Đề tài Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của đàn gia cầm sau khi tiêm phòng vaccine cúm A/H5N1 tại tỉnh Nghệ An

rbin/Re-1/2003 (H5N1). - Vaccine Nobilis Influenza H5 (Hà Lan) tiêm cho gà: Đây là loại vaccine dị chủng: sử dụng chủng virus A/Chicken/Mexico/232/94/CPA (H5N2). 2.7. Miễn dịch chống virus cúm [14] 2.7.1. Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu Cũng giống như đối với các mầm bệnh khác, đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu là hàng rào phòng ngự đầu tiên ngăn cản sự xâm nhập của virus vào cơ thể. Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu (miễn dịch bẩm sinh) gồm phản ứng viêm, sự thực bào bị nhiễm virus, sốt, và sự sản sinh interferon có tác dụng hạn chế sự lây lan của virus tới các tế bào chưa bị nhiễm virus. * Các tế bào thực bào và bổ thể: Một khi virus đã xâm nhập vào cơ thể các tế bào thực bào gồm các tế bào trung tính, các tế bào monocyte và các tế bào đại thực bào sẽ được hoạt hóa và thực hiện các chức năng của chúng. Bổ thể cũng có tác dụng thúc đẩy quá trình thực bào các hạt virus. * Các cytokin (các interferon): Có 3 loại interferon: alpha (α), beta (β) và gamma (γ). Interferon α và β (còn gọi là các interferon type 1) là các cytokin được các tế bào bị nhiễm virus tiết ra. Chúng kết gắn với các thụ cảm quan đặc hiệu có trên các tế bào liền kề và bảo vệ các tế bào đó chống lại sự xâm nhiễm của virus. Các interferon tạo nên một phần hoặc tham gia một phần vào đáp ứng phòng hộ tức thì của vật chủ. Ngoài những tác dụng diệt virus trực tiếp đó, interferon α và β cũng thúc đẩy sự thể hiện các phân tử MHC loại I và loại II trên bề mặt các tế bào bị nhiễm virus và chính bằng cách này mà thúc đẩy sự trình diện các kháng nguyên virus tới các tế bào miễn dịch đặc hiệu. Sự có mặt của interferon α và β có thể được chứng minh trong dịch thể trong các pha nhiễm virus cấp tính. Interferon γ (còn được gọi là interferon miễn dịch) là một cytokin do tế bào CD4 TH - 1 tiết ra, chức năng của interferon γ là thúc đẩy các đáp ứng miễn dịch đặc hiệu qua trung gian tế bào T. Như vậy nếu như interferon type 1 tạo cho tế bào một "trạng thái kháng virus", đặc trưng bằng sự ức chế đối với cả sự nhân lên của virus và cả sự tăng sinh của tế bào thì interferon γ do các tế bào T đã được hoạt hóa sản sinh ra có khả năng cảm ứng sự tổng hợp các phân tử MHC loại I và chính các phân tử này làm cho các tế bào dễ dàng "được nhận biết" bởi các tế bào T gây độc tố với tế bào (Tc). Khi virus gây nhiễm tế bào bên cạnh đã được hoạt hóa, các protein kháng virus sẽ phát hiện các vật liệu thông tin di truyền ngoại lai. Các protein đó sẽ được hoạt hóa và ức chế quá trình nhân lên của virus bằng cách phân hủy (bẻ gãy) ARN thông tin và làm dừng quá trình tổng hợp protein. Các protein này làm cho các tế bào bị ngừng trệ và điều đó sẽ hạn chế sự nhân lên tiếp tục của virus và do đó hạn chế sự lây lan của virus sang các tế bào khác. Chính vào giai đoạn đình trệ này mà hệ thống miễn dịch có thời gian để huy động đáp ứng miễn dịch qua tế bào T. Cơ chế tác động của các interferon: Nâng cao hiệu quả của đáp ứng miễn dịch bằng cách thúc đẩy sự thể hiện các phân tử MHC loai I trên bề mặt của các tế bào bị nhiễm virus. Vì thế các interferon sẽ làm tăng cơ hội cho các tế bào T gây độc tế bào nhận biết và tiêu diệt các tế bào bị nhiễm. Tác dụng diệt virus trực tiếp: Làm thoái hóa ARNm của virus, ức chế quá trình sinh tổng hợp protein. Hệ quả của các tác dụng này là ngăn cản sự xâm nhiễm của virus vào các tế bào mới. * Các tế bào diệt tự nhiên (Natural Killer Cells): Là một nhóm các tế bào lâm ba cầu T, có nguồn gốc từ tủy xương, có mặt trong máu và các mô bào. Các tế bào NK có khả năng nhận biết và dung giải các tế bào bị nhiễm virus và một số loại tế bào ung thư. Khả năng này không đặc hiệu và không bị giới hạn bởi phân tử MHC nên chúng được gọi là các tế bào diệt tự nhiên. Các tế bào này không có các thụ cảm quan bề mặt đặc hiệu với kháng nguyên (TCR hoặc các thụ cảm quan immunoglobulin). Về mặt kiểu hình, các tế bào NK không có các chất đánh dấu (marker) bề mặt đặc trưng cho các tế bào T và các tế bào B và chính vì thế các tế bào NK là một dòng lâm ba cầu riêng biệt. Mặc dù không thể hiện tính đặc hiệu với kháng nguyên, chúng lại thể hiện ở một mức độ nào đó khả năng chọn lọc các tế bào "bất bình thường" để dung giải. Thuận lợi chủ yếu mà các tế bào NK có hơn các lâm ba cầu đặc hiệu với kháng nguyên về khả năng miễn dịch chống virus là ở chỗ nó không có pha ẩn của quá trình tăng sinh dòng tế bào khi được hoạt hóa nên các tế bào NK hoạt động ngay như là các tế bào thực hiện, còn các lâm ba cầu B và T đặc hiệu với kháng nguyên mất thời gian để tăng sinh rồi sau đó mới thực hiện chức năng. Vì thế các tế bào NK có thể có các hiệu quả sớm trong diễn biến nhiễm virus và có thể hạn chế sự lây lan virus trong giai đoạn sớm. Tế bào NK được hoạt hóa bởi IL-2 và nhất là IL-12 và tự giải phóng ra TNF-α và IFN-γ. Tế bào NK có thụ cảm quan đặc hiệu với mảnh Fc của phân tử IgG nên có khả năng dung giải tế bào đích thông qua hiện tượng gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity, ADCC): Trước hết kháng thể đặc hiệu gắn lên tế bào bị nhiễm virus, sau đó phức hợp này gắn lên tế bào NK thông qua thụ thể dành cho mảnh Fc, do đó tế bào NK có điều kiện tiếp cận với tế bào đích và tiêu diệt tế bào đích. * Các yếu tố "diệt virus cúm" khác: Đó là các IgA, α-defensin (1-3), các chất ức chế haemagglutinin, các acid béo không bão hòa và monoglycerid. 2.7.2. