớt khả năng ức chế của các dẫn xuất. Những vi sinh vật đột biến dinh dưỡng-sinh trưởng với sự chống cự lại những dẫn xuất được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thương mại amino acid. Có thể thu được một lượng lớn lysine đơn giản là cắt những nhánh dẫn tới những amino acid khác. Thể đột biến của Corynebacterium có thể sản xuất 79 g l−1 lysine, 54 g l−1 lysine, 48 g l−1 lysine, 48 g l−1 lysine trong khi những sinh vật đột biến điều chỉnh dinh dưỡng-sinh trưởng sản xuất 70 g l−1 lysine và 76 g l−1 lysine. Sự sản xuất threonine 72 và 76.5 g l−1 bởi những sinh vật đột biến điều chỉnh dinh dưỡng-sinh trưởng đã cũng được thông báo. Mondal et al. có báo cáo rằng những sinh vật đột biến kháng cự ethionine của Brevibacterium heali sản xuất 13 g l−1 methionine. Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 44 Việc tăng lượng nước nội bào ở thể đột biến có thể làm tăng lượng methionine ở nấm men.Sự sản xuất thừa L - methionin bởi vi sinh vật đột biến kháng ethionine có thể tiến hành ở S. cerevisiae, Nấm men lipolytica và Candida petrophilum trong khi methylotrophic yeast, Candida boidinii 2201 sản xuất 6.2 mg g−1 DCW methionine tổng. Vi khuẩn methylotrophic đột biến kháng Ethionine sản xuất 420 mg ml−1 methionine trong điều kiện tối ưu. Thế đột biến kháng Ethionine của Saccharomyces uvarum ATCC 26602 được tìm thấy sản xuất L – methionine ngoại bào. Thể đột biến ER 108 kháng DL- ethionine, mang đột biến chống cự chloramphenicol, và thể nguyên sinh được thu được từ nó đồng nhất với thể nguyên sinh từ S. X2928 cerevisiae kháng sinh mang 6 thể khuyết dưỡng. Bốn thể khuyết dưỡng duy trì được khả năng sản xuất thừa L-methionine. Thể khuyết dưỡng threonine và kháng đa dẫn xuất C. glutamicum ESLMR 724 mg sản xuất 2 ml-1 methionine trong môi trường chứa 10% glucose. Ghosh và Banerjee báo cáo rằng việc sử dụng hydrocarbon Serratia marcescens var. kiliensis sản xuất 1,68 gl-1 acid glutamic và 0,78 gl-1 methionine trong điều kiện môi trường tối thích là môi trường tổng hợp với hydrocacbon là nguồn carbon duy nhất. Thể đột biến của E. coli K-12, kháng các dẫn xuất methionine (norleucine, ethionine và - methylmethionine) và dẫn xuất threonine amino-₃-Hydroxy valeric acid sản xuất 2 mg ml-1 của cả methionine và threonine. E. coli K-12 kháng ethionine và 5- bromouracil sản xuất 1 mg ml-1 của cả methionine cũng như threonine. Chủng đột biến TN1 của E. coli JM109 sản xuất 910 mg l-1 L- methionine. Odessa đưa ra báo cáo rằng 3,5 gl-1 L-methionine được sản xuất từ thể đột biến kháng DL- ethionine Pseudomonas putida VKPM V-4167. Genencor đã đưa ra báo cáo rằng việc sản xuất methionine từ vi sinh vật có thể được nâng cao bằng cách sửa đổi con đường sinh tổng hợp methionine bao gồm: (a) chuyển vào vi sinh vật một homoserine kích hoạt enzymes (ví dụ như homoserine kinase), homoserine acetyltransferase hoặc homoserine succinyltrans ferase gene và cầu sulfur kết nối các enzyme (ví dụ như O-succinylhomoserine-(thiol)- lyase hoặc O-acetylhomoserine-(thiol)- lyase); (b) sau đó khôi phục các transformants( tế bào nhận gen), và cung cấp S cho tế bào sản xuất methionine, vi