Đề tài Đánh giá sự biến đổi hoạt độ enzym của hỗn hợp Papain và Amylase dạng bột và dạng dung dịch trong điều kiện lão hoá cấp tốc

-1,6-glucosidase) và amylo-1,6-glucosidase. Các endoamylase thuỷ phân các liên kết glucosid bên trong của chuỗi polysaccharid. - Exoamylase:gồm b-amylase và g-amylase, là những enzym thuỷ phân tinh bột từ các đầu cuối không khử của chuỗi polysaccharid. v Đặc điểm của một số amylase: c a-amylase (a-1,4-glucan-4-glucanohydrolase, EC.3.2.1.1) a-amylase là enzym có khả năng thuỷ phân tinh bột, amylose amylopectin, glycogen, dextrin, là một endoenzym, có ở nước bọt và dịch tuỵ và cả ở máu, tham gia thuỷ phân tiêu hoá tinh bột một phần ở miệng, phần lớn là tiêu hoá tinh bột ở ruột non. a-amylase cũng được phân lập từ hầu hết các động vật, các hạt nảy mầm và một số loài nấm như Aspergillus oryzae, hoặc từ một số loại vi khuẩn không gây bệnh như Bacillus subtilis. * Cơ chế tác dụng: a-amylase có khả năng phân cắt các liên kết a-1,4-glucosid của cơ chất một cách ngẫu nhiên, tạo nên hỗn hợp gồm 70 - 90% maltose, một lượng nhỏ D-glucose và các a-dextrin giới hạn phân tử lượng thấp (gồm 4 - 8 phân tử glucose và chứa một hoặc hơn một liên kết a-1,6- glucosid). Các liên kết a-1,6-glucosid trong chuỗi polysaccharid không bị phá vỡ bởi enzym này. Các giai đoạn của quá trình thuỷ phân tinh bột của a-amylase: - Giai đoạn dextrin hoá: a-amylase Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp (4-8 liên kết glucosid) - Giai đoạn đường hoá: a-amylase Dextrin tetra- và trimaltose di- và monosaccharid a-amylase † Tổng quát : Amylose oligosaccharid polyglucose (di và monosaccharid) Maltose maltotriose maltotetrose Khả năng dextrin hoá của a-amylase rất cao, do đó người ta còn gọi a-amylase là amylase dextrin hoá hay amylase dịch hoá. * Tính chất: a-amylase là một protein phức tạp có chứa Ca2+. a-amylase có nguồn gốc khác nhau, thường có thành phần acid amin không hoàn toàn giống nhau và mỗi loại a-amylase từ một nguồn gốc cũng thường có một tổ hợp các acid amin đặc hiệu riêng. Thành phần chung của các a-amylase có chứa nhiều tyrosin, trytophan, acid glutamic và acid aspartic. Các acid amin có tính acid là glutamic và aspartic chiếm khoảng 1/4 lượng acid amin của phân tử enzym, nhưng ngược lại, a-amylase có rất ít methionin và chỉ có 7 – 10 gốc cystein. Các a-amylase có nguồn gốc khác nhau cũng có KLPT rất khác nhau: a-amylase từ tuỵ động vật có KLPT là 4500 Da, trong khi đó a-amylase từ Bacillus subtilis có tác dụng giống a-amylase từ tuỵ động vật mà KLPT lại gấp đến 2 lần là 9900 Da [4], [6]. Nhìn chung, a-amylase có một số đặc tính như: + Protein của a-amylase có tính acid yếu; dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và cồn thấp độ. + Điểm đẳng điện của a-amylase nằm trong vùng pH 4,2 - 5,7 [3]. + a-amylase là một metaloenzym, mỗi phân tử a-amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam Ca/mol. Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc ba của enzym, duy trì hoạt động của enzym [4]. + Hoạt động của a-amylase được hoạt hoá bởi ion Cl-, bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+... pH tối thích là 6,9 (a-amylase động vật); 4,7 - 5,4 (a-amylase thực vật – mầm lúa); 5,0 - 6,0 (a-amylase vi khuẩn Bacillus subtilis) [3]. + Độ bền nhiệt của các a-amylase nguồn gốc khác nhau cũng không giống nhau, các a-amylase nấm men và vi khuẩn bền với nhiệt hơn các a-amylase động vật và thực vật [4]. c b-amylase (a-1,4-glucan–maltohydrolase, EC.3.2.1.2) b-amylase là enzym thuỷ phân tinh bột, hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là ở hạt nảy mầm. b-amylase xúc tác sự thuỷ phân cắt từng phân tử maltose khỏi đầu không khử của chuỗi polysaccarid bằng cách phân cắt liên kết a-1,4-glucosid. KLPT của b-amylase là 152.000 Da và 215.000 Da, bị ức chế bởi iodoazobenzoat, iodoacetamid, ascorbat, các kim loại nặng như Ag+, Hg2+, Cu2+, các thuốc thử có chứa nhóm –SH. pH tối thích 4,0 – 5,0 [4]. b-amylase chịu nhiệt kém hơn a-amylase nhưng bền với acid hơn, bị bất hoạt ở nhiệt độ 70oC [4]. c g-amylase (glucoamylase, a-1,4-glucan-4-glucanohydrolase, EC.3.2.1.3) g-amylase là enzym này có khả năng thuỷ phân liên kết a-1,4 lẫn a-1,6 glucosid. Khi thuỷ phân liên kết a-1,4-glucosid trong chuỗi polysaccharid, glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch polysaccharid. Ngoài các liên kết a-1,4 và a-1,6 glucosid, glucoamylase còn có khả năng thuỷ phân các liên kết a-1,2 và a-1,3 glucosid. Do đó, glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin, dextrin, maltose... thành glucose mà không cần có sự tham gia của các loại amylase khác [4]. pH tối thích của glucoamylase nằm trong vùng acid nhẹ là 4,0-5,0 và cũng có loại glucoamylase có pH tối thích nằm trong vùng trung tính khoảng 6,0-7,5 [4]. v ứng dụng: Với vai trò là enzym có tác dụng thuỷ phân polysaccharid, amylase đã được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt may, y tế và nhiều lĩnh vực kinh tế khác. Trong công nghiệp thực phẩm để làm lỏng tinh bột, nấu rượu bia, chế tạo bánh kẹo. Trong Y Dược, dùng để chế tạo glucose, dextrin uống và tiêm truyền, dùng làm thuốc chữa rối loạn tiêu hoá, bổ trợ tiêu hoá cho nhiều đối tượng khác nhau. Đặc biệt, gần đây người ta dùng amylase để hoá lỏng thức ăn nhằm tăng đậm độ dinh dưỡng trên một thể tích thức ăn cho trẻ em SDD. Ngoài ra, cũng đã có những ý tưởng sử dụng amylase nhằm mục đích chống viêm và phù nề mặc dù những ý tưởng đó vẫn còn phải được chứng minh trong thực tế. 1.1.2. Papain Papain [EC.3.4.1.21] là một trong các enzym thuỷ phân protein có nguồn gốc thực vật được nghiên cứu nhiều về tính chất và cơ chế hoạt động. Papain chủ yếu được tách chiết từ nhựa quả đu đủ xanh của cây đu đủ Carica papaya L. (Caricaceae). a- Cấu tạo hoá học: Papain là một endoprotease có chứa 16,1%N và 1,2%S [4]. Phân tử enzym có 212 acid amin trong đó không chứa methionin, khối lượng phân tử 23400 Da. Mạch polypeptid của Papain có đầu tận amin là isoleucin, đầu tận carboxyl là asparagin, phân tử có 3 liên kết disulfua (S-S) được tạo bởi 6 gốc cystein và một nhóm –SH (sulfhydryl) tự do ở vị trí 25, các liên kết này không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc [4]. Thành phần chính của papain chưa hoạt hoá là hỗn hợp protein cystein disulfid. Khi hoạt hoá papain bằng KCN sẽ giải phóng ra nhóm thiol của phân tử enzym và b-thiocyanatalanin do sự tương tác giữa cyanid và cystein. Sau đó, b-thiocyanatalanin khép vòng tạo thành a-iminothiazolidin. Khi có không khí, cơ chế trên xảy ra theo chiều ngược lại tạo thành sản phẩm không hoạt hoá. Quá trình hoạt hoá papain không làm thay đổi cấu trúc không gian của nó [4]. N+H3 CºN papa in papa in N+H3 COO- ắSắSắCH2ắCH ắSH + S CH2-CH COO- Papain hoạt động CN- hoạt hoá b-thiocyanatalanin O2 HC-NH2 S NH COO- H2C CH a-iminothiazolidin Hình1: Sơ đồ cơ chế hoạt hoá papain bằng cyanid b- Cấu trúc không gian của papain: Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước của các trục chính trong cấu trúc không gian 3 chiều là: 36´48´36, mạch polypeptid chính bị gấp khúc thành hai phần riêng biệt tạo nên một “hốc đặc biệt”. