Đề tài Công nghệ vi sinh

không phù hợp, iv) Quản lý chất lượng nước không thích hợp. Trong nghi ên cứu này, chúng tôi điều chế beta- glucan bước đầu ở quy mô ph òng thí nghiệm, đồng thời cũng tiến h ành thử nghiệm hoạt tính của chế phẩm n ày đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) trên tôm sú Penaeus monodon. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Tôm sú penaeus monodon thu nh ận từ các trại nuôi tôm đ ược xử lý và nuôi trong hệ thống bể kính, cho ăn v à nuôi dưỡng dưới thức ăn được điều chế theo quy trình hình 1, virus gây h ội chứng đốm trắng (wssv) đ ược sử dụng cho mục đích lây nhiễm, làm tác nhân gây bệnh. Virus được phát hiện trên tôm bằng SV- kít, phương pháp PCR kèm theo phương pháp xác đ ịnh hình thái huyết bào tôm. Hàm lượng protein được xác định bằng ph ương pháp Bradford. Ch ế phẩm beta- glucan được tách chiết từ nấm men Saccharomyces cerevisiae theo quy tr ình bên dưới (hình 2): Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007256 KẾT QUẢ 1. Điều chế beta-glucan từ Saccharomyces cerevisiae Chế phẩm Beta-glucan được điều chế từ Saccharomyces cerevisiae có màu xám trắng, có mùi, vị đặc trưng và ở dạng bột mịn. Hiệu suất điều chế được trình bày ở bảng 1. Bảng 1: Kết quả điều chế Beta-glucan từ Saccharomyces cerevisiae 2. Quan sát hình thái tế bào haemocyte Đây là công đoạn nằm trong phương pháp đếm tổng huyết bào trong huyết tương tôm, là cơ sở khoa học cũng như làm tăng độ chính xác cho phương pháp. Qua đây cũng nhằm mục đích xác định sơ bộ hình thái của huyết bào (tế bào haemocyte) tôm. Các huyết bào có rất nhiều hình dạng khác nhau: hình tròn, oval, móng ngựa, đường kính trong khoảng 5-12 µm. Màu sắc: có màu xanh dương nhạt khi bắt màu với thuốc nhuộm giemsa. Ở trạng thái sinh lý bình thường (hình 3), huyết bào có màu xanh đồng lợt. Số lần điều chế 1 3 2 4 5 Trọng lượng nấm men ban đầu (g) 50 150 200 300 500 Trọng lượng glucan khô thu được (g) 3,50 10,67 14,80 21,07 35,51 Hiệu suất tách chiết (%) 7,00 7,11 7,40 7,02 7,10 Hiệu suất tách chiết trung b ình (%) 7,13 thức ăn (đã xay nhuyễn) beta-glucan (dạng bột) chất kết dính (gelatin + tinh bột) trộn đều và làm ấm bằng nước ấm (nước đun sôi để nguội nhiệt độ 40-50oc) tạo độ dẻo cần thiết và ép viên thức ăn chứa beta-glucan Hình 1: Quy trình tạo thức ăn viện chứa beta- glucan Hình 2: Quy trình tách chiết beta-glucan Huyeàn phuønaám men trong dung dòch NaOH 1M (1: 5(w/v)) UÛ trong ôû 90oC, 1 giôø Khuaáy ñeàu, ñeå nguoäi ôû nhieät ñoä phoøng Li taâm 4000 voøng/10 phuùt, thu caën, rö ûa vôùi nö ôùc 3 laàn, tru g hoøa caën naøy vôùi dung dòch acid acetic 2M, li taâm thu caën Rö ûa caën thu ñö ôïc baèng moät lö ôïng thö øa acetone (4 acetone : 1nö ôùc (v/v)), rö ûa laïi 3 laàn vôùi nö ôùc Thu caën, trải thaønh lôùp moûng treân moät taám plastic. Saáy khoâ ôû 700C, 8 giôø Nghieàn baèng maùy nghieàn Beta-glucan daïng boät Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 257 Hình 3 . Tiêu bản Haemocyte nhuộm giemsa d ưới kính hiển vi quang học x100; A: tiêu bản, B: trong buồm đếm. 3. Kết quả nhiễm nhân tạo trên tôm Sau khi nhiễm khoảng 3 - 4 ngày, tôm bắt đầu biểu hiện và chết do wssv. Biểu hiện được ghi lại như sau: tôm bị nhiễm đốm trắng có biểu hiện v òng đốm trắng đường kính 0,3 - 0,5mm ở vùng vỏ đầu ngực, quanh mang, ăn rất ít, phản xạ kém (bắt rất dễ) (hình 4) Hình 4. Mẫu tôm chết do bệnh đốm trắng nhiễm nhân tạo 4. Kết quả theo dõi khi lây nhiểm virus và cho ăn thức ăn chứa Beta-glucan Khảo sát tỉ lệ sống sót Tỉ lệ sống sót đợt 1: lô đối chứng âm ((-) wssv (-) glucan): tỉ lệ sống được duy trì ở mức trên 90% trong suốt thời gian thí nghiệm. Lô đối chứng dương ((+) wssv (-) glucan): tỉ lệ sống giảm mạnh, bắt đầu từ ng ày thứ 3 (còn 77,78%). từ ngày thứ 4 đến thứ 7, tỉ lệ sống này giảm rất mạnh (từ 72,22% xuống c òn 0%). Lô thí nghiệm ((+) wssv (+) glucan): tỉ lệ sống cũng bắt đầu giảm v ào ngày thứ 3 (còn 81,82%) và cũng giảm mạnh vào các ngày sau đó. Đến ngày thứ 7, tỉ lệ sống của lô thí nghiệm c òn 21,21% và vẫn còn duy trì đến ngày thứ 8 là 12,12%. Mặc dù, cả 2 lô (lô đối chứng dương và lô thí nghiệm) có tỉ lệ sống đều giảm, nh ưng tỉ lệ sống của lô thí nghiệm luôn duy tr ì ở mức cao hơn lô đối chứng dương. Đặc biệt là ở ngày thứ 7, tỉ lệ sống ở lô đối chứng d ương là 0%, trong khi lô thí nghiệm vẫn duy trì ở mức 21,21% (hình 5) BA Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007258 Hình 5: tỉ lệ sống sót của tôm đợt 1 Hình 6 : tỉ lệ sống sót của tôm đợt 2 Tỉ lệ sống sót đớt 2: Lô đối chứng âm ((-) wssv (-) glucan): tỉ lệ sống được duy trì ở mức trên 88,89% trong suốt thời gian thí nghiệm. Lô đối chứng dương ((+) wssv (-) glucan): sau 4 ngày nhiễm, tỉ lệ sống bắt đầu giảm xuống c òn 96,67% và giảm mạnh trong 3 ngày tiếp theo. Đến ngày thứ 7, tỉ lệ sống này chỉ còn 6,67%, và tôm chết hoàn toàn vào ngày thứ 8. Lô thí nghiệm ((+) wssv (+) glucan): tỉ lệ sống bắt đầu giả m vào ngày thứ 5 (còn 75%) và cũng giảm mạnh vào các ngày sau đó. Đến ngày thứ 8, tỉ lệ sống của lô thí nghiệm c òn 12,5%. Các kết quả này cũng gần giống như đợt thí nghiệm, mặc dù, cả 2 lô (lô đối chứng dương và lô thí nghiệm) có tỉ lệ sống đều giảm, nhưng tỉ lệ sống của lô thí nghiệm luôn duy tr ì ở mức cao hơn lô đối chứng dương. Đặc biệt là ở ngày thứ 8, tỉ lệ sống ở lô đối chứng d ương là 0%, trong khi lô thí nghi ệm vẫn duy trì ở mức 12,5% (hình 6) Tổng huyết bào Tổng huyết bào đợt 1: Lô đối chứng ((-) wssv (-) glucan): tổng huyết bào được duy trì ở mức 14,95 - 15,29 x 106 huyết bào/ml trong suốt thời gian thí nghiệm. Lô đối chứng âm ((+) wssv (-) glucan): tổng huyết bào giảm vào ngày thứ 3 (9,03 x 106 huyết bào/ml), đến ngày thứ 6 chỉ còn 1,3 x 106 huyết bào/ml). Lô thí nghiệm ((+) wssv (+) glucan): tổng huyết bào giảm cũng vào ngày thứ 3 (còn 14,45 x 106 huyết bào/ml), giảm mạnh ở ngày thứ 4 (chỉ còn 2,85 x 106 huyết bào/ml). Tuy nhiên, từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 8, tổng huyết bào vẫn duy trì được ở mức từ 5,82 - 7,83 x 106 huyết bào/ml (hình 7). Tổng huyết bào đợt 2: Lô đối chứng âm (( -) wssv (-) glucan): tổng huyết bào được duy trì ở mức 13,98 - 14,23 x 106 huyết bào/ml trong suốt thời gian thí nghiệm. Lô đối chứng dương ((+) wssv (-) glucan): tổng huyết bào bắt đầu giảm từ ngày thứ 2 (còn 12,67 x 106 huyết bào/ml), giảm mạnh ở ngày thứ 4 (còn 4,92 x 106 