Đề tài Khảo sát hệ vi sinh vật và đánh giá mức độ an toàn vi sinh trong bia

nấm men. Quá trình lên men là quá trình biến đổi cả về số lượng và chất lượng các thành phẩm của dịch đường để tạo thành một chất hoàn toàn khác mà người ta gọi là bia. Quá trình lên men bia chia làm hai giai đoạn: lên men chính và lên men phụ. 2.5.3.7 Lên men chính Là quá trình nhằm chuyển hóa các chất hòa tan trong dịch đường thành C2H5OH, CO2 và các sản phẩm phu khác. Trong quá trình lên men chính, nấm men sinh trưởng mạnh, nên cần cung cấp đủ oxy cho nấm men sinh trưởng. Trong quá trình này, lượng CO2 sinh ra nhiều làm tăng áp suất trong tăng nhanh chóng, do đó cần có biện pháp thu hồi CO2 nhanh chóng, để đảm bảo an toàn và có CO2 sử dụng trong hai giai đoạn sau. Quá trình lên men chính gồm có bốn giai đoạn. Ở giai đoạn thứ ba, sau khi lên men hai đến ba ngày, quá trình lên men diễn ra mạnh mẽ nhất hàm lượng chất hòa tan trong dịch len men giảm từ 2,5 – 3,0% mỗi ngày, nhiệt đọ tăng rất nhanh do đó phải thường xuyên kiểm tra và khóng chế nhiệt độ dưới 10oC. Kết thúc quá trình lên men chính, hàm lượng CO2 gần như bằng không. Đến đây sản bia thu được gọi là bia non. Khi độ đường của dịch lên men nhỏ hơn hoặc bằng 4o Plato là có thể chuyển bia non sang giai đoạn lên men phụ (Hồ Sưởng, 1992). Thời gian lên men chính thường kéo dài từ năm đến bảy ngày. 2.5.3.8 Lên men phụ Mục đích của quá trình này là tiếp tục lên men phầm chất khô còn lại sau khi lên men chính (khoảng 1%), giúp bão hòa CO2 tạo bọt cho bia, tăng cường và ổn định mùi vị, độ trong cho bia, giúp loại bỏ các hợp chất ảnh hưởng xấu đến chất lượng bia như: diaxetyl, axetandehyt Quá trình lên men phụ còn giúp ổn định bia thông qua quá trình kết tủa lạnh các phức chất protein – tanin. Quá trình lên men phụ được tiến hành như sau: bia non sau khi lên men chính được hạ xuống nhiệt độ 5 – 7oC trong vòng 48 giờ, sau đó giảm tiếp về 1 – 2oC. Trong quá trình làm lạnh tế bào phần nấm men lắng xuống đáy thùng lên men được lấy ra để xử lí. Thời gian lên men phụ và tồn trữ là 3 – 6 tuần. Trong quá trình lên men phụ cần chú ý khi chuyển bia non sang thùng lên men kín, không được để bia non tiếp xúc với không khí. Nếu oxy xâm nhập vào bia ở giai đoạn này sẽ gây ra các phản ứng oxy hóa (chất màu, polyphenol, axit amin, etanol) làm cho màu, mùi vị bia bị ảnh hưởng xấu. Oxy còn là tác nhân gây nên oxy hóa etanol tạo ra axetaldehyt, oxy hóa methanol tạo ra fomandehyt là những hợp chất gây đau đầu cho người uống. Thời gian lên men phụ và ủ chín bia rất quan trọng. Đây là giai đoạn làm cho mùi của nấm men tươi và vị đắng của hoa houblon biến mất, hàm lượng diaxetyl giảm được 50%... Nếu rút ngắn giai đoạn này thì không đảm bảo được các tiêu chuẩn về mùi vị, độ bền và giá trị sinh học của bia. Nếu các quá trình trước diễn ra không thuận lợi khiến độ bền của bia không đạt yêu cầu, thì ngay trong giai đoạn lên men phụ và giai đoạn ủ bia phải co những biện pháp xử lí kịp thời. Trong quá trình lên men phụ và ủ bia nhiều loại hợp chất đã được chuyển hóa. Các hợp chất này nếu tồn tại nhiều trong bia sẽ gây ảnh hưởng đến mùi vị, cảm quan và giá trị sinh học của bia. Diaxetyl là hợp chất có ảnh hưởng lớn nhất đến hương vị bia. Vai trò của giai đoạn lên men phụ và ủ bia làm giảm được lượng diaxetyl càng nhiều càng tốt. Hợp chất lưu huỳnh là những hợp chất gây nên vị xấu và được coi như là những chất chủ yếu gây ra vị chưa chín của bia sau khi lên men. Theo Nguyễn Thị Hiền, 2007, các hợp chất có chứa nitơ có trong dịch đường trong quá trình sản sinh của nấm men. Bảng 2.8 Một số loại diaxetyl có trong bia (P.S.Hughes và E.D.Baxter, 2001) Hợp chất diaxetyl Hàm lượng trong bia (mg/l) Ngưỡng gây