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của “khe” này, nhóm sulfhydryl hoạt động của cystein 25 nằm bên trái “khe” và nhóm histidin 159 nằm bên phải “khe”. Phần có cấu trúc xoắn a chiếm khoảng 20% toàn bộ acid amin có trong phân tử [4]. c- Hoạt tính enzym và cơ chế tác dụng: Đặc điểm quan trọng nhất của papain là khả năng thuỷ phân protein đến tận acid amin. Papain thuỷ phân protein thành các polypeptid và các acid amin, đóng vai trò vừa như một endopetidase vừa như một exopeptidase [4]. R R R R Các endopeptidase thuỷ phân proein chủ yếu thành peptid: (-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n + (HOH) (-NH-CH-COOH)i + (H2N-CH-CO-)k i + k = n R R R R Các exopeptidase thuỷ phân các peptid thành amino acid: (-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n + (HOH) (NH2-CH-COOH)n' + (H2N-CH-CO-)k' n' + k' = n So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác, papain có khả năng thuỷ phân sâu hơn, vì vậy nó được dùng để thuỷ phân tiếp các liên kết peptid còn lại sau khi đã thuỷ phân bằng pepsin, trypsin hay chymotrysin. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng, papain có khả năng phân huỷ hầu hết các liên kết peptid trừ các liên kết với prolin và với các acid glutamic có nhóm carboxyl tự do. d- Sự hoạt hoá papain: Papain cần có nhóm sulfhydryl tự do để thể hiện hoạt tính xúc tác. Do trung tâm hoạt động của papain có nhóm cystein 25 và nitrogen bậc 3 của histidin 159 có tính khử nên các chất đóng vai trò hoạt hoá papain là các chất có tính khử yếu như: cystein, glutathion acid, hydrocyanid, hydrosulfid, natrithiosulfat... trong đó cystein thường được dùng nhiều nhất. Khi có mặt của một trong các chất hoạt hoá này thì nhóm -SH ở trung tâm hoạt động của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính của papain. Sự hoạt hoá càng được tăng cường khi có sự hiện diện của các chất có khả năng liên kết với kim loại nặng như EDTA. Vì vậy, để thu được hoạt tính enzym tối ưu nhất người ta thường dùng hỗn hợp cystein và EDTA, trong đó cystein đóng vai trò chất hoạt hoá papain, còn EDTA đóng vai trò liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong dung dịch enzym. Cơ chế của sự hoạt hoá papain: HCN, H2S,... I2, O2,... Pa-S-S-Pa 2 Pa-SH (bất hoạt) (hoạt động) 2+ 2+ Pa-S- + -S-Pa {2 Pa-S-}Me2+ (hoạt động) (bất hoạt) e- Sự ức chế papain: Papain bị kìm hãm (ức chế) bất thuận nghịch bởi các chất oxy hoá như: O2, ozon, H2O2, Iodid acetat, iodid acetamid, thuỷ ngân chlobenzoat, cystin và một số dẫn chất disulfid khác. Các chất này ức chế hoạt tính của papain bằng phản ứng với nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain và do vậy mà làm thay đổi cấu trúc tâm hoạt động của nó [4]. Papain bị ức chế thuận nghịch bởi không khí, cystein ở nồng độ thấp, các ion kim loại nặng như Cd2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+, Hg2+, Pb2+ [4],[3]. f- Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym: w Nhiệt độ: Papain là enzym chịu được nhiệt độ tương đối cao và độ bền chịu nhiệt của nó phụ thuộc vào dạng chế phẩm. ở dạng nhựa khô papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 100oC. Còn ở dạng dung dịch papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5oC và nếu tăng nhiệt độ cao hơn (> 100oC) thì nó sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm một lượng lớn chất hoạt hoá vào dung dịch do cấu trúc trung tâm hoạt động của enzym đã bị phá huỷ hoàn toàn. Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 4oC bền trong nhiều tháng. Trong dung dịch dẫn xuất thuỷ ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng. Papain dạng ổn định ở trạng thái khô có thể chịu nhiệt độ sấy ở 115oC trong thời gian 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được 90% [4]. Papain ở dạng tinh sạch và ở dạng tinh thể có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong nhựa mủ, do trong nhựa mủ còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ nó [4]. Khi thuỷ phân các protein khác nhau, tuỳ thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ phản ứng thích hợp (nhiệt độ tối ưu) cho papain cũng khác nhau. Đối với cơ chất casein, nhiệt độ phản ứng tối ưu là 37oC [4]. w pH: Papain hoạt động ở khoảng pH tương đối rộng từ 4,5 - 8,5 và hầu như bền ở khoảng pH này, nhưng lại dễ biến tính trong môi trường acid có pH 12. Đặc biệt papain dạng ổn định có thể chịu được ở pH = 1,5 và pH = 8,5 trong 90 phút. Tuỳ thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu của papain sẽ khác nhau, chẳng hạn papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là 7 - 7,5; với albumin ở pH tối ưu là 4,5 - 7,1 và với gelatin ở pH tối ưu là 5,2 - 6,0 và 6,4. Điểm đẳng điện của papain là pI = 9 [4]. g- Công dụng: Papain có tác dụng làm mềm thịt, thuỷ phân protein làm trong đồ uống, làm mềm và sạch da. Trong Y Dược, papain là enzym được dùng để phòng chống dính, làm tróc vẩy và xử lý làm sạch vết thương [9]; chế phẩm uống papain có tác dụng tiêu hoá protein có trong thức ăn và có tác dụng chống viêm phi steroid (theo cơ chế enzym). 1.2. Một số sản phẩm thuốc có chứa papain và amylase Hiện nay các chế phẩm enzym đang được sử dụng ở Việt Nam vẫn chủ yếu là nhập của nước ngoài. Một số chế phẩm chứa Papain và Amylase sử dụng với mục đích điều trị rối loạn tiêu hoá thông dụng như [8]: - Pantyrase, Panthicone, Panticone F, Dailase, Gastal, Korzym, Pandual, Panwoodi, Sancase, Stilase, Topase F, Hanolase...