Đề tài Enzyme từ thực vật

Cũng như các loại enzym thủy gỉai khác , nhóm SH tham gia trực tiếp vào các hoạt động của enzym ficin. Khi các chất ức chế như HgCl2, N-ethylmalenine, iod acetic acid, chloroacetamide hay iodacetamide kết hợp với trung tâm hoạt động của ficin thì enzym sẽ bị bất hoạt. Các chất kìm hãm hoạt động của các protease động vật khi liên kết với gốc cystein của enzym ficin cũng có thể bất hoạt ficin như: những dẫn xuất chloromethyl ceton của N-tosyl-L-phenylalanine và N-tosyl-L-Lysine, 1,3-dibrommoacetone cũng gây ra sự bất hoạt ficin. Trong lòng trắng trứng có một loại protein có khả năng kìm hãm hoạt động của ficin. Người ta cho rằng khi protein này kết hợp với ficin sẽ tạo ra một chất có hoạt tính kìm hãm enzym. - Tính chuyên biệt: Các liên kết peptide của nhiều loại protein tự nhiên như protein sữa, hemoglobin, protein đậu nành, gelatin, collagen, elastin, fibrin, fibrinogen và cả ascaris sống đều có thể bị thủy giải bởi enzim ficin. Ficin còn có thể thủy phân các liên kết peptide, ester, các liên kết amide của cơ chất nhân tạo. - Tính bền vững: Bền vững với nhiệt độ: Ở dạng tinh thể, Cohen nhận thấy chúng có thể giữ nguyên hoạt tính trong hai giờ ở 50oC Dịch enzym ficin sẽ bị mất hoạt tính quathời gian bảo quản đông lạnh kéo dài mà nguyên nhân có thể do từng phần của enzym bị chuyển về dạng bất hoạt do hiện tượng oxi hóa Bền vững với pH:Trong một vùng pH khá rộng(4.5-9.5) độ bền vững của enzym ficin đạt đến mức cực đại nhưng trong một vùng pH hẹp dao động quanh pH=8 thì nó lại có tính bền vững ở mức độ tối thiểu. Nguyên nhân là do một nhóm SH tối cần thiết bị oxi hóa. Tuy nhiên, sự suy giảm tính bền vững ờ pH sẽ mất đi khi gia tăng nồng độ cystein từ 0,01-0,25M. Ficin có độ bền vững cực đại ở pH 7.5 và pHopt trung bình ở khoảng 6-7.5 Khi hòa tan các kết tủa enzymvào trong nước hay trong các dung dịch muối dễ bay hơi có thể gây ra sự bất hoạt enzym. Do đó, để tránh hiện tượng này người ta thường hòa tan kết tủa enzym vào trong dung dịch đêm phosphate 0.01M, pH7 có NaCl 0.1M và việc gắn enzym lên các nhân tố mang như blue acid 83, redacid 17, …để làm tăng tính bền vững của enzym. Cơ chế xúc tác của enzyme: các loại enzyme protease thu dược từ đu đủ, sung, vải, dứa có tên gọi là thiol-proteae, cystein-protease hay sulfhydryl-protease có khả năng bền với nhiệt trong khoảng 600 - 800C ở pH tự nhiên. Tâm hoạt động của các enzyme này gồm có 2 amino acid là cystein và histidine Cơ chế thuỷ giải protein xảy ra qua 2 giai đoạn: Giai đoạn 1: giai đoạn “acyl hoá” Giai đoạn 2: giai đoạn “deacyl hoá “có sự tham gia của phân tử nước d. Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thủy phân protein của ficin - Nhiệt độ: hoạt động thủy phân protein của enzym ficin chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi nhiệt độ. Trong khoảng nhiệt độ không làm biến tính enzym, tốc độ phản ứng của enzym tỉ lệ thuận với sự gia tăng nhiệt độ và nhiệt độ. Mỗi enzym có một nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động xúc tác của nó, tại đó tốc độ phản ứng của enzym đạt đến tối đa. Điểm nhiệt độ đó gọi là nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme. - Độ pH: pH của môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ phản ứng của enzym. Mỗi enzym có một trị số pH thích hợp cho hoạt động của enzym gọi là pH tối thích, tại đó tốc độ phản ứng của enzym đạt đến mức cực đại Độ pH ảnh hưởng đến hoạt động của enzym do: Tác động vào trạng thái ion hóa của phân tử enzym Tác động vào trạng thái ion hóa của cơ chất Tác dụng vào độ bền của phân tử enzym Tác dụng vào sự kết hợp giữa phần protein và phi protein của phân tử enzym. PHẦN 2: NHỮNG ENZYM ỨNG DỤNG VÀO THỰC PHẨM 2.1. Enzym pectinase[2]: Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin. Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Những enzyme này vì vậy có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả 2.1.1.Phân loại : Enzyme pectinase có thể được phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng. Bảng 2.1: Phân loại enzym pectinase Stt Enzym (tên gọi theo hệ thống) Enzym (tên thường gọi) Phản ứng xúc tác 1 Pectin-pectinhydrolase pectinesterase Pectin + H2O = n metanol + pectic acid 2 Poly-a-1,4 galacturonid-glycano hydrolase-PG Endopoly galacturonase (endo-PG) Thủy phân liên kết a-1,4-D-galacturonid trong galacturonid không theo một trật tự nào 3 Poly-a-1,4-D-galacturonidgalacturon-hydrolase Exopoly galacturonase (exo-PG) Thủy phân liên kết a-1,4-D-galacturonid trong pectat, trong galacturonic với sự đứt mạch của acid galacturonic 4 Poly-a-1,4-D-galacturonidmetilester-glycanohydrolase Endopolymetil-galacturonase (Endo-PMG) Thủy phân liên kết a-1,4-D-galacturonid trong pectin không theo một trật tự nhất định. 5 Poly-a-1,4-D-galacturonid digalacturonoliase Exo-pectatliase (exo-PKTE) Thủy phân liên kết a-1,4-D-galacturonid trong pectat với sự tạo thành D-4,5 aciddegalacturonic không theo một trật tự nhất định. 6 Poly-a-1,4-D-galacturonid glicanoliase Endopectatliase (PETE) Thủy phân liên kết a-1,4-D-galacturonid trong pectat, trong galacturonic với sự tạo thành nối đôi không theo một trật tự nhất định 7 Poly-a-1,4-D-galacturonid metylester glicanoliase Endopectinliase (Endo-PTE) Thủy phân liên kết a-1,4-D-galacturonid trong pectin với sự tạo thành nối đôi không theo một trật tự nhất định Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester. Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vị galaturonate nằm kề đơn vị không bị ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol. Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau. Nếu thu từ nguồn VSV thì PH tối ưu từ 4,5-5,5, còn nếu từ nguồn thực vật thì có pH tối ưu từ 5,0-8,5. Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30-40oC và bị vô hoạt ở 55-62oC. Pectinesterase thường được hoạt hoá bởi các ion Ca2+ và Mg2+. Polygalacturonase còn có tên gọi là poly -1,4-galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết –1,4-glycosid. Các exo-PG (exo-poly 1,4--D-galacturonide) galacturonohydrolase, phân cắt từ các đầu không khử, và endo-PG (endo-poly1,4--D-galacturonide) glycanohydrolase, tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất. Polygalacturonase ít gặp trong thực vật nhưng có chủ yếu ở một số nấm mốc và vi khuẩn. Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất. Trên cơ sở tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng với cơ chất, enzym polygalacturonase được chia làm bốn loại: * Polymethylgalacturonase hay còn gọi là -1,4-galacturonite-methylesglucanohydrolase, tác dụng trên polygalactorunic acid đã được methoxyl hoá (tức là pectin). Enzyme này lại được phân thành hai nhóm nhỏ phụ thuộc vào khả năng phân cắt ở trong hay cuối mạch trong phân tử pectin, đó là endo-glucosidase-polymethyl galacturonase kiểu I và exo-glucosidase-polymethylgalaturonase kiểu II. * Polygalacturonase, enzyme tác dụng trên pectic acid hoặc pectinic, cũng được chia thành hai nhóm nhỏ là endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II và exo-glucosidase-polygalacturonase kiểu IV. Enzyme endo-glucosidase-Polymethyl-galacturonase kiểu I là enzyme polymethylgalacturonase dịch hoá pectin có mức độ methyl hoá càng cao thì bị thủy phân bởi enzyme này càng nhanh và càng có hiệu quả. Trong dung dịch, khi có mặt của enzyme pectinesterase thì hoạt độ của enzyme này thường bị giảm. Enzyme này rất phổ biến trong các VSV, đặc biệt là nấm mốc A. niger, A, awamori. Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bị ester hoá. Cả hai enzyme exo-PEL (exo-Poly(1,4--D-galac turonide) lyase) và endo-PEL (endo-poly(1,4--D-galacturonic lyase) đều tồn tại. Pectate và pectin có lượng methoxyl thấp là các cơ chất thích hợp hơn cả cho các enzyme này. Nói chung, cả hai enzyme này đều có khoảng pH tối đa nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca2+ để hoạt động. Pectate lyase không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm. Các enzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật. Ngoài ra còn có: Pectin-transeliminase hay còn được gọi là poly –1,4-galaturonite –methylesteglucanoliase, là enyme tác dụng trên pectin và pectinic acid. Polygalactorunate-transeliminase còn được gọi là poly -1,4D-galaturonite –glucanoliase, là enzyme tác dụng trên pectic acid và pectinic acid. Pectin lyase (PNL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate đã bị ester hoá. Tất cả các PNL đều là endo-enzyme Đặc điểm của Enzyme pectinase: 2.1.2.1 . Enzym pectinase từ nguồn thực vật: Pectinesterase: Trong thực vật, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enyme PE. Enzyme này thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần vỏ tế bào. PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm. Các cation kim loại ở nồng độ thấp, như Ca2+ chẳng hạn, có khuynh hướng làm tăng nồng độ hoạt động của enzyme. Cà chua chứa ít nhất hai loại PE. Cả PE1 và PE2 đều tăng trong giai đoạn đầu của quá trình chín. Khi bước vào giai đoạn chín, nồng độ enzyme PE1 giảm xuống, nhưng PE2 tích luỹ dần cho đến khi trái cây có màu đặc trưng của trái chín. PE2 có khối lượng phân tử 23kD, pH tối ưu 7,6. Enzyme này bị bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở 67oC. Các ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng độ 0,005M và 0,05M, theo thứ tự. PE của đậu nành là protein có khối lượng phân tử 33kD, hoạt động tối ưu tại pH gần 8. Polygalacturonic acid, là sản phẩm được hình thành do quá trình để methyl hoá các phân tử galacturonic acid. Trong thịt quả chuối có hai isoenzyme PE. Cả hai có cùng khối lượng phân tử là 30kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 và 9,3. Các enzyme này hoạt động ở pH tối đa là 7,5. Hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào dung dịch NaCl ở nồng độ 0,2M, và đưa pH của dung dịch về 6,0. Các enzyme này bị ức chế bởi nhiều loại Polyol có khối lượng phân tử thấp, như glycerol, sucrose, glucose, maltose và galactose. PE trong quả cam có hai loại: đó là hai isoenzyme PE1 và PE2 có khối lượng phân tử 36,kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 10,05 và 11,0, theo thứ tự. pH tối ưu của PE1 là 7,6, còn của PE2 là 8,0. Trong thành phần của nhiều thịt quả khác cũng chứa hai isoenzyem, một trong hai enzyme này có tính bền nhiệt hơn, còn enzyme kia thì ít mẫn cảm hơn khi bị tác động của protease. Độ ổn định của enzyme có thể liên quan đến mức độ glycosyl hoá của các phân tử enzyme. Enzyme bền nhiệt hơn và enzyme còn lại có khối lượng là 51kD và 36kD, theo thứ tự. Hình 2.1: Cấu trúc của pectinesterase từ carrot Cả táo và kiwi cũng chứa hai loại isoenzyme. Các isoenzyme của kiwi có cùng khối lượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là 7,3. Tuy nhiên, chúng khác nhau về mức độ bền nhiệt. Polygalacturonase: Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn VSV. PG thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như Sacchromyces gragilis, Aspergillus niger, Lactobacillus plantarum, Cochiliobolus carbonum, Neurospora crassa, các loài Ascomycete, Phizopus arrchizus, và Fusarium osyporum. Tuy nhiên, trong thực tế, PG của thực vật bậc cao được nghiên cứu rất nhiều ở cà chua chín. - Các enzyme PG trong cà chua chín tồn tại dưới hai dạng, và cả hai đều là endo-enzyme. PG1 có khối lượng phân tử 84kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ở nhiệt độ 78oC. PG2 có khối lượng phân tử 44kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ở 57oC. PG1 có độ ổn định tối đa ở pH 4,3, trái lại PG2 ổn định tối đa ở pH 5,6. - Exo-PG thủy phân các đầu không khử của chuỗi polygalacturonic, tạo ra galacturonic acid là sản phẩm thủy phân chiếm ưu thế. Sự thủy phân polymer này bị gián đoạn của sự tồn tại của các mạch nhánh trong cơ chất. Mức độ thuỷ phân tăng tỉ lệ với kích thước cơ chất, đạt tối đa với mức polymer hoá 20 đối với các exo-PG ở cà rốt và đào. Hoạt động của các exo-enzyme làm tăng nhanh sự tạo thành các nhóm khử và làm tăng chậm độ nhớt của dung dịch cơ chất. Sự phân hủy polyuronide trong quá trình chín không gây ra sự tích lũy galacturonic acid, và chỉ có endo-enzyme PG là có liên quan. 2.1.2.2 . Enzym pectinase từ vi sinh vật Nguồn giàu enzyme pectinase là nấm mốc, nấm men, vi khuẩn. Nấm mốc: penicillium glaucum, p.ehrlichii, p.chrysogenum, p.expanam, p.cilrimim, aspergillus awamori, a.foetidus, a.niger, a.terrus, a.saitoi, a.aureus, a.oryzae, a.wentii, fusarium moniliforme,… Nấm men: saccharomyces fragilis Vi khuẩn: bacillus polymyxa, flavobacterium pectinovorum, klebsiella aerogenes… các loài vi sinh vật này thường có trong bề mặt tất cả các loại quả, các bộ phận khác của thực vật. khi quả bị hư hỏng, hoặc thực vật chết, chúng sẽ cùng các loài vi sinh vật khác phá huỷ nhanh quả và các bộ phận của thực vật. người ta thường thu pectinase từ canh trường bề mặt hoặc từ canh trường bề sâu của nấm mốc. các vi khuẩn và nấm men cũng tổng hợp được enzime này a.niger chủ yếu tổng hợp ra pectinnesterase. con.diplodiella, pen.citrimin tạo ra chủ yếu là polygalacturonase. nấm men sacch.fragilis dường như chỉ tạo ra endopectintraseliminase. vi khuẩn bac.polymyxa, bac.species lại chủ yếu tạo ra transeliminase. Pectinesterase: Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị ph tối ưu khác nhau: ph tối ưu của pectinesterase từ nguồn nấm mốc là 4,5 đến 5,5 còn của chế phẩm đã loại bỏ enzime polygalacturonase sẽ có ph tối ưu từ 2,0 đến 6,5. trái lại ph tối ưu của pectinesterase từ nguồn thực vật thượng đẳng là từ 6 đến 7,5 – 8. Nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là 40 đến 450C. từ 55 đến 620c thì enzime bị vô hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của enzime pectinesterase từ thực vật thượng đẳng cao hơn: từ 55 – 600c Pectinesterase có thể nhận được từ canh trường nấm mốc A.niger có nhiệt độ tối ưu là 30 – 45oc, phopt= 4,5-5,5 và bị vô hoạt ở 55- 62oc và từ thực vật (phopt=7,5-8, toopt= 55-60oc). khả năng hoạt động của chúng phụ thuộc vào nguồn thu nhận, mức độ ester hoá của pectin. ion natri và đặc biệt là ion canxi, cũng như chlorua của na, k và ca sẽ hoạt hóa pectinesterase từ nấm mốc conithyrium diplodiella và từ a.niger. trái lại các cation hóa trị 3 và 4 (thủy ngân nitrat, chì nitrat, nhôm sunfat và sắt clorua) sẽ kìm hãm tác dụng của pectinesterase Ngoài ra, người ta đã thu được enzime pectinesterase ở trạng thái đông thể. và người ta cũng đã xác lập được rằng n-axit cuối trong phân tử enzime là phenylalanin Pectinesterase của nấm mốc sẽ thủy phân trước nhất là nhóm methylester nằm ở giữa hai nhóm carboxyl tự do. và enzime sẽ thủy phân lần lượt cắt liên kết ester dọc theo phân tử pectin. hoạt động của pectinesterase phụ thuộc nhiều vào mức độ ester hóa của pectin và tỷ lệ thuận vào mức độ ester hóa. chẳng hạn, đối với tác động của pectinesterase từ nấm mốc a.niger, cần thiết phải có pectin ester hóa ở mức độ cao không ít hơn 70%. Polygalacturonase: Hầu hết các nghiên cứu về pg đều trên cơ sở các nguồn vi sinh vật. pg thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như: saccharomyces fragilis, asperigillus niger, lactobacillus plantarum, cochlibolus carbonum, neurosrora crassa, các loài ascomycete, rhizopus arrchizus và fusarium oxysrorum. pH tối ưu của các polygalacturonase cũng khác nhau, phụ thuộc vào nguồn thu và cơ chất. chẳng hạn polygalacturonase dịch hóa (endopolygalacturonase) khi tác dụng trên acid pectinic thì ph tối ưu nằm trong khoảng từ 4,0 – 5,5. cũng enzime đó nhưng khi tác dụng trên pectin thì lại có ph tối ưu trong khoảng 5,5 – 6. còn polygalacturonase đường hóa khi tác dụng trên pectin thì ph tối ưu từ 3 – 4 nhưng khi tác dụng trên acid pectinic thì ph tối ưu cao hơn một ít ở vùng 4,4- 6 Các polygalacturonase chủ yếu bền vững ở vùng pH từ 4 – 6 Polygalacturonase đường hóa chủ yếu từ A.niger nếu được hoạt hóa bằng thủy ngân thì có thể bền vững khi pH= 2,5 Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng từ 40 -450c. trong khoảng nhịệt độ đó, chúng thường bền vững, nhưng sẽ bị vô hoạt hóa khi ở nhiệt độ 50 và 55 - 650c Các polygalacturonase cũng như pectinesterase đều được hoạt hóa bởi các caiton của kim loại kiềm cũng như cation amon Hình 2.2: polygalacturonase từ erwinia carotovora ssp. carotovora 2.1.3 Những ảnh hưởng và ứng dụng enzym pectinase trong công nghệ Thực phẩm: Những ảnh hưởng có lợi khi sử dụng enzyme pectinase: Từ khi phát hiện ra enzym và khả năng chuyển hóa của enzym loài người đã tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng enzym trong công nghiệp. Số lượng enzym phát hiện ngày càng nhiều và số lượng enzym được ứng dụng vào công nghiệp cũng ngày càng nhiều. Trong sản xuất thực phẩm, người ta thường sử dụng các chế phẩm pectinase dưới dạng tinh khiết. Người ta không dùng chế phẩm dưới dạng canh trường nấm mốc sấy khô. Tỉ lưởng chế phẩm pectinase cô đặc trên lượng nguyên liệu đem chế biến vào khoảng từ 0.03 – 0.05 đến 0.10%. Pectinase thường được sử dụng trong các ngành công nghiếp thực phẩm sau: sản xuất rượu vang; sản xuất nước quả và nước uống không có cồn; sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả cô đặc, mứt nhừ, mứt đông, … ; sản xuất nước giải khát. sản xuất cà phê và cà phê hòa tan. Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và các nước uống không rượu, đều có thể sử dụng pectinase một cách rất hiệu quả. Nhờ tác dụng của pectinase mà các quá trình ép, làm trong và lọc dịch quả rất dễ dàng, do đó làm tăng hiệu suất sản phẩm. Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu nghiền quả, sẽ làm tăng hiệu suất nước quả sau khi ép lên tới 15 – 25%. Bởi lẽ khi có pectin thì khối quả nghiền sẽ có trạng thái keo, do đó khi ép dịch quả không thoát ra được. Nhờ pectinase phân giải các cơ chất pectin, làm các chất chiết trong dịch bào dễ thoát ra ngoài hơn, làm tăng hiệu suất chất chiết, hơn nữa dịch quả trong suốt không bị vẩn đục và lọc rất dễ dàng. Không những vậy, enzym pectinase còn góp phần chiết rút được các chất màu, tanin và những chất hòa tan nữa, do đó làm tăng thêm chất lượng của thành phẩm. Các chế phẩm pectinase dùng trong sản xuất phải có những yêu cầu sau: - Chế phẩm không được làm giảm chất lượng của vang, không được gây ảnh hưởng xấu đến hương vị và màu sắc của sản phẩm; nghĩa là chế phẩm phải được làm sạch tới mức tối đa khỏi các tạp chất có ảnh hưởng xấu đến chất lượng vang. - Chế phẩm được đưa vào dịch hay bã nghiền để tăng cường quá trình sơ chế quả, tăng nhanh và làm trong dịch, nâng cao tốc độ lọc, tăng hiệu suất chung và đặc biệt là hiệu suất của phần tự chảy có chất lượng cao. Để tăng nhanh và tốt quá trình làm trong dịch thì tương quan hoạt độ của các enzym chính như endo – PMG là 