sinh vật ở đây có thể là Corynebacterium sp.hoặc Brevibacterium sp. 5. Sự phát triển của những vi sinh vật đột biến kháng nhiều dẫn xuất: Khoảng vài nghìn vi sinh vật đột biến thu được nhờ sự phát triển của những vi sinh vật đột biến kháng nhiều dẫn xuất. Số lượng lớn này sẽ giảm xuống còn khoảng 500 vi sinh vật bằng việc chuyển những tế bào này vào môi trường chứa những dẫn xuất sử dụng replica plating technique (kĩ thuật cô lập khuẩn lạc có gen đột biến trên đĩa petry). Những khuẩn lạc của vi sinh vật đột biến được chuyển riêng rẽ và đồng thời vào đĩa (plate) chứa ethionine, norleucine, methionine sulphoxide và methyl methionine sulphonium chloride . Một mạng lưới (grid) được tạo thành trên cơ sở mỗi đĩa Petri, trong đó mỗi hình vuông của mạng lưới được đánh số và cấy 1 khuẩn lạc đã được cô lập. Một khuẩn lạc được lựa chọn bởi replica plating được cấy trên những hình vuông cùng số trong mỗi đĩa . Chỉ những khuẩn lạc mà có thể phát triển trong mọi đĩa cùng loại được chuyển tới nhũng đĩa tiếp theo chứa đựng dẫn xuất với nồng độ cao hơn. Quá trình được lặp lại vài lần cho đến khi số lượng những sinh vật đột biến được giảm bớt tới giữa 60 và 70. Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 45 PHỤ LỤC 1. Sự tổng hợp methionine trong tế bào vi sinh vật: Khoảng 16 loài vi sinh vật đã được báo cáo cho các sản phẩm Methionine(Bảng 1). S. no. Microorganis m Genetic marker Methionine yield Me thod of me thionine (mg ml−1 ) analysis 1. Arthrob acter sp. DSM9771 [58] – 23.00 a HPLC 2. Bacillus megaterium [22,142 ] B6 US- 215 – 4.50 PC B7 1 – 0.072 PC, MB 3. Brevibacteri um heali [18,19] BhLT 27 Lys−, Thr− 25.5 – BrEthR 50 2 EthR 13.0 PC, MB 4. [105] Candida boidinii 220 1 – 6.2 mg g −1 E500- 78 EthR 16.02 mg g−1 b MB AKU 4618 – 4.54 mg g −1 Cand ida sp. 25 A – 6.12 mg g −1 5. C. glutamic um [12 ] ER 107 Thr−, EthR 0.100; 0.200c ER 108 Thr−, EthR 0.100; 0.150c Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 46 ER 109 Thr−, EthR –; 0.500 c ESLMR 724 Thr−, EthR , SLMR MetHxR 2.00 COL, ESLR 146 EthR , SLMR 0.550 PC, ETz R 754 Thr−, EthR , TriazoleR , TFMR 0.754 MB ETz R 606 Thr−, EthR , TriazoleR , 0.610 ETz FR 619 Thr−, EthR TriazoleR , TFMR 0.950 ETz MR 510 Thr−, EthR , MetHxR , TriazoleR 0.850 ESLFR 736 Thr−, EthR , SLMR , TFMR 0.100 6. C. lil ium M128 [70] EthR , NorleucineR , MetSoR 1.98 SP 7. E. coli [68,108, 109] K1 2 5BUR 1.00 – K1 2 AHVR , EthR , 5BUR 2.00 PC JM109- TNI EthR , NorleucineR 0.91 AAA, MB 8. Hans enula polymor ph a DL1 [105] – 5.00 mg g −1 MB EthR 9. Kluyvermyc es lactis IPU126 [141] 14.20 – 10. Methylo monas sp. [23]PC, MB OM 33 EthR 0.07 OE120 EthR 0.42 11. Mi cr oco ccus gluta micus X1 [16] Biotin − 2.00 PC Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 47 5.60 mg g −1 MB 12. Pichia pastoris IFO 0948 [105] – 13. sp. FE-244 [21] EthR Pseudo monas 0.80 MB 14. Pseudomon as putida VKPMV-4167 [110] EthR 3.5 – 15. Serratia marcescens var. kiliensis [107 ] – 0.78 d PC 16. Torulopsis glabrata IFO 005 [105] – 5.04 mg g −1 MB Table 1 Abbreviations for methionine analysis method: COL, colo rimetry; MB, microbiological assay (all repor ted assays used Leuconostoc mesenteroides AT CC No. 8042); PC, paper chromatography; SP, spectrophotometry; AAA, amino acid analyser. Abbreviations markers: MetHx, methionine hydroxamate; SLM, selenomethionine; MetS, methionine sulphoxide; 5BU, 5-bromouracil; AHV, −-amino-₃ -valeric acid. a Hydantoin bioconversion. b Productivity in optimized medium. c Productivity when cysteine was added in medium. d n -Alkane as substrate. Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 48 Trong số này, Corynebacterium và Brevibacterium cơ chế đơn giản hơn. Trong Fig.11, những con đường dành cho Corynebacterium sp. và trong Fig.12, con đường E. coli được trình bày. Nguyên nhân của sự tiến hóa này còn là điều bí ẩn. Kể từ khi con đường tổng hợp methionine được điều khiển rất chặt chẽ, các thể đột biến không chịu sự điều khiển này cần phải được cô lập. Rất nhiều các vi sinh vật đã bị cô lập, trong tầm công nghiệp quan trọng của nó. Tương tự, cũng đã có những nỗ lực đang được thực hiện cho các sản phẩm của methionine bằng lên men chìm. Methionin, lysine, threonine và isoleucine là những amino acid họ aspartate. Những con đường óinh tổng hợp của những acid amin này đã được cải tiến từ công việc của một số nhà nghiên cứu. Wijesundera, Woods, Rowbury và Woods đã hoàn thành con đường sinh tổng hợp methionine ở E. coli. Flavin et al có báo cáo về sự tổng hợp methionine ở Salmonella typhimurium. Sự tổng hợp methionine và các cơ chế trong Corynebacterium đã được báo cáo từ Kase và Nakayama. Những con đường sinh tổng hợp methionine có nhiều nét đặc trưng phổ biến tại hầu hết các vi sinh vật, mặc dù một số loài sử dụng con đường khác nhau, nhưng đều được tổng hợp lại từ vi khuẩn và nấm. Theo con đường này aspartate được chuyển đổi sang 4-phospho-L-aspartate nhờ aspartate kinase, bị oxi hóa bởi aspartaldehyde dehydrogenase để tạo thành aspartate semialdehyde. Aspartate semialdehyde b ị oxi hóa bởi homoserine dehydrogenase để tạo thành homoserine. Mặt khác, aspartate semialdehyde được chuyển thành dihydropicolinate nhờ dihydropicolinate synthase dẫn đến sự hình thành lysine. Từ homoserine, có hai nhánh phát sinh, một dẫn đến sự hình thành methionine , một dẫn đến sự hình thành threonine và sau đó là isoleucine. Homoserine kết hợp với cinyl suc-CoA và sản xuất O-succinylhomoserine trong E. coli nhờ homoserine O-succinyltransferase. Hầu hết các vi khuẩn có O-succinylhomoserine như là một chất trung gian, trong khi hầu hết các nấm và vài vi khuẩn như Bacillus và Corynebacterium có O-acetylhomoserine thay vì O-succinylhomoserine. Sự hình thành methionine từ O_acetylhomoserine có thể đi theo hai con đường. Theo con đường thứ nhất, homocysteine được tổng hợp từ cystathionine trong một số vi khuẩn và vài nấm như Neurospora crassa. Trong con đường thứ hai, acetyl homoserine được trực tiếp chuyển sang homocysteine bởi O-acetylhomoserine (thiol)- lyase . Morinaga et al. đã làm tương tự trong facultative methylotroph, Pseudomonas FM 518 cho thấy hoạt động của cả ₃ -cystathioninase và O- acetylhomoserine sulfhydrilase. Cystathionine được tổng hợp từ O-succinyl homoserine và cysteine bỡi enzyme