(Dạng viên nén hoặc viên nang) (Hàn Quốc). - Gaszym (Viên nén, viên nang) (Thái Lan). - Panzytrat, Pancurmen, Pangrol, Nezym forte (Đức). - Viên nén sủi bọt Pepfiz, Papaynol (siro, viên nén, viên nhện), Neopetine (dạng thuốc giọt và dạng viên nang) (ấn Độ). - Viên bọc đường Pancrelase (Pháp - Đức). - Creon, Pancreflash (viên nén bọc) (Pháp). - Festale N (Roussel VN). - Neo-Panpur (Hungari). - AlPAMylase (viên nang) và alpamylase trẻ em (dạng dung dịch): lần đầu tiên được sản xuất tại Việt Nam, tại công ty Dược khoa - Trường Đại học Dược Hà Nội. Các sản phẩm này đã được sản xuất và được phép lưu hành cho mục đích phòng và chữa bệnh, nhưng những công trình nghiên cứu hỗ trợ thêm nhằm đảm bảo chất lượng thuốc tốt trong các quá trình sản xuất và phân phối lưu thông vẫn cần được tiếp tục. Đánh giá sự biến đổi hoạt tính của hỗn hợp papain và alpha amylase trong các dạng thuốc ở những điều kiện nhất định vẫn là cần thiết để có cơ sở đảm bảo và nâng cao độ ổn định của thuốc, phục vụ tốt cho công tác phòng và chữa bệnh. Phần II Thực nghiệm và kết quả 2.1. Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm 2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu 2.1.1.1. Chế phẩm enzym - Chế phẩm papain đạt tiêu chuẩn IP 96. - Chế phẩm alpha amylase đạt tiêu chuẩn IP 96. 2.1.1.2. Hỗn hợp các chế phẩm a) Hỗn hợp bột papain và alpha amylase (PA B): PA B1 PA B2 Alpha amylase IP 96 Papain IP 96 Dimethicone IP 96 Lactose 100 mg 100 mg 30 mg vđ 500 mg Alpha amylase (fungal) IP 96 100 mg Papain IP 96 100 mg Simethicon DĐVN III 30 mg Calci tribasic phosphat vđ 500 mg b) Hỗn hợp dung dịch papain và alpha amylase (PA D): PA D1 PA D2 Alpha amylase IP 96 200 mg Papain IP 96 100 mg Tinh dầu Dill IP 96 20 mg Tinh dầu Anise IP 96 20 mg Tinh dầu Caraway IP 96 20 mg Nước cất vđ 10 ml Alpha amylase (fungal) IP 96 200 mg Papain IP 96 100 mg Tinh dầu hồi DĐVN III 30 mg Tinh dầu cam DĐVN III 30 mg Saccarose DĐVN III 200 mg Hỗn hợp Nipazin/Nipazon (tỷ lệ 9/2) 0,2 mg Nước cất vđ 10 ml * Trong đó: - Hỗn hợp PA B1 và PA D1 được nghiên cứu và sản xuất bởi hãng Raptakos – ấn Độ, đã được phép nhập khẩu và lưu hành ở Việt Nam. - Hỗn hợp PA B2 và PA D2 được nghiên cứu chế tạo tại bộ môn Hoá sinh – Trường Đại học Dược Hà Nội. 2.1.2. Hoá chất và thuốc thử * Cơ chất: - Dung dịch casein 4%: Hoà tan 4,0g casein tinh khiết với 90ml nước (60oC, 30phút), chỉnh đến pH 7,0 bằng dung dịch NaOH 1N, thêm nước vừa đủ 100ml (pha trước khi dùng). - Dung dịch casein 0,6%: Cân chính xác khoảng 0,6g casein tinh khiết cho vào cốc có mỏ. Thêm dung dịch đệm phosphat pH 7,2 vừa đủ 100ml. Đun cách thuỷ trong 60 phút, vừa đun vừa khuấy. Sau đó lọc qua gạc. - Dung dịch tinh bột 1‰: Cân chính xác khoảng 1,0g tinh bột khô (sấy chân không ở 60oC, 5 mmHg trong 4 giờ) vào cốc có mỏ dung tích 100ml. Thêm khoảng 5ml nước, khuấy đều, sau đó thêm 50ml nước sôi để hồ hoá. Đun nóng trong 5 phút, làm lạnh đến khoảng 20oC, thêm 5g NaCl. Chuyển toàn lượng dung dịch vào bình định mức, thêm nước vừa đủ 100ml. Pha loãng 10ml dung dịch này với dung dịch đệm acetat pH 5,0 thành 100ml dung dịch cơ chất tinh bột. * Hoá chất và thuốc thử: - Dung dịch cystein hydroclorid 5%: Hoà tan 5,0g cystein hydroclorid trong 90ml nước cất, chỉnh pH đến 7,0 bằng dung dịch NaOH 1N, thêm nước vừa đủ 100ml (pha trước khi dùng). - Dung dịch cystein 0,04M: Hoà tan 0,49g cystein vào 90ml dung dịch đệm pH 7,2, sau đó thêm dung dịch đệm pH 7,2 vừa đủ 100ml (pha trước khi dùng). - Dung dịch đệm phosphat pH 7,2: Na2HPO4.12H2O 55,132g. Acid citric 4,853g. Nước cất vừa đủ 1000ml. - Dung dịch đệm acetat pH 5,0: Hoà tan 6,8g natri acetat và 2,5ml acid acetic băng vào khoảng 400ml nước cất, sau đó thêm nước vừa đủ 500ml. Điều chỉnh đến pH 5,0 nếu cần. - Dung dịch Iod 0,1N: Hoà tan 7g Iod và 18g Kali Iodid vào 50ml nước cất. Thêm 3 giọt acid hydroclorid và pha loãng với nước thành 500ml. - Dung dịch Iod 0,02N: Pha loãng 10ml dung dịch Iod 0,1N bằng nước cất thành 50ml. - Dung dịch acid trichloroacetic 10% Acid trichloroacetic 10g. Nước cất vừa đủ 100ml. - Thuốc thử Gornall: Hoà tan 1,5g CuSO4.5H2O và 6,0g Natri Kali Tartrat trong 500ml nước cất. Thêm 300ml dung dịch NaOH 10% (30g Natri hydroxyd trong 300ml nước cất). Vừa thêm vừa lắc đều. Thêm 1g KI rồi hoàn thành 1000ml bằng nước cất. Lắc kỹ, bảo quản trong lọ nút kín. - Dung dịch NaOH 1N và 0,1N. - Dung dịch phenolphtalein 0.1% trong cồn. - Dung dịch formaldehyd (TT). 2.1.3. Dụng cụ máy móc - Tủ ấm. - Máy điều nhiệt Cliffton Peu - 2. - Máy li tâm Hettich 13 - 12. - Máy đo quang (UV - VIS) Helios. 2.1.4. Phương pháp nghiên cứu 2.1.4.1. Điều kiện lão hoá cấp tốc cho các chế phẩm enzym - Buồng thí nghiệm LHCT chứa mẫu nghiên cứu là một tủ ấm riêng biệt, đóng kín, đặt cố định và để liên tục ở nhiệt độ 50oC trong suốt thời gian thí nghiệm: 10 tuần (70 ngày). - Các mẫu nghiên cứu PA B1, PA B2, PA D1, PA D2 đựng trong chai thuỷ tinh màu nâu, nắp kín, được đặt trong buồng thí nghiệm LHCT trong suốt thời gian nghiên cứu. Định kỳ 7 ngày (1 tuần) 1 lần lấy mẫu xác định hoạt độ enzym theo các phương pháp xác định hoạt độ enzym và đánh giá sự biến đổi hoạt độ các enzym trên các biểu đồ riêng biệt thông qua theo dõi phần trăm (%) hoạt độ enzym (HđE) còn lại và tốc độ (v) giảm HđE theo tuần (HđE/t) cho mỗi hỗn hợp enzym. 2.1.4.2. Kỹ thuật định lượng protein bằng phản ứng Biuret [10] ã Nguyên tắc: Protein có liên kết peptid cho tác dụng với CuSO4 và NaOH tạo thành phức màu tím hồng. Đo quang phổ hấp thụ so với biểu đồ mẫu để định lượng protein. ã Xây dựng biểu đồ mẫu để định lượng protein bằng phản ứng Biuret: Cân 1,00g Albumin bò tinh khiết, hoà tan với dung dịch NaCl 0,9% vừa đủ để có dung dịch 1%. Từ dung dịch này ta thực hiện phản ứng theo bảng sau: Thuốc thử ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Dd albumin 1% (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 Dd NaCl 0,9% (ml) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Thuốc thử Gornall (ml) 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Lắc đều, để 30 phút ở nhiệt độ phòng, đo quang ở bước sóng l = 530nm. Từ kết quả đo quang phổ hấp thụ thu được của các dung dịch dựng biểu đồ nồng độ protein (mg/ml) – mật độ quang (D). 