55,0.102 đơn vị/mg protein chứa trong chế phẩm, còn enzym Cx là 57,5 đơn vị/mg protein trong 1 lít dung dịch. Trong trường hợp này không cần có mặt PE. Nhưng nếu hoạt độ của endo – PMG ở trong chế phẩm là 31,0.102 đơn vị/mg protein thì cần có mặt PE với hoạt độ là 4,1 đơn vị/mg protein. Trong sản xuất vang nho giữa hàm lượng enzym endo – PMG va Cx phải có sự tương quan nhất định. Khi chế phẩm có hoạt độ endo – PMG là 28,2.102 đơn vị/mg protein và Cx là 28,7 đơn vị/mgP quá trình làm trong sẽ xảy ra nhanh hơn khi có hoạt độ endo – PMG là 25,4.102 đơn vi/mg P và Cx là 55,0 đơn vị/mgP. - Chế phẩm pectinase cũng phải tăng độ ổn định của vang nghĩa là phải chứa enzym proteinase với hoạt độ không thấp hơn 120 đơn vị/g theo globulin và 140 đơn vị/g theo anbumin. - Để tránh gây tổn thất các chất màu cùa vang đỏ và tránh xuất hiện màu tối trong vang trắng thì hoạt độ của các enzym oxy hoá trong chế phẩm không được vượt quá 0,1 đơn vị/mg axit ascorbic trong một phút trên một gam chế phẩm. - Chế phẩm pectinase dùng trong vang quả phải bảo toàn được hoạt độ trong điều kiện có chứa rượu (10-12%) và phải tác dụng có hiệu quả trong điều kiện có độ pH nhất định. - Để xử lý dịch hoặc bã nghiền ở trạng thái dòng có thể dùng chế phẩm pectinase có hoạt độ cao (12000đv/g) hoặc dùng chế phẩm pectinase không tan. Chẳng hạn trong sản xuất vang nho, khi sử dụng chế phẩm pectawamorin PM10x, người ta thấy có thể tăng hiệu suất dịch tự chảy lên 32%. Trung bình thể tích của phần dịch tự chảy có thể tăng được 10%, còn hiệu suất chung của dịch tăng lên 1 – 2%. Hoặc khi ép bã nghiền nho trắng đã được xử lý bằng pectinol thì thấy quá trình ép tiến hành nhanh hơn. Hiệu suất dịch khi đó tăng lên 9,6%. Vậy dùng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng tốc độ làm trong và tốc độ lọc của dịch. Khi sử dụng chế phẩm pectinase, các polime của dịch như protein, pectin … sẽ thủy phân làm giảm độ nhớt do đó làm tăng tốc độ lọc. Trong 1 giờ dịch thu được từ bã nghiền của nho có xử lý bằng chế phẩm pectinase sẽ qua lọc 7 lần nhanh hơn từ bã không được xử lý. A.A.Martakov đã chứng tỏ rằng khi xử lý bã nghiền bằng enzym thì độ nhớt của dịch bị giảm đi ít hơn là khi xử lý dịch, vì lẽ khi đó protopectin của thành tế bào cũng bị phân giải. Khi dịch không được xử lý bằng enzym thì trong quá trình lắng, các hạt vẩn đục lớn và nhỏ sẽ bị kết tủa xuống. Khi sử dụng enzym thì các chất cao phân tử của dịch sẽ bị thủy phân từng phần, độ nhớt bị giảm, kết quả là tốc độ làm trong đều tăng. Sử dụng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng chất lượng của dịch quả và của vang. Trong quá trình xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase, thành phần hóa học của bã thay đổi rất đáng kể mà trước tiên là hàm lượng chất phenol. Người ta thấy rằng khi xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng hàm lượng catesin ở trong dịch. Khi đó quá trình trích ly sẽ vượt lên trước quá trình oxy hoá catesin ngay cả khi nhiệt độ tăng. Điều này rất quan trọng, vì các hợp chất phenol đặc biệt là catesin có các nhóm hydroxil ở vị trí octo thường có họat tính của vitamin P. Như vậy xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng giá trị sinh học của dịch quả và vang. Không những vậy vang được pha chế từ dịch và bã nghiền có xử lý bã bằng chế phẩm pectinase sẽ chín nhanh hơn do đó cần chiết sớm hơn. Người ta cho thấy rằng chế phẩm thu được từ nấm mốc, Botrylis cinerea gây ảnh hưởng rất tốt đến chất lượng của vang, vang có hương thơm mạnh và dịu do hàm lượng glyxerin và ester ở trong vang cao. Khi chế biến nước quả có thịt quả, người ta thường sử dụng chế phẩm enzym bao gồm pectintrancelinutase, hemicellulase, cellulase. Trong đó, enzym pectintrancelinutase đóng vai trò quan trọng nhất. Trong hỗn hợp chế phẩm enzym trên, tuyệt đối không được có mặt enzym polygalacturonase, đặc biệt không được chứa enzym endopolygalacturonase. Những enzym này thường làm giảm độ nhớt của nước quả và phá vỡ độ đồng nhất của nước quả. Việc ứng dụng enzymvào chế biến nước quả và trong sản xuất rượu vang bắt đầu từ năm 1930. Khi đó, Z,J.Kertesz và A.Meilliz được xem như những người đầu tiên đưa ra ý tưởng sử dụng enzym trong chế biến rau quả. Từ đó đến nay, trên thế giới có rất nhiều loại chế phẩm thương mại được sản xuất và ứng dụng trong chế phẩm rau quả. Cơ chế tác động của enzym pectinase: Trong chế biến nước quả, người ta sử dụng các chế phẩm enzym nhằm hai mục đích cơ bản. - Phá vỡ thành tế bào thức vật nhằm nâng cao hiệu suất thu nước quả. - Làm trong và ổn định chất lượng nước. Phá vỡ thành tế bào. Tế bào thực vật được cấu tạo bằng vỏ tế bào (thành tế bào). Vỏ tế bào như một lớp thành bảo vệ rất hữu hiệu và tạo hình cho tế bào. Ở vỏ tế bào thực vật có nhiều chất pectin, các chất pectin được xem như chất ciment gắn các tế bào với nhau. Phá vỡ sự gắn kết này sẽ tạo điều kiện cho các vật chất trong tế bào thoát ra khỏi tế bào. Các chế phẩm enzym có chứa không chỉ pectinase mà còn chứa các enzym trong nhóm cellulase. Các loại enzym này sẽ làm phá vỡ thành tế bào và giúp quá trình thu nhận dịch tế bào tốt hơn. Làm trong nước quả. Nước quả sau khi được tách khỏi tế bào thường chứa nhiều chất khác nhau. Trong đó chất pectin chiếm lượng đáng kể và pectin thường gây hiện tượng độ nhớt cao và gây đục nước quả. Hàm lượng pectin ở một số loại quả được trình bày ở bảng sau: Bảng 2.2:Hàm lượng pectin của một số loại quả và dịch quả Stt Nguồn pectin Pectin (%) Chất ester hóa (%) Stt Nguồn pectin Pectin (%) Chất ester hóa (%) 1 Nho 0,2 -1,0 10 - 65 6 Vỏ chanh 32,0 50 - 65 2 Dịch nho 0,01 - 0,09 – 7 Thịt chanh 25,0 – 3 Táo 0,5 - 1,6 70 - 90 8 Vỏ cam Vỏ lụa Dịch quả 20,0 29,0 16,0 4 Dịch táo 0,2 – 9 Củ cải đường 30,0 5 Khối nghiền nho đen 1,6 – Các chất protein có trong bào tương, màng tế bào và gian bào. Pectin chứa polygalacturonic acid, araban và galactan. Trong đó lượng polygalacturonic acid chiếm tới 40-60%. Khi bị thủy phân, pectin tách thành hai phần: - Phần trung tính – phức chất galactanoraban - Phần acid – acid pectic. Trong bào tương, pectin nằm ở dạng hòa tan. Trong màng tế bào và gian bào, chúng nằm ở dạng không hòa tan gọi là protopectin. Protopectin ở màng gian bào có chứa lượng kim