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Cả hai nhánh của đáp ứng miễn dịch thu được là đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào đều đóng vai trò là cơ chế thực hiện đặc hiệu trong miễn dịch chống virus. Các đáp ứng miễn dịch thông qua tế bào T và tế bào B đặc hiệu với kháng nguyên có thể được thực hiện bằng: Miễn dịch qua trung gian tế bào B, kết quả là quá trình sản xuất kháng thể đặc hiệu. Bào chế/ chuẩn bị và trình diện kháng nguyên thông qua các phân tử MHC loại I và MHC loại II. Miễn dịch tế bào chống virus với khả năng nhận biết kháng nguyên đặc hiệu của virus và kháng nguyên của các tế bào bị nhiễm virus, nhận biết phức hợp kháng nguyên - MHC và các tế bào đích/ tế bào bị nhiễm virus. Kháng thể: Nhìn chung các kháng thể đặc hiệu đóng vai trò then chốt trong đáp ứng phòng hộ chống lại nhiễm virus. Kháng thể được sản xuất tại chỗ là rất quan trọng trong bảo vệ các bề mặt niêm mạc và kháng thể lưu hành, chủ yếu là IgG có tác dụng bảo hộ toàn thân. Kháng thể sẽ tấn công virus trong tế bào bị nhiễm. IgG có thể nhận biết các tế bào bị nhiễm và hoạt hóa bổ thể. IgG có thể giao thoa, làm ảnh hưởng tới sự trao đổi chất của tế bào bị nhiễm virus. IgG có thể ngăn các virus bám vào các tế bào đích. Kháng thể hoạt động tích cực trong các pha ban đầu của quá trình nhiễm virus. Kháng thể có thể ngăn cản sự tái nhiễm của cùng một loại virus. Loại kháng thể có hiệu quả nhất trong tác dụng diệt virus là kháng thể trung hòa. Đây là loại kháng thể gắn với virus mà thường là vỏ ngoài của virus hoặc vỏ protein capsid bên trong và chúng phong bế sự gắn kết của virus vào màng tế bào và đi vào tế bào vật chủ. Trong quá trình nhiễm virus kháng thể phát huy tác dụng mạnh nhất vào giai đoạn sớm trước khi virus xâm nhập được vào tế bào đích của nó. Về mặt này kháng thể tương đối không có hiệu quả trong các trường hợp nhiễm virus nào đó lần đầu tiên, chủ yếu là do pha ẩn của quá trình sản xuất kháng thể. Tuy nhiên, các kháng thể đã được hình thành từ trước, đặc biệt là các kháng thể trung hòa là dạng có hiệu quả của miễn dịch phòng hộ chống lại các virus. Có thể nói kháng thể là yếu tố phòng thủ đầu tiên chống lại các mầm bệnh ngoại bào với ba cách chính như sau: Trung hòa: Bằng cách kết gắn với mầm bệnh hoặc kết gắn với các chất ngoại lai, các kháng thể có thể ngăn cản sự tiếp xúc của mầm bệnh với tế bào đích của chúng. Phức hợp kháng nguyên - kháng thể sau đó bị các tế bào đại thực bào "nuốt" và phân hủy. Kháng thể sau khi gắn vào kháng nguyên làm cho kháng nguyên này dễ dàng bị các tế bào thực bào gồm đại thực bào và các tế bào Leucocyte nhân đa hình thái nhân điện là ngoại lai. Các tế bào thực bào sẽ tiêu hóa kháng nguyên và phá hủy kháng nguyên. Opsonin hóa: Sự kết gắn của kháng thể vào một mầm bệnh hay một chất ngoại lai có thể opsonin hóa chúng và tạo điều kiện thuận lợi cho các tế bào thực bào nuốt và tiêu hủy mầm bệnh hoặc vật liệu ngoại lai. Vùng Fc của kháng thể tương tác với các thụ cảm quan Fc trên tế bào thực bào và điều đó làm cho mầm bệnh càng dễ bị thực bào. Hoạt hóa bổ thể: Sự hoạt hóa từng nấc của bổ thể nhờ kháng thể có thể dẫn đến sự dung giải virus. Thêm vào đó, một số thành phần giáng hóa của bổ thể (ví dụ C3b) có tác dụng opsonin hóa các mầm bệnh và tạo điều kiện thuận lợi cho các tế bào thực bào "nuốt" chúng dễ dàng thông qua các thụ cảm quan bổ thể có trên các tế bào đó. Các tế bào T gây độc tế bào (Cytotoxic T Cells): Các tế bào thực hiện chính tham gia vào quá trình làm sạch các virus đã thâm nhập vào tế bào là các tế bào lâm ba cầu T gây độc tế bào (Cytotoxic T Lymphocyte, CTL) CD8+ đặc hiệu với virus. Các tế bào này nhận biết các kháng nguyên nói chung và trong trường hợp kháng nguyên virus chính là các kháng nguyên được tổng hợp bên trong nhân tế bào hoặc trong cytosol. Và những kháng nguyên này đã được phân giải và trình diện trên bề mặt tế bào bị nhiễm. Kháng nguyên được trình bày trên bề mặt tế bào dưới dạng các peptid ngắn liên kết với các phân tử MHC loại I. Tuy nhiên không phải tất cả các đáp ứng CTL đều có lợi cho vật chủ mà trong một số trường hợp tổn thương mô bào do CTL đặc hiệu đối với virus gây ra lớn hơn các tổn thương do nhiễm virus gây nên. Cơ chế hoạt động của tế bào t gây độc tế bào: Vì virus không có bộ máy tổng hợp và chuyển hóa riêng nên chúng phải khu trú trong tế bào và lợi dụng tế bào để tái tạo. Do virus phát triển trong tế bào chất nên tránh được tác dụng của kháng thể, vì vậy virus chỉ bị tiêu diệt khi giết chết tế bào bị nhiễm virus. Trong trường hợp này tế bào TCD8 gây độc đóng vai trò quan trọng vì nó có thể giết chết một cách có chọn lọc các tế bào bị nhiễm này. Sự biệt hóa từ tiền Tc thành tế bào Tc có thể gây độc trực tiếp cần có 2 tín hiệu: Tín hiệu 1: Tế bào T nhận diện phức hợp kháng nguyên - MHC loại I trên tế bào trình diện kháng nguyên hoặc tế bào đích. Tín hiệu 2: cytokin do tế bào TCD4 tiết ra (IL-6, IL-2, IFN-γ) khi nó nhận diện được kháng nguyên trên tế bào trình diện kháng nguyên. Để loại bỏ các tế bào bị nhiễm virus mà không làm hủy hoại tế bào lành, tế bào TCD8 chỉ giết chết một cách có chọn lựa những tế bào đích đã bộc lộ kháng nguyên đặc hiệu mà thôi. Tế bào TCD8 gây độc cũng sản sinh IFN-γ và cả TNF-α để kìm hãm sự nhân lên của virus, làm tăng sự bộc lộ các phân tử MHC loại I và hoạt hóa tế bào đại thực bào. PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là gà và vịt nuôi tại tỉnh Nghệ An đã được tiêm phòng vaccine cúm A/H5N1. 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian nghiên cứu: Từ ngày 6/1/2010 đến ngày 9/5/2010. - Địa điểm nghiên cứu: Cơ quan thú y vùng III, thành phố Vinh, Nghệ An. 3.3. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của đàn gà và đàn vịt sau khi tiêm phòng vaccine đợt 1 và đợt 2. - So sánh tỷ lệ bảo hộ giữa gà và vịt sau khi tiêm phòng vaccine. - Đáp ứng miễn dịch ở gà và vịt theo quy mô chăn nuôi sau tiêm phòng vaccine. 3.4. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất * Nguyên liệu Kháng nguyên đông khô virus cúm A, chủng H5N1: Inactivated antigen A/ck/Scot/59, được nhập từ công ty Veterinary Laboratories Agency (Anh). Hồng cầu: Hồng cầu của gà trống khoẻ mạnh, chưa tiêm phòng vaccine cúm gia cầm và Newcastle được pha loãng trong dung dịch PBS có pH= 7,2 thành hỗn dịch hồng cầu 0,5 %. * Thiết bị và dụng cụ: Thiết bị: Tủ lạnh -20oC, tủ lạnh 4oC, nồi hấp khử khuẩn, máy ly tâm. Dụng cụ: Pipet 1ml, 5ml, 10ml; Multichannel pipet 30 - 300µl, 20 - 200µl; Micropipet 10µl-100µl, 100µl-1000µl; đầu típ các loại, syringe nhựa 5ml; kim tiêm G25; ống eppendorf; ống falcon; lọ 50ml, 100ml, 200ml; ống nghiệm, que hematocrit; máng nhựa; giấy thấm; khăn thấm, đĩa 96 lỗ (đáy chữ V), phích đá. * Hóa chất và các dung dịch cần thiết: Dung dịch PBS 0,01M, pH=7,2 Nước sinh lý 0,85% Dung dịch Natri citrate 5% Cồn sát trùng. 