2.1.4.3. Phương pháp xác định hoạt độ Papain a) Phương pháp 1 (PP1): Xác định hoạt độ papain dựa theo nguyên tắc của phản ứng Biuret. ã Nguyên tắc: Cơ chất protein được ủ với enzym ở điều kiện thích hợp trong thời gian nhất định. Lượng protein còn lại được xác định bằng cách cho tủa với acid trichloroacetic, tủa này phản ứng với thuốc thử Gornall tạo phức màu tím hồng. Đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng l = 530nm, cuvet 1cm. ã Tiến hành: - Pha chế phẩm enzym đến nồng độ thích hợp bằng dung dịch đệm phosphat pH = 7,2. - Xác định khả năng thuỷ phân protein của papain: Tiến hành phản ứng theo bảng sau: Thuốc thử (ml) ống cơ chất ống thử ống chứng Dd casein 0,6% 2,0 2,0 0 Acid trichloroacetic 10% 2,5 0 2,5 Dd đệm pH 7,2 1,5 1,5 1,5 Cystein 0,04M 0,5 0,5 0,5 Dd enzym 1% 0 0,5 0,5 Lắc đều, ủ ấm 37oC trong 60 phút. Sau thời gian ủ ấm, cho vào ống thử 2,5 ml acid trichloroacetic 10%. Lắc kỹ, để ở nhiệt độ phòng 10 phút, đem ly tâm lấy tủa. Hoà tan tủa với 4,0 ml thuốc thử Gornall, lắc kỹ, để ổn định ở nhiệt độ phòng 30 phút. Đo mật độ quang ở bước sóng l = 530nm, cuvet 1cm. ã Cách tính kết quả: Đơn vị hoạt độ papain (HđP): Katal (K) và nanoKatal (nK), 1nK=10-9K. Katal là số mol cơ chất bị thuỷ phân bởi 1 mg enzym trong 1 giây. ỉ Hoạt độ papain được tính theo công thức: HđP = (nanoKatal) Trong đó: A : Lượng protein (mg) bị thuỷ phân (xác định theo biểu đồ). B : Độ pha loãng của dung dịch chế phẩm enzym. 23600 : Trọng lượng phân tử gam của casein (g). 209 : Số liên kết peptid của một phân tử casein. T : Thời gian thuỷ phân (giây). m : Lượng chế phẩm enzym đem thử (mg). ỉ Hoạt độ papain theo % (hoạt độ protease tương đối) được tính theo công thức: Dcơ chất - Dthử – Dchứng Dcơ chất HđP (%) = ´ 100% Trong đó: Dcơ chất : Mật độ quang của ống cơ chất. Dthử : Mật độ quang của ống thử. Dchứng : Mật độ quang của ống chứng. b)Phương pháp 2 (PP2): Xác định hoạt độ papain theo IP 96 [11] ã Nguyên tắc: Dưới tác dụng của Papain ở 60oC trong thời gian thích hợp, cơ chất casein bị thuỷ phân hoàn toàn giải phóng các acid amin. Định lượng các acid amin sinh ra sau phản ứng, từ đó suy ra hoạt độ papain. ã Tiến hành: - Pha dung dịch thử: + Từ hỗn hợp PA dạng bột: Cân chính xác lượng bột chế phẩm chứa khoảng 0,5g bột Papain cho vào cốc có mỏ, thêm 10ml dung dịch cystein hydroclorid, trộn đều. Chuyển hỗn hợp này vào bình định mức 100ml, tráng cốc bằng nước cất, thêm nước vừa đủ. Lắc đều. Lọc lấy dịch lọc. + Từ hỗn hợp PA dạng dung dịch: Lấy chính xác 10ml chế phẩm cho vào bình định mức 50ml, thêm 10ml dung dịch cystein hydroclorid, lắc đều, thêm nước vừa đủ. - Lấy chính xác 15ml dung dịch casein và 30ml nước vào một bình nón dung tích 100ml. Để ổn định ở nhiệt độ 60oC ± 0,1 trong bình cách thuỷ. - Thêm 5,0ml dung dịch thử, duy trì hỗn hợp ở 60oC trong 30 phút. - Làm lạnh nhanh đến nhiệt độ phòng. Song song làm một mẫu trắng với 5,0ml dung dịch thử đã đun sôi 5 phút và để nguội tới nhiệt độ phòng (huỷ enzym). - Thêm vào mỗi bình 2 – 3 giọt dung dịch phenolphtalein 0,1% và 10ml dung dịch formaldehyd (TT) đã được trung hoà bằng NaOH 0,1N với chỉ thị là dung dịch phenolphtalein 0,1%. - Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi có màu hồng nhạt xuất hiện. ã Cách tính kết quả: Sự chênh lệch thể tích dung dịch NaOH 0,1N dùng cho mẫu thử và mẫu trắng là hoạt độ thuỷ phân protein (hoạt độ papain) có trong 5,0ml dung dịch thử. † Hoạt độ papain có trong mỗi ml dung dịch chế phẩm được tính theo công thức: HđP / ml = † Hoạt độ papain của mỗi gam bột chế phẩm được tính theo công thức: HđP / g = Trong đó: a : Số ml dung dịch NaOH 0,1N dùng cho mẫu thử. b : Số ml dung dịch NaOH 0,1N dùng cho mẫu trắng. F : Hệ số hiệu chỉnh của NaOH. Mt : Khối lượng bột thuốc đem thử (g). 2.1.4.4. Xác định hoạt độ Amlylase theo IP 96 [11] ã Nguyên tắc: Cơ chất tinh bột được ủ với dịch amylase ở các nồng độ khác nhau ở 40oC trong một thời gian nhất định. Bằng cách lên màu với thuốc thử Iod của tinh bột dư sau phản ứng xác định được lượng enzym đã thuỷ phân hết cơ chất tinh bột. Từ đó suy ra hoạt độ amylase. ã Tiến hành: - Pha dung dịch thử: + Từ hỗn hợp PA dạng bột: Cân chính xác một lượng bột hỗn hợp PA chứa khoảng 0,025g bột alpha amylase vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch đệm acetat pH 5,0 vừa đủ, trộn đều. Lọc lấy dịch lọc. Lấy chính xác 2ml dung dịch này vào bình định mức 50ml, thêm dung dịch đệm acetat pH 5,0 vừa đủ, lắc đều. + Từ hỗn hợp PA dạng dung dịch: Lấy chính xác 1ml chế phẩm cho vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch đệm acetat pH 5,0 vừa đủ, lắc đều. Lấy chính xác 2ml dung dịch này pha loãng bằng dung dịch đệm acetat pH 5,0 thành 50ml dung dịch thử. - Cho vào 6 ống nghiệm có nắp mỗi ống chính xác 5ml dung dịch cơ chất tinh bột. Đặt các ống nghiệm vào bình cách thuỷ duy trì ở nhiệt độ 40oC ± 0,1. - Khi nhiệt độ của dung dịch trong các ống nghiệm đạt tới 40oC, thêm chính xác 0,55; 0,60; 0,65; 0,70; 0,75; 0,80 ml dung dịch thử vào từng ống nghiệm riêng biệt. Tính thời gian từ lúc cho dung dịch thử vào cơ chất. Trộn đều, đặt các ống nghiệm vào bình cách thuỷ. - Sau đúng 60 phút, lấy các ống nghiệm ra và làm nguội nhanh đến nhiệt độ phòng. - Thêm vào mỗi ống nghiệm 0,05ml dung dịch Iod 0,02N, trộn đều để lên màu. - Xác định ống có chứa lượng dung dịch thử nhỏ nhất không có màu xanh hay tím nhạt, tính hoạt độ enzym theo ống này. (Trong trường hợp tất cả các ống đều không lên màu hoặc đều lên màu thì cần phải điều chỉnh lại độ pha loãng của dung dịch thử cho phù hợp). ã Cách tính kết quả: Hoạt độ alpha amylase trong 1ml chế phẩm dạng dung dịch hoặc trong 1g chế phẩm dạng bột là lượng tinh bột tính bằng gam bị thuỷ phân bởi 1ml chế phẩm dạng dung dịch hoặc 1g chế phẩm dạng bột trong 1 giờ ở 40oC, được tính theo công thức sau: ỉ Hoạt độ alpha amylase trong 1ml chế phẩm dạng dung dịch: HđA / ml = ỉ Hoạt độ alpha amylase trong 1g chế phẩm dạng bột: HđA / g = Trong đó: Mtinh bột : Khối lượng tinh bột khô đã cân để pha dung dịch cơ chất tinh bột (g). Vmin : Thể tích dung dịch thử nhỏ nhất trong ống nghiệm không có màu xanh hay tím nhạt (ml). Mt : Khối lượng bột đem thử (g). 