huyết bào/ml ) và chỉ còn 2,36 x 106 huyết bào/ml ở ngày thứ 6. Lô thí nghiệm ((+) wssv (+) glucan): tổng huyết bào cũng giảm vào ngày thứ 2 (11,87 x 106 huyết bào/ml), tiếp tục giảm mạnh đến ngày thứ 4 (chỉ còn 2,58 x 106 huyết bào/ml). tuy nhiên, từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 7, tổng huyết bào vẫn duy trì được ở mức từ 4,71 - 6,89 x 106 huyết bào/ml. Như vậy, tổng lượng haemocyte trong huyết tương tôm, qua 2 đợt thí nghiệm, chỉ tiêu này ở nhóm cho ăn chế phẩm beta -glucan ((+) wssv (+) glucan) mặc dù có chiều hướng TÆ LEÄ SOÁNG SOÙT ñôït I 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 Ngaøy thí nghieäm Tæ le ä s oán g so ùt ( % ) (-) WSSV (-) GLUCAN (+) WSSV (-) GLUCAN (+) WSSV (+) GLUCAN TÆ LEÄ SOÁNG SOÙT ñôït II 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 Ngaøy thí nghieäm T æ l eä so áng s oùt (% ) (-) WSSV (-) GLUCAN (+) WSSV (-) GLUCAN (+) WSSV (+) GLUCAN Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 259 giảm, nhưng vẫn ổn định và được duy trì ở mức cao hơn nhóm không ăn chế phẩm beta- glucan ((+) wssv (-) glucan) (hình 8). Hình 7: Đồ thị biến thiên haemocyte đợt 1 Hình 8: Đồ thị biến thiên haemocyte đợt 2 Hàm lượng protein trong huyết tương Biến thiên hàm lượng protein đợt 1: Lô đối chứng âm (( -) wssv (-) glucan): tổng hàm lượng protein trong huyết tương duy trì ở mức ổn định trong suốt thời gian thí nghiệm (từ 21,03 – 26,95 mg/ml). Lô đối chứng dương ((+) wssv (-) glucan): tổng hàm lượng protein trong huyết tương bắt đầu giảm vào ngày thứ 3 (còn 20,63 mg/ml) và đến ngày thứ 6 chỉ còn 7,67 mg/ml. Lô thí nghiệm ((+) wssv (+) glucan): tổng hàm lượng protein trong huyết tương cũng bắt đầu giảm từ ngày thứ 3 (còn 15,76 mg/ml) và tiếp tục giảm ở những ngày sau đó, đến ngày thứ 8 chỉ còn 6,78 mg/ml. Tổng hàm lượng protein trong huyết tương của lô thí nghiệm giảm ít hơn và luôn duy trì ở mức cao hơn tổng hàm lượng protein trong huyết tương của lô đối chứng dương (hình 9). Hình 9: Biến thiên hàm lượng protein đợt 1 Hình 10: Biến thiên hàm lượng protein đợt 2 Biến thiên hàm lượng protein trong huyết tương đợt 2: Lô đối chứng âm ((-) wssv (-) glucan): tổng hàm lượng protein trong huyết tương luôn duy trì ở mức ổn định trong suốt thời gian thí nghiệm (từ 23,04 – 24,21 mg/ml). Lô đối chứng dương ((+) wssv (-) glucan): tổng hàm lượng protein trong huyết tương bắt đầu giảm vào ngày thứ 4 (còn 19,64 mg/ml), tiếp tục giảm ở những ngày tiếp theo và đến ngày thứ 6 chỉ còn 9,56 mg/ml. Lô thí nghiệm ((+) wssv (+) glucan): tổng hàm lượng protein trong huyết tương cũng bắt đầu ÑOÀ THÒ BIEÁN THIEÂN LÖÔÏNG HAEMOCYTE THEO THÔØI GIAN ñôït I 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 1 2 3 4 5 6 7 8 Ngaøy thí nghieäm Lö ôïn g ha em oc yt e (x 10 6 t eá ba øo/ m l) (-) WSSV (-) GLUCAN (+) WSSV (-) GLUCAN (+) WSSV (+) GLUCAN Ñ O À T H Ò B IE ÁN T H IE ÂN L Ö Ô ÏN G H AE M O C Y T E T H E O T H Ô ØI G IAN ñô ït II 0 2 4 6 8 10 12 14 16 1 2 3 4 5 6 7 N gaøy th í ngh ie äm L ö ôï n g h ae m oc yt e (x 10 6 t eá b aø o/ m l) (-) W S S V (-) GLUC A N (+) W S S V (-) GLUC A N (+) W S S V (+) GLUC A N BIEÁN THIEÂN HAØM LÖÔÏNG PROTEIN HUYEÁT TÖÔNG THEO THÔØI GIAN ñôït I 0 5 10 15 20 25 30 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ngaøy thí nghieäm H aøm lö ôïn g pr ot ei n hu ye át t öô ng (m g/ m l) (-) WSSV (-) GLUCAN (+) WSSV (-) GLUCAN (+) WSSV (+) GLUCAN BIEÁN THIEÂN HAØM LÖÔÏNG PROTEIN HUYEÁT TÖÔNG THEO THÔØI GIAN ñôït II 0 5 10 15 20 25 30 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ngaøy thí nghieäm H aøm lö ôïn g pr ot ei n hu ye át t öô ng (m g/ m l) (-) WSSV (-) GLUCAN (+) WSSV (-) GLUCAN (+) WSSV (+) GLUCAN Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007260 giảm từ ngày thứ 2 (còn 18,18 mg/ml) và dao động thất thường ở những ngày tiếp theo, nhưng có khuynh hướng cao hơn lô đối chứng dương. Như vậy, tổng hàm lượng protein trong huyết tương tôm: qua 2 đợt thí nghiệm, chỉ tiêu này ở nhóm cho ăn chế phẩm beta-glucan ((+) wssv (+) glucan) mặc dù có chiều hướng giảm, có lúc dao động cao thấp thất thường nhưng vẫn duy trì ở mức cao hơn nhóm không ăn chế phẩm beta- glucan ((+) wssv (-) glucan) (hình 10). 5. Chuẩn đoán và phát hiện virus WSSV bằng phương pháp PCR và trên SV -kit. Chuẩn đoán và phát hiện virus WSSV bằng phương pháp PCR Hình 11. Kết quả phương pháp phát hiện virus wssv trên tôm bằng PCR; giếng pos: mẫu đối chứng dương, giếng neg: mẫu đối chứng âm giếng 1: ( -) wssv (-) glucan, giếng 3: (+) wssv (-) glucan, giếng 4: (+) wssv (+) glucan Kết quả cho thấy, Beta-glucan làm tăng cường tính miễn dịch cho hệ thống ph òng vệ ở tôm. Còn ở lô đối chứng dương, sự gia tăng huyết bào và các protein miễn dịch không bù đắp nổi sự tiêu huyết (vỡ tế bào haemocyte) do virus tiến hành tự nhân bản dựa trên cơ sở vật chất và nguyên liệu của tế bào này quá nhanh, không có s ự hỗ trợ của Beta- glucan từ ban đầu. Chuẩn đoán và phát hiện virus WSSV trên SV-kit. Hình 12: Kết quả phát hiện virus wssv tr ên tôm bằng sv - kit Mẫu đối chứng âm (-) wssv (-) glucan âm tính. Mẫu đối chứng dương ((+) wssv (-) glucan) và mẫu thí nghiệm ((+) wssv (+) glucan) đều cho kết quả d ương tính. Dựa vào cường độ màu trên màng nitrocellulose (hình 12), chúng tôi k ết luận mức độ nhiễm bệnh của 2 lô đối chứng dương (+) wssv (-) glucan và mẫu thí nghiệm (+) wssv (+) glucan là như nhau. Điều này là hoàn toàn phù hợp với phương pháp cảm nhiễm. Cũng như phương pháp chẩn đoán PCR bên trên, kết quả của phương pháp này không có giá tr ị đánh giá tính tăng cường hệ miễn dịch ở tôm của beta -glucan khi cảm nhiễm virus với Băng đặc hiệu wssv 364 bp Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 261 một liều lượng cấp tính, mà chỉ có giá trị đánh giá phương pháp cảm nhiễm là thành công. Để đánh giá xác đáng tính tăng cường hệ miễn dịch ở tôm của beta -glucan ở một liều lượng cấp tính, chúng tôi dựa vào các chỉ tiêu sinh lý máu và tỉ lệ sống sót của tôm trong một khoảng thời gian nhất định như phần kết quả và biện luận đã trình bày. IV. KẾT LUẬN Chế phẩm beta-glucan điều chế từ nấm men bánh m ì saccharomyces cerevisiae có hiệu quả đối với việc tăng cường hệ miễn dịch và duy trì thời gian sống tại một khoảng thời gian nhất định của tôm sú penaeus monodon ở liều gây nhiễm cấp tính. Do đó, mục tiêu của đề tài là khảo sát khả năng tăng cường kích thích miễn dịch trên tôm sú penaeus monodon của chế phẩm beta-glucan đối với virus gây hội chứng đốm trắng (wssv). Mục tiêu này cơ bản thành công ở quy mô phòng thí nghiệm. Tôm sử dụng các hệ thống khác nhau chống lại những tác động do môi tr ường bất lợi (dễ nhiễm bệnh). Do các bệnh dễ lây nhiễm và chất lượng nước xung quanh phản ánh thông qua huyết tương của tôm, cho nên các thông số huyết tương (như tổng lượng huyết bào lưu thông trong hệ tuần hoàn, tổng hàm lượng protein trong huyết tương tôm tại một thời điểm nhất định, các chỉ ti êu này đặc biệt có liên quan đến các thông số về sinh lý, môi trường và các yếu tố có thể gây sốc cho tôm) l à một thông số nhạy và có ý nghĩa nhất định đối với việc đánh giá mầm bệnh v à các yếu tố gây sốc từ môi trường. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Văn Thị Hạnh (2001). Nghiên cứu sự phát triển của một số Baculovirus trong tế bào côn trùng nuôi cấy in vitro và khả năng ứng dụng trong sản xuất thuốc trừ sâu sinh học và kiểm soát virus gây bệnh trên tôm, Luận án Tiến sĩ sinh học, Viện Sinh học Nhiệt đới, Tp. Hồ Chí Minh. 2. Phạm Văn Tình (1996). Kỹ thuật nuôi tôm sú , NXB Nông Nghiệp, trang 5 - 9. 3. Trì Thanh Thảo (2003). Chẩn đoán bệnh đốm trắng tr ên tôm sú (penaeus monodon) bằng kỹ thuật non-stop single-tube semi-nested PCR (Kiatpathomchai, 2001), Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TPHCM. 4. Nguyễn Thị Phượng (2005). Nghiên cứu và phân tích một số thành phần carbohydrate và phương pháp phá h ủy vách tế bào nấm men, Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. 5. Walker GM (1998). Yeast physiology and Biotechnology , Wiley, Chichester. 6. Reimund S., (2003). A new non-degrading isolation process for 1,3 -b-D-glucan of high purity from baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae, Switzerland. 7. Suphantharika M, Khuntae P, Thanardkit P, Verduyn C, (2003). Preparation of spent brewer’s yeast -glucans with a potential applicat ion as an immunostimulant for black tiger shrimp, Penaeus monodon. Bioresourse Technology, p. 88, 55 -60. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007262 8. Thanardkit P, Khunrae P, Suphantharika M and Verduyn C, (2002). Glucan from spent brewer’s yeast: preparation, analysis and use as a potential immunost imulant in shrimp feed, World Journal of Microbiology & Biotechnology, p. 18, 527 -539. 9. Sugimoto, (1976). Process for Autolysis of Yeast , U.S Patent 3,961,080. 10. Kado (2000). Process for producing yeast extract , U.S Patent 6,051,212. 11. Raa, J., (2000). The use of immune-stimulants in fish and shellfish feeds , University of Tromso, Norway. 12. T.W.Flegel (1998). Advances in Shrimp Biotechnology. Proceedings to the Special Session on Shrimp Biotechnology, 5 th Asian Fisheries Forum, Chiengmai, Thailand. 13. Chang CF et al., (1999). Effect of dietary beta-1,3-glucan on resistance to white spot syndrome virus (WSSV) in postlarval and juvenile Penaeus monodon , FishAquat Organ; 36; 163-8. 14. Cheng FC, Su MS, Chen HY, (1999). A rapid method to quantify total haemocyte count of Penaeus monodon using ATP analysis , Fish Pathol. 15. Karin Van De Braak, (2002). Haemocytic defence in black tiger shrimp (Penaeus monodon), Wagening University, Netherland. 16. Hazel Wade, Vinh Viet Nguyen, Hue Thu Nguyen, (2002). Preliminary Overview of Shrimp Aquaculture in Vietnam. 17. Hong Phuoc Le, (2001). Haemocyte reactions against microorganisms in Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon). 18. Vetvicka V., Sima P, (2004). -Glucan in invertebrate, ISJ 1: 60-65. SUMMARY Investigation of immunostimulation of beta -glucan for tiger shrimp penaeus monodon against virus WSSV Vo Long Thuan, Nguyen Duy Long, Hoang Quoc Khanh, Van Thi Ha nh Institute of Tropical Biology Beta-glucan was found in yeast cell as a natural immunostimulants to reduce stress and mortalities, to maintain good health of cultured organisms and to stimulate the non - specific defence mechanism, is becoming increasingly important in aquaculture. In this study, we investigate effect of beta -glucan to reducing susceptibility disease and infection of WSSV virus to tiger shrimp Penaeus monodon. A SV-kit and PCR analysis system are proceeded to determine cell infected by WSSV virus and the blood cells are also investigate and counting during the treatment with beta -glucan. The results show on treatments and supplies by beta-glucan into experimental design tanks by feed increased survival percentage at 7 th-days treatment with highest level is 21.2%. Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 263 CHỌN GIỐNG NẤM MEN Rhodotorula CÓ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CÙNG VỚI MỐC Monascus sp TRÊN MÔI TRƯỜNG GẠO TẤM THEO PH ƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY BỀ MẶT Nguyễn Thị Minh Nguyệt, ĐH Công nghiệp Đống Thị Anh Đào, ĐH Bách khoa TPHCM Nguyễn Hữu Phúc Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Nấm men Rhodotorula còn được gọi là vi sinh vật sinh sắc tố carotenoid (carotengensis). Các sắc tố carotenoid chính trong nấm men Rhodotorula là: -carotene, torularhodin và torulene [2]. Đ ã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid trên nhiều các nguồn cơ chất khác nhau nhưng chủ yếu là theo phương pháp nuôi cấy dịch thể [1], [3], [4], [6], [7] Mốc Monascus còn gọi « mốc gạo đỏ » từ rất lâu đã được dùng làm chất màu hay phụ gia thực phẩm. Hiện tại đã có hơn 50 patent có liên quan đến việc sử dụng sắc tố đỏ Monascus vào thực phẩm đã được công nhận tại Nhật Bản, Mỹ, Pháp v à Đức. [5] Các sắc tố đựơc tiết ra từ Monacus là hỗn hợp của màu đỏ, cam và vàng thường được dùng chung mà không cần tách riêng ra từng loại. Khi tế bào trưởng thành, vách tế bào chuyển sang màu nâu làm ảnh hưởng đến chất lượng của sắc tố thu được [8]. Để tăng hiệu quả sử dụng tinh bột của nấm men Rhodotorula khi nuôi trên môi trừơng gạo tấm đồng thời tăng hàm lượng sắc tố carotenoid tiết ra canh tr ường nuôi cấy một cách tự nhiên không dùng các tác động cơ học để phá vỡ thành tế bào nấm men, lần đầu tiên chúng tôi đã thành công tiến hành nuôi hỗn hợp nấm men Rhodotorula và nấm mốc Monascus sp. . VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu, hóa chất và môi trường:  Giống vi sinh vật: các chủng nấm men Rhodotorula do chúng tôi phân lập và định danh gồm: Rh.graminis (MN5), Rh.glutinis HUI-1(MN10) Rh.glutinis HUI-2 (MN17) và 4 giống chưa định danh đến loài là Rhodotorula sp1(MN1), Rhodotorula sp.3 (MN12), Rhodotorula sp.4 (MN16). Giống mốc Monascus sp.