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu 3.4.2.1. Chuẩn bị hỗn dịch hồng cầu gà 0,5% * Phương pháp lấy máu: Dùng bơm tiêm 5ml hút sẵn 1ml (10% thể tích) dung dịch chống đông Natri citrate 5%. Sát trùng, sau đó tiến hành lấy máu ở tĩnh mạch cánh gà. Cho máu vào ống nghiệm. * Rửa hồng cầu: Ly tâm 1000 - 1500 vòng/phút, trong 15 phút, đổ bỏ huyết tương, cho thêm nước sinh lý (NaCl 0,85%) vào hồng cầu, lắc đều. Ly tâm như trên 3 - 4 lần để rửa hồng cầu. Sau lần ly tâm cuối bỏ nước ở trên. * Pha hồng cầu 0,5% (sử dụng trong phản ứng HA và HI): Dùng Micropipet hút 1ml hồng cầu đã rửa trên cho vào ống thuỷ tinh có sẵn 199ml PBS, lắc đều được hỗn dịch hồng cầu 0.5%. Dung dịch hồng cầu 0,5% có thể giữ được trong khoảng 1 tuần ở 40C. Hồng cầu dung huyết phải loại bỏ. 3.4.2.2. Chuẩn bị huyết thanh Cách lấy mẫu: Dùng syringer lấy 1ml máu ở tĩnh mạch cánh cho vào ống eppendoft, để nghiêng ống 450, để ở nhiệt độ phòng hoặc tủ lạnh 40C (1 đến 2 giờ) cho máu đông, sau đó ly tâm chắt huyết thanh. Nếu không sử dụng huyết thanh ngay thì bảo quản ở 40C trong vòng 1 tuần, nếu bảo quản lâu hơn nên giữ ở -200C cho đến khi thực hiện phản ứng. Xử lý huyết thanh: Đối với huyết thanh của một số loại gia cầm như: gà, chim, chim cút có thể không cần xử lý, vì mức độ thấp hoặc không phát hiện được ức chế không đặc hiệu. Nhưng đối với huyết thanh của thủy cầm (vịt, ngan, ngỗng...) thì trước khi thực hiện phản ứng HI cần phải được xử lý để loại trừ khả năng ức chế không đặc hiệu và hiện tượng ngưng kết giả. Vì trong huyết thanh của các loại gia cầm này có các phần tử không phải là kháng thể (ví dụ: acid sialic) nhưng có khả năng bám vào các điểm tiếp nhận của hồng cầu gây hiện tượng ngưng kết hồng cầu giả, làm phản ứng ngăn trở không đặc hiệu và kết quả trong phản ứng chẩn đoán bệnh cúm sai lệch. Có nhiều phương pháp xử lý huyết thanh khác nhau như phương pháp sử dụng enzyme phá hủy điểm tiếp nhận (RDE), phương pháp hấp phụ hồng cầu đặc (hồng cầu 10%). Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp xử lý bằng nhiệt. Phương pháp xử lý như sau: Huyết thanh trước khi làm phản ứng đem ủ ở nhiệt độ 560C trong 30 phút. 3.4.2.3. Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) Cho 1 ml PBS vào lọ kháng nguyên đông khô lắc trộn đều để hoàn nguyên kháng nguyên. Sau đó thực hiện phản ứng HA để chuẩn độ kháng nguyên. Trên cơ sở kết quả của phản ứng HA pha kháng nguyên làm việc bằng 4 đơn vị HA. * Phản ứng HA: Cho 25µl PBS vào các giếng từ A1 - A12, B1 - B12. Cho 25µl kháng nguyên cúm gia cầm vào giếng A1, B1. Pha loãng kháng nguyên bằng cách dùng micropipet trộn đều và chuyển 25µl từ giếng A1, B1 sang giếng A2, B2 và tuần tự đến giếng A11, B11 thì bỏ đi 25µl. Các giếng A12, B12 dùng để đối chứng (gồm hồng cầu và PBS). Thêm 25µl hồng cầu 0,5% vào tất cả các giếng, lắc nhẹ. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Đọc kết quả: Hiệu giá của kháng nguyên được tính ở độ pha loãng cao nhất mà vẫn còn hiện tượng ngưng kết hồng cầu. - Pha kháng nguyên làm việc 4 đơn vị HA: Lấy hiệu giá HA của kháng nguyên nhân với 4 ta có tỷ lệ để pha kháng nguyên 4 HA. Ví dụ: Hiệu giá HA của kháng nguyên là 1/256 thì ta pha kháng nguyên đó với tỷ lệ 1/64 (1/256 x 4 = 1/64) để được kháng nguyên 4HA. Kiểm tra kháng nguyên làm việc 4 đơn vị HA: Yêu cầu kháng nguyên 4HA dùng cho phản ứng HI phải chuẩn, kết quả mới chính xác và không bị sai lệch. Vì vậy, sau khi pha, kháng nguyên 4HA phải được chuẩn độ lại. Các bước tiến hành như sau: Cho 25µl PBS vào các giếng từ A1 – A5, B1 – B5. Cho 25µl kháng nguyên 4HA đã pha vào các giếng A1, B1. Pha loãng kháng nguyên theo cấp số 2 từ hàng A1, B1 đến hàng A4, B4 rồi bỏ đi 25µl; A5 và B5 là các giếng đối chứng (gồm hồng cầu và PBS). Thêm 25µl hồng cầu 0,5% vào tất cả các giếng A1 – A5, B1 – B5, lắc nhẹ. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Đọc kết quả: Kháng nguyên đạt 4HA nếu ngưng kết hồng cầu đến giếng thứ 2. Nếu ngưng kết đến giếng thứ 3 là kháng nguyên đặc nên cần phải thêm PBS, nếu chỉ ngưng kết đến giếng thứ 1 là kháng nguyên loãng nên cần phải thêm kháng nguyên đậm đặc vào. Sau đó tiến hành chuẩn độ lại kháng nguyên 4HA theo các bước như trên. 3.4.2.4. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) Cho 25µl PBS vào tất cả các giếng của đĩa 96 giếng (trừ A1-H1). Cho 50µl huyết thanh cần kiểm vào tất cả các giếng của cột đầu tiên (A1-H1). Pha loãng huyết thanh theo cơ số 2 bằng cách dùng micropipet trộn đều và chuyển 25µl huyết thanh từ cột 1 sang cột 2 và tuần tự đến cột 11 thì bỏ đi 25µl cuối cùng. Cho 25µl kháng nguyên 4HA vào tất cả các giếng từ cột 1 đến cột 11. Thêm 25µl PBS vào cột đối chứng dương (cột 12): gồm hồng cầu và PBS. Lắc đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút. Cho 50µl dung dịch hồng cầu 0,5% vào tất cả các giếng, lắc đều. Để đĩa ở nhiệt độ phòng 30 phút. Đọc kết quả: Kết quả dương tính (+) khi hồng cầu tụ ở đáy giếng. Hiệu giá kháng thể được tính ở độ pha loãng cao nhất của huyết thanh mà vẫn còn hiện tượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu. Kết quả âm tính (-) nếu có hiện tượng ngưng kết hồng cầu ở đáy giếng. 3.5. Phương pháp xử lý số liệu Số mẫu có hiệu giá kháng thể ≥ 4log2 x 100 Tỷ lệ bảo hộ (%) = Tổng số mẫu xét nghiệm Giá trị trung bình nhân (GMT) được tính theo công thức: GMT = (T1 x T2 x T3x ...x Tn)1/n Trong đó: T1, T2, T3, ... , Tn là hiệu giá kháng thể của các mẫu huyết thanh xét nghiệm, n là số mẫu. Công thức này được viết dưới dạng logarit như sau: GMT = 2log2GMT Mẫu huyết thanh âm tính được gán cho giá trị log2T = -1 vì mẫu dương tính ở lỗ không pha loãng có log2T = 0 (tức 20 = 1). * So sánh hai giá trị ta dùng hàm phân bố χ2: Với mức ý nghĩa α, nếu χ2thực nghiệm ≥ χ2α thì tỷ lệ quan sát là khác nhau và ngược lại. Khoảng tin cậy của tỷ lệ được xác định theo bài giảng thống kê sinh vật học và phương pháp nghiên cứu khoa học (Nguyễn Minh Hoàn, 2002). PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của gia cầm sau tiêm phòng vaccine cúm A/H5N1 đợt 1 Gà vịt sau tiêm phòng 21 ngày được lấy máu để kiểm tra hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI). Qua đó đánh giá kết quả bảo hộ của vaccine trên đàn gia cầm của tỉnh. 4.1.1. Kết quả đánh giá khả năng miễn dịch ở gà Kết quả kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch trên gà sau tiêm phòng đợt 1 được trình bày ở bảng 1. Kết quả ở bảng 1 cho thấy gà nuôi ở các địa phương thuộc tỉnh Nghệ An có đáp ứng miễn