cystathionine ₃ -synthase . Bước này là thuận nghịch và đòi hỏi pyridoxal phosphat như là một cofactor. Cystathionine sau đó sẽ bị tách thành homocysteine, pyruvate và ammoniac bỡi cystathionine-₃ - lyase (EC 4.4.1.8), một pyridoxal phosphate phụ thuộc vào enzyme. Homocysteine bị methyl hóa bỡi homocysteine S-methyltransferase dẫn đến sự hình thành methionine. Sự methyl hóa homocysteine bỡi homocysteine S-methyltransferase có thể phụ thuộc Vitamin B12 hoặc đọc lập. Tuy nhiên, 5-methyltetrahydrofolate hoạt động như là một tác nhân cho nhóm methyl trong cả hai trường hợp. Gần đây, Rukert et al. đã cải tiến những con đường sinh tổng hợp L-methionine trong Corynebacterium glutamcium sử dụng phối hợp gen. Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 49 Hình 14. Regulation of methionine biosynthesis in Corynebacterium Hình 21Regulation of methionine biosynthesis Escherichia coli Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 50 2. Điều hòa sinh tổng hợp methionine Sự điều hòa và tổng hợp acid amin trong họ aspartate đã được nghiên cứu bởi nhiều người. Aspartate kinase (EC 2.7.2.4) là enzyme đầu tiên của con đường sinh tổng hợp các acid amin họ aspartate, nó xúc tác cho quá trình phosphoryl hóa aspartate. Trong E. coli, có ba aspartate kinases. Aspartate kinase I b ị ức chế bởi threonine và sự tổng hợp của nó cũng bị kìm hãm bởi threonine và isoleucine. Aspartate kinase II b ị ức chế và kìm hãm bởi methionine và aspartate ki- nase III bị ức chế và kìm hãm bởi lysine. Vì vậy, sự vượt trội của một trong những sản phẩm hiện không làm chấm dứt toàn bộ con đường. Việc giảm aspartate-semialdehyde để homoserine được xúc tác bởi hai homoserine dehydrogenases (EC 1.1.1.3). Sự tổng hợp của homoserine dehydrogenase I bị kìm hãm bởi threonine và isoleucine và các hoạt động của nó bị ức chế bởi threonine, trong khi homoserine dehydrogenase II chịu sự kìm hãm của methionine. Ngoài ra, E. coli có thể điều chỉnh sự hiện diện của hỗn hợp sản phẩm trong con đường. Nếu methionine hiện diện vượt mức trong khi lysine, threonine và isoleucine lại ở mức thấp thì aspartate kinase không tổng hợp methionine để điều chỉnh tỉ lệ methionine và ba acid amin còn lại. Vì vậy, mỗi acid amin thường được kiểm soát bởi enzyme đầu tiên trong nhánh của nó. Mặt khác, Brevibacterium và Corynebac-terium sp. được tìm thấy có cơ chế đơn giản hơn nhiều. Những vi sinh vật này chỉ có một aspartate kinase bị ức chế bỡi sự phối hợp của lysine và threonine. Vì vậy, để quá trình ức chế ngược aspartate kinase hiệu quả yêu cầu cả lysine và threonine. Khi lysine và threonine và đồng thời có mặt trong 1 mM, aspartate kinase b ị ức chế tới 94%, trong khi chỉ một acid amin 1 mM, aspartate kinase chỉ bị ức chế 12-20% . Các nghiên cứu về sinh tổng hợp methionine ở C. glutamicum cho thấy methionine ngoại bào kích thích tổng hợp một số enzyme kìm hãm quá trình. Mondal et al. đã ghi lại một số cơ chế tác động của các enzyme vào quá trình sinh tổng hợp methionine. Báo cáo cho thấy ở một số vi sinh vật SAM hay các dẫn xuất nó có khả năng hạn chế sự tổng hợp methionine. SAM kìm hãm các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp methionine. Vai trò kìm hãm của SAM như là một loại sản phẩm cuối cùng trong qua trình sinh tổng hợp methionine ở Corynebacterium . Cùng với emzyme ức chế ngược đầu tiên được tìm thấy ở Bacillus. Điều đó nói lên rằng methionine và SAM ức chế homoserine acetyltransferase của Bacillus polymyxa và mỗi sự ràng buộc ức chế là khác nhau. Ở Saccharomyces cerevisiae, SAM ức chế homoserine acetyltransferase, enzyme đầu tiên của quá trình tổng hợp methionine. Ở E. coli, các gene của methionine regulon được phân phối trên toàn nhiễm sắc thể. Chức năng của S-adenosylmethionine như là một chất đồng kìm hãm và met J gene là một chất kìm hãm mất hoạt tính đã được xác nhận khi nghiên cứu tổng hợp methionine ở E. coli. Tuy nhiên, không một thể đột biến nào với met J và met K có thể kiểm soát hoàn toàn sự sản sinh methionine. Patte và Boy có báo cáo cho thấy ở E. coli enzyme aspartaldehyde dehydrogenase là loại bị kìm hãm đa trị bởi lysine, threonine và methionine. Các nghiên cứu của Urbanowski et al. đã xác định được một điểm , gọi là met R, cần thiết cho met E và met H gen. Tuy nhiên, met E tự động điều tiết trong quá trình tổng hợp trong khi metR protein kích thích nó biểu hiện. Met R gene là một trans-activator của met E gene và R gene là một gen tự sinh và bị kiềm hãm bởi metJ protein. Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 51 Hai trong số những enzyme liên quan đến những bước cuối của sự sinh tổng hợp methionin bị ức chế không ngang bằng bởi cả vitamin B12 lẫn methionin trong E. coli. Mới đây, Kalinowsky et al.đã cung cấp cấu trúc gen của Corynebac- glutamicum terium và sử dụng nó để xây dựng lại những con đường chuyển hóa để sản xuất những amino acid họ aspartate. Tài liệu tham khảo: 1. Effect of cysteine on methionine production by a regulatory mutant of Corynebacterium lilium. Dharmendra Kumar, Kartik Subramanian, Virendra S. Bisaria, T.R. Sreekrishnan, James Gomes. Department of Biochemical Engineering and Biotechnology, Indian Institute of Technology, New Delhi 110016, India 2. Production of L-methionine by submerged fermentation: A review. James Gomes ∗ , Dharmendra Kumar. Department of Biochemical Engineering and Biotechnology, Indian Institute of Technology, New Delhi 110016, India 3. Production of methionine by a multi-analogue resistant mutant of Corynebacterium lilium. D. Kumar, S. Garg, V.S. Bisaria, T.R. Sreekrishnan, J. Gomes. Department of Biochemical Engineering and Biotechnology, Indian Institute of Technology, Delhi, Hauz Khas, New Delhi 110016, India 4. Methionine production by fermentation. Dharmendra Kumara,*, James Gomesb 5. aDepartment of Biotechnology, Sun Pharma Advanced Research Centre, Vadodara- 390 020, India bDepartment of Biochemical Engineering and Biotechnology, Indian Institute of Technology, New Delhi-110016, India 5.” Các quá trình công nghệ cơ bản trong sản xuất thực phẩm”- Khoa hóa thực phẩm và công gnhệ sinh học trường ĐHBK Hà Nội-1996 6.”Hóa sinh công nghiệp” –Lê Ngọc Tú (chủ biên). NXB Khoa học và Kĩ thuật Hà Nội, 2005 7.”Vi sinh vật học “- Nguyễn Lân Dũng (chủ biên). NXB Gíao dục, 2003