mùi (mg/l) Mùi 2,3 – Butanedion 0,01 – 0,40 0,07 – 0,15 Ôi bơ 3 –Hydroxy – 2 – butanol 1,00 – 10,00 17,00 Trái cây mốc, mùi gỗ 2,3 – Butanediol 50,00 – 150,00 4500,00 Cao su 2,3 – Pentanediol 0,01 – 0,15 0,90 Ôi bơ, trái cây 3 – Hydroxy – 2 – pentanol 0,05 – 0,07 0,90 Ôi bơ, trái cây Andehyt cũng là một trong những hợp chất có ảnh hưởng lớn đến mùi vị của bia. Trong nhóm này có axetandehytđược chú ý nhất. Nó không những là hợp chất gây ảnh hưởng xấu đến mùi vị mà còn là hợp chất chính gây đau đầu khi uống bia. Các thao tác trong lúc chuyển bia từ lên men lên chính sang lên men phụ, trong các công đoạn vận chuyển dịch, ly tâm, làm lạnh có thể gây ra sự oxy hóa bia, làm chuyển etanol sang axetandehyt (Nguyễn Thị Hiền, 2007). Một số hợp chát andehyt có trong bia được chỉ ra ở bảng 2.9. Một số hợp chất khác xuất hiện trong quá trình lêm men phụ và tồn trữ axit béo mạch ngắn, các axit amin, photphat, axit nucleic, peptide, polyphenol cũng gây những ảnh hưởng nhất định đén chất lượng bia. Bảng 2.9 Một số hợp chất andehyt có trong bia (P.S.Hughes và E.D.Baxter, 2001) Hợp chất andehyt Hàm lượng trong bia (mg/l) Ngưỡng gây mùi (mg/l) Nguồn Mùi Axetandehyt 2 – Methylpropanan Hexanan Trans – 2 – Hexenan Nonanan Trans – 2 – Nonanan Fufuran 2,000 – 20,000 0,020 – 0,500 0,003 – 0,070 0,005 – 0,010 0,001 – 0,011 1x10-5 – 2x10-3 0.010 – 1,000 0,08 – 0,80 0,02 – 0,50 0,01 – 0,02 0,01 – 0,02 0,06 – 0,60 0,09 – 18,00 0,00 1 2 3 3 3 3 4 Cỏ tươi, sơn Chuối chanh Chát của rượu vang Chát và se Se và chát Mùi giấy cacton Giấy và vỏ khô * Nguồn sinh ra: 1-Oxy hóa các rượu bậc thấp. 2-Từ hoa houblon. 3-Oxy hóa axit béo. 4-Sản phẩm của phản ứng maillard. 2.5.3.9 Hoàn thiện sản phẩm 1. Lọc trong Có hai phương pháp để làm trong bia là lọc và ly tâm. Trong thực tế sản xuất thường dùng cách lọc có bộ trợ lọc diatomit. Nguyên tắc của quá trình lọc là bia và diatomot được khuấy trộn thành huyền phù, sau đó huyền phù được bơm quay vòng qua máy lọc nhiều lần để tạo màng trên lưới lọc. Sau khi đã tạo được màng lọc thì bia sẽ được lọc qua lớp diatomit này. Bia lúc đầu còn đục nên phải bơm hồi lưu lại, hồi lưu liên tục đến khi nào bia trong thì cho vào TBF. Mục đích của quá trình lọc trong là tạo độ trong “lấp lánh” cho bia, loại bỏ đáng kể các vi sinh vật bao gồm nấm men còn tồn tại trong quá trình tàn trữ, loại bỏ các phức chất protein, các hạt dạng keo polyphenol, polysaccharide và protein ít tan, làm cho bia trở nên ổn định. Bên cạnh đó, một lượng đáng kể vitamin cũng bị mất đi trong quá trình lọc trong. 2. Bão hòa CO2 Trong thực tế sản xuất, ít khi CO2 được bão hòa theo phương pháp tự nhiên lại đạt đến nồng độ cần thiết. Vì vậy cần phải có công đoạn bão hòa CO2 cho bia. Bia được cacbonic hóa ở nhiều thời điểm khác nhau như sau lên men chính, sau lên men phụ và thời gian tàn trữ. Nhưng phổ biến nhất là sau khi lọc và trước lúc chiết chai. 3. Chiết bia Mục đích của quá trình chiết bia làm tăng thời gian bảo quản cho bia, ổn địh chất lượng và mùi vị đặc trưng của bia trong quá trình vận chuyển. Bia được chiết theo nguyên tắc đẳng áp trong hệ thống tuần hoàn kín để ổn định chất lượng bia. Trong quá trình chiết bia phải giữ trạng thái ổn định, hạn chế thấp nhất sự xáo trộn bia để tránh gây trào bia và tổn thất CO2, giảm thiểu sự xâm nhập O2 và vi sinh vật vào trong bia. Chai và bốc phải vệ sinh sạch trước khi chiết. Giai đoạn này có ảnh hưởng khá nhiều đến chất lượng bia. Nếu không đảm bảo vệ sinh sẽ làm cho bia bị nhiễm vi sinh vật. Một số vi sinh vật sẽ ảnh hưởng đến giá trị cảm quan, làm thay đổi hóa lí của bia. Trong đó có một số vi khuẩn lactic có thể tiếc ra enzym decaboxylaza khử tyrosin thành tyramin, là hợp chất gây đau