dịch với vaccine cúm A/H5N1. Trong tổng số 600 mẫu kiểm tra có 418 mẫu có đáp ứng miễn dịch, trong đó 370 mẫu có hiệu giá kháng thể đạt mức bảo hộ ≥4log2, chiếm tỷ lệ 61,67%. Giá trị trung bình nhân (GMT) chung cho toàn tỉnh là 9,46. Tuy nhiên khả năng đáp ứng miễn dịch của gà, đặc biệt là tỷ lệ bảo hộ sau tiêm phòng, là không đồng đều giữa các huyện. Ở huyện Diễn Châu có 28/60 mẫu huyết thanh có hiệu giá kháng thể ≥ 4log2, chiếm tỷ lệ 46,67%, GMT là 3,56. Các số liệu tương ứng đối với các huyện khác là: Nghi Lộc: 101/150, 67,33%, và 12,01. Hưng Nguyên: 27/30, 90,00%, và 21,61. Đô Lương: 50/60, 83,33%, và 39,85. Nam Đàn: 46/90, 51,11%, và 5,08. Nghĩa Đàn: 93/150, 62%, và 9,8. Thanh Chương: 25/60, 41,67, và 4,81. Theo Tô Long Thành (2007) [15] đàn gia cầm đạt tỷ lệ bảo hộ là đàn có ≥70% số cá thể có hiệu giá kháng thể ≥ 4log2. Như vậy trong tất cả các huyện của tỉnh Nghệ An thì chỉ có Hưng Nguyên (90,00%) và Đô Lương (83,33%) là có tỷ lệ bảo hộ ở đàn gà đạt yêu cầu theo quy định. Còn các huyện khác đều có đàn gà chưa đạt mức bảo hộ cần thiết, trong đó Thanh Chương là địa phương có tỷ lệ bảo hộ thấp nhất (41,67%). Bảng 1: Kết quả kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của gà sau khi tiêm phòng vaccine cúm A/H5N1 đợt 1 Huyện n n+ Phân bố hiệu giá kháng thể (log2) Tỷ lệbảo hộ (%) GMT -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Diễn Châu 60 35 25 0 3 2 2 20 5 0 3 0 0 0 46,67 3,56 Nghi Lộc 150 118 32 0 6 6 5 36 24 26 4 10 1 0 67,33 12,01 Hưng Nguyên 30 30 0 0 0 1 2 14 11 1 0 1 0 0 90,00 21,61 Đô Lương 60 55 5 0 2 1 2 10 5 13 11 6 4 1 83,33 39,85 Nam Đàn 90 52 38 0 2 2 2 10 21 13 2 0 0 0 51,11 5,08 Nghĩa Đàn 150 99 51 0 1 4 1 8 36 26 19 4 0 0 62,00 9,80 Thanh Chương 60 29 31 0 1 2 1 4 6 0 9 4 2 0 41,67 4,81 Tổng 600 418 182 0 15 18 15 102 108 79 48 25 7 1 61,67 9,46 Chú thích: n: Số mẫu xét nghiệm n+: Số mẫu có kháng thể GMT: Giá trị trung bình nhân hiệu giá kháng thể Kết quả ở bảng 1 cũng cho thấy khả năng đáp ứng miễn dịch đối với vaccine cúm là không đồng đều giữa các cá thể, đối với các mẫu huyết thanh có phản ứng HI dương tính thì mức phân bố hiệu giá dao động từ 1log2 đến 10log2. Điều này là do khả năng đáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: cơ địa, tuổi, giống, tình trạng sức khỏe, chế độ dinh dưỡng, chăm sóc quản lý, ... của cá thể được tiêm vaccine. Giá trị trung bình nhân của hiệu giá kháng thể (GMT) ở các huyện cũng rất khác nhau, cao nhất là ở huyện Đô Lương với GMT = 39,85, thấp nhất là Diễn Châu (GMT chỉ đạt 3,56). Trong tổng số 600 mẫu huyết thanh kiểm tra thì có 182 mẫu không phát hiện có kháng thể, chiếm 30,33%. Trong đó có một đàn gà của huyện Nam Đàn và một đàn gà của huyện Nghĩa Đàn theo hồ sơ chứng nhận là đã được tiêm phòng 2 mũi vaccine nhưng không có mẫu nào dương tính với phản ứng HI. Điều này có thể lý giải rằng đàn gà chưa được tiêm phòng và công tác giám sát sau tiêm phòng đã không chặt chẽ. Sự phân bố hiệu giá kháng thể trong quần thể gà đạt mức bảo hộ (370 mẫu có hiệu giá ≥ 4log2) được thể hiện như sau: Ở 4log2: 102 mẫu chiếm 27,57% Ở 5log2: 108 mẫu chiếm 29,19% Ở 6log2: 79 mẫu chiếm 21,35% Ở 7log2: 48 mẫu chiếm 12,97% Ở 8log2: 25 mẫu chiếm 6,76% Ở 9log2: 7 mẫu chiếm 1,89% Ở 10log2: 1 mẫu chiếm 0,27%. Qua phân tích trên ta thấy hiệu giá kháng thể chủ yếu phân bố ở mức 4log2 và 5log2. Như vậy có thể nói rằng tỷ lệ bảo hộ đàn thấp là do tỷ lệ tiêm phòng chưa đạt, tiêm không hết số lượng so với tổng đàn và có những đàn chưa được tiêm phòng. Điều này là do người dân chưa ý thức sâu sắc mức độ nguy hiểm của dịch bệnh, còn chủ quan, lơ là trong công tác phòng chống dịch, tiêm phòng cho đàn gia cầm chỉ là biện pháp đối phó của một bộ phận lớn người dân. Một số người cho rằng đàn gia cầm chỉ cần tiêm phòng một lần là đủ chứ họ không biết rằng sau 6 tháng khả năng đáp ứng miễn dịch của đàn gia cầm giảm và cần phải tiêm phòng nhắc lại hoặc một số lại sợ rằng tiêm phòng sẽ gây giảm đẻ, gây xáo động đàn…vì vậy họ đã không tiêm. Ngoài ra do hình thức chăn nuôi chủ yếu là gà thả vườn, quy mô nhỏ, chưa được quy hoạch và quản lý chặt chẽ nên gặp khó khăn trong công tác tiêm phòng. Do không quản lý được số lượng và khó bắt giữ nên nếu như không được sự đồng tình thực hiện một cách có ý thức trách nhiệm cao của người dân thì việc bỏ sót một số lượng lớn gia cầm so với tổng đàn là khó tránh khỏi. Nguyên nhân tiếp theo cũng có thể là do kỹ thuật tiêm phòng và bảo quản vaccine không đúng nên đã làm ảnh hưởng đến chất lượng tiêm phòng. 4.1.2. Kết quả đánh giá khả năng miễn dịch ở vịt Kết quả kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch trên đàn vịt nuôi tại các huyện của tỉnh Nghệ An được trình bày ở bảng 2. Qua bảng 2 ta thấy: Khi kiểm tra 180 mẫu huyết thanh vịt lấy ở huyện Yên Thành thì có 146 mẫu có hiệu giá kháng thể đạt mức bảo hộ ≥ 4log2, chiếm tỷ lệ 81,11%, với GMT là 32. Các chỉ số về tỷ lệ bảo hộ và GMT ở các huyện còn lại như sau: Diễn Châu: 45,00% và 5,53. Nghi Lộc: 68,33% và 11,99. Hưng Nguyên: 52,22% và 11,94. Đô Lương: 100% và 40,32. Nghĩa Đàn: 96,67% và 35,1. Thanh Chương 20,00% và 2,14. Riêng huyện Nam Đàn thì toàn bộ 60 mẫu huyết thanh kiểm tra đều không phát hiện có hiệu giá kháng thể. Như vậy, trong tổng số 8 huyện có lấy mẫu kiểm tra giám sát sau tiêm phòng thì huyện Đô Lương có tỷ lệ bảo hộ ở đàn vịt đạt mức cao nhất (100%), tiếp đến là Nghĩa Đàn với tỷ lệ bảo hộ 96,67%, Yên Thành (81,11%). Các huyện còn lại gồm Nghi Lộc, Diễn Châu, Hưng Nguyên, Nam Đàn, Thanh Chương đều chưa đạt mức bảo hộ đàn. Trong đó, tỷ lệ bảo hộ trên đàn vịt ở Nam Đàn là 0% và Thanh Chương là chỉ 20%. Trong tổng số 600 mẫu huyết thanh có 176 mẫu âm tính với phản ứng HI (29,33%) và 424 mẫu dương tính (70,67%), trong đó có 353 mẫu có hiệu giá kháng thể đạt mức bảo hộ. Trong số 353 mẫu đạt mức bảo hộ, phân bố các hiệu giá kháng thể như sau: 79 mẫu 4log2 chiếm 22,38%, 98 mẫu 5log2 chiếm 27,76%, 85 mẫu 6log2 chiếm 24,08%, 51 mẫu 7log2 chiếm 14,45%, 29 mẫu 8log2 chiếm 8,22%, 8 mẫu 9log2 chiếm 2,27%, và 3 mẫu có hiệu giá kháng thể 10log2 chiếm 0,85%. Như vậy, hiệu giá kháng thể của huyết thanh vịt trong đợt 1 chủ yếu phân bố ở mức 5log2, 6log2 và 4log2. GMT của đàn vịt trong đợt 1 chỉ đạt 10,03. Huyện n n+ Phân bố hiệu giá kháng thể (log2) Tỷ lệbảo hộ (%) GMT -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Yên Thành 180 157 23 0 1 3 7 16 33 43 35 11 5 3 81,11 32,00 Diễn Châu 120 73 47 0 7 5 7 13 19 10 0 10 2 0 45,00 5,53 Nghi Lộc 60 48 12 0 1 4 2 16 11 5 9 0 0 0 68,33 11,99 Hưng Nguyên 90 72 18 0 2 5 18 9 15 8 6 8 1 0 52,22 11,94 Đô Lương 30 30 0 0 0 0 0 18 8 4 0 0 0 0 100,00 40,32 Nam Đàn 60 0 60 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,00 0,50 Nghĩa Đàn 30 29 1 0 0 0 0 6 8 14 1 0 0 0 96,67 35,10 Thanh Chương 30 15 15 0 3 3 3 1 4 1 0 0 0 0 20,00 2,14 Tổng 600 424 176 0 14 20 37 79 98 85 51 29 8 3 58,83 10,03 Bảng 2: Kết quả kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của vịt sau khi tiêm phòng vaccine cúm A/H5N1 đợt 1 Chú thích: n: Số mẫu xét nghiệm n+: Số mẫu có kháng thể GMT: Giá trị trung bình nhân hiệu giá kháng thể Mặc dù một số huyện có tỷ lệ bảo hộ và giá trị trung bình nhân hiệu giá kháng thể đạt khá cao, trong khi ở một số huyện tỷ lệ này lại rất thấp, thậm chí là 0% dẫn tới tỷ lệ bảo hộ chung của cả tỉnh chỉ đạt 58,83%, chưa đạt mức bảo hộ cần thiết theo quy định. Kết quả này có thể là do một số nguyên nhân sau: - Vịt chủ yếu được nuôi theo hình thức chạy đồng và theo thời vụ nên đã gây khó khăn cho công tác tiêm phòng. Một số huyện như Nam Đàn, Thanh Chương còn chưa quản lý được chăn nuôi thuỷ cầm nên tỷ lệ tiêm phòng còn thấp so với tổng đàn, thậm chí là không tiêm phòng. Ngoài ra còn có hiện tượng nhập đàn mới chưa được tiêm phòng vào đàn đã tiêm để có giấy tiêm phòng. - Kỹ thuật tiêm phòng không đúng. - Quá trình bảo quản vaccine không đảm bảo làm cho chất lượng vaccine bị ảnh hưởng. 4.2. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của gia cầm sau tiêm phòng vaccine cúm A/H5N1 đợt 2 4.2.1. Kết quả đánh giá khả năng miễn dịch ở gà Kết quả giám sát sau tiêm phòng đợt 2 trên gà được trình bày ở bảng 3. Nhìn vào bảng 3 ta thấy: Hiệu giá kháng thể của gà nuôi trên địa bàn tỉnh Nghệ An sau tiêm phòng đợt 2 có cao hơn đợt 1 nhưng vẫn chưa đạt mức cần thiết theo quy định. Tỷ lệ gà có kháng thể sau tiêm phòng đợt 2 là 74,44% (402 mẫu), GMT là 11,96, tỷ lệ bảo hộ đạt 64,63% (349 mẫu). Các số liệu của đợt 1 tương ứng là 69,67%, 9,46 và 61,67%. Tỷ lệ gà được bảo hộ và giá trị trung bình nhân hiệu giá kháng thể cũng khác nhau giữa các huyện: - Với đàn gà của huyện Diễn Châu, 36,67% (11/30 mẫu) có hiệu giá kháng thể đạt mức bảo hộ theo quy định, GMT = 4,29. Các số liệu trên ở các huyện còn lại tương ứng là: Thanh Chương: 73,33% (66/90 mẫu), 13,51. Nghi Lộc: 36,67% (11/30 mẫu), 5,16. Hưng Nguyên: 58,33% (35/60 mẫu), 9,62. Nam Đàn: 90% (108/120 mẫu), 39,17. Nghĩa Đàn: 98,33% (118/120 mẫu), 64. Đô Lương: 90/90 mẫu huyết thanh kiểm tra đều không phát hiện có kháng thể. Bảng 3: Kết quả kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của gà sau khi tiêm phòng vaccine cúm A/H5N1 đợt 2 Huyện n n+ Phân bố hiệu giá kháng thể (log2) Tỷ lệbảo hộ (%) GMT -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Diễn Châu 30 22 8 0 3 3 5 9 1 1 0 0 0 0 36,67 4,29 Thanh Chương 90 78 12 0 4 3 5 27 23 13 1 1 1 0 73,33 13,51 Nghi Lộc 30 17 13 0 1 4 1 1 1 4 2 2 1 0 36,67 5,16 Hưng Nguyên 60 48 12 0 3 5 5 11 13 8 1 2 0 0 58,33 9,62 Nam Đàn 120 118 2 0 1 1 8 36 20 15 25 8 3 1 90,00 39,17 Nghĩa Đàn 120 119 1 0 0 1 0 3 24 54 34 2 1 0 98,33 64,00 Đô Lương 90 0 90 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,00 0,50 Tổng 540 402 138 0 12 17 24 87 82 95 63 15 6 1 64,63 11,96 Chú thích: n: Số mẫu xét nghiệm n+: Số mẫu có kháng thể GMT: Giá trị trung bình nhân hiệu giá kháng thể Như vậy huyện Nghĩa Đàn và Nam Đàn là các huyện có tỷ lệ gà có hiệu giá kháng thể ≥4log2 đạt mức cao nhất, tương ứng là 98,33% và 90,00%. Bên cạnh đó lại có những huyện chưa đạt mức bảo hộ cần thiết như Diễn Châu, Thanh Chương, Nghi Lộc, Hưng Nguyên, Đô Lương. Trong đó thấp nhất là Đô Lương (0%), tiếp đến là Nghi Lộc và Diễn Châu (36,67%). Cũng tương tự như vậy, Nghĩa Đàn và Nam Đàn là 2 huyện có giá trị trung bình nhân hiệu giá kháng thể đạt cao nhất tương ứng là 64 và 39,17. Các huyện còn lại có giá trị GMT đạt được còn thấp, trong đó ngoài Đô Lương thì Diễn Châu và Nghi Lộc là các huyện có giá trị GMT đạt được thấp nhất, tương ứng là 4,29 và 5,16. Trong tổng số 349 mẫu có hiệu giá kháng thể đạt mức bảo hộ theo quy định thì 24,93% có hiệu giá kháng thể là 4log2 (87 mẫu); 23,50% là 5log2 (82 mẫu); 27,22% là 6log2 (95 mẫu); 18,05% là 7log2 (63 mẫu); 4,39% là 8log2 (15 mẫu); 1,72% là 9log2 (6 mẫu) và 0,29% là 10log2 (1 mẫu). Qua đó ta thấy hiệu giá kháng thể của huyết thanh gà trong đợt 2 chủ yếu phân bố ở mức 6log2, và ở các mức 4log2, 5log2 cũng phân bố với tỷ lệ khá cao. Trong tổng số 540 mẫu huyết thanh kiểm tra hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng đợt 2 ở tỉnh Nghệ An có 138 mẫu không có đáp ứng miễn dịch với vaccine cúm A/H5N1, chiếm tỷ lệ 25,56%. Với tỷ lệ khá cao mẫu huyết thanh nghiên cứu không có kháng thể như vậy thì nguy cơ mắc bệnh cúm gia cầm trên đàn gà của tỉnh là rất lớn. Khả năng đáp ứng miễn dịch thấp hoặc không có khả năng đáp ứng miễn dịch, dẫn tới tỷ lệ bảo hộ và giá trị GMT trên đàn gà của tỉnh sau tiêm phòng đợt 2 vẫn chưa đạt theo yêu cầu là do vẫn chưa khắc phục được những khó khăn và hạn chế như đã trình bày ở trên. 4.2.2. Kết quả đánh giá khả năng miễn dịch ở vịt Kết quả kiểm tra mẫu huyết thanh sau tiêm phòng đợt 2 của vịt được ghi nhận ở bảng 4. Bảng 4 cho thấy khả năng đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng đợt 2 của vịt được nuôi trên địa bàn tỉnh Nghệ An rất thấp, tỷ lệ bảo hộ chung trên đàn vịt của tỉnh chỉ đạt 42,12%, GMT chỉ đạt 3,95. Điều này có nghĩa là còn 57,88% số vịt trên địa bàn nghiên cứu không được bảo hộ với virus cúm A/H5N1 và như vậy nguy cơ mắc bệnh của đàn vịt là rất cao. Nguy hiểm hơn, số vịt này sẽ là nguồn lưu trữ và phát tán virus ra môi trường làm ô nhiễm môi trường. Vì vậy nguy cơ xảy ra dịch trên địa bàn tỉnh Nghệ An là rất lớn. Bảng 4: Kết quả kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của vịt sau khi tiêm phòng vaccine cúm A/H5N1 đợt 2 Huyện n n+ Phân bố hiệu giá kháng thể (log2) Tỷ lệbảo hộ (%) GMT -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Diễn Châu 150 30 120 0 4 8 12 2 2 1 1 0 0 0 4,00 0,86 Nghi Lộc 90 72 18 0 6 7 7 15 18 11 5 1 1 