2.1.4.5. Phương pháp xử lý thống kê y học các mẫu nghiên cứu [10] a) Tính độ lệch tiêu chuẩn d Độ lệch tiêu chuẩn là sự biến đổi của những kết quả riêng biệt xung quanh trị số trung bình M. Công thức tính độ lệch tiêu chuẩn d: d = Trong đó: Xi : kết quả đo lần thứ i (i = 1,2,3,…,n). M : giá trị trung bình của các kết quả giữa các lần đo. n : số lần đo. Như vậy ta có kết quả của mẫu nghiên cứu là: M ± d. b) Tính độ tin cậy t, ngẫu xuất thống kê p Cách tính trị số t so sánh sự chênh lệch của hai số trung bình: - Tính khoảng lệch tiêu chuẩn chung cho hai số trung bình theo công thức: d 1,2 = - Tính sai số tiêu chuẩn chênh lệch giữa hai số trung bình: - Tính trị số t: Trong đó: X1, X2 : Kết quả của mẫu 1 và mẫu 2. M1, M2 : Trị số trung bình của kết quả mẫu 1 và mẫu 2. n1, n2 : Số lần đo của mẫu 1 và mẫu 2. ị Sau đó xem ngẫu xuất p (tra bảng t [10], với độ tự do n1 + n2 - 2). 2.1.4.6. Phương pháp tính tuổi thọ thuốc theo nguyên tắc Vanhoff [1] Tth = K ´ Tct Trong đó: Tth: Tuổi thọ thuốc ở điều kiện thường. Tct: Tuổi thọ thuốc ở điều kiện LHCT. A là hệ số nhiệt độ của tốc độ phản ứng (thường là 2). DTo = To lão hoá - To bảo quản bình thường. 2.2. Kết quả Thực nghiệm và nhận xét 2.2.1. Xây dựng biểu đồ mẫu định lượng protein bằng phản ứng Biuret Đo mật độ quang (D) theo nồng độ protein thu được kết quả như sau: Nồng độ protein (mg/ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Mật độ quang D 0,053 0,115 0,157 0,203 0,273 0,313 0,386 0,419 0,468 0,535 † Tính các hệ số protein Ki là tỷ lệ giữa nồng độ protein (mg/ml) và độ hấp thụ quang (D): Nồng độ protein (mg/ml) D K = Tính hệ số K trung bình (KTB): [ Công thức tính nồng độ protein (Cprotein)theo mật độ quang (D): Cprotein = KTB ´ D (*) Từ các kết quả trên, thiết lập và vẽ biểu đồ mẫu biểu diễn độ hấp thụ quang (D) theo nồng độ protein (mg/ml): Hình2: Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang D theo nồng độ protein (mg/ml). ĩ Kết quả trên biểu đồ (hình 1) cho thấy sự biến thiên của mật độ quang D biến đổi tuyến tính bậc I theo nồng độ protein (mg/ml). Như vậy ta có thể tính được nồng độ (hay hàm lượng) protein dựa vào độ hấp thu quang D của dung dịch protein theo nguyên tắc của phản ứng Biuret: Công thức (*). 2.2.2. Xác định hoạt độ Papain trong hỗn hợp bằng PP1 Các hỗn hợp PA B1, PA B2, PA D1 và PA D2 được đặt trong tủ ấm ở nhiệt độ 50oC liên tục trong suốt thời gian nghiên cứu. Hoạt độ của papain trong các hỗn hợp được đo cách 1 tuần (7 ngày) 1 lần theo phương pháp 1 với cơ chất là dung dịch casein 0,6%, thời gian phản ứng là 60 phút, nhiệt độ 37oC. Kết quả đo hoạt độ papain của các hỗn hợp trình bày trong các bảng 1 và 2 là kết quả trung bình của 3 lần thí nghiệm ở cùng điều kiện. 2.2.2.1. Hoạt độ papain trong các hỗn hợp bột Các hỗn hợp PA B1 và PA B2 được đặt trong cùng điều kiện, được lấy ra khỏi tủ ấm cùng ngày và đem kiểm tra, kết quả đo hoạt độ papain được trình bày ở bảng 1. Sự biến đổi HđP của các hỗn hợp bột được thể hiện qua phần trăm (%) HđP còn lại theo thời gian (tuần) trong hình 3 và tốc độ biến đổi HđP/tuần của các hỗn hợp được biểu diễn trên hình 4 như sau: Bảng 1: Hoạt độ papain trong hỗn hợp dạng bột Thời gian (tuần) HđP trong các hỗn hợp bột P1-2 PA B1 PA B2 HđP (nK) vi (nK/tuần) HđP còn lại (%) HđP (nK) vi (nK/tuần) HđP còn lại (%) 0 1.73 ± 0.03 100 1.87 ± 0.02 100 P < 0.05 1 1.57 ± 0.02 0.16 90.76 1.62 ± 0.09 0.25 86.63 P < 0.05 2 1.15 ± 0.07 0.38 66.26 1.42 ± 0.05 0.20 75.94 P < 0.05 3 1.04 ± 0.03 0.15 60.26 1.31 ± 0.11 0.11 70.05 P < 0.05 4 0.92 ± 0.05 0.13 52.93 1.06 ± 0.02 0.25 56.68 P < 0.05 5 0.87 ± 0.02 0.05 50.09 0.95 ± 0.07 0.11 50.80 P < 0.05 6 0.73 ± 0.04 0.13 42.46 0.87 ± 0.05 0.08 46.52 P < 0.05 7 0.68 ± 0.02 0.05 39.44 0.83 ± 0.05 0.04 44.39 P < 0.05 8 0.51 ± 0.05 0.17 29.77 0.74 ± 0.03 0.09 39.57 P < 0.05 9 0.48 ± 0.07 0.04 27.57 0.69 ± 0.02 0.05 36.90 P < 0.05 10 0.42 ± 0.05 0.05 24.50 0.61 ± 0.03 0.08 32.62 P < 0.05 = 0.13 ± 0.08 = 0.13 ± 0.1 pv1-v2 < 0.05 Ghi chú: v1 là tốc độ biến đổi HđP qua các tuần: vi = HđPn – HđPn+1 (n = 0á10 tuần). P < 0.05 là kết quả so sánh hoạt độ của PA B1 và PA B2 ở cùng thời điểm. Hình 3: Sự biến đổi HđP trong các hỗn hợp dạng bột theo thời gian Hình 4: Tốc độ biến đổi HđP của các hỗn hợp bột. Các số liệu bảng 1, hình 3 cho thấy hoạt độ papain của cả hai hỗn hợp bột đều giảm dần theo thời gian, độ giảm HđP tương đương giữa các tuần và gần như có sự giảm HđP một cách tuyến tính trong cả quá trình nghiên cứu. Sau hơn hai tháng (70 ngày) nghiên cứu ở điều kiện LHCT, hoạt độ papain của PA B1 còn lại 24,5%, của PA B2 còn lại 32,6% so với ban đầu. Kết quả đo HđP trong mỗi đợt kiểm tra của hai hỗn hợp PA B1 và PA B2 có sự khác nhau nhưng không có ý nghĩa thống kê (p < 0.05). Thêm nữa, qua so sánh thống kê và thấy pv1-v2 < 0.05, suy ra và không có khác biệt rõ rệt. Điều đó chứng tỏ tốc độ biến đổi hoạt độ papain của hai hỗn hợp bột là tương đương. Hình 4 còn cho thấy tốc độ biến đổi HđP của hai hỗn hợp đều tăng cao ở ngay những tuần đầu, sau đó giảm. Sự biến đổi HđP xảy ra mạnh mẽ nhất đối với PA B1 là ở tuần thứ 2 (đạt đỉnh v ở 0.38 nK/tuần) và ở ngay tuần đầu tiên đối với PA B2 (đạt đỉnh v ở 0.25 nK/tuần). Đỉnh v của PA B1 cao hơn đỉnh v của PA B2, như vậy HđP của PA B1 biến đổi nhanh hơn HđP của PA B2. 2.2.2.2. Hoạt độ papain trong các hỗn hợp dạng dung dịch Các hỗn hợp dung dịch PA D1 và PA D2 cũng được đặt trong cùng điều kiện như trên, hàng tuần được lấy ra khỏi buồng thí nghiệm để kiểm tra. Kết quả kiểm tra được trình bày ở bảng 2, sự biến dổi HđP của các hỗn hợp dạng dung dịch được biểu diễn bởi phần trăm (%) HđP còn lại sau mỗi tuần trên hình 5 và tốc độ biến đổi v (nK/tuần) được biểu diễn trên hình 6 như sau: Bảng 2: Hoạt độ papain trong hỗn hợp dạng dung dịch Thời gian (tuần) HđP trong các hỗn hợp dạng dung dịch P1-2 PA D1 PA D2 HđP (nK) vi (nK/tuần) HđP còn lại (%) HđP (nK) vi (nK/tuần) HđP còn lại (%) 0 1.94 ± 0.07 100 1.82 ± 0.03 100 P < 0.05 1 1.84 ± 0.05 0.10 94.89 1.80 ± 0.05 0.02 98.90 P < 0.05 2 1.77 ± 0.06 0.07 91.25 1.73 ± 0.02 0.07 95.05 P < 0.05 3 1.62 ± 0.03 0.15 83.33 1.67 ± 0.02 0.06 91.76 P < 0.05 4 1.33 ± 0.07 0.29 77.12 1.54 ± 0.07 0.13 84.62 P < 0.05 5 1.19 ± 0.05 0.14 61.26 1.31 ± 0.06 0.23 71.98 P < 0.05 6 0.94 ± 0.05 0.25 48.41 1.17 ± 0.05 0.14 64.29 P < 0.05 7 0.82 ± 0.02 0.12 42.20 0.92 ± 