đầu cho người uống. Ngoài ra, nếu trong quá trình này oxy xâm nhập vào bia nhiều sẽ gây oxy hóa etanol sinh ra axetandehyt, nguyên nhân chính gây đau đầu trong bia. 4.Thanh trùng bia Trong bia thành phẩm, sản xuất theo các phương pháp thông thường luôn luôn chứa các tế bào còn sống, bao gồm nấm men thuần chủng và các vi sinh vật lạ khác. Một số vi sinh vật ngoại lai như vi khuẩn axetic, một số nấm sợi, vi khuẩn thuộc nhóm E.coli và nhiều loại khác không thể phát triển được trong bia. Nguyên nhân là vì trong đó không có oxy, lại có hàm lượng ethanol đáng kể, các chất đắng và pH cũng tương đối thấp. Nấm men kể cả nấm men giống và một số loài nấm men dại, vi khuẩn lactic thuộc nhóm Sarcina và một số khác dễ dàng phát triển trong bia. Xử lí nhiệt là một trong những giải pháp quan trọng nhất để diệt vi sinh vật. Nội dung này được chia làm hai cấp: tiệt trùng và thanh trùng. Tiệt trùng là nâng nhiệt độ lên đến 100 – 120oC, còn thanh trùng chỉ ở 60 – 80oC. Thời gian cần thiết để diệt các tế bào vi sinh vật phụ thuộc vào nhiệt độ. Khả năng chịu nhiệt của các loài vi sinh vật khác nhau cũng khác nhau, và khả năng đó dao động trong khoảng khá rộng. Ngoại trừ một số,còn đa số nấm men đều bị diệt ở nhiệt độ 62 – 63oC trong vòng 2 phút, ở nhiệt độ đó, phải kéo dài tới 15 – 20 phút nhiều loại vi khuẩn mới bị tiêu diệt. Còn vi khuẩn chịu nhiệt thì với thời gian đó mà ở nhiệt độ 100oC chúng vẫn không chết. Bào tử của nấm men và nấm mốc kém chịu nhiệt hơn so với bào tử của vi khuẩn. Chúng bị diệt ở 80oC, còn bào tử của vi khuẩn , nhiều trường hợp phải ở nhiệt độ 120oC trong 30 phút may ra mới tiêu diệt được chúng. Thanh trùng bia sẽ dẫn đến sự thay đổi bất lợi cho hương, vị và màu sắc của sản phẩm. Ngay sau khi thanh trùng, những sự thay đổi đó rất khó nhận ra, nhưng sau một thời gian bảo quản thì chúng mới lộ rõ. Một trong những nguyên nhân dẫn đến sự thay đổi đó là sự tạo thành melanoid. Có hai phương pháp thanh trùng bia: thanh trùng cả khối và thanh trùng trong bao bì. Thanh trùng cả khối lại có hai phương án: chiết chai ở nhiệt độ cao và chiết chai sau khi làm lạnh. Trong cả hai phương án này thì thiết bị trao đổi nhiệt thông dụng nhất vẫn là máy tấm bản. 2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng bia 2.6.1 Loại nấm men Chỉ tiêu này ảnh hưởng đến các thông số của quá trình công nghệ và đến hương vị của sản phẩm cuối cùng do khả năng kết bông, lắng và khả năng sống của nấm men. Chủng nấm men được lựa chọn phải có tính ổn định về các đặc trưng trên. 2.6.2 Tăng trưởng của nấm men Vận tốc lên men phụ thuộc vào chất lượng của nấm men, vào nhiệt độ và vào nồng độ ban đầu của dịch đường. Tăng trưởng của nấm men phụ thuộc vào các yếu tố sau: - Tỷ lệ men giống vừa phải. - Cấy giống càng sớm càng tốt. - Sự phân bố đồng đều của nấm men trong dịch. - Khả năng sinh trưởng cực đại của nấm men. - Nhiệt độ lên men và thông khí thích hợp. 2.6.3 Lượng nấm men Cấy vào trong dịch khoảng 10 – 18 triệu tế bào/ml dịch. Nồng độ bia càng cao, tỷ lệ nấm men cấy ban đầu càng phải lớn để duy tì thời gian lên men. 2.6.4 Nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ phải nằm trong khoảng 7 – 10oC để đảm bảo quá trình lên men bắt đầu nhanh, tuy nhiên không quá nhanh. Quá trình lên men không được bắt đầu trước khi mẻ dịch cuối cùng đưa vào tank lên men. Sẽ xuất hiện khó khăn nếu thời gian điền đầy dịch vào một thiết bị lên men lớn hơn 24h. 2.6.5 Thông khí Trong thiết bị lên men đang được điền đầy bằng các mẻ dịch liên tiếp, cần phải giảm quá trình thông khí. Nếu một tank lên men nhận được 5 – 6 mẻ trong 24h, trong hai mẻ đầu cần phải giảm thông khí. Nếu quá trình điền đầy dịch trong tank lên men có thể tích lớn bị kéo