(As6) nhận từ Viện Sinh học Nhiệt đới - Viện Khoa học miền Nam. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007264  Gạo tấm: gạo tấm thứ phẩm mua từ cơ sở cung cấp hàng nông sản thực phẩm số 28- Nguyễn Thị Nhỏ - chợ Bình Tây.  Thành phần môi trường nuôi bề mặt gồm : - Nguồn nitrogen: bột đậu nành. - Nguồn carbohydarte bổ sung : dầu cooking oil T ường An. - Nguồn phospho gồm: KH2PO4, K2HPO4, Na2HPO4. - Nguồn khoáng và vitamin gồm: MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O, CaCl2.2H2O, CaCO3, CuSO4.5H2O, ZnSO4.7H2O, FeSO4.H2O, cao nấm men.  Giữ các giống men Rhodotorula trên môi trường thạch malt, mốc Monascus sp. trên môi trường PGA, để ở nhiệt độ 80C và cấy chuyền định kỳ sau hai tuần.  Nuôi cấy bề mặt: theo quy mô phòng thí nghiệm trong điều kiện vô trùng, được tiến hành trên hai mức, hoạt hóa giống trên máy lắc và nuôi bề mặt trong các khay nhựa PP chịu nhiệt dung tích 700ml. Nguyên liệu gạo tấm sau khi ngâm 24giờ được hồ hóa cho vào các khay, bổ sung dinh dưỡng điều chỉnh về pH 5,3 rồi mang đi thanh trùng ở nhiệt độ 1000C trong 30 phút. Cấy giống vào các khay nhựa và đặt ở phòng có nhiệt độ trung bình 28 ± 10C, độ ẩm không khí 38-40%. Độ ẩm môi trường cho nuôi cấy bề mặt là 60-65%.  Các hoá chất, máy móc, thiết bị chuyên dùng trong phân tích hóa sinh, vi sinh thu ộc phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm v à Sinh học - Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. Phương pháp:  Khảo sát tỷ lệ giống men theo phương pháp đếm khuẩn lạc CFU, tỷ lệ mốc theo phương pháp đếm bào tử trên buồng đếm hồng cầu. Dựng đường chuẩn và đo mật độ quang để xác định tỷ lệ giống sử dụng. Đối với nấm men chúng tôi sử dụng trung bình: 107-108CFU/g nguyên liệu khi nuôi độc lập men. Khi nuôi hỗn hợp tỷ lệ men 5.106- 5.107CFU/g và bào tử mốc trung bình là 5.106-5.107/g.  Định tính hoạt độ amylase theo ph ương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Dùng môi trường Czapeck agar trong đó thay glucose bằng tinh bột tan 1%, khử trùng môi trường ở 1 atm trong 30 phút, đổ vào các đĩa Petri cấy các chủng vi sinh vật nghi ên cứu. Để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 3 ngày đối với mốc và 10 ngày đối với các chủng nấm men, cho vào đĩa 1ml dung dịch lugol 1%. Quan sát vòng phân giải tinh bột.  Xác định các chủng giống phát triển nhanh tr ên môi trường gạo tấm có bổ sung dinh dưỡng, đo hàm lượng protein xác định sau khi phát hiện m àu bằng thuốc thử Foling của Lowry (O. H. Lowry et al., 1951).  Xác định hoạt độ alpha-amylase bằng cách phát hiện màu với Ido và so màu ở bước sóng 620nm theo phương pháp Smith&Roe.  Xác định hoạt độ protease theo phương pháp của Anson cải tiến.  Xác định hàm lượng tinh bột của nguyên liệu và tinh bột sót theo phương pháp kết tủa bằng cồn 960.  Xác định hàm lượng đạm tổng theo phương pháp Kjeldahl với hệ thống chưng cất đạm tự động bằng hệ chuẩn H 3BO3-H2SO4. Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 265  Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy khô ở nhiệt độ 1050C đến khối lượng không đổi. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Định tính hoạt tính amylase của các chủng nghi ên cứu: Sau khi tiến hành thí nghiệm như đã trình bày ở phần phương pháp, chúng tôi thu được kết quả như hình 1. Men Rhodotorula cho phản ứng dương tính khi nhỏ lugol vào thạch đĩa nhưng hoạt độ amylase rất yếu chỉ hình thành một vòng phân giải tinh bột rất nhỏ bao lấy khuẩn lạc nấm men. Trong khi đó mốc Monascus sp. có vòng phân giải tinh bột rất lớn lên đến 29,3mm. 2. Khả năng phát triển trên môi trường gạo tấm khi nuôi hỗn hợp men và mốc Cấy men và mốc vào môi trường gạo tấm đã bổ sung dinh dưỡng, vào cùng một lúc. Định kỳ sau 24 giờ lấy mẫu xác định gián tiếp hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry. Kết quả thu được như bảng 1. Bảng 1: Hàm lượng protein hòa tan khi nuôi hỗn hợp từng chủng men với mốc. Hàm lượng proetin hòa tan (mg/g)Thời gian (ngày) MN1-As6 MN5-As6 MN10-As6 MN12-As6 MN16-As6 MN17-As6 1 2,705 2,163 3,918 4,115 2,324 2,027 2 2,661 4,105 6,172 3,902 3,902 2,262 3 9,485 15,299 7,997 5,703 5,703 3,283 4 11,874 17,612 11,183 9,826 7,826 3,749 5 8,973 10,271 13,386 11,735 6,735 4,591 6 5,792 7,485 8,706 12,643 5,049 5,370 7 3,952 6,013 6,313 5,477 4,996 3,717 8 2,826 4,967 5,083 5,049 4,502 3,046 Hình 1a: Vòng phân giải tinh bột Hình 1b: Vòng phân giải tinh bột của menRhodotorula graminis. của mốc Monascus sp. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007266 0.000 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000 12.000 14.000 16.000 18.000 20.000 1 2 3 4 5 6 7 8 Thời gian nuôi (ngày) Hà m lư ợn g pr ot ei n hò a ta n (m g/ g ng uy ên li ệu ) MN1- As6 MN5- As6 MN10 - As6 MN12- As6 MN16- As6 MN17- As6 Hình 2: So sánh hàm lượng protein hòa tan hình thành trong th ời gian nuôi hỗn hợp từng chủng men Rhodotorula với mốc Monascus sp. Hình 2 cho thấy MN5-As6 phát triển chung với nhau tốt nhất hàm lượng protein tăng lên hẳn (đạt 17,61mg/g ) chỉ trong thời gian 4 ngày. Trong khi nuôi độc lập các men đỏ đa số các chủng đều đạt hàm lượng protein cực đại sau 6 -7 ngày nuôi cấy. 3. Xác định hoạt độ amylase, protease trong canh tr ường khi nuôi độc lập các chủng men đỏ trên môi trường gạo tấm. Để xác định hoạt độ amylase, protease trong thời gian nuôi cấy, chúng tôi chỉ khảo sát trên 4 chủng men cho kết quả nuôi cấy hỗn hợp hiệu quả, tức tiến hành khảo sát trên các mẫu thí nghiệm gồm : MN1-As6, MN5-As6, MN10-As6 và MN12-As6. Kết quả thu được như bảng 2. Bảng 2: Hoạt độ amylase, protease khi nuôi phối hợp men -mốc theo thời gian. MN1-As6 MN5-As6 MN10-As6 MN12-As6Thời gian (ngày) Amylase (UI/g) Protease (UI/g) Amylase (UI/g) Protease (UI/g) Amylase (UI/g) Protease (UI/g) Amylase (UI/g) Protease (UI/g) 1 0,0005 0,1112 0,0004 0,0848 0,0001 0,0576 0,0002 0,1324 2 0,0030 0,3425 0,0007 0,6672 0,0058 0,1340 0,0042 0,5473 3 0,0052 0,6742 0,0091 1,3168 0,0068 0,6742 0,0055 0,9647 4 0,0067 0,9640 0,0072 1,8480 0,0043 1,2678 0,0059 1,1240 5 0,0042 1,0340 0,0057 1,0000 0,0042 0,8640 0,0037 0,8930 6 0,0027 0,7813 0,0036 0,7712 0,0023 0,5378 