0.02 0.25 50.55 P < 0.05 8 0.66 ± 0.06 0.16 33.84 0.79 ± 0.04 0.13 43.41 P < 0.05 9 0.47 ± 0.08 0.19 24.42 0.65 ± 0.03 0.14 35.71 P < 0.05 10 0.40 ± 0.04 0.07 20.56 0.57 ± 0.04 0.08 31.32 P < 0.05 = 0.15 ± 0.07 = 0.13 ± 0.07 pv1-v2 > 0.05 Ghi chú: v1 là tốc độ biến đổi HđP qua các tuần: vi = HđPn – HđPn+1 (n = 0á10 tuần). P < 0.05 là kết quả so sánh hoạt độ của PA D1 và PA D2 ở cùng thời điểm Hình 5: Sự biến đổi HđP trong hỗn hợp dạng dung dịch theo thời gian Hình 6: Tốc độ biến đổi của HđP của các hỗn hợp dạng dung dịch Bảng 2, hình 5 cho thấy tương tự các hỗn hợp dạng bột, hoạt độ papain của hai hỗn hợp dạng dung dịch cũng giảm dần và gần như tuyến tính theo thời gian. Kết quả đo HđP trong mỗi đợt kiểm tra của hai hỗn hợp PA D1 và PA D2 có sự khác nhau nhưng không có ý nghĩa thống kê (p < 0.05). Sau 70 ngày đặt trong điều kiện LHCT, so với ban đầu HđP của PA D1 còn lại là 20,6% và của PA D2 còn lại là 31,32%. Mặt khác, pv1-v2 > 0.05 suy ra ạ có ý nghĩa thống kê, chứng tỏ tốc độ biến đổi HđP của PA D1 và PA D2 có sự khác nhau rõ rệt: sự giảm HđP của PA D2 chậm hơn của PA D1. Điều này có thể do một số thay đổi trong công thức pha chế của hai hỗn hợp như sự có mặt chất bảo quản (nipazin, nipazon) trong công thức pha chế của PA D1 và sự khác nhau về hàm lượng tinh dầu, chất làm ngọt. Theo dõi sự biến thiên tốc độ biến đổi HđP của các hỗn hợp dạng dung dịch ở hình 6 cho thấy tốc độ biến đổi HđP không đều giữa các tuần ở cả hai hỗn hợp dung dịch, nhưng nhìn chung là tăng dần. Tốc độ biến đổi HđP đạt đến đỉnh ở tuần thứ tư đối với hỗn hợp D1 và tuần thứ bảy đối với hỗn hợp D2, sau đó giảm dần. Điều đó có thể do trong thời gian đầu hàm lượng protein enzym lớn cho nên mật độ tiếp xúc giữa các protein enzym với nhiệt lớn hơn về giai đoạn sau, khi số lượng protein enzym còn lại ở mức thấp hơn. Đỉnh của tốc độ biến đổi HđP của D1 cao hơn D2 cũng chứng tỏ sự biến đổi HđP ở D1 nhanh hơn so với D2. 2.2.3. Xác định hoạt độ papain trong các hỗn hợp bằng PP2 Các hỗn hợp PA B1, PA B2, PA D1 và PA D2 được đặt trong tủ ấm ở nhiệt độ 50oC liên tục trong suốt thời gian nghiên cứu, khoảng 4 tuần 1 lần xác định hoạt độ papain theo phương pháp 2, tiến hành với cơ chất là dung dịch casein 4%, thời gian phản ứng là 30 phút, ở nhiệt độ 60oC. Kết quả phần trăm hoạt độ papain còn lại so với ban đầu của các hỗn hợp được trình bày ở bảng 3 &4. Các kết quả này là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ở cùng điều kiện. a - Xác định hoạt độ papain trong các hỗn hợp dạng bột Bảng 3: Hoạt độ papain trong hỗn hợp dạng bột (pp2) Thời gian (ngày) HđP còn lại trong các hỗn hợp (%) P1-2 PA B1 PA B2 0 100 100 P < 0.05 28 52.40 57.39 P < 0.05 49 39.20 45.63 P < 0.05 70 37.40 43.05 P < 0.05 Ghi chú: P < 0.05 là kết quả so sánh hoạt độ của PA B1 và PA B2 ở cùng thời điểm. Sự biến đổi HđP trong các hỗn hợp dạng bột được thể hiện trên hình 7: Hình 7: Sự biến đổi HđP trong hỗn hợp dạng bột theo thời gian. Kết quả ở bảng 3 và hình 7 cho thấy hoạt độ papain của hai hỗn hợp bột bị giảm nhanh ở giai đoạn đầu, sau đó giảm chậm, gần như không biến đổi. Sau 70 ngày đặt trong điều kiện LHCT, hoạt độ papain của hỗn hợp PA B1 còn 37,4%, của hỗn hợp PA B2 còn 43% so với ban đầu. P < 0,05 chứng tỏ sự khác nhau về hoạt độ papain của 2 hỗn hợp trong mỗi đợt kiểm tra là không có ý nghĩa thống kê. Như vậy có thể thấy kết quả đo HđP theo PP2 tương đối phù hợp với kết quả đo theo PP1. b - Xác định hoạt độ papain trong các hỗn hợp dạng dung dịch Bảng 4: Sự biến đổi hoạt độ papain trong hỗn hợp dạng dung dịch Thời gian (ngày) HđP còn lại trong các hỗn hợp (%) P1-2 PA D1 PA D2 0 100 100 P < 0.05 28 63.72 69.81 P < 0.05 49 42.27 48.40 P < 0.05 70 27.79 35.25 P < 0.05 Ghi chú: P < 0.05 là kết quả so sánh hoạt độ của PA D1 và PA D2 ở cùng thời điểm. Sự biến đổi HđP của PA D1 và PA D2 được biểu diễn trên hình 8 : Hình 8: Sự biến đổi HđP trong hỗn hợp dạng dung dịch theo thời gian Kết quả ở bảng 4 và hình 6 cho thấy hoạt độ papain của hai hỗn hợp dạng dung dịch trong điều kiện cấp tốc bị giảm theo thời gian. Mức độ giảm HđP của PA D1 nhanh hơn mức độ giảm HđP của PA D2. Sau 70 ngày đặt ở điều kiện LHCT, hoạt độ P của PA D1 đã giảm 72%, hoạt độ P của PA D2 đã giảm 65%. Như vậy cũng có thể thấy kết quả đo HđP của các hỗn hợp dạng dung dịch theo PP2 tương đối phù hợp với kết quả đo HđP theo PP1. 2.2.3.Xác định hoạt độ alpha amylase trong các hỗn hợp Cũng giống như xác định hoạt độ papain, việc theo dõi sự biến đổi hoạt độ amylase cũng được tiến hành trong điều kiện LHCT: các hỗn hợp PA B1, PA B2, PA D1 và PA D2 được đặt trong tủ ấm ở nhiệt độ 50oC suốt thời gian thực nghiệm, cách 1 tuần (7 ngày) 1 lần đem xác định hoạt độ AM, tiến hành theo phương pháp IP 96 với cơ chất là dung dịch tinh bột 1‰, thời gian là 60 phút, ở nhiệt độ 40oC. Kết quả kiểm tra là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm trong cùng điều kiện, được trình bày như sau: 2.2.3.1. Hoạt độ alpha amylase trong hỗn hợp dạng bột Hoạt độ amylase của các hỗn hợp PA B1, PA B2 được xác định song song, các kết quả được trình bày ở bảng 5. Sự biến đổi HđA của hai hỗn hợp được biểu diễn trên hình 9 theo phần trăm (%) HđA còn lại so với HđA ban đầu sau mỗi tuần. Tốc độ biến đổi HđA được biểu diễn trên hình 10. Bảng 5: Hoạt độ amylase trong hỗn hợp dạng bột Thời gian (tuần) HđA trong các hỗn hợp bột P1-2 PA B1 PA B2 HđA /g vi (HđA/t) HđA còn lại (%) HđA /g vi (HđA/t) HđA còn lại (%) 0 91.84 ± 0.07 100 102.04 ± 0.15 100 P < 0.05 1 68.40 ± 0.10 23.44 74.48 83.00 ± 0.09 19.03 81.35 P < 0.05 2 58.71 ± 0.05 9.69 63.93 68.45 ± 0.21 14.55 67.08 P < 0.05 3 51.27 ± 0.23 7.44 55.83 60.02 ± 0.14 8.43 58.82 P < 0.05 4 44.54 ± 0.15 6.73 48.50 56.73 ± 0.04 3.29 55.60 P < 0.05 5 38.75 ± 0.38 5.79 42.19 53.32 ± 0.07 3.41 52.25 P < 0.05 6 34.78 ± 0.28 3.97 37.87 48.92 ± 0.08 4.40 47.94 P < 0.05 7 33.12 ± 0.73 1.66 36.06 43.57 ± 0.21 5.35 42.70 P < 0.05 8 30.05 ± 0.47 3.07 32.72 39.91 ± 0.24 3.66 39.11 P < 0.05 9 29.47 ± 0.31 0.58 32.09 38.86 ± 0.13 1.05 38.08 P < 0.05 10 28.04 ± 0.48 1.43 30.53 36.69 ± 0.07 2.17 35.96 P < 0.05 = 6.38 ± 6.91 = 6.53 ± 6.54 pv1-v2 < 0.05 Ghi chú: v1 là tốc độ biến đổi HđP qua các tuần: vi = HđAn – HđAn+1 (n = 0á10 tuần). P < 0.05 là kết quả so sánh hoạt độ của PA B1 và PA B2 ở cùng thời điểm. Hình 9: Sự biến đổi HđA trong hỗn hợp dạng bột theo thời gian. Hình 10: Tốc độ biến đổi HđA của các hỗn hợp bột. Kết quả ở bảng 5 và hình 9 cho thấy hoạt độ amylase của cả PA B1 và PA B2 đều bị giảm theo thời gian. ở giai đoạn đầu HđA của hai hỗn hợp giảm nhanh, về sau giảm chậm và gần như tiến tới ổn định. Trong mỗi đợt kiểm tra, so sánh HđA giữa PA B1 và PA B2 cũng cho thấy HđA của hai hỗn hợp khác nhau không có ý nghĩa thống kê, chứng tỏ sự biến đổi HđA của hai hỗn hợp là tương đương. Sau 70 ngày ở điều kiện LHCT, hoạt độ amylase của PA B1 chỉ còn 30,5%, của PA B2 còn 36%. Mặt khác, xét về tốc độ biến đổi HđA của PA B1 và PA B2 ở hình 10 cho thấy tốc độ biến đổi HđA của hai hỗn hợp tương đương, đều rất cao ở tuàn đầu tiên sau đó giảm và ổn định hơn. So sánh và cũng cho thấy pv1-v2 < 0.05 suy ra sự khác biệt giữa và không có ý nghĩa thống kê. Tuy nhiên có thể thấy HđA của PA B2 giảm chậm hơn HđA của PA B1. Điều này có thể do sự thay đổi một số thành phần trong công thức pha chế của B1 so với B2 như việc sử dụng calci tribasic phosphat thay cho lactose có tính chất ít hút ẩm hơn và alpha amylase (fungal) có nguồn gốc từ nấm có khả năng bền với nhiệt hơn. 2.2.3.2. Hoạt độ alpha amylase trong hỗn hợp dạng dung dịch Hoạt độ amylase của hai hỗn hợp PA D1, PA D2 cũng được tiến hành song song ở mỗi đợt kiểm tra. Kết quả xác định HđA của các dung dịch này được trình bày ở bảng 6, sự biến thiên theo phần trăm HđA còn lại so với ban đầu được biểu diễn trên hình 11 và tốc độ biến đổi HđA được biểu diễn trên hình 12 như sau: Bảng 6: Hoạt độ amylase trong hỗn hợp dạng dung dịch Thời gian (tuần) HđA trong các hỗn hợp dạng dung dịch P1-2 PA D1 PA D2 HđA /ml v1 (HđA/t) HđA còn lại (%) HđA /ml vi (HđA/t) HđA còn lại (%) 0 31.56 ± 0.18 100 32.59 ± 0.09 100 P < 0.05 1 28.06 ± 0.09 3.51 88.90 29.10 ± 0.32 3.49 92.12 P < 0.05 2 25.25 ± 0.15 2.81 80.01 27.87 ± 0.13 1.23 88.22 P < 0.05 3 21.04 ± 0.12 4.21 66.67 23.17 ± 0.21 4.7 73.35 P < 0.05 4 19.42 ± 0.27 1.62 61.54 20.27 ± 0.27 2.9 64.17 P < 0.05 5 14.85 ± 0.05 4.57 47.06 17.78 ± 0.06 2.49 56.28 P < 0.05 6 14.03 ± 0.21 0.83 44.45 16.09 ± 0.19 1.69 50.93 P < 0.05 7 12.02 ± 0.23 2.00 38.10 14.52 ± 0.20 1.57 45.96 P < 0.05 8 10.52 ± 0.07 1.50 33.34 14.00 ± 0.04 0.52 44.32 P < 0.05 9 10.10 ± 0.19 0.42 32.00 12.50 ± 0.07 1.5 39.57 P < 0.05 10 9.71 ± 0.03 0.39 30.77 12.50 ± 0.05 0 39.57 P < 0.05 = 2.19 ± 1.56 = 2.01 ± 1.49 pv1-v2 < 0.05 Ghi chú: v1 là tốc độ biến đổi HđP qua các tuần: vi = HđAn – HđAn+1 (n = 0á10 tuần). P < 0.05 là kết quả so sánh hoạt độ của PA D1 và PA D2 ở cùng thời điểm. Hình 11: Sự biến đổi HđA trong hỗn hợp dạng dung dịch theo thời gian Hình 12: Tốc độ biến đổi HđA của các hỗn hợp dạng dung dịch. Tương tự như các hỗn hợp dạng bột, kết quả ở bảng 6 và hình 11 cũng cho thấy hoạt độ amylase của hai hỗn hợp PA D1, PA D2 giảm theo thời gian. Trong mỗi đợt kiểm tra, sự khác nhau về kết quả xác định HđA của hai hỗn hợp là không có ý nghĩa (p < 0.05). Tuy nhiên, khác với các hỗn hợp dạng bột, hình 12 cho thấy tốc độ biến đổi HđA của các hỗn hợp dạng dung dịch không đạt đỉnh ngay từ những tuần đầu mà tăng dần, đạt đỉnh ở tuần thứ 4 đối với D1 và tuần thứ 5 ở D2, sau đó tiếp tục giảm. Thêm nữa, so sánh và cho thấy pv1-v2 < 0.05 suy ra ạ không có ý nghĩa thống kê, chứng tỏ độ giảm HđA của hai hỗn hợp này là tương đương và HđA của D2 giảm chậm hơn của D1. Sau 70 ngày đặt ở điều kiện LHCT, hoạt độ amylase của PA D1 còn lại 30.8%, của PA D2 còn lại 40%. 2.3. BàN LUậN Về tốc độ biến đổi hoạt độ papain và amylase trong các hỗn hợp chế phẩm nghiên cứu Các kết quả trên đã cho thấy một thực tế là các enzym amylase cũng như papain đều bị biến đổi hoạt tính nhanh hơn ở điều kiện LHCT so với điều kiện thường (30oC ± 2, độ ẩm 70 - 80%). Trong thí nghiệm này chúng tôi chỉ tiến hành với điều kiện nhiệt độ cao là 50oC (cao hơn nhiệt độ thường khoảng 20oC), sau gần 2,5 tháng hoạt tính của các enzym trong các hỗn hợp chế phẩm đã giảm rất nhiều so với hoạt tính ban đầu (100%): hoạt độ papain chỉ còn khoảng 25%, hoạt độ amylase chỉ còn khoảng 35%. Như vậy nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ biến đổi của các chế phẩm enzym. Từ sự biến đổi hoạt độ của các enzym trong điều kiện LHCT có thể sơ lược đánh giá được độ bền hoạt tính của các enzym papain và amylase trong các hỗn hợp chế phẩm dạng bột và dạng dung dịch. Bằng cách quy đổi thời gian biến đổi từ điều kiện LHCT sang điều kiện thường (ở Việt Nam là 30oC ± 2) chúng tôi nhận thấy để hoạt tính của các enzym trong hỗn hợp giảm > 60% thì cần thời gian là: khoảng 590 ngày đối với hỗn hợp bột, khoảng 610 ngày đối với hỗn hợp dung dịch. Như vậy bằng cách nâng nhiệt độ thêm 20oC có thể rút ngắn thời gian theo dõi hoạt độ enzym trong chế phẩm enzym khoảng 10 lần (từ khoảng 710 ngày xuống 70 ngày). Không những thế, những kết quả ban đầu về theo dõi sự biến đổi hoạt độ papain và amylase trong 2 dạng hỗn hợp (bột và dung dịch) cũng cho thấy các hỗn hợp B2 và D2 có tốc độ biến đổi hoạt độ các enzym nhìn chung là chậm hơn so với các hỗn hợp B1 và D1. Điều này có thể do những thay đổi về công thức pha chế giữa các chế phẩm cùng dạng và khẳng định khả năng ổn định hoạt chất của các chế phẩm enzym sản xuất tại Việt Nam, đóng góp một phần quan trọng trong việc quyết định triển khai sản xuất các sản phẩm thuốc có thành phần chính là các enzym, nhất là papain và amylase tại Việt Nam. Về việc ứng dụng phương pháp LHCT và các phương pháp xác định hoạt độ enzym w Phương pháp LHCT là một phương pháp để xác định nhanh tuổi thọ của thuốc. Trong khuôn khổ đề tài này của chúng tôi đã cho thấy một ưu điểm của phương pháp LHCT là có thể rút ngắn được thời gian theo dõi độ ổn định của một chế phẩm thuốc. Việc tăng nhiệt độ thêm 20oC so với điều kiện thường ở khu vực Việt Nam (30oC) đã làm cho tốc độ biến đổi hoạt độ các enzym lên đến 7 - 10 lần và rút ngắn thời gian theo dõi xuống khoảng 10 lần (từ khoảng 700 ngày xuống 70 ngày), đồng thời cũng có thể thấy số lượng thí nghiệm cũng được giảm, cụ thể là: trong điều kiện LHCT chỉ có 10 lần thí nghiệm trong 10 tuần, trong khi đó, tiến hành trong điều kiện thường (1 lần /tháng) thì số thí nghiệm trong khoảng 2 năm (700 ngày) là 24 