dài sẽ dẫn đến giảm sự hình thành các este và tăng sự hình thành các rượu bậc cao, axetaldehyt và diaxetyl 2.6.6 Tăng trưởng của nấm men Nếu trong quá trình lên men, nấm men phát triển gấp 3 lần về số lượng thì được coi là bình thường, hai phần sẽ được lấy ra để cấy vào các mẻ lên men sau, một phần được giữ lại trong quá trình làm chín bia. Nấm men tăng trưởng càng nhiều, sự hình thành rượu bậc cao càng tăng trong khi sự hình thành este lại giảm 2.6.7 Nhiệt độ lên men Nhiệt độ lên men càng cao (khoảng 10 – 25oC) cường độ lên men càng nhanh và lượng este, diaxetyl hình thành càng tăng. 2.6.8 Aûnh hưởng của áp suất Sử dụng áp suất trong quá trình lên men (0,3 – 0,7 bar) sẽ làm tăng sự hòa tan CO2 nhưng lại làm giảm tăng trưởng nấm men. Vì vậy ảnh hưởng của áp suất đến quá trình lên men ngược lại so với ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men. Nó chỉ được sử dụng trong phần lớn các phương pháp lên men gia tốc 2.6.9 Nhiệt độ của quá trình lên men phụ Nhiệt độ trong khi làm chín bia có thể làm tăng lên bằng cách giảm diaxetyl ở nhiệt độ cao: 3 ngày 12oC và 1 ngày ở 20oC nhưng sẽ dẫn đến nguy cơ tự phân. Quá trình làm chín bia có thể thực hiện ở 5 – 8oC đặc biệt đối với nấm men không kết lắng. Bia được giảm từ lên men chính đến nhiệt độ lên men phụ trong 24 – 36h. Nhiệt độ này được giữ trong 5 – 8 ngày cho đến khi diaxetyl được khử hoàn toàn (< 0,1 mg/l). Các hợp chất không mong muốn khác như axetaldehyt, H2S và mercaptan được khử trong quá trình này 2.7 Hệ vi sinh vật trong bia 2.7.1 Vi sinh vật gây hư hỏng bia Bia là môi trường nghèo dinh dưỡng, không phải là môi trường thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật. Nồng độ ethanol trong bia thường là 4 – 5%. Bia có độ pH từ 3,8 – 4,7 thấp hơn độ pH thích hợp cho sự tăng trưởng của vi sinh vật. Hơn nữa, nồng độ CO2 cao và nồng độ O2 rất thấp làm cho bia gần như kỵ khí. Bia cũng chứa những hợp chất đắng của hoa houblon (khoảng 17 – 55ppm của iso-α-acid) là chất độc đối với các vi khuẩn Gram dương. Nồng độ chất dinh dưỡng chẳng hạn như saccharide, acid amin rất thấp vì hầu hết đã được tiêu thụ bởi nấm men trong quá trình lên men. Vì vậy, chỉ có một số loài vi khuẩn có thể phát triển được trong môi trường bia và có thể làm hư hỏng bia (xem bảng ), trong đó bao gồm cả loài vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm. Vi khuẩn Gram dương hầu hết đều thuộc nhóm vi khuẩn Lactic, được xem là nhóm vi khuẩn gây hại nhất cho ngành công nghiệp sản xuất bia và nguyên chính của các sự cố gây hư hỏng bia. Hiện nay, các loài vi khuẩn hiếu khí không phải là một vấn đề nghiêm trọng trong hư hỏng bia từ khi nồng độ O2 được giảm mạnh. Thay vào đó là các vi khuẩn kị khí: Pectinatus.spp. và Megasphaera cerevisiae gây ảnh hưởng nghiêm trọng đối vời ngành công nghiệp sản xuất bia. 2.7.1.1 Vi khuẩn gram (+) Hầu hết các vi khuẩn Gram dương gây hư hỏng bia thuộc nhóm vi khuẩn lactic, nhưng chỉ có một vài chủng vi khuẩn lactic là tác nhân gây hư hỏng bia: Lactobacillus và Pediococcus. Chúng là vi khuẩn gram (+), không sinh bào tử, phản ứng âm tính trong kiểm tra có xúc tác (10% H2O2 tạo ra làm sủi bọt môi trường) a. Lactobacillus Họ Lactobacillus là họ lớn nhất trong họ vi khuẩn lactic với rất nhiều loài. Chúng được sử dụng rộng rãi trong các quá trình lên men khác nhau bao gồm các sản phẩm thực phẩm như rượu vang, bia, yoghurt và dưa chua. Chúng có dạng hình que với kích thước 1,0 x (2 - 20)μm. Các vi khuẩn chịu axit này bị ức chế bởi nòng độ O2 thấp va nồng độ CO2 cao. Quá trình sinh trưởng được kích thích khi có mặt khí CO2, sinh trưởng mạnh nhất ở 30oC. Quá trình chuyển hóa của vi sinh vật có thể lên men đồng hình, sản phẩm cuối