0,0033 0,7624 7 0,0010 0,6497 0,0012 0,5872 0,0013 0,5034 0,0025 0,6724 8 0,0007 0,5647 0,0009 0,5134 0,0005 0,4397 0,0018 0,4034 Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 267 0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 1 2 3 4 5 6 7 8 Thời gian (ngày) H oạ t đ ộ am yl as e (U I/g ) M1-As6 M5-As6 M10-As6 M12-As6 Đồ thị trên cho thấy khi nuôi hỗn hợp MN5 và As6 cũng cho hoạt độ amylase và protease cũng cao nhất nhưng thời gian đạt giá trị cực đại có khác nhau. Hoạt lực amylase và protease trong canh trư ờng lần lượt đạt 0,0091 và 1,8480 (UI/g). Kết quả thu được phù hợp với cơ sở lý thuyết vì bản chất của các enzyme là protein nên khi enzyme tiết ra môi trường nhiều thì hàm lượng protein hòa tan xác định được cũng sẽ cao theo. 4. Xác định hàm lượng tinh bột của nguyên liệu trước khi cấy giống vào và so sánh hàm lượng tinh bột sót sau thời gian nuôi cấy độc lập men MN5 v à nuôi hỗn hợp MN5 -As6. Bảng 3: Kết quả phân tích hàm lượng tinh bột. Số TT Mẫu thí nghiệm Hàm lượng tinh bột (%) 1 Gạo tấm nguyên liệu 62,76 2 Gạo tấm sau khi ngâm 24 giờ 54,58 3 Gạo tấm sau khi hồ hóa và thanh trùng 27,35 4 Gạo tấm nuôi men MN5 sau 7 ngày 13,71 5 Gạo tấm nuôi hỗn hợp MN5- As6 sau 7 ngày 4,17 Kết quả bảng 3 cho thấy qua giai đoạn ngâm, hồ hóa và thanh trùng nhiệt gạo tấm, một phần tinh bột đã bị thủy phân thành các hợp chất đơn giản hơn cung cấp cho hoạt động trao đổi chất của nấm men, tuy nhi ên lượng tinh bột sót khi nuôi men độc lập khá cao. Ngược lại nuôi hỗn hợp men MN5 với mốc Monascus sp. sau 7 ngày nuôi cấy lượng tinh bột sót chỉ còn 4,17%. 5. Khảo sát sự thay đổi độ ẩm và pH theo thời gian nuôi cấy Sau mỗi ngày nuôi cấy men hỗn hợp MN5-As6, chúng tôi tiến hành xác định sự thay đổi độ ẩm và pH và thu được kết quả như bảng 4. Bảng 4: Sự thay đổi pH và độ ẩm theo thời gian khi nuôi hỗn hợp MN5 -As6. Ngày 1 2 3 4 5 6 7 8 pH 6,7 7,24 6,12 6,81 5,16 5,14 4,48 4,04 Ẩm độ 65 65,74 67,38 68,45 69,19 69,35 70,12 70,68 0.0000 0.5000 1.0000 1.5000 2.0000 1 2 3 4 5 6 7 8 Thời gian (ngày) H oạ t đ ộ pr ot ea se (U I/g ) MN1 -As6 MN 5-As6 MN 10-As6 MN12 -As6 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007268 pH ban đầu là 5,5 sau 2 ngày nuôi cấy pH tăng mạnh nhưng sau đó pH giảm dần về phía acid. Giải thích điều này do trong thời gian nuôi Monascus thường làm môi trường chuyển sang acid yếu. Ngược lại độ ẩm của môi trường tăng dần theo thời gian đó là do hàm lượng nước tạo thành tích tụ trong khay lên men làm độ ẩm tăng lên. 6. Kết quả phân tích hàm lượng protein tổng và lipid tổng Mẫu nuôi hỗn hợp MN5 -As6 sau thời gian 7 ngày chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng protein tổng, lipid tổng, tinh bột, đ ường sót của mẫu nuôi men MN5 và mẫu nuôi hỗn hợp men-mốc. Kết quả thu được như bảng 5. Bảng 5: Thành phần môi trường sau 7 ngày nuôi cấy của MN5 và MN5-As6. Vi sinh vật nuôi cấy Protein thô (%) Lipid tổng (%) Tinh bột (%) Chỉ nuôi men MN5 19,46 36,63 13,71 Hỗn hợp MN5-As6 23,37 55,13 4,17 KẾT LUẬN Tiến hành nuôi cấy hỗn hợp từng chủng men đỏ Rhodotorula với mốc Monascus sp. theo phương pháp bề mặt chúng tôi đã chọn được nấm men Rhodotorula graminis (MN5) cho kết quả nuôi cấy hỗn hợp với mốc Monascus sp. l à cao nhất. Với tỷ lệ giống 1:1 sau 7 ngày nuôi cấy hỗn hợp men MN5 và mốc Monascus sp. trên môi trường gạo tấm đã qua hồ hóa có bổ sung dinh dưỡng, chúng tôi thu được kết quả như sau:  Protein tổng : 23,37%.  Lipid tổng : 55,13%.  Tinh bột : 4,17%. Kết quả trên góp phần làm tăng đáng kể giá trị dinh dưỡng của gạo tấm dùng trong chăn nuôi và đặc biệt là tăng chất màu carotenoid để làm nguồn thức ăn phục vụ cho chăn nuôi gia cầm đẻ trứng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Phan Tú Anh - "Sinh tổng hợp sinh khối Rhodotorula gi àu Protein-Carotenoid"- Báo cáo tổng kết nghiệm thu đề tài chương trình vườn ươm sáng tạo KHKT trẻ- Sở Khoa học Công nghệ- Thành Đoàn Tp. HCM- Năm 2003. 2. Bhosale P., Jogdant V.V, Grade R.V. - "Stability of -carotene in spray dried preparation of Rhodotorula glutinis mutant 32"- Journal of Applied Microbiology, September 2003, Vol.95 (3), pp.584. 3. Buzzini Pietro, Martini Alessandro "Production of carotenoids by strains of Rhodotorula glutinis cultured in raw materials of agro -industrial origin"- Bioresource technology 71 (1999) 41 -44. 4. Buzzini Pietro -"Batch and fed batch carotenoid production by Rhodotorula glutinis -Debaryomyces castellii co -cultures in corn syrup"-Journal of Applied Microbiology 2001, 90, pp.843 -847. Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 269 5. Dufossé L. -“Microbiol production of food grade pigments” - Food Technol. Biotechnol. Vol. 44(3), 2006, pp.313-321. 6. Frengova Ginka, Emilina Simova, Dora Beshkova - "Use of Whey untrafiltrate as a substrate for production of carotenoid by the yeast Rhodotorula rubra"- World Journal of Microbiology and Biotechnology , Applied Biochemistry and Biotechnology, March 2004, Vol. 112, Issue 3, pp.133 -142. 7. Frengova Ginka, Emilina Simova, Dora Beshkova - "Beta-carotene-rich carotenoid- protein preparation and exopolysaccharide production by Rhodotorula rubra GED 8 grown a yogurt starter culture" - Journal of Industry Microbiology and Biotechnology, Applied Biochemistry and Biotechnology, ISSN 1367-5435, 2006, Vol. 2, pp. 572-577. 8. Iturriaga E. A., Papp T., Breum J., Arnau J., Eslava A.P. - “ Strain and culture condition improvement for -carotene production with Mucor. In: methods in biotechnology: Microbial processes and products” - J. L. Barredo (Ed), USA (2005), Vol. 18, pp. 239-256. SUMARY High nutrition production by Rhodotorula yeast co -cultivated with Monacus sp. Mold on the broken grain of ordinary rice by solid state method Nguyen Thi Minh Nguyet(1), Đong Thi Anh Đào (2), Nguyen Huu Phuc(3) (1)Univ. Industry (2)Univ Technology (3)Institute of Tropical Biology Broken grain of ordinary rice, obtained from the poultry feed agent, were soaked overnight at room temperature, acidified to pH 4.0 with chloric acid. The broken grain of ordinary rice were cooked for 20 minutes, at 95 0C in water also at pH 4.0. Cooked rice were added mineral and nutrition. Mixing followed and devided into each of 700ml P.P. box. Media were sterilized by autoclaving at 121 0C for 20 min. The cooked rice were inoculated with yeast suspension of Rhodotorula and spore suspension of Monascus sp. The suspension was prepared by growing on glucose 4% in 10ml tubes at 300C for 24 hours and contained approximately 5.10 6-5.107mould spores/g and 5.106- 5.107CFU/g. Incubated conditions were : pH media = 5.3, moisture 65%, temperature 28±10C. Depending on the solute protein content were obtained as co -culturing every Rhodotorula species and Monascus sp., we chose Rhodotorula graminis (MN5) has the best grown with Monacus sp.