1 57,78 10,16 Hưng Nguyên 60 53 7 0 1 2 3 18 12 10 3 3 1 0 78,33 18,59 Nam Đàn 60 51 9 0 3 3 5 26 13 1 0 0 0 0 66,67 8,98 Nghĩa Đàn 60 60 0 0 0 0 1 37 11 9 2 0 0 0 98,33 23,70 TP Vinh 90 88 2 0 0 4 3 19 3 40 9 0 0 0 78,89 29,40 Yên Thành 120 6 114 0 0 0 3 0 0 3 0 0 0 0 2,50 0,60 Đô Lương 30 0 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,00 0,50 Tổng 660 360 300 0 14 24 44 117 59 75 20 4 2 1 42,12 3,95 Chú thích: n: Số mẫu xét nghiệm n+: Số mẫu có kháng thể GMT: Giá trị trung bình nhân hiệu giá kháng thể Tuy nhiên, tỷ lệ bảo hộ và giá trị trung bình nhân hiệu giá kháng thể trên vịt ở các huyện là không giống nhau. Tỷ lệ bảo hộ đạt cao nhất là ở Nghĩa Đàn với 98,33%, tiếp đến là thành phố Vinh (78,89%) và Hưng Nguyên (78,33%). Các huyện còn lại tỷ lệ bảo hộ còn chưa đạt yêu cầu quy định, trong đó thấp nhất là Đô Lương (0%), tiếp đến là Yên Thành (2,50%) và Diễn Châu (4,00%). Giá trị trung bình nhân hiệu giá kháng thể đạt cao nhất là thành phố Vinh với 29,40, tiếp đến là Nghĩa Đàn với 23,70. Ngoài Đô Lương thì GMT thấp nhất là ở Yên Thành (0,60) và Diễn Châu với GMT = 0,86. Sự phân bố hiệu giá kháng thể trong quần thể vịt có đáp ứng miễn dịch với vaccine cúm A/H5N1 dao động từ 1log2 đến 10log2. Trong tổng số 660 mẫu huyết thanh kiểm tra có 278 mẫu có hiệu giá kháng thể đạt ngưỡng bảo hộ cần thiết, sự phân bố của các hiệu giá kháng thể như sau: 42,09Conaio4444444444444% có hiệu giá kháng thể đạt 4log2 (117 mẫu); 21,22% đạt 5log2 (59 mẫu); 26,98% đạt 6log2 (75 mẫu); 7,19% đạt 7log2 (20 mẫu); 1,44% đạt 8log2 (4 mẫu); 0,72% đạt 9log2 (2 mẫu) và có 0,36% có hiệu giá kháng thể đạt 10log2 (1 mẫu). Như vậy hiệu giá kháng thể chủ yếu phân bố ở mức 4log2, các mức khác phân bố thấp hơn. Khả năng đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng đợt 2 của đàn vịt thấp hơn đợt 1 (tỷ lệ bảo hộ ở đợt 2 là 42,12% và đợt 1 là 58,83%; GMT ở đợt 2 là 3,95, đợt 1 là 10,03) là do công tác giám sát gia cầm sau tiêm phòng chưa chặt chẽ, tỷ lệ tiêm phòng thấp so với tổng đàn, còn nhiều gia cầm, nhiều huyện chưa tiêm phòng như Diễn Châu có đến 3/5, Yên Thành 3/4 đàn, Đô Lương 1/4 đàn. Ngoài ra có thể còn do chất lượng tiêm phòng chưa đạt, kỹ thuật tiêm phòng của thú y cơ sở chưa đúng, tiêm chưa đủ số mũi quy định và chưa đủ liều, lấy mẫu không đúng thời gian quy định, quá trình bảo quản vaccine không đảm bảo kỹ thuật dẫn đến chất lượng vaccine bị ảnh hưởng, chế độ dinh dưỡng cho đàn vịt không đảm bảo, việc chăm sóc và nuôi dưỡng chưa được chú trọng làm ảnh hưởng đến sức khỏe của vịt dẫn đến khả năng đáp ứng miễn dịch thấp. 4.3. So sánh tỷ lệ bảo hộ giữa gà và vịt sau tiêm phòng vaccine cúm A/H5N1 Kết quả so sánh tỷ lệ bảo hộ sau tiêm phòng vaccine cúm A/H5N1 giữa gà và vịt được thể hiện ở bảng 5 và biểu đồ 1. Bảng 5: Kết quả tổng hợp khả năng đáp ứng miễn dịch ở gà và vịt sau tiêm phòng vaccine cúm A/H5N1 đợt 1 và đợt 2 Đợt kiểmtra Loài Số mẫu kiểm tra Phân bố hiệu giá kháng thể (log2) Tỷ lệbảo hộ (%) -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 Gà 600 182 0 15 18 15 102 108 79 48 25 7 1 61,67 Vịt 600 176 0 14 20 37 79 98 85 51 29 8 3 58,83 2 Gà 540 138 0 12 17 24 87 82 95 63 15 6 1 64,63 Vịt 660 300 0 14 24 44 117 59 75 20 4 2 1 42,12 Kết quả tổng hợp ở bảng 1 cho thấy: Ở đợt 1: Trong tổng số 600 mẫu huyết thanh gà được lấy để kiểm tra hiệu giá kháng thể có 370 mẫu có hiệu giá ≥ 4log2, đạt tỷ lệ bảo hộ là 61,67%. Đối với vịt tỷ lệ này là 58,33% (353/600 mẫu). Ở đợt 2: Đối với mẫu huyết thanh gà: Có 349/540 mẫu có hiệu giá kháng thể ≥ 4log2, chiếm tỷ lệ 64,63%. Tỷ lệ này trên mẫu huyết thanh vịt là 42,12% (278/660 mẫu). Nhìn vào biểu đồ ta thấy, tỷ lệ bảo hộ của gà ở cả 2 đợt đều cao hơn so với vịt. Ở đợt 1 sự chênh lệch là không lớn, chỉ 2,84% (vịt 58,83%, gà 64,63%). Ở đợt 2 có sự chênh lệch rất rõ (chênh lệch 22,51%), cụ thể là vịt 42,12%, gà 64,63%. Song để kiểm tra sự sai khác này có ý nghĩa về mặt thống kê hay không chúng tôi đã sử dụng hàm phân phối χ2 . Qua tính toán chúng tôi thấy: Ở đợt 1: χ2 = 1,01, với mức ý nghĩa α = 0,05 thì χ2 (0,05) = 3,84. Vậy χ2 < χ2 (0,05) nên sự khác nhau giữa tỷ lệ bảo hộ của gà và vịt trong đợt 1 là không có ý nghĩa thống kê. Ở đợt 2: χ2 = 60,31, với mức ý nghĩa α = 0,001 thì χ2 (0,001) = 10,83. Vậy χ2 > χ2 (0,001) nên sự khác nhau về tỷ lệ bảo hộ của gà và vịt trong đợt 2 là có ý nghĩa, với mức ý nghĩa α = 0,001. Tỷ lệ bảo hộ của vịt thấp hơn gà là do những nguyên nhân sau: - Người dân thường nuôi vịt để tận dụng thời vụ, thời vụ nuôi vịt thường chỉ khoảng 60 ngày nên người chăn nuôi chủ quan, không tiêm phòng. Vì vậy đã có nhiều đàn không được tiêm phòng. - Công tác quản lý ấp nở, nuôi mới thủy cầm còn lỏng lẻo, chưa được quan tâm. - Ngoài ra còn có thể do kỹ thuật tiêm phòng không đúng, ví dụ như: tiêm cho vịt phải tiêm vào cơ ức thì lại tiêm vào gáy, khi tiêm xong phải thả vịt vào chỗ mát nghỉ ngơi nhưng lại thả vịt ra mương. Tỷ lệ bảo hộ của đàn thuỷ cầm thấp là nguy cơ lớn về dịch bệnh cúm gia cầm trên địa bàn tỉnh Nghệ An. Đây là một trong những nguyên nhân làm cho dịch cúm gia cầm vẫn bùng phát trở lại ở Nghệ An trong những năm qua. 4.4. Đáp ứng miễn dịch ở gà và vịt theo quy mô chăn nuôi sau tiêm phòng vaccine cúm A/H5N1 Để tìm hiểu xem quy mô chăn nuôi có ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của gà và vịt hay không, dựa vào quy mô chăn nuôi thực tế chúng tôi phân thành các loại sau: - Quy mô nhỏ: dưới 200 con - Quy mô vừa: Từ 200 - 500 con - Quy mô lớn: Trên 500 con Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể theo quy mô chăn nuôi được trình bày ở bảng 6: Bảng 6: Đánh giá khả năng miễn dịch của gà và vịt sau tiêm phòng theo quy mô chăn nuôi Quy mô(con) Gà Vịt Số mẫu kiểm tra Số mẫubảo hộ Tỷ lệbảo hộ (%) GMT Số mẫu kiểm tra Số mẫubảo hộ Tỷ lệbảo hộ (%) GMT < 200 210 79 37,62 3,22 270 112 41,48 4,54 200 - 500 390 291 74,62 16,91 210 135 64,29 13,21 >500 - - - - 120 106 88,33 36,97 Qua bảng 6 ta thấy: * Đối với gà: - Ở đàn gà quy mô < 200 con: Trong tổng số 210 mẫu huyết thanh được lấy từ các đàn gà được nuôi theo quy mô nhỏ có 79 mẫu có hiệu giá kháng thể đạt mức bảo hộ (chiếm 37,62%), với GMT là 3,22. Phân bố của các hiệu giá kháng thể đạt ngưỡng bảo hộ như sau: Ở 4log2: 26 mẫu, 5log2: 21mẫu, 6log2: 18 mẫu, 7log2: 7 mẫu, 