cùng tạo ra là axit lactic Trái với ý kiến tin rằng tất cả các chủng Lactobacillus đều có thể tăng trưởng trong bia những một số báo cáo chỉ ra rằng chỉ có một số loài có khả năng làm bia hư hỏng. L.brevis là loài gây hư hỏng bia được phát hiện thấy nhiều ở trong bia và nhà máy bia, hơn một nửa sự cố là do vi khuẩn loài này gây ra, phát triển tối ưu ở nhiệt độ 30oC, độ pH từ 4 – 6 và thường kháng với hợp chất đắng của hoa houblon. Điều quan trọng thứ hai vi khuẩn gây hư hỏng trong bia, L.lindneri chiếm 15 – 25% các vi khuẩn gây hư hỏng bia. Sinh lý học tương tự như L.brevis và gần đây được công nhận như một loài riêng biệt thuộc họ Lactobacillius. Khả năng chống các hợp chất đắng rất cao, phát triển tối ưu ở nhiệt độ 19 – 23oC chịu nhiệt hơn so với các vi khuẩn Latic khác. Mọi chủng L.lindneri đều có khả năng gây hư hỏng bia. L.lindneri phát triển chậm trên các môi trường thường dùng, nhưng phát triển rất nhanh trong bia là mối nguy hại cho các nhà sản xuất bia. L. buchneri, L. casei, L. coryneformic, L. curvatus và L. plantarum ít phổ biến hơn so với hai loài mô tả trên. L. buchneri tương tự như L.brevis nhưng khác ở khả năng lên men melezitose, một số chủng L. buchneri cần có riboflavin trong quá trình tăng trưởng của chúng. L. casei có thể sản sinh ra diacetyl gây cho bia có hương vị ôi bơ gây khó chịu cho người tiêu dùng. Ngưỡng giá trị của diacetyl trong bia thấp hơn nhiều (0,15 ppm) so với acid lactic (300 ppm). Diacetyl cũng được sản xuất bởi nấm men trong quá trình lên men và sẽ được sản sinh ra nhiều hơn nếu nấm men dại không được loại bỏ sau khi lên men chính. L. brevisimilis, L. malefermentans, L. parabuchneri, L. collinoides và L. paracasei subsp. Paracasei cũng được báo cáo là loài vi khuẩn làm hư hỏng bia. b. Pediococcus Pediococci là vi khuẩn lên men đồng hình có thể tăng trưởng thành từng cặp hoặc theo từng cụm bốn tế bào. Chúng cần có vitamin để sinh trưởng hoặc kích thích sinh trưởng và nhiệt độ tối ưu là khoảng 25oC. Trong bia, cuối quá trình lên men và trong quá trình bảo quản thì nhiễm tạp Pediococcus phổ biến hơn so với nhiễm tạp Lactobacillus. Đặc biệt chúng làm hỏng bia ở nhiệt độ thấp. Kết quả chủ yếu là tạo ra diaxetyl. Pediococcus có thể được phân lập trêm môi trường của Lactobacillus. Ủ ở 25oC trong điều kiện yếm khí như các vi khuẩn Gram(+)khác bị nhiễm nhiều lần làm cho bia chua, vị ôi bơ. Chúng được tìm thấy ở nhiều giai đoạn trong quá trình sản xuất bia. Một số Pediococci spp đã được tìm thấy tại các nhà máy bia: P. acidilactici, P. damnosus, P. dextrinicus, P. halophilus (gần đây được phân loại là Tetragenococcus halophilus), P. inolinatus, P. parvulus và P. pentosaceus. Trong số đó P. damnosus phổ biến nhất. Các tỷ lệ hư hỏng bia bởi Pediococci đã giảm nhiều là kết quả của việc cải thiện điều kiện vệ sinh trong nhà máy bia. P. damnosus thường kháng các hợp chất của hoa houblon. Điều thú vị là P. damnosus thường được tìm thấy trong bia sản phẩm và len men phụ. Ngược lại, P. inolinatus thường xuất hiện trong nấm men nhưng hiếm thấy trong các giai đoạn lên men. P. dextrinicus, P. inolinatus phát triển ở pH trên 4,2, nồng độ ethanol thấp và các hợp chất của hoa houblon. P. acidilactici, P. pentosaceus chưa bao giờ được báo cáo là gây ra bất kì khiếm khuyết nào trong bia thành phẩm. Số lượng diacetyl sản xuất bởi loài pediococcus thay đổi tùy từng loài với các loài P. damnosus sản xuất số lượng lớn diacetyl, P. inolinatus và P. pentosaceus ít hơn( không có gì cả). Do đó các nhà sản xuất thường chú ý đến P. damnosus. c. Các vi khuẩn Gram dương khác Ngoài Pediococcus thuộc họ Lactobacillus, một loài từ họ Micrococcus thỉnh thoảng cũng gây ra hư hỏng cho bia, có thể phát