loại khá lớn và một lượng nhóm metocyl đủ để làm protopectin bền vững. Còn protopectin ở màng tế bào chứa một lượng kim loại không nhiều, có độ metocyl hóa cao. Vì thế, tế bào thực vật có khả năng trương nở tốt. Nếu enzym tham gia phân giải pectin ở gian bào sẽ làm các tế bào khó liên kết với nhau và thịt quả dễ dàng bị mềm ra. Pectin thường có mối liên kết hydro và liên kết nguyên tử yếu hơn so với cellulose. Tham gia phân hủy pectin gồm nhiều loại enzym : cellulose, pectinase,… Trong sản xuất các mặt hàng từ quả (mứt nhừ, mứt đông, …) Pectinase cũng có vai trò quan trọng. Nhờ pectinase mà có thể thu được dịch quả có nồng độ đậm đặc. Chẳng hạn như dịch táo cô đặc đến 72 độ Brix, nếu không tách các pectin tự nhiên chứa trong đó đi thì sản phẩm sẽ bị keo tụ một cách mạnh mẽ và không thể cô đặc hơn nữa. Đa số trường hợp, người ta khử pectin đi, sau đó mới lọc rồi cô đặc, nhưng tùy theo điều kiện sản xuất và yêu cầu chất lượng sản phẩm mà có thể bổ sung enzyme và trước hay sau quá trình cô đặc, đôi khi người ta cho pectinase tác dụng trong suốt thời gian cô đặc. Sử dụng enzym để sản xuất nước quả thanh trùng uống trực tiếp từ quả táo và quả vải: Ngày nay, nước quả trong hoặc nước quả đục được sản xuất ở nhiều nước trên thế giới. tuỳ theo hàm lượng đường hoặc acid có trong quả, người ta chế biến nước quả có cho thêm đường hoặc acid hay không. đối với nước quả có hàm lượng đường và acid thấp, người ta thường phải bổ sung đường hoặc acid để điều chỉnh chất lượng cuối cùng của sản phẩm. hàm lượng pectin cao trong dịch quả thường không có lợi vì khi đó độ nhớt của sản phẩm rất cao. việc thủy phân pectin có trong dịch quả còn làm cho những sản phẩm dịch quả trong không bị đục. tuy nhiên việc xử lý pectin bằng enzym pectinase không nên tiến hành phân giải pectin đến cùng mà cần phải giữ một lượng pectin nhất định trong sản phẩm nước quả. chính lượng pectin này sẽ giúp cho chất lượng nước quả tốt hơn. Sản xuất nước uống ngay từ dâu tây , anh đào và phúc bồn tử. Người ta thường sản xuất cả dạng nước quả trong và nước quả đục từ các loại trái cây trên. trong quá trình sản xuất , người ta cho thêm đường và điều chỉnh lại lượng acid cho phù hợp. các loại nước quả này thường chứa nhiều pectin . do đó việc sử dụng các chế phẩm enzym pectinase để loại bỏ khả năng gây đục cho nước quả trong cũng như ổn định và nâng cao chất lượng dịch quả là điều cần thiết. Sản xuất nước mận Người ta thường sản xuất nước quả pha đường từ mận . Mận là loại quả cho hiệu suất thu nhận nước ép rất thấp. Để thu nhận nước quả từ mận, người ta phải áp dụng phương pháp nhiệt và enzym. Chẳng hạn như trong sản xuất nước quả táo có dùng enzyme pectinase: khi xử lý nước quả ở 50oc trong 2h, hiệu suất tách nước quả tăng được 20%, ở 37-40oc sau 2-4h xử lý, hiệu suất tách nước quả tăng từ 20-25% Trong sản xuất nước quả nho có dùng chế phẩm enzyme pectinase: thời gian xử lý là 3h ở 450c, hiệu suấ thu nhận dịch nho đối với nho trắng đạt 77,3% (bình thường 65,9%), đối với nho đỏ đạt 82,2% (bình thường 66%) Trong sản xuất cà phê, người ta dùng pectinase để tách lớp keo ở trên bề mặt của hạt cà phê. Trước đây người ta dùng ngay vi sinh vật để làm công việc này, nhưng thường quá trình xảy ra không đồng đều và khó kiểm tra. Hiện nay người ta thường dùng các chế phẩm pectinase có nguồn gốc từ vi sinh vật vì có hoạt tính cao và ổn định hơn là các chế phẩm được thu nhận từ nguồn thực vật. Ø Hiệu quả của việc sử dụng enzym Đã có nhiều nghiên cứu và kết quả áp dụng trong sản xuất nước quả và rượu vang cho thấy khi sử dụng enzym pectinase cho hiệu suất nước quả và chất lượng rượu vang rất cao. Khi tiến hành ứng dụng enzym trong sản xuất nước quả và rượu vang, người ta đặc biệt quan tâm đến hai yếu tố có tính chất quyết định đến hiệu quả enzym. - Nguyên liệu - Khả năng xay, nghiền và làm nhỏ nguyên liệu. Nguyên liệu: Không phải tất cả các loại quả đều cho hiệu suất cao khi xử lý enzym. Khi sử dụng enzym trong chế biến nước quả và rượu vang người ta phải đưa ra độ chín kỹ thuật cho phù hợp. Khái niệm này hoàn toàn khác với khái niệm độ chín kỹ thuật khi trong công nghệ người ta không sử dụng enzym. Độ chín kỹ thuật để sản xuất nước quả là giai đoạn chín của quả, đảm bảo tách dịch quả được tốt với sự tích tụ tối đa các chất có giá trị dinh dưỡng cao và hương vị thích hợp. Tuy nhiên cũng cần biết rằng, phần lớn nguyên liệu, hiệu suất dịch quả cao không trùng hợp với sự tích tụ các chất có giá trị dinh dưỡng. Ở nhiếu loại quả, khả năng thoát dịch quả không trùng với mức độ chín. Nhiều khi quả thật chín, khả năng tích tụ chất dinh dưỡng cao nhưng lại không thuận lợi cho việc tách nước quả. Chính vì thế, từng loại quả, người ta phải tiến hành phân loại và xác định độ chín kỹ thuât riêng, sao cho phù hợp với việc sử dụng enzym và thu hồi dịch quả. Công việc thứ hai sau khi phân loại quả, việc nhất thiết phải làm trước khi sử dụng enzym là quả phải được làm sạch bằng cách rửa nhiều lần để loại bỏ những tạp chất, VSV. Sau đó là các quá trình kỹ thuật như xé nhỏ, nghiền, … để tăng khả năng tác động của enzym và tăng hiệu suất thu dịch quả. Khả năng làm nhỏ nguyên liệu. Làm nhỏ nguyên liệu là khâu kỹ thuật rất quan trọng, nó quyết định đến hiệu quả tác động của enzym và hiệu suất thu nhận dịch quả cũng như chất lượng dịch quả. Tùy theo tính chất cơ lý và đặc điểm cấu tạo của từng loại quả người ta chọn những phương pháp xử lý quả thích hợp như nghiền cắt, chà hay xé nhỏ. Khi thực hiện một trong những phương pháp cơ học trên, một số tế bào bị phá hủy, mất tính chất bán thấm, do đó việc chọn phương pháp cơ học làm nhỏ quả phù hợp với từng loại quả rất có ý nghĩa công nghệ. 2.1.4. Ứng dụng enzym pectinase để nâng cao hiệu suất trích ly nước dứa: Tiến hành trích ly nước dứa có sử dụng chế phẩm pectinase giúp nâng cao hiệu suất trích ly lên 91,4%. Hình 2.3: Ảnh hưởng của lượng enzym pectinase đến hiệu suất trích ly Hình 2.4: Ảnh hưởng của enzym pectinase Untral SP-L đến hiệu suất trích ly Hình 2.5: Ảnh hưởng của nồng độ enzym 3XL đến độ truyền quang 2.2. Enzym amylase[3],[4]: Hệ enzym amylase là một trong số các hệ enzym được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực kinh tế quốc dân khác. Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzym nói chung và về amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811 – 1814. Những nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi của nhà bác học Nga – Viện sĩ K.S.Kirhof. Ông nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm (malt) và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường. 19 năm sau, tức là vào năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Persoz đã tách được chất phân giải tinh bột đó từ đại mạch nảy mầm. Các tác giả đã dùng rượu để kết tủa nó trong dịch chiết malt và thu được enzym ở dạng bột, đồng thời đặt tên là diaslase (xuất phát từ chữ Hi Lạp có nghĩa là phân giải). Sau này theo đề nghị của Duclo, enzym phân giải tinh bột được gọi là amylase. Amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn. Bấy giờ, người ta thu chúng chủ yếu từ canh trường vi khuẩn, nấm sợi và một số loài nấm men. 2.2.1 Phân loại : Enzym amylase chia làm 2 nhóm: Endoamylase: gồm có * a - amylase: Cắt đứt được tất cả các liên kết -1,4-glucoside trong mạch polysacharide, trừ điểm phân nhánh trong amylopectin, để tạo thành những maltose và những dextrin giới hạn . a -amylase hầu như không tác dụng trên tinh bột nguyên thủy mà tác dụng thủy phân mạnh lên hồ tinh bột. Tính chất đặc trưng là khả năng dextrin hóa cao. * nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại : khử trực tiếp là pullulanase ( hay a-dextrin 6-glucanohydrolase). khử gián tiếp là transglucosidase( hay oligo-1,6-glucosidase) và amylo-1,6-glucosidase. Các enzyme này thủy phân liên kết chuỗi bên trong của chuỗi polysaccharide. Exoamylase : gồm có * b-amylase Enzym này có trong hạt đậu, khoai tây…. Tham gia phân giải chuỗi amylase, còn đối với amylopectin, enzym này tham gia phân cắt glucose thứ hai, thứ ba từ điểm liên kết -1,6 glucoside. Nhiệt độ hoạt động tối ưu là 550C, pH 5-5,5. -amylase trong malt thủy phân tinh bột tạo ra maltose. Maltose là sản phẩm chủ yếu của hoạt động -amylase. * glucoamylase. Đây là hững enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polisacchride. Theo lý thuyết enzym này có thủy phân tinh bột để tạo ra glucose có hiệu suất đến 100%. 2.2.2 Đặc điểm của enzyme amylase [2]: 2.2.2.1 Enzyme amylase từ nguồn thực vật a - amylase Bảng 2.3 : Một số tính chất của -amylase từ các nguồn khác nhau Stt Loại enzym Nguồn enzym Khoảng pH tối ưu Khoảng nhiệt độ tối ưu (oC) 1 2 3 4 5 Pancreatic enzym -amylase vi khuẩn -amylase vi khuẩn ưu nhiệt -amylase của nấm sợi -amylase của malt Tuyến tụy động vật Bac.subtilis Bac.amyloliquefucieins Bac.licheniformic Asp.niger Asp.oryzae Malt đại mạch,tiểu mạch 5,5-8,5 (6,0-7,0) 4,5-9,0 (6,5-7,5) 5,8-8,0 (7,0) 4,0-7,0 (5,0-6,0) 3,5-7,5 (4,5-7,0) 40-45 Mất hoạt tính ở 750C 70-85 Mất hoạt tính ở 950C 90-105 Mất hoạt tính ở 1200C 55-60 Mất hoạt tính ơ 800C 60-70 Mất hoạt tính ở 850C Amylase từ các nguồn khác nhau sẽ có thành phần aminoacid đặc hiệu riêng . a - amylase là một protein giàu tyrosine, trytophan, acidglutamic và aspartic . Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme. a - amylase có ít methionine và có khoảng 7 – 10 gốc cystein. * Trọng lượng phân tử của a - amylase malt là 59.000kDa (Knin,1956; Fischer, Stein, 1960) * Amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng. * Protein của các amylase có tính acid yếu và có tính chất của globulin. ( Bernfeld P , 1951) * a - amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử a - amylase đều có chứa 1- 30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1- 6 nguyên tử gam/mol. Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của, duy trì hoạt động của enzyme. Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất, a - amylase bền nhiệt độ hơn các amylase khác. Tất cả các amylase Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH 4,2 – 5,7đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+,Hg2+… * Điều kiện hoạt động của a - amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. Biên độ pH tối thích cho hoạt động của a - amylase từ malt khác với a - amylase từ vi sinh vật. pH tối thích cho hoạt động của a - amylase từ đaị mạch nảy mầm và thóc nảy mầm là 5,3 ( có thể hoạt động tốt trong khoảng pH 4,7 – 5,4 ) * Độ bền với acid của a - amylase malt kém hơn so với độ bền của a - amylase nấm mốc. * Độ bền của a - amylase bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH. Tuy nhiên so với các loại amylase khác thì độ bền với nhiệt của a - amylase cao hơn. Ở 0oC và pH 3,6, a - amylase của malt hoàn toàn bị mất hoạt tính. a - amylase của mầm thóc và malt hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 58 – 60oC. b - amylase * b-amylase hiện diện phổ biến ở thực vật. Ở ngũ cốc, b-amylase tham gia vào quá trình phân giải tinh bột trong quá trình nảy mầm của hạt, xúc tác sự thủy phân liên kết a-1,4-glucan trong tinh bột, glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose tư đầu không khử của mạch. Ở lúa, b-amylase được tổng hợp trong suốt quá trình nảy mầm của hạt và hầu như không được tổng hợp ở hạt khô. * b-amylase hầu như không thủy phân các hạt tinh bột nguyên vẹn nhưng nó phân hủy hồ tinh bột rất mạnh. * b-amylase phân giải 100% amylose thành maltose, phân giải 54-58% amylopectin thành maltose. * b-amylase không bền khi có Ca2+, chịu nhiệt kém hơn a - amylase nhưng bền với acid hơn. b-amylase bị bất hoạt ở nhiệt độ 70oC. Nhiệt độ hoạt động tối thích của b-amylase là 55oC, pH 5,1-5,5. 2.2.2.2. Enzyme amylase từ nguồn vi sinh vật Để thu nhận amylase người ta thường dùng các giống nấm sợi Aspergillus (Asp. oryzae, Asp. niger, Asp. usamii, Asp. awamo-ri, Asp. batatae) ; Rhizopus (Rh. Lonnesis, Rh. neveus, Rh. japonicum , Rh. fonkinensis, Rh. lopninen-sis, Rhizopus. delemar) và một số loài của Neurospora, Mucor sinh tổng hợp rất mạnh mẽ không những chỉ a-amylase mà cả glucoamylase. Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida , Saccharomyces, Endomycopsis, Endomyces cũng tạo amylase. Đặc biệt người ta đã tuyển chọn được chủng Endomycopsis species 20-9 có khả năng tổng hợp mạnh mẽ glucoamylase, a-amylase, glucoziltransferase và invertase. Nhiều vi khuẩn cũng có khả năng tạo lượng lớn enzym amylase như Bacillus Polymyxa , Bac. cassavanum ,Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas saccharophila, Phytomonas destructans … Các vi khuẩn ưa nhiệt (ưa ấm) có khả năng sinh trưởng nhanh (4-6 lần vi khuẩn ưa ấm) và phát triển tốt ở nhiệt độ tương đối cao, nên khi nuôi chúng ở nhiệt độ cao ít bị nhiễm vi sinh vật khác.Những vi khuẩn ưa nhiệt tạo nhiều enzym amylase đáng chú ý là Bac. diastaticus, Bac. stearothermo-philus, Bac. coagulans, Bac. circulans. Đặc biệt, Bac. circulans được phân lập từ đất sinh trưởng tốt ở 65-700C và tạo amylase mạnh nhất ở 500C. Vì vậy người ta nuôi vi khuẩn này để làm giống ở 700C, còn khi nuôi để thu enzym thì nuôi ở 500C. Trong số vi khuẩn ưa ẩm tạo amylase mạnh, thì Bac. subtilis được nghiên cứu chu đáo hơn cả và được sử dụng rộng rãi nhất. Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của Bac. subtilis là 370C. Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loài tạo amylase mạnh, tuy nhiên, cũng có một số loài, chẳng hạn như xạ khuẩn ưa nhiệt Micromonospora vulgaris 42 có khả năng tạo một lượng nhỏ a-amylase hoạt động ở 650C cùng với protease và các enzym khác. 2.2.2.3 Những ảnh hưởng và ứng dụng của enzyme amylase trong công nghệ thực phẩm: Bảng 2.4 : Ứng dụng enzym amylase Lĩnh vực ứng dụng Amilase của nấm mốc Amilase của vi khuẩn Sản xuất rượu từ tinh bột Amilase của A. awamori, A. oryzac, A. usamii. A. awamori có gluamilase mạnh, thiếu protease nên phải kết hợp với A. oryzac. Hỗn hợp này cho vào đường hoà tinh bột với tỷ lệ 6-6.5%. Ở VN thường dùng chế phẩm A. usamii. Sản xuất bia Dùng chế phẩm amilase của A. oryzac với tỷ lệ 1% và a.lactic để điều chỉnh pH có thể thay thế 50% malt. Ở Đan Mạch, Nhật Bản, Mỹ dùng amilase của vi khuẩn trong sản xuất bia thay thế cho malt. Sản xuất bánh mì Dùng 0.002 – 0.003 % chế phẩm amilase của nấm mốc làm tăng chất lượng bánh mì (hương vị, màu sắc, độ xốp, thể tích riêng). Thường dùng amilase của A. oryzac (nhưng phải loại protease) Sản xuất glucose và mật Nhật, Mỹ, Canada sản xuất glucoza bằng glucoamilase của A. awamori, Rhizopus Sản xuất thực phẩm gia súc Sử dụng amilase của A. oryzac, A. awamori Ứng dụng enzym amylase trong công nghệ sản xuất rượu, bia: Trong sản xuất rượu, vai trò của glucoamylase rất quan trọng hơn cả -amylase. Vì glucoamylase chuyển hóa tinh bột đến cùng còn -amylase không chuyển hóa tinh bột thành đường đơn có thể lên men được. Trong sản xuất rượu thì đòi hỏi thủy phân tinh bột thành các đường dễ lên men, ngược lại trong sản xuất bia chỉ cần một sự đường hóa nửa vời, nghĩa là phải còn lại dextrin để tạo cho bia có vị đặc trưng và tạo bọt. Trong công nghệ sản xuất bia, người ta thường sử dụng enzym amylase có trong mầm đại mạch để thuỷ phân tinh bột có trong mầm đại mạch. Ngoài ra, người ta còn sử dụng các enzy khác có rong mầm đại mạch để thủy phân và chuyển hoá các chất không tan sang trạng thái tan như chuyển protein, cellulose, … sang amino acid và glucose. Quá trình hạt đại mạch nảy mầm là quá trình sinh tổng hợp enzym amylase và nhiều enzym khác. Đây là quá trình sinh lý bình thường của quá trình nảy mầm của hạt. Lợi dụng quy luật sinh lý bình thường này của hạt, loài người đã biết can thiệp rất khoa học để quá trình trên được tiến hành nhanh hơn, mạnh hơn và biết ngưng ở một giai đoạn nhất định, phục vụ cho mục đích của mình trong việc tạo ra sản phẩm là bia chứ không phải là cây lúa đại mạch như trong sản xuất nông nghiệp. Tuy nhiên , xét về mặt kỹ thuật thấy có một số thiếu sót cơ bản: Thứ nhất : Trong kỹ thuật nảy mầm, các chất khô có trong hạt sẽ bị tiêu hao. Sự tiêu hao này là điều khó tránh khỏi trong bất kỳ quá trình nảy mầm nào của hạt Thứ hai : Quá trình nảy mầm của hạt là quá trình đòi hỏi thời gian cho sinh tổng hợp các loại enzym và quá trình chuyển hoá vật chất . Các quá trình này thường kéo dài khoáng 10-11 ngày. Thời gian chi phí cho giai đoạn này không nhỏ nếu như đem so sánh với toàn bộ quy trình sản xuất bia. Thứ ba : Do phải sản xuất malt nên cần phải có một phân xưởng sản xuất malt trong nhà máy bia. Tiêu hao lao động cho sản xuất malt thường chiếm khoảng 1/3 tổng tiêu hao lao động chung của nhà máy bia. Chính vì thế trong thời gian từ những năm 60 của thế kỷ trước đến nay, người ta đã tìm những nguồn enzym khác thay thế cho malt nhằm làm giảm bớt những nhược điểm đã trình bày trên. Những enzym được sử dụng trong sản xuất bia thay thế malt phải đảm bảo những yêu cầu sau: Enzym thay thế malt cần phải phù hợp với enzym của malt về đặc tính tác dụng và phải có hoạt tính mạnh hơn enzym có trong malt . Các enzym có trong malt bao gồm : emzym phân giải tinh bột thành đường, enzym protease tham gia thuỷ phân protein, enzym tham gia thuỷ phân cellulose, hemicellulose. Enzym thay thế malt phải đảm bảo cho việc lọc, lên men dịch đường, làm trong bia, cũng như phải tạo ra những đặc tính bia phù hợp như tạo bọt, độ trong và tính chất ổn định trong bảo quản. Sử dụng enzym từ VSV là hướng nghiên cứu và ứng dụng ở nhiều nước. Sau một thời gian dài, các ứng dụng này cho thấy những ưu điểm quan trọng sau: Thay thế được 30-50% malt trong sản xuất bia. Hạ giá thành sản phẩm bia. Giảm đáng kể vốn đầu tư xây dựng. Ứng dụng enzym trong sản xuất siro và các loại sản phẩm chứa đường: - Enzym được sử dụng sau khi tinh bột hoà vào nước. - Theo công nghệ trên dung dịch bột bắp được điều chỉnh ở pH = 6 được hồ hoá ở nhiệt độ cao và được thực hiện theo phuơng pháp liên tục. Ở giai đoạn gia nhiệt người ta cho một lượng nhỏ -amilase để dịch tinh bột có độ nhớt thấp tránh tình trạng cháy khét. - Sau đó cho lượng enzym còn lại vào. Đây là giai đoạn đường hoá mạnh để đạt giá trị DE 15-20. Thời gian để đạt được phải mất 2 giờ. - Ngoài tinh bột bắp người ta còn sử dụng tinh bột khoai tây, tinh bột mì khoai mì. - Enzym sử dụng phải là những enzym chịu nhiệt. Ngoài ra người ta còn sử dụng -amilase từ nhiều sinh vật khác nhau. Điểm quan trọng nhất của enzym -amilase là chúng hoạt động ở pH gần như trung tính. Điều này giúp cho quá trình đường hoá diễn ra dễ dàng. Bảng 2.5: Hiệu suất chuyển hóa tinh bột bằng enzym cố định trong sản xuất siro fructose(%) Enzym cố định Glucose Maltose Maltotriose Maltotetraose -amilase 1 51 14 34 -amilase-pullulanase 30 8 32 -amilase- pullulanase -amilase 2 69 18 11 2.2.2.4.Một số chế phẩm enzyme thương mại: STT Chế phẩm enzyme Tên thương mại Hãng sản xuất 1 a-Amylase vi khuẩn Tenase Optiamyl BAN Rapidase Miles lab Miles Kali-chemie Novo-nordisk Gist-brocades 2 a-amylase vi khuẩn chịu nhiệt Termamyl Taka-them II Taka-lite Opti-therm Maxamyl Novo-nordisk Miles lab Miles Kali-chemie Gist-brocades 3 Amyloglucosidase Diazym Optidex AMG Spezym Amygase Miles lab Miles Kali-chemie Novo-nordisk Flun Blochemical Gist-brocades 4 b-amylase Dextrozyl (ch ứa AMG) Promozym Novo-nordisk 5 Amylase nấm sợi Blozym MKC. Fufal amylase Fungamyl clarase Amano Novo-nordisk Miles lab 2.3. Cenllulase[3],[4]: Cellulase là một phức hệ enzyme xúc tác thủy phân cellulose thành cellobiose và cuối cùng là glucose Được thu nhận từ các nguồn khác nhau: Động vật: dịch tiết dạ dày bò, các nhóm thân mềm… Thực vật: trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa mì mạch đen… Vi sinh vật: các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men… Phân loại: Phân loại theo cơ chế xúc tác Endo-β-1,4-glucanase EC 3.2.1.4 Enzyme cellulase Exo-β-1,4-glucanase β -glucosidase 1,4- β-D-glucan-4-glucanohydrolase EC 3.2.1.74 1,4- β-D-glucan cellobiohydrolase EC.3.2.1.91 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm Tăng hiệu suất trích ly các chất khác nhau từ nguyên liệu thực vật. Trong sản xuất bia dưới ảnh hưởng của hệ enzym cenllulase thành tế bào đại mạch bị phá hủy khiến enzym protease và amylase tác dụng dễ dàng với protein và tinh bột . Khi đó lượng đường và các chất hòa tan tăng lên . Trong sản xuất nước quả, muốn tăng hiệu suất thu hồi chất chiết phải kết hợp hai chế phẩm enzyme cellulose và pectinase, vì thành tế bào của rau quả chủ yếu được tạo thành bởi cellulose nên sử dụng chế phẩm enzyme cellulase để làm phá vỡ thành tế bào tăng hiệu suất trích ly và thu hồi chất chiết trong dịch rau quả. Ủ Ép Ly tâm Lọc tinh Phối chế Bài khí Tiệt trùng Rót hộp Sản phẩm Enzym cenllulase , pectinase bã bã Syrup Táo Rửa Chần Nghiền Nước thải Nước Trong qui trình sản xuất nước táo trước khi ép ta tiến hành ủ enzym cenllulase và pectinase . Mục đích là để phá hủy tế bào tăng hiệu suất ép . Đồng thời bổ sung pectinase để thủy phân pectin trong vỏ táo để tránh hiện tượng nước quả bị đục và kết tủa. Ở đây cần giữ ở nhiệt độ tối thích cho enzym hoạt động là 500C . Thời gian ủ khoảng 1 giờ . Và hàm lượng enzym bổ sung 2-8 % dịch ép. 2.4. Enzym oxy hóa khử [4]: 2.4.1. Peroxydase: - Enzym peroxydase xúc tác sự oxy hóa cơ chất bằng hydro perocyd . Nó phân hủy hydro perocyd giải phóng ra oxy nguyên tử . Sau đó oxy nguyên tử oxy hóa các chất khác nhau. - Các cơ chất có thể bị oxy hóa bởi peroxydase khi có hydro peroxyd là : + Các phenol : acid galic, pirocatechin…. + Các amin thơm. + Các chất dễ oxy hóa : acid ascorbid… - Enzyme peroxydase, polyphenoloxydase đóng vai trò quan trọng nhất và có tác dụng khác nhau trong quá trình lên men chè đen. Các enzyme này đều hoạt động mạnh ở 450C, đến 700C thì hoạt động yếu hẳn đi và ở nhiệt độ cao hơn sẽ bị vô hoạt hoàn toàn. Các màng tế bào ngăn cách các hợp chất hóa học có thành phần khác nhau trong 1 lá, vì vậy các hợp chất này không thể tiếp xúc và phản ứng được với nhau. Khi phá vỡ tế bào, các chất trong các tế bào sẽ được thoát ra ngoài và tiếp xúc nhau, khi đó phản ứng oxy hóa ngay tức khắc sẽ diễn ra, dẫn đến hình thành các hợp chất phenolic lớn hơn được gọi là theaflavin (TF) và polymeric thearubigin (TR). Tùy thuộc vào mức độ phản ứng của các hợp chất phenolic khi có mặt của enzyme mà sẽ tạo ra các sản phẩm chè khác nhau: chè đen, chè oolong, hay chè xanh. Polyphenoloxydase: Polyphenoloxydase xúc tác sự oxy hóa các polyphenol khác nhau và các dẫn xuất của chúng , cũng như các monome khi có oxy phân tử . Cơ sở tác dụng của polyphenoloxydase là sự oxy hóa thuận nghịch Cu+ thành Cu 2+ Polyphenoloxydase và polyphenol có trong quả và lá cây nên khi rau quả bị dập nát , cắt lát … thì phản ứng oxy hóa polyphenol xảy ra hình thành sản phẩm có màu . Đó là nguyên nhân gây thâm đen táo , khoai tây… Đó là phản ứng không mong muốn xảy ra. Tuy nhiên trong sản xuất trà đen , chè oolong thì phản ứng này góp phần tạo màu cho sản phẩm. Trong nhóm polyphenoloxydase có những enzym oxy hóa monophenol gọi là monophenoloxydase. Tirozinase là chất điển hình , nó xúc tác sự chuyển hóa acidamin tirozin tạo ra kinon tương ứng . Sau một loạt các chuyển hóa các kinon này cho ra chất màu xám đen gọi là melanin. Đó là chất làm cho bột mì bị thâm đen trong quá trình bảo quản. Glucooxydase: Enzym glucooxydase khi có mặt oxy sẽ chuyển hóa glucose thành acid gluconic và H2O2. Glucooxydase dùng với mục đích : để oxy hóa glucose và để liên kết oxy. + Ngăn ngừa sản phẩm khỏi bị oxy hóa( tách oxy ra khỏi chúng). + Ngăn ngừa các sản phẩm khỏi bị biến đổi xấu đi bằng cách oxy hóa các glucose trong các sản phẩm đó trước. Trong sản xuất rượu vang , bia , phomai, công ngiệp thịt… người ta dùng enzym glucooxydase để liên kết với các oxy ngăn ngừa các sản phẩm khỏi bị oxy hóa. Trong sản xuất bia còn dùng glucooxydase để ổn đinh thành phần. Do ở nhiệt độ phòng bia chưa thanh trùng sẽ bị đục do nấm mốc và vi khuẩn phát triển. Nếu cho ít chế phẩm glucooxydase vào bia ( 1g/200ml) thì sẻ tách hết oxy trong chất lỏng cũng như oxy trong các khoảng tự do , làm tăng tính cám quan của sản phẩm. Glucooxydase cũng có ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột trứng . Nếu trong bột trứng có chứa glucose thì trong quá trình chế biến cũng như bảo quản , glucose sẽ tương tác với protein và sẽ bị oxy hóa dần dần tạo sản phẩm có màu sẫm và mùi khó chịu . Trong albumin trứng có chứa 3% glucose . Vì vậy trong sản xuất bột trứng và albumin trứng người ta dùng glucoseoxydase để oxy hóa trước glucose để tăng thời gian bảo quản sản phẩm và chất lượng sản phẩm. TÀI LIỆU THAM KHẢO : [1]. Bùi Ái, “ Công nghệ lên men ứng dụng trong công nghệ thực phẩm”,NXB Đại học quốc gia TPHCM, 2009. [2]. Hoàng Kim Anh, “Hóa học Thực phẩm”, NXB Khoa học và kỹ thuật, 2008 [3]. Nguyễn Đức Lượng, “ Công nghệ enzym”, “ Công nghệ vi sinh tập 1,2, 3” , NXB Đại học Quốc gia TPHCM. [4]. Lê Ngọc Tú, “ Hóa sinh công nghiệp”, NXB Khoa học và kỹ thuật , 2002.