8log2: 7 mẫu, 9log2: 0 mẫu, 10log2: 0 mẫu. Như vậy, sự phân bố hiệu giá kháng thể ở đàn gà quy mô < 200 con chủ yếu tập trung ở mức 4log2 và 5log2. - Ở đàn gà quy mô từ 200-500 con: Có 291 mẫu huyết thanh có hiệu giá kháng thể ≥ 4log2 trong tổng số 390 mẫu kiểm tra (chiếm 74,62%), GMT là 16,91. Sự phân bố hiệu giá kháng thể trong quần thể gà đạt ngưỡng bảo hộ như sau: Ở 4log2: 76 mẫu, 5log2: 87 mẫu, 6log2: 61 mẫu, 7log2: 41 mẫu, 8log2: 18 mẫu, 9log2: 7 mẫu, 10log2: 1 mẫu. Như vậy, sự phân bố hiệu giá kháng thể ở đàn gà quy mô 200-500 con chủ yếu tập trung ở mức 4log2 và 5log2. Phân bố cũng khá cao ở 6 log2 . - Quy mô đàn gà trên 500 con có số mẫu xét nghiệm là 0. Qua phân tích trên cho thấy, đàn gà có quy mô vừa có tỷ lệ bảo hộ (74,62%) và giá trị trung bình nhân hiệu giá kháng thể (16,91) cao hơn đàn gà nuôi theo quy mô nhỏ (có tỷ lệ bảo hộ là 37,62% và GMT = 3,22). * Đối với vịt: - Ở đàn vịt có quy mô nhỏ (< 200 con): Có 112/270 mẫu có hiệu giá kháng thể đạt mức bảo hộ, chiếm tỷ lệ 41,48%, GMT là 4,54. Các hiệu giá kháng thể đạt ngưỡng bảo hộ phân bố như sau: Ở 4log2: 34 mẫu, 5log2: 38 mẫu, 6log2: 23 mẫu, 7log2: 5 mẫu, 8log2: 11 mẫu, 9log2: 1 mẫu, 10log2: 0 mẫu. Như vậy sự phân bố hiệu giá kháng thể ở đàn vịt quy mô < 200 con chủ yếu tập trung ở mức 4log2 và 5log2. - Ở đàn vịt có quy mô vừa (200 - 500 con): Có 135/210 mẫu xét nghiệm có hiệu giá kháng thể đạt ngưỡng bảo hộ, đạt tỷ lệ bảo hộ là 64,29%, GMT là 13,21. Phân bố của các hiệu giá kháng thể đạt ngưỡng bảo hộ như sau: Ở 4log2: 29mẫu, 5log2: 32 mẫu, 6log2: 26 mẫu, 7log2: 27 mẫu, 8log2: 15 mẫu, 9log2: 4 mẫu, 10log2: 2 mẫu. Như vậy sự phân bố các hiệu giá kháng thể khá đồng đều và tập trung nhiều hơn ở mức 5log2. - Ở đàn vịt có quy mô lớn (trên 500 con): Trong tổng số 120 mẫu xét nghiệm có 106 mẫu có hiệu giá kháng thể đạt mức bảo hộ, chiếm tỷ lệ 88,33%, GMT là 36,97. Sự phân bố các hiệu giá kháng thể đạt bảo hộ như sau: Ở 4log2: 16 mẫu, 5log2: 28 mẫu, 6log2: 36 mẫu, 7log2: 19 mẫu, 8log2: 3 mẫu, 9log2: 3 mẫu, 10log2: 1 mẫu. Như vậy sự phân bố hiệu giá kháng thể ở đàn vịt quy mô trên 500 con chủ yếu tập trung ở mức 5log2 và 6log2, cũng phân bố khá cao ở 7log2. Qua kết quả so sánh tỷ lệ bảo hộ của vịt theo quy mô chăn nuôi ta thấy: Đàn vịt được nuôi theo quy mô nhỏ, tỷ lệ bảo hộ đàn và giá trị trung bình nhân hiệu giá kháng thể là thấp nhất (tỷ lệ bảo hộ chỉ đạt 41,48%, GMT chỉ đạt 4,54). Cao nhất là đàn vịt được nuôi theo quy mô lớn (tỷ lệ bảo hộ đạt 88,33% và GMT đạt 36,97). Kết quả trên nói lên rằng quy mô nuôi có ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch ở gà và vịt. Tỷ lệ gà và vịt được bảo hộ ở quy mô vừa và lớn cao hơn gà và vịt được nuôi theo quy mô nhỏ. Sự khác biệt này có thể do gà, vịt nuôi theo quy mô nhỏ thì hầu hết là đàn gà, vịt thả vườn của các hộ gia đình với số lượng ít, chăn nuôi ở đây chủ yếu là với mục đích tự cung, tự cấp, một phần nhỏ là mục đích kinh tế. Vì vậy, người dân chưa quan tâm nhiều đến việc chăm sóc, nuôi dưỡng và phòng bệnh cho gia cầm. Chế độ dinh dưỡng cho đàn gia cầm không đảm bảo, đặc biệt là khẩu phần protein. Điều đó đã làm giảm khả năng đáp ứng miễn dịch của gia cầm. Công tác tiêm phòng cho đàn gia cầm cũng gặp nhiều khó khăn, vì vậy tỷ lệ gia cầm được tiêm phòng trong cùng một đàn thường thấp. Ngoài ra lọ vaccine đóng chai với liều khá lớn (500liều/ lọ) mà với số lượng gia cầm/ hộ ít nên sau khi mở nắp lọ vaccine phải sử dụng trong thời gian dài hơn, việc bảo quản vaccine trong quá trình tiêm lại chưa được đảm bảo nên hiệu lực của vaccine bị giảm. Còn đối với đàn gà, vịt được nuôi theo quy mô lớn hơn thì thường chủ yếu là vì mục đích kinh tế nên có sự đầu tư về kỹ thuật hơn, việc chăm sóc được tốt hơn, chế độ dinh dưỡng được đảm bảo hơn, người chăn nuôi cũng hiểu biết hơn, ý thức cao hơn về sự nguy hiểm của dịch bệnh (thiệt hại do dịch bệnh gây ra cho đàn gia cầm có quy mô lớn sẽ lớn hơn nhiều so với đàn gia cầm có quy mô nhỏ). Vì vậy họ ý thức hơn trong vấn đề phòng bệnh cho đàn gia cầm. Ngoài ra với số lượng đàn gia cầm lớn công tác tiêm phòng sẽ thuận lợi hơn, tỷ lệ gia cầm được tiêm/đàn cao hơn, thời gian sử dụng lọ vaccine ngắn nên hiệu quả của công tác tiêm phòng đạt được cao hơn. PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ những kết quả đạt được trong quá trình nghiên cứu chúng tôi có một số kết luận sau: - Tỷ lệ bảo hộ và đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng trên đàn gia cầm của tỉnh Nghệ An trong cả 2 đợt tiêm phòng của năm 2009 là khá thấp: + Đối với gà: Đợt 1: Tỷ lệ bảo hộ là 61,67%, GMT = 9,46. Đợt 2: Tỷ lệ bảo hộ là 64,63%, GMT = 11,96. + Đối với vịt: Đợt 1: Tỷ lệ bảo hộ là 58,83%, GMT = 10,03. Đợt 2: Tỷ lệ bảo hộ là 42,12%, GMT = 3,95. - Tỷ lệ bảo hộ ở vịt thấp hơn ở gà. - Quy mô nuôi có ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch ở gà và vịt: gà, vịt nuôi với quy mô vừa và lớn có tỷ lệ bảo hộ và giá trị trung bình nhân hiệu giá kháng thể cao hơn quy mô nhỏ. + Đối với gà: Quy mô lớn: Không có mẫu huyết thanh được kiểm tra. Quy mô vừa: Tỷ lệ bảo hộ là 74,62% , GMT = 16,91. Quy mô nhỏ: Tỷ lệ bảo hộ là 37,62%, GMT = 3,22. + Đối với vịt: Quy mô lớn: Tỷ lệ bảo hộ là 88,33% , GMT = 36,97. Quy mô vừa: Tỷ lệ bảo hộ là 64,29% , GMT = 13,21. Quy mô nhỏ: Tỷ lệ bảo hộ là 41,48%, GMT = 4,54. 5.2. Đề nghị Qua quá trình nghiên cứu và tìm hiểu tình hình thực tế ở các địa phương chúng tôi có một số kiến nghị sau: - Cần tiếp tục cho thực hiện đề tài này hàng năm trên các địa phương khác để có biện pháp phòng chống dịch cúm gia cầm hiệu quả hơn. - Tỷ lệ bảo hộ trên đàn gia cầm ở một số huyện trên địa bàn tỉnh Nghệ An rất thấp. Vì vậy cần tổ chức tiêm phòng nhắc lại cho những đàn gia cầm đó đồng thời tiến hành tiêm phòng bổ sung cho những đàn gia cầm mới nhập. - Tổ chức tốt hơn công tác tiêm phòng và nâng cao chất lượng tiêm phòng. - Giám sát chặt chẽ đàn gia cầm sau tiêm phòng và quản lý các đàn gia cầm nuôi mới. - Tăng cường tuyên truyền, nâng cao ý thức của người chăn nuôi về công tác tiêm phòng. - Tập huấn, nâng cao tay nghề cho đội ngũ thú y cơ sở. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1]. Bùi Quang Anh, Văn Đăng Kỳ, Bệnh cúm gia cầm: Lưu hành bệnh, chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XI, số 3, 2004, 69 - 75. [2]. Trần Hữu Cổn, Bùi Quang Anh, Bệnh cúm ở gia cầm và biện pháp phòng chống, NXB Nông Nghiệp - Hà Nội, 2004, 8 - 33. [3]. Ban chỉ đạo quốc gia phòng chống dịch cúm gia cầm, Sổ tay giám sát bệnh cúm gia cầm, NXB Nông Nghiệp - Hà Nội, 2007, 11 - 12. [4]. Bùi Bá Bổng, Bùi Quang Anh, Trần Kim Anh, Lê Văn Bầm, Trương Văn Dung, Phạm Văn Đông, Đậu Ngọc Hào, Văn Đăng Kỳ, Hoàng Văn Năm, Lê Thị Kim Oanh, Nguyễn Thanh Sơn, Cẩm nang phòng chống bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao (H5N1), NXB Nông Nghiệp - Hà Nội, 2007, 5 - 9, 25 - 30. [5]. Trương Văn Dung, Những kết quả đã đạt được về bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XV, số 4, 2008, 5 - 8. [6]. Nguyễn Tiến Dũng, Vài nét về virus cúm gia cầm H5N1, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XV, số 4, 2008, 80 - 86. [7]. Marie Edan, Thomas Delquigny, Hoàng Hải Hóa, Patrice Gautier, Điều tra dịch tễ, NXB Nông Nghiệp - Hà Nội, 2007, 18. [8]. Marie Edan , Thomas Delquigny, Hoàng Hải Hóa, Patrice Gautier, Chẩn đoán cúm gia cầm, NXB Nông Nghiệp - Hà Nội, 2007, 8 - 21, 27 - 28. [9]. Trần Xuân Hạnh, Một vài vấn đề phòng bệnh virus cúm gia cầm bằng vaccine, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XI, số 3, 2004, 84 - 85. [10]. Trần Thị Hoài, Thông tin chăn nuôi - thú y - Hội chăn nuôi Thừa Thiên Huế, 2003, 30 - 31. [11]. Văn Đăng Kỳ, Diễn biến tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam và những giải pháp phòng chống, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XV, số 4, 2008, 87 - 89. [12]. Lê Văn Năm, Kết quả khảo sát các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể bệnh cúm gia cầm ở một số cơ sở chăn nuôi các tỉnh phía Bắc, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XI, số 3, 2004, 87 - 89. [13]. Phạm Hồng Sơn, Nghiên cứu tạo kháng nguyên ngưng kết hồng cầu gián tiếp gắn virus cúm A và vận dụng mới trong chẩn đoán bệnh cúm ở gia cầm, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XVI, số 2, 2009, 12 - 22. [14]. Tô Long Thành, Miễn dịch chống virus, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XVI, số 2, 2009, 77 - 89. [15]. Tô Long Thành, Các loại vaccine cúm gia cầm và đánh giá hiệu quả tiêm phòng, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XIV, số 2, 2007, 84 - 90. [16]. Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó, Bệnh cúm H5N1 ở gà và chim, NXB Lao động, Hà Nội, 2006. [17]. Tin khoa học kỹ thuật về cúm gia cầm, Tại sao virus cúm có tính lây nhiễm cao hơn ở nhiệt độ lạnh mùa đông?, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XV, số 4, 2008, 92 - 93. [18]. Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương, Các phương pháp chẩn đoán, xét nghiệm bệnh cúm gia cầm, NXB Nông Nghiệp - Hà Nội, 2004, 5, 33 - 38. [19]. Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương, Tài liệu giám sát bệnh cúm gia cầm, NXB Nông Nghiệp - Hà Nội, 2004, 5 - 7. Các trang web tiếng việt [20]. Cục thú y, 2009. Báo cáo dịch cúm gia cầm và các biện pháp phòng dịch. . [21]. Cục thú y, 2005, Quy trình chẩn đoán bệnh cúm gia cầm. [22]. [23]. Nguyễn Quốc Bình, Vũ Thủy Tiên, Thông tin chung và hướng giải pháp về vaccine cúm gia cầm. TrungtmcngnghsinhhcThnhPhHChMinh_htm.zip - ZIP archive, unpacked size 12,681 bytes [24]. Le Thanh Hoa Tổng quan về virus cúm A/H5N1: vấn đề dịch tễ học, tiến hóa, hình thành genotype và tương đồng kháng nguyên-miễn dịch-vaccine. Institute of Biotechnology [25]. [26]. Phát hiện virus cúm gia cầm lây nhiễm trên chó. [27]. Tình hình dịch bệnh gia súc, gia cầm năm 2008 và các biện pháp phòng chống dịch năm 2009. [28]. Tổng đàn gia cầm và đàn lợn tăng trưởng khá [29]. H.Y (2005), Dịch cúm gia cầm ở Việt Nam. Các trang web tiếng Anh [30]. Tien Dung Nguyen, The Vinh Nguyen, Dhanasekaran Vijaykrishna, Robert G. Webster, Yi Guan, J.S. Malik Peiris and Gavin J.D. Smith (2008), Multiple sublineages of Influenza A virus (H5N1), Vietnam, 2005-2007. [31]. Jennifer L Mckimm-Breschkin, Paul W. Selleck, Tri Bhakti Usman, and Michael A Johnson, Reduced sensitivity of Influenza A (H5N1) to Oseltamivir. [32]. Avian Influenza-Highly Pathogenic (HPAI), Fowl Plague. MỤC LỤC Trang TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1: Kết quả kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của gà sau khi tiêm phòng vaccine cúm A/H5N1 đợt 1 41 Bảng 2: Kết quả kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của vịt sau khi tiêm phòng vaccine cúm A/H5N1 đợt 1 44 Bảng 3: Kết quả kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của gà sau khi tiêm phòng vaccine cúm A/H5N1 đợt 2 46 Bảng 4: Kết quả kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của vịt sau khi tiêm phòng vaccine cúm A/H5N1 đợt 2 48 Bảng 5: Kết quả tổng hợp khả năng đáp ứng miễn dịch ở gà và vịt 50 Bảng 6: Đánh giá khả năng miễn dịch của gà và vịt sau tiêm phòng 52 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Các dạng hình thái khác nhau dưới kính hiển vi điện tử (A), mô hình cấu tạo hạt virus (B), cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A 11 Hình 2: Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A trong tế bào chủ 14 Hình 3. Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của virus cúm A. 18 Lời cảm ơn Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này cũng như hoàn thành khóa học 5 năm qua, bản thân em đã nhận được sự dìu dắt, dạy bảo tận tình của quý thầy cô giáo khoa Chăn nuôi - Thú y nói riêng và Trường đại học Nông lâm nói chung. Đặc biệt là thầy giáo Th.S Trần Quang Vui đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài. Em xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó! Em cũng xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, cán bộ công chức của Cơ quan thú y vùng III đã hết lòng giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho em thực hiện đề tài trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Mặc dù đã có nhiều cố gắng nhưng do kiến thức, năng lực cũng như kinh nghiệm nghiên cứu của bản thân còn hạn chế, thời gian thực tập không nhiều nên không thể tránh khỏi những sai sót. Kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến của quý thầy cô giáo và các bạn để khóa luận tốt nghiệp được hoàn thiện hơn. Xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực tập HOÀNG THI MAI