triển trong bia với pH có giá trị trên 4,5, nồng độ ethanol và nồng độ các hợp chất đắng trong hoa houblon thấp. Micrococcus cũng có thể phát triển trong điều kiện kị khí, nó tạo ra một mùi hương trái cây không điển hình trong bia Vi khuẩn gram âm Một số họ của các vi khuẩn Gram âm được biết là có liên quan đến sự hư hỏng của bia. Sự hiện diện của màng kị nước ngoài làm Gram âm vi khuẩn thường kháng với các hợp chất đắng của hoa houblon. Các sự cố hư hỏng trong bia do vi khuẩn đã được giẩm đáng kể do lượng O2 thấp hơn nhiều trong các quá trình lên men và trong bia thành phẩm của các nhà máy bia hiện đại. Thay vào đó, sự xuất hiện của các vi khuẩn kị khí trong các sự cố hư hỏng bia đã tăng lên. Chúng bao gồm các họ Pectinatus, Megaspahera, Selenomonas, Zymomonas và Zymophilus. Đặc biệt Pectinatus và Megaspahera gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng cho các nhà máy bia hơn Lactobacilli và Pediococci, chủ yếu là gây ra mùi trứng thối trong bia thành phẩm. a. Pectinatus Pectinatus .spp là một trong những vi khuẩn gây hư hỏng bia nguy hiểm nhất. Chúng đóng vai trò lớn trong 2 – 3% sự cố hư hỏng bia do vi khuẩn, chủ yếu ở bia hơi. Các môi trường sống tự nhiên của các loài Pectinatus vẫn còn chưa biết. Trực khuẩn Gram (-), hơi cong, chuyển động, tròn xoe ở một đầu hoặc hai đầu. Tế bào trưởng thành rất linh hoạt và có hình chữ “X” là do sự chuyển động của chúng. Tế bào già đi chuyển theo kiếu giống con rắn. Kích thước tế bào là (0,7 – 0,9) x (2,0 - 32)μm. Tiên mao nhô ra từ một vị trí trên tế bào. Được xem là trung gian giữa vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm. Nhiệt độ tăng trưởng từ 15 – 40oC với nhiệt độ tối ưu 32oC, pH từ 3,5 – 6 với pH tối ưu 4,5. Acid propionic và acetic được sản xuất nhiều trong quá trình tăng trưởng cũng như succinic, acid lactic và acetol. Pectinatus .spp cũng có thể lên men acid lactic. Tính năng đặc trưng nhất của hư hỏng bia gây ra bởi Pectinatus .spp rất phong phú: độ đục, có mùi trứng thối mang theo sự kết hợp của các acid béo, hydro sulfua và mecaptan methyl. Hoạt động này gây ra hư hỏng và thiệt hại nghiêm trọng cho các nhà máy bia. b. Megasphaera Megasphaera là cầu khuẩn Gram (-), bất động và yếm khí bắt buộc, không sinh bào tử, monofile, mesophilic cầu khuẩn xảy ra đơn lẻ hoặc theo từng cặp và đôi khi như các chuỗi ngắn. Họ này gồm hai loài: M. elsdenic và M. cerevisiae. M. cerevisiae phát triển ở 15 – 37oC, tối ưu ở nhiệt độ 28oC và ở giá trị pH trên 4,1. Sự tăng trưởng của loài này bị ức chế ở nồng độ ethanol 2,8 (w/v) nhưng vẫn có thể lên đến 5,5(w/v). Sự hư hỏng bia là do tạo ra một lượng đáng kể axit butyric và một lượng nhỏ axit caproic. Megasphaera có thể phát triển ở điều kiện yếm khí trong môi trường bia được làm giàu bởi glucose và pepton (các peptit đẽ tiêu hóa trong thịt). Dấu hiệu bia hỏng giống như Pectinatus, sản sinh ra hydro sunfua gây ra mùi khó chịu trong bia, là một trong những vi sinh vật đáng sợ nhất đối với bia. Bảng 2.10 Các vi khuẩn gây hư hỏng bia Vi khuẩn Gram dương Hình gậy Cầu khuẩn Lactobacillus spp L. brevis L. brevisimilis L.buchneri L. casei L. coryneformic L. curvatus L. lindneri L. malefermentans L. parabuchneri L. Plantarum Pediococcus spp P. damnosus P. dextrinicus P. inopinatus Micrococcus sp M. kristinae Vi khuẩn Gram âm Hình gậy Cầu khuẩn Pectinatus spp P. cerevisiphilus P. frisingensis P. sp. DSM20764 Selenomonas sp S. lacticifex Zymophilus sp Z. raffinosivorans Megasphaera sp M. cerevisiae Zymomonas sp Z. mobilis 2.7.2 Vi sinh vật gây bệnh Danh sách các vi sinh vật mà chúng tôi đè cập được dựa trên TCVN 7042 : 2002 gồm các chỉ tiêu vi sinh vật như sau: tổng số vi khuẩn hiếu khí, tổng số