(the maximum protein content was 17,612 mg/g media). After 7 days co-culture, nutrient components of solid state media were increased worthily (total protein 23.37% , t otal lipid 55.23% and starch 4.17%). The aim of this research was to increase the nutrition and carotenoid pigments of broken grain of ordinary rice, as they are produced by co -culturing Rhodotorula species and Monascus sp. It is necessary for poultry feed in order to increase the pigment of egg. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007270 NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC V À KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN CỦA MỘT SỐ GIỐNG NẤM MEN Rhodotorula PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Nguyễn Thị Minh Nguyệt , ĐH Công nghiệp Tp.HCM Đống Thị Anh Đào, ĐH Bách khoa Tp.HCM Nguyễn Hữu Phúc Viện Sinh học Nhiệt đới. MỞ ĐẦU Nấm men Rhodotorula là một trong rất ít các chi nấm men có khả năng tổng hợp tích luỹ một lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu l à β-carotene, torulene, torularhodin.[7], [14] Tại các nước có nền sinh học phát triển nấm men Rhodotorula được nghiên cứu nhiều và đã được sử dụng như một nguồn cung cao chất màu thực phẩm an toàn, [9] sinh khối nấm men có giá trị dinh d ưỡng cao dùng trong chăn nuôi.[7], [8], [15], [16] Những kết quả nghiên cứu cho thấy tại Việt Nam rất phổ biến chi nấm men Rhodotorula. Một số chủng đã được nghiên cứu về khả năng tạo sinh khối, tích luỹ carotenoid, chất béo đặc biệt l à các acid béo không no có giá tr ị sinh học cao trên các phế phụ phẩm chế biến nông sản th ực phẩm. [1], [3] Với xu thế càng hướng vào các loại thức ăn tự nhiên có nguồn gốc sinh học thay thế các chất bổ sung có nguồn gốc tổng hợp hóa học n ên việc phân lập và tuyển chọn các giống nấm men từ tự nhiên có khả năng thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp thức ăn gia súc trên các nguồn nguyên liệu thô là một hướng nghiên cứu đáng quan tâm. Mục đích của chúng tôi là tìm ra các chủng nấm men Rhodotorula có khả năng phát triển theo phương pháp nuôi cấy bề mặt trên từng loại phế phụ phẩm hữu cơ nhất định, đặc biệt là các phụ phẩm của ngành công nghệ thực phẩm nhằm nâng cao chất lượng thức ăn gia súc góp phần tạo nên một nền nông nghiệp sạch, bền vững. Trong phạm vi bài viết này chúng tôi chỉ trình bày kết quả bước đầu của công tác phân lập, tuyển chọn nấm men sinh sắc tố carotenoid thuộc chi Rhodotorula có khả năng nuôi cấy theo phương pháp bề mặt để thu sinh khối giàu sắc tố carotenoid. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Nguyên liệu, hóa chất và môi trường Các vật liệu dùng trong phân lập và nuôi cấy bán rắn. Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 271  Nguồn carbohydrate gồm: glucose, saccharose, maltose, đ ại mạch, tinh bột, bột ngô, cám gạo, gạo tấm, bã sắn, dầu thực vật.  Nguồn nitrogen gồm: bột cá, bột đậu tương, bột lạc, monosodium glutamate, ure, (NH4)2SO4, pepton.  Nguồn phospho gồm : KH2PO4, K2HPO4, Na2HPO4.  Nguồn khoáng và vitamin gồm : MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O, CaCl2.2H2O, CaCO3, CuSO4.5H2O, ZnSO4.7H2O, FeSO4.H2O, cao nấm men, cao thịt.  Mẫu phân lập từ đất trồng, bề mặt lá cây, các loại hoa, vỏ trái cây chủ yếu lấy từ Long An và một số tại Thành phố Hồ Chí Minh, nước biển tại thành phố Vũng Tàu. Tổng số mẫu phân lập là 64.  Môi trường phân lập: * Môi trường A (YMPG: Yeast extract - Malt extract- Pepton - Glucose -agar). * Môi trường B (YPG: Yeast extract - Pepton - Glucose-agar). * Môi trường C (PGA: Potatoes - Glucose - agar).  Các hoá chất, máy móc, thiết bị chuyên dùng trong phân tích hóa sinh, vi sinh thu ộc phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm v à Sinh học, Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. 2. Phương pháp  Phương pháp phân lập và giữ giống: các mẫu thí nghiệm được phân lập bằng phương pháp Koch lần lượt trên cả ba môi trường A, B và C, nuôi ở các nhiệt độ cần thiết và tiếp tục làm thuần cũng trên môi trường phân lập. Chọn các khuẩn lạc to, tròn có màu từ vàng, cam đến đỏ, quan sát dưới kinh hiển vi có h ình thái của nấm men (có nhân điển h ình). Giữ giống trên môi trường thạch malt ở nhiệt độ 5 0C. Cấy chuyền định kỳ sau 2 tuần.  Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và định loại nấm men theo các khoá phân loại của Lodder et al. [4]  Khảo sát khả năng sử dụng các nguồn carbohydrate, nguồn nitrate và một số các phản ứng sinh hóa: dùng các mẫu test ID 32 E của hãng BioMérieuxsa (Pháp) kết hợp với các thí nghiệm kiểm chứng tr ên thạch đĩa và trong ống nghiệm.  Nuôi cấy bề mặt: theo quy mô phòng thí nghiệm trong điều kiện vô trùng, được tiến hành trên hai mức, hoạt hóa giống trên máy lắc và nuôi bề mặt trong các khay nhựa PP chịu được nhiệt độ thanh trùng.  Khi chọn nấm men có khả năng phát triển tích lũy sinh khối nhanh tr ên môi trường nghiên cứu, chúng tôi xác định hàm lượng protein sau khi phát hiện m àu bằng thuốc thử Foling (O. H. Lowry et al., 1951) .  Nguyên liệu sau lên men qua lọc thô thu dịch và ly tâm với tốc độ 6.000 vòng/ phút trong 20 phút, tách sinh khối tế bào nấm men mang xác định độ ẩm để quy về khối lượng sinh khối tế bào khô thu được trong 1kg môi trường. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007272  Khảo sát tỷ lệ giống theo phương pháp đếm khuẩn lạc CFU và đo mật độ quang OD. Giống được hoạt hoá trên môi trường glucose 4% trên máy lắc ngang trong 24 giờ. Tỷ lệ giống cấy vào đạt 8.107 - 10.107 CFU/ml/ 100g môi trường.  Xác định hàm lượng protein tổng theo phương pháp Micro-Kjeldalh.  Xác định hàm lượng chất béo theo phương pháp Soxlet.  Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Đặc điểm sinh học Từ 64 mẫu phân lập, bước đầu chúng tôi tuyển chọn đ ược 17 chủng nấm men sinh sắc tố từ kem, hồng cam đến đỏ cam , trong đó có 8 chủng có các đặc điểm như: - Vết cấy màu hồng do sinh sắc tố carotenoid. - Không lên men các loại đường. - Không đồng hóa Inositol. - Sinh enzyme urease. - Không tạo thành hợp chất loại tinh bột. Theo khóa phân loại của Lodder, chúng tôi đã chọn được 8 chủng thuộc chi Rhodotorula và kết quả mô tả hình thái tế bào, khuẩn lạc như sau: Bảng1: Mô tả đặc điểm tế bào, khuẩn lạc của 8 chủng nấm men thuộc c hi Rhodotorula Đặc điểm Chủng Nguồn phân lập Hình dạng tế bào Mô tả khuẩn lạc Kích thước khuẩn lạc (mm) MN 1 Đất vườn Hình dài Màu hồng cam hay đỏ cam , bề mặt nhẵn, bóng sáng, mép không có răng cưa, tâm khu ẩn lạc nhô lên. 7 - 10 MN 5 Vỏ táo Hình tròn Màu hồng hay cam, to, tròn bề mặt mịn, nhẵn bóng, mép không răng cưa, dày . 10 - 20 MN 7 Nước biển Hình tròn cầu Màu vàng kem hay hồng cam, tròn, bề mặt khô mịn, mờ đục, mép không răng cưa, khuẩn lạc dày ở tâm. 5 – 15 MN 8 Mía Hình tròn Màu cam đến đỏ cam, to tròn, bề mặt ghồ ghề, xếp mí, mép không có răng cưa, tâm khu ẩn lạc dày đặc các nếp gấp. 12 - 16 MN 10 Lá lúa Hình dài Màu hồng cam hay đỏ, to, tròn nhẵn bóng, nhiều nhớt, mép không có răng cưa, khuẩn lạc tương đối dày như nhau tại tâm cũng như gần mép. 8 - 14 MN 12 Lá dâm bụt Hình trứng Màu cam hay hồng cam, to tròn, bề mặt khô nhẵn, mép không có răng cưa, bề dày trung bình. 12 – 17 MN 16 Vỏ dưa lê Hình elip kéo dài Màu cam hay đỏ, to tròn đôi khi ghồ ghề, bề mặt hơi khô, xếp nhiều nếp, mép không có răng c ưa, khuẩn lạc mỏng . 8 - 13 MN 17 Hoa bụt Hình tròn cầu Màu cam, to hình ovan, bề mặt khô, mịn , mép khuẩn lạc không có răng cưa, khuẩn lạc mỏng hơi nhô lên ở tâm 7 -12 Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 273 2. Kết quả phản ứng sinh hóa: Bảng 2: Kết quả một số phản ứng hóa sinh thực hiện trong ống nghiệm tr ên thạch đĩa. Đặc điểm Chủng ký hiệu Lê n m en c ác lo ại đ ư ờ ng In os ito l H ìn h th àn h ac id a ce tic Ph ản ứ ng D B B D -S ac ch ar os e D -M al to se D -G lu co se D - G al ac to se L- A ra bi no se M el eb io se R af in os e Ti nh b ột Th u ỷ ph ân u re N itr at MN 1 - - - + + + + + - - - - + + MN 5 - - - + + + + + -/+ - + - + + MN 7 - - - + + + + + - - + + + + MN 8 - - - + - - + - - - - - + - MN 10 - - - + + + + - - - -/+ - + + MN 12 - - - + + + + - - - - - + - MN 16 - - - + + - + - - - - - + - MN 17 - - - + + + + +/- - - - - + + Kết quả từ bộ test ID 32 E v à kết hợp các thí nghiệm tiến h ành trên đĩa peptri ( bảng 2) chúng tôi định danh đ ược đến và xác định được 4 loài là: (MN 5) Rh. graminis, (MN7) Rh. ingeniosa , (MN 10) Rh. glutinis HUI-1, (MN 17) Rh. glutinis HUI-2. Bốn chủng chưa định danh đến loài chúng tôi ký hiệu là: Rhodotorula sp.1 (MN 1), Rhodotorula sp.2 (MN 8), Rhodotorula sp.3 (MN 12), Rhodotorula sp.4 (MN 16). 3. Lựa chọn chủng có khả năng tích luỹ sinh khối nhanh trên môi trường gạo tấm theo phương pháp nuôi cấy bề mặt. Từ 8 chủng phân lập được chúng tôi đã chọn được 4 có khả năng tích luỹ sinh khối nhanh trên gạo tấm đã qua hồ hóa là: Rhodotorula sp.1 (MN 1), (MN 5) Rh. graminis, Rh. glutinis HUI-1 (MN 10), Rh. sp3 (MN 12). Đ ối chiếu bảng 2 cho thấy đa số đều có phản ứng âm tính (-) trên môi trường tinh bột (trừ MN 7), nhưng khi nuôi cấy bề mặt trên gạo tấm đã qua hồ hóa bởi môi trường acid cho thấy nấm men đỏ n ày lại phát triển mạnh. Kết quả này được giải thích như sau một số vi sinh vật không đồng hóa tinh bột sống, nhưng lại phát triển tốt trên tinh bột chín. Gạo tấm khi hồ hóa bằng n ước có pH thấp tinh bột gạo đã bị thuỷ phân một phần thành các phân tử đơn giản hơn tạo thuận lợi cho hoạt động trao đổi chất của nấm men. Dựa vào hình 1 thấy (MN 10) Rh. glutinis HUI-1 có năng lực tích luỹ sinh khối trên môi trường nghiên cứu vượt các chủng khác , sự cách biệt so với Rhodotorula sp.1 (MN 1), (MN 5) Rh. graminis, Rhodotorula sp.3 (MN 12) là không nhiều nhưng sinh khối tế bào có sắc tố đỏ cam đậm. Chúng tôi chọn (MN 10) Rh. glutinis HUI-1 là chủng dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007274 Hình 1: So sánh khả năng tích luỹ sinh khối của 8 chủng phân lập đ ược trên môi trường gạo tấm đã qua hồ hoá, ở 27 - 280C và pH = 4,7 4. Xác định khoảng pH thích hợp của chủng (MN 10) Rh. glutinis HUI-1. Sử dụng chủng (MN 10) Rh. glutinis HUI-1 đã được lựa chọn, chúng tôi tiến hành chọn khoảng pH thích hợp trên môi trường gạo tấm đã qua hồ hóa có bổ sung dinh dưỡng. Kết quả hình 2 cho thấy khi nuôi cấy bán rắn trên gạo tấm đã qua hồ hóa cả 4 chủng nấm men nghiên cứu đều phát triển mạnh trong v ùng pH 4,5 - 5,5. Khi tăng pH môi trường ngay từ thời điểm đầu nhận thấy nấm men phát triển chậm, pha thích nghi kéo dài, sinh khối tế bào giảm dần, tới pH 7,0 sinh khối tế khô thu đ ược chỉ đạt 6,5g/ 1kg môi trường. Tiến hành làm thí nghiệm lên dốc trong vùng pH từ 4,5 - 5,5 chúng tôi nhận được giá trị pH cực đại là 5,3. Ở pH 5,3 nấm men (MN 10 ) Rh. glutinis HUI-1 phát triển cực đại, sinh khối có sắc tố đỏ cam, kết quả phù hợp với nghiên cứu trước đây của nhiều tác giả . (Páca và Votruba 1991, Prell et al. 1991, Sigler et al. 1983, Orndorff et al. US4677072). Hình 2: Ảnh hưởng của pH đến khả năng tích luỹ sinh khối của Rhodotorula sp.3 nuôi bán rắn ở 280C trên môi trường gạo tấm đã hồ hóa sau 7 ngày. 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 MN 1 MN 5 MN 7 MN 8 MN1 0 MN1 2 MN1 6 MN1 7 Chủng Si n h kh ối kh ô (g/ kg m ôi tr ư ờ n g) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 3.5 4.0 4.5 5 5.5 6.0 6.5 7.0 pHS in h kh ối k hô (g /k g m ôi tr ư ờn g) Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 275 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 50 100 150 200 250 300 Thời gian nuôi cấy (giờ) SK K g/ kg m ôi tr ư ờ n g Dry cell Protein 5. Xác định đường cong sinh trưởng (MN 10) Rh. glutinis HUI-1 ở pH = 5,3 của chủng Rhodotorula sp.3 nuôi bán rắn trên cơ chất là gạo tấm đã qua hồ hóa, ở nhiệt độ 27-280C. Tiến hành nuôi cấy bề mặt (MN 10) Rh. glutinis HUI-1 ở 27 - 280C trên môi trường gạo tấm đã qua hồ hóa có pH = 5.3 và không điều chỉnh pH trong suốt quá tr ình nuôi cấy. Sau 24 giờ lấy mẫu phân tích h àm lượng protein theo phương pháp Lowry đồng thời xác định sự thay đổi pH trong suốt quá tr ình nuôi cấy. Kết quả như hình 3: Hình 3:Sự hình thành sinh khối và protein hòa tan của Rhodotorula sp.3 ở 280C, pH = 5,3 trên môi trường tấm gạo đã hồ hóa sau 7 ngày. Sinh khối thu được sấy 600C cho đến khối lượng không đổi, xác định hàm lượng protein tổng, và hàm lượng chất béo cho kết quả: Sau 7 ng ày thu được 14,45g/kg môi trường. Sinh khối khô chứa 52,47g protein v à 28,68 g/100g sinh khối khô. KẾT LUẬN Kết quả khảo sát điều kiện và môi trường lên men bán rắn là:  Nhiệt độ nuôi: 27-28 0C.  