lần. Như vậy đã giảm được số lượng thí nghiệm 2,4 lần. Ngoài công sức tiến hành thí nghiệm thì số lượng hoá chất, thuốc thử cũng giảm và như vậy đã làm tăng hiệu quả kinh tế. Tất cả những ưu thế trên cho thấy nếu phương pháp LHCT được coi là chấp nhận thì việc nghiên cứu để triển khai một sản phẩm thuốc sẽ nhanh hơn nhiều và đem lại nhiều hiệu quả khác nữa. w Qua việc tiến hành thí nghiệm với các phương pháp xác định hoạt độ papain và amylase chúng tôi có một số nhận định sau: + Về phương pháp xác định hoạt độ papain: Phương pháp 2 (xác định hoạt độ papain theo IP 96) được coi là phương pháp chuẩn đánh giá hoạt độ enzym trong chế phẩm thuốc, đã được Hội đồng Dược điển (HĐDĐ) ấn Độ chấp nhận. Tuy nhiên, qua thực tế tiến hành các thí nghiệm chúng tôi nhận thấy việc phát hiện điểm kết thúc phụ thuộc vào chủ quan của người đo nên cho kết quả có độ chính xác không cao. Trong khi đó, phương pháp 1 - xác định hoạt độ papain theo nguyên tắc của phản ứng biuret – là phương pháp xác đinh hoạt độ enzym thông qua việc định lượng protein, thường được sử dụng trong các nghiên cứu về protein ở lĩnh vực Hoá sinh. Phương pháp này tuy đòi hỏi phải có thiết bị, máy móc hiện đại nhưng tiến hành không phức tạp mà kết quả dựa vào đo độ hấp thụ quang nên khách quan hơn. + Về phương pháp xác định hoạt độ amylase: đây cũng là phương pháp chuẩn để đánh giá hoạt độ amylase được HĐDĐ ấn Độ chấp nhận. Nhưng qua thực nghiệm chúng tôi nhận thấy ở phương pháp này điểm kết thúc của phản ứng không rõ ràng, cách đánh giá kết quả hoàn toàn phụ thuộc vào chủ quan cho nên kết quả không chính xác. Tuy nhiên phương pháp này tiến hành đơn giản, kết quả chỉ dùng để so sánh nên vẫn phù hợp với yêu cầu của đề tài này. Phần III Kết luận và đề xuất 3.1. Kết luận Đã khảo sát được sự biến đổi hoạt độ enzym (papain và alpha amylase) trong bốn hỗn hợp chế phẩm gồm hai chế phẩm dạng bột (PA B1 và PA B2) và hai chế phẩm dạng dung dịch (PA D1 và PA D2) trong thời gian 10 tuần ở điều kiện lão hoá cấp tốc (50oC) với sự đánh giá HđE 1lần / tuần. Hoạt độ papain trong hỗn hợp dạng bột biến đổi ở điều kiện LHCT (50oC) theo quy luật: nhanh ở tuần 1 - 3 (với tốc độ biến đổi v từ 0.15 đến 0.25 nK/tuần), ở các tuần tiếp theo tốc độ giảm chậm hơn và giữ ở mức ổn định (v từ 0.07 - 0.12 nK/tuần ). Trong khi đó, HđP trong hỗn hợp dạng dung dịch biến đổi ở điều kiện LHCT theo quy luật: tốc độ giảm HđP chậm nhưng đều nhau giữa các tuần (v từ 0.10 - 0.15 nK/ tuần). Tốc độ biến đổi HđP của PA B1 so với PA B2, của PA Dốc với PA D2 ở mỗi tuần khác nhau không có ý nghĩa thống kê với p < 0.05. Hoạt độ amylase trong hỗn hợp dạng bột bị giảm trong điều kiện LHCT theo quy luật: nhanh ở tuần 1 - 3 (tốc độ biến đổi v từ 10 - 24 HđA/g/tuần), ở các tuần tiếp theo tốc độ giảm chậm dần và giữ ở mức ổn định (v từ 4 - 7.44 HđA/g/tuần ). Còn đối với các hỗn hợp dạng dung dịch, HđA trong điều kiện LHCT biến đổi theo quy luật: tốc độ giảm HđA tăng dần, cao nhất ở các tuần 4 - 5 (v đạt 4 - 5 HđA/ml/ tuần), sau đó giảm (v từ 0.5 - 3 HđA/ml/ tuần). Tốc độ biến đổi HđA của PA B1 so với PA B2, của PA Dốc với PA D2 ở mỗi tuần khác nhau không có ý nghĩa thống kê với p < 0.05. Điều kiện LHCT ở 50oC đã làm tăng tốc độ giảm HđE so với ở điều kiện thường (30oC) lên 10 lần (70 ngày / 710 ngày). ứng dụng phương pháp LHCT để đánh giá sự biến đổi HđE không những có thể giảm thời gian khảo sát độ ổn định của một sản phẩm thuốc chứa chế phẩm enzym xuống 10 - 15 lần, mà còn giảm được các tốn phí do số lần tiến hành thí nghiệm lớn (24 lần xuống còn 10 lần). Do đó sử dụng phương pháp LHCT để đánh giá sự biến đổi HđE trong nghiên cứu độ ổn định của một số thuốc sẽ mang lại nhiều lợi ích, trước hết là tạo thuận lợi để sớm hoàn thành hồ sơ sản phẩm và có những quýet định phù hợp để triển khai sản xuất các sản phẩm thuốc đó. 3.2. Đề xuất Vì thời gian có hạn và khuôn khổ của công trình khoá luận tốt nghiệp mới tiến hành đánh giá sự biến đổi hoạt độ enzym ở nhiệt độ duy nhất là 50oC nên chúng tôi đề nghị: Có thể tiến hành đánh giá sự biến đổi hoạt dộ enzym của các chế phẩm enzym ở một số điều kiện LHCT khác như 40oC, 60oC hoặc các điều kiện khác. Kết hợp sự đánh giá biến đổi hoạt độ enzym với các biện pháp nân cao độ bền hoạt tính enzym như tác động đến cấu trúc hoá học của enzym và các kỹ thuật bào chế đặc biệt để các chế phẩm enzym có tác dụng phòng và chữa bệnh sớm được triển khai ứng dụng trong thực tế. Tài liệu tham khảo 1. Bộ môn bào chế, Trường Đại học Dược Hà Nội - Chuyên đề kỹ thuật bào chế -1999 - Trang 22-37. 2. Bộ môn Hoá sinh, Trường Đại học Dược Hà Nội - Hoá sinh I, II - 1996. 3. Nguyễn Hữu Chấn - Enzym và chất xúc tác sinh học - Nhà xuất bản y học Hà Nội - 1996. 4. Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn ánh tuyết, Lê Thị Thuỷ Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thuý Hương, Phạm Thanh Huyền, Tạ Thu Hằng - Công nghệ enzym - Nhà xuất bản Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh - 2004 - Trang 152-161, 185-194. 5. Nguyễn Văn Mùi - Thực hành hoá sinh học - Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội - 2001. 6. Nguyễn Văn Mùi - Xác định hoạt độ enzym - Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật Hà Nội - 2002 - Trang 40-55. 7. Nguyễn Văn Rư - Luận án tiến sĩ dược học “Nghiên cứu tạo chế phẩm protease nguồn gốc động vật, thực vật ứng dụng trong phòng chống suy dinh dưỡng” - Hà Nội - 2002. 8. Phạm Thiệp, Vũ Ngọc Thuý - Thuốc biệt dược & cách sử dụng - Nhà xuất bản Y học - 2004 - Trang 700-701. 9. Từ điển bách khoa dược học - Nhà xuất bản từ điển bách khoa Hà nội - 1999 - Trang 472- 473. 10. Vũ Đình Vinh, Đặng Thanh Phức, Đỗ Đình Hồ - Kỹ thuật y sinh hoá - Trường Đại học Quân y - 1974. 11. Commission of National Pharmacopoeia - French International Pharmacopoeia - Paris - 1998. 12. George A.B. - Encyclopedia of Food and Color Additives - New York - 1998. 13. Lehninger A.L., Nelson D.L., Cox M.M. - Principles of biochemistry - 2nd edition - Worth Publishers Inc. - 1993. 14. London the Royal Pharmacetical Society - Martindal-The extra Pharmacopoeia - “Supplementary Drugs and Substances” - London - 1997. 15. Indian pharmacopoeia 1996 - Vol 1. 16. Whitaker. J. R. - Principles of Enzymology for the food sciences - 1972.