bào tử nấm men – mốc, Coliform, Escheria coli, Staphylococcus areus, Clotridium perfrigens. Trong đó nhóm vi khuẩn Escheria coli, Staphylococcus areus, Clotridium perfrigens thuộc vi khuẩn gây bệnh, tổng số bào tử nấm men – mốc thuộc vi sinh vật gay hư hỏng sản phẩm, nhóm Coliforms và tổng số vi khuẩn hiếu khí chỉ thị điều kiện thực hành sản xuất kém. 2.7.2.1 Tổng số vi khuẩn hiếu khí Chỉ số này còn có tên gọi khác là: số vi sinh vật hiếu khí, tổng số đếm trên đĩa, tổng số vi sinh vật sống, số đếm đĩa chuẩn. Chỉ tiêu này được dùng để đánh giá mức độ nhiễm tạp của nguyên liệu và sản phẩm. Từ đó đánh giá tình trạng vệ sinh và các điều kiện bảo quản sản phẩm và dự đoán khả năng hư hỏng của sản phẩm. Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử (O2). Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này đưựoc xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm. 2.7.2.2 Staphylococcus areus Staphylococcus areus là vi sinh vật có khả năng sản sinh một loại độc tố đường ruột bền nhiệt, không bị phân hủy khi đun ở ở 100oC trong khoảng 30 phút. Staphylococcus areus không có khả năng cạnh tranh cao so với các vi khuẩn gây hỏng thực phẩm khác nhưng đôi khi không có đối thủ cạnh tranh, chẳng hạn trong thực phẩm muối hoặc chế biến, chúng có thể sinh sôi và tạo ra độc tố bền nhiệt. Khi vi sinh vật này xâm mhiễm vào trong thực phẩm, chúng tiết độc tố vào sản phẩm và gây độ độc. Khi con người tiêu thụ thực phẩm có chứa độc tố này, sau 4 – 6 giờ ủ bệnh sẽ bộc phát các triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy, nôn mửa, các triệu chứng này kéo dài từ 6 – 8 giờ. Các nguồn lây nhiễm vào thực phẩm chủ yếu từ các khâu chế biến. Trong tự nhiên các vi sinh vật này thường tìm thấy trên da, mũi, tóc hay lông của các loài động vật máu nóng 2.7.2.3 Clostridium perfrigens Là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, di động, kị khí, có trong phân người và động vật cho nên cũng được làm vi sinh vật chỉ thị về khả năng nhiễm phân. Bào tử có mặt ở khắp mọi nơi trong môi trường và dễ dàng nhiễm vào thực phẩm. Quan niệm về sự ngộ độc thực phẩm do Clostridium perfrigens gây ra đã có những thay đổi trong những năm gần đây. Theo những quan niệm trước đây cho rằng các dòng Clostridium perfrigens kháng nhiệt, tạo bào tử và không làm tan máu mới có thể gây ngộ độc thực phẩm. Nhưng trong những năm gần đây các dòng nhạy cảm với nhiệt, không làm tan máu cũng được tìm thấy trong các vụ ngộ độc do vi sinh vật này gây nên. Vì các bào tử của Clostridium perfrigens kháng nhiệt nên chúng thường sống sót qua quá trình nấu chín. Tuy nhiên cũng phụ thuộc vào thời gian tiếp xúc với nhiệt. Nếu những bào tử sống sót, khi gặp điều kiện thích hợp chúng sẽ nảy mầm và nhân lên. Khi đun nấu thức ăn ở nhiệt độ thấp và thời gian ngắn có thể làm cho các dòng kháng nhiệt tồn tại vì thế chúng sẽ gây tái nhiễm sau khi bảo quản. Clostridium perfrigens gây bệnh đường tiêu hóa cho người tiêu dùng khi sử dụng thực phẩm có một lượng lớn tế bào vi khuẩn sống. Mặt khác khi vi khuẩn hình thành bào tử có khả năng gây độc tố gây chứng bệnh ngộ độc. Bệnh xuất hiện với những triệu chứng của ngộ độc do độc tố của vi sinh vật này gây ra: đau thắt vùng bụng, tiêu chảy, đôi khi nôn mửa xuất hiện sau 8 – 20 giờ khi ăn một lượng lớn tế bào sống Clostridium perfrigens. Thời gian ủ bệnh là 12 – 24 giờ. 2.7.2.4 Nấm men – nấm mốc Đây lầ nhóm vi sinh vật nhân thật, thuộc nhóm dị dưỡng, chúng cần nguồn carbon hữu cơ để cung cấp năng lượng từ môi trường bên ngoài, chúng rất đa dạng về chủng loại. Hầu hết nấm men và nấm mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, một số khác có thể phát triển trong diều kiện vi hiếu khí. Là vi sinh