Độ ẩm không khí (%): 38 - 40.  pH môi trường: 5,3  Độ ẩm cơ chất: 65-67%  Tỷ lệ giống: sử dụng lượng cấy giống trung b ình 8.107 - 10.107 CFU/ml/ 100g môi trường cho sản lượng sinh khối không thua kém g ì so với khi sử dụng lượng giống nhiều hơn (1.106 - 2.106 CFU/g môi trường).  Thành phần môi trường nuôi cấy gồm:  Gạo tấm đã nấu chín.  1% (khối lượng) bột đậu nành.  1% (ml/g) dầu ăn.  Khoáng chất (g/lit): NaNO3 = 2,55, MgSO4.7H2O = 0,75, K2HPO4 = 1,75, FeSO4 = 0,1, KCl = 1,5 cho thêm nư ớc cất vào đủ 1 lít. Sử dụng: 40 (% ml/g). Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007276  Hàm lượng protein hòa tan sau 7 ngày nuôi cấy đạt cực đại là: 2,53 g/kg. Sinh khối khô đạt cực đại là 14,45g/kg môi trường.  Hàm lượng chất béo và protein tổng sau 7 ngày nuôi cấy lần lượt là: 28,68% và 52,47 % chất khô.  Từ kết quả thu được bước đầu chúng tôi nhận thấy ph ương pháp nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula trên môi trường gạo tấm đã qua hồ hóa có thể đạt hiệu quả cao. Cần nghiên cứu thêm điều kiện tự phân nấm men để sử dụng toàn bộ sản phẩm thu được sau nuôi cấy bán rắn nhằm l àm tăng hàm lượng beta-carotene góp phần cải thiện dinh dưỡng cho gia súc, gia cầm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Phan Tú Anh - "Sinh tổng hợp sinh khối Rhodotorula gi àu Protein-Carotenoid"- Báo cáo tổng kết nghiệm thu đề tài chương trình vườn ươm sáng tạo KHKT trẻ - Sở Khoa học Công nghệ - Thành Đoàn Tp.HCM - Năm 2003. 2. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự -"Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh học "- NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội 1986, - trang 324. 3. Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Thị Minh Nguyệt - “Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Rhodotorula glutinis để thu nhận sinh khối giàu protein”- Tuyển tập các công trình khoa học 45 năm trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 2001, trang 188 -194. 4. Barnett J. A., Payne R. W., Yarrow D. - "Yeast- characteristics and identification" - Cambridge University Press, Cambridge - London - New York - Melbourne, 1990, pp. 70-71. 5. Bhosale P., Jogdant V. V, Grade R. V.- "Stability of -carotene in spray dried preparation of Rhodotorula glutinis mutant 32"- Journal of Applied Microbiology, September 2003, Vol.95 (3), pp.584. 6. Bong Kyum Kim, Pyoung Kyu Park, Hee Jeong Chae and Eui Yong Kim - “Effect of phenol on β-carotene content in total carotenoids production in cultivation of Rhodotorula glutinis”- Korean J. Chem. Eng., 2004, 21(3), 689 -692. 7. Buzzini Pietro, Martini Alessandro "Production of carotenoids by strains of Rhodotorula glutinis cultured in raw materials of agro -industrial origin"- Bioresource technology 71 (1999) 41 -44. 8. Buzzini Pietro -"Batch and fed batch carotenoid production by Rhodotorula glutinis -Debaryomyces castellii co -cultures in corn syrup"-Journal of Applied Microbiology 2001, 90, pp. 843-847. 9. Dufossé L.-“Microbiol production of food grade pigments” - Food Technol. Biotechnol. Vol. 44(3), 2006, pp. 313-321. 10. Frengova G. I., Emilina S. D., Beshkova D. M.- "Formation of carotenoids by Rhodotorula glutinis in whey ultrafitrate" - Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, Bulgarian Academic of Sciences, 1994. 11. Frengova G. I., Emilina S. D., Beshkova D. M.-"Carotenoid production by lactoso - negative yeast co-cultivated with lactic acid bacteria in whey ultrafiltrate" - Journal Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 277 of Applied Microbiology, Institute of Microbiology, Bulgarian Academic of Sciences, Bulgaria 2003, Vol. 58 (7-8), pp. 562-567. 12. Frengova Ginka, Emilina Simova, Dora Beshkova - "Use of Whey untrafiltrate as a substrate for production of carotenoid by the yeast Rhodotorula rubra" - World Journal of Microbiology and Biotechnology, Applied Biochemistry and Biotechnology, March 2004, Vol. 112, Issue 3, pp.133 -142. 13. Frengova Ginka, Emilina Simova, Dora Beshkova - "Beta-carotene-rich carotenoid- protein preparation and exopolysaccharide production by Rhodotorula rubra GED 8 grown a yogurt starter culture" - Journal of Industry Microbiology and Biotechnology , Applied Biochemistry and Biotechnology, ISSN 1367-5435, 2006, Vol.2, pp.572-577. 14. Hayman P. et al. - "Carotenoids bionsynthesisi in Rhodotorula glutinis" -Journal of bacterionlogy, American Society for Mi crobiology. Printed in U.S.A 1974, Vol.120, No.3, pp.1339-1343. 15. Iturriaga E. A., Papp T., Breum J., Arnau J., Eslava A.P. -“ Strain and culture condition improvement for -carotene production with Mucor. In: methods in biotechnology:Microbial processes and products”- J. L. Barredo (Ed), USA (2005), Vol. 18, pp. 239-256. 16. Jacob Z.-"Enrichment of wheat bran by Rhodotorula gracilis through solid -state fermentation"- Folia Microbiol (Praha), 1991, Vol.36 (1), pp. 86 -91. 17. Vani Saxena C. D., Sharma C. D., Bhagat S. D., Saini V. S. and Adhikari D. K.- "Lipid and fatty acid biosynthesis by Rhodotorula" -JAOCS Abstracts, April 1998, Vol.75(4), pp. 501-505. SUMMARY Studying som biological characteristics and the solid -state fermentation ability of some strains of red yeast Rhodotorula isolated from south Viet Nam Nguyễn Thị Minh Nguyệt (1), Đống Thị Anh Đ ào (2), Nguyễn Hữu Phúc (3) (1)Univ. Industry (2)Univ. Technology HCMCity (3)Institute of Tropical Biology Chosen 4 species of genus Rhodotorula were isolated from leaves, flowers and soils in South Viet Nam were grown in broken gr ain of ordinary rice (size 1- 2mm) which were starched by solid state method fo r receiving red yeast biomass. The medium component and culture condition medium of solid -state culture method were determined. Red yeast biomass were coloured from orange to red. Nutrition rate of enriched broken grain of ordinary rice product is higher than other researches. The result can be applied for Microbiol Production of Food grade pigments as well as supplement production for animal feed technology .