vật ưa mát, nhiệt độ thích hợp từ 20 – 28oC, một số khác ưa lạnh hay ưa nóng. Thông thường chỉ có nấm mốc gây ra độc tố làm trúng độc. Người ăn phải nấm mốc có thể bị khối u trong gan, gây ra ung thư gan, tác động lên thận làm suy thoái thận. 2.7.2.5 Coliforms Coliforms được xem là những vi sinh vật chỉ thị an toàn vệ sinh, bởi vì số lượng của chúng hiện diện trong mẫu chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác trong thực phẩm. Các nhà nghiên cứu cho rằng số lượng Coliforms trong thực phẩm càng cao thì khả năng hiện diện các vi sinh vật gây bệnh khác cũng rất lớn. Coliforms là nhóm trực khuẩn đường ruột gram ( - ) không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi, có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 37oC trong vòng 24 giờ. Coliforms chịu nhiệt là những coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 44oC trong môi trường canh EC. Coliforms phân (Faecal Coliforms hay E. coli giả định) là coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi được ủ khoảng 24 giờ ở 44,5oC trong canh trypton. Coliforms phân là một thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột ở người và các động vật máu nóng khác, được sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm và nước uống cũng như để chỉ thị sự ô nhiễm phân trong mẫu môi trường. Trên thực tế kiểm nghiệm Coliforms phân được quan tâm nhiều hơn, đặc biệt là E.coli là loại được quan tâm nhiều nhất về vệ sinh an toàn thực phẩm. Nhóm Coliforms gồm 4 giống đó là Escherichia với một loài duy nhất là E.coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacte (gồm hai loài E.aerobacte và E.cloacae). Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm IMViC Bảng 2.11 Biểu hiện sinh hóa các giống của Coliforms Phản ứng Indol Methyl Red Voges Proskauer Citrat Escherichia +(-) + - - Citrobacter -(+) + - + Klebsiella -(+) - + + Enterobacte -(+) - + + Ghi chú: (+) phản ứng dương tính, (-) phản ứng âm tính, +(-) đa số là phản ứng dương tính và –(+) đa số là phản âm tính Coliforms phát triển tốt trên nhiều loại môi trường, nhiều loại thực phẩm. Có những nghiên cứu cho thấy chúng có thể phát triển ở nhiệt độ thấp đến -2oC và cao đến 50oC. Trong thực phẩm chúng phát triển yếu và rất chậm ở 5oC tuy cũng có tài liệu ghi nhận sự phát triển của chúng ở 3 – 6oC. Ngưỡng pH để Coliforms có thể phát triển là 4,4 – 9 E.coli có thể phát triển trên môi trường tối thiểu chỉ chứa một nguồn carbon duy nhất (chẳng hạn glucose) và một nguồn nitơ duy nhất như (NH4)2SO4 cùng vài loại khoáng khác. Chúng phát triển tốt trên môi trường thạch thường, cho những khuẩn lạc thấy được sau 12 – 16 giờ ở 37oC, phát triển tốt ở rất nhiều loại thực phẩm trong điều kiện thích hợp. Coliforms có hai nhóm: - Coliforms có nguồn gốc từ phân phát triển nhanh, khoảng 16 giờ, trong môi trường dinh dưỡng ở 44oC, không mọc ở 4oC trong 30 ngày. Là loại vi khuẩn ưa nhiệt, nhiệt độ thích hợp nhất là 41oC. - Coliforms không có nguồn gốc từ phân, chúng có nguồn gốc thủy sinh hay từ đất, mọc nhanh ở 4oC trong 3 – 4 ngày và 10oC trong 1 ngày. Không mọc ở 41oC, ở 44oC ức chế hoàn toàn sự phát triển của tất cả các coliforms không có nguồn gốc từ phân. 2.7.2.6 Escherichia coli Vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) thuộc: - Lớp: Schazomyces. - Bộ: Eubacteriales - Họ: Enterobacteriaceae - Giống: Escherichia - Loài: Escherichia coli Escherichia coli còn có tên là Bacteriam coli Commue được ông Escherich phát hiện năm 1885 trong trường hợp tiêu chảy ở trẻ em. Theo P.J.Quinn và cs (1994), E.coli có nhiều trong ruột của động vật ăn thịt, ăn tạp hơn là động vật ăn cỏ, sống vài tuần đến vài tháng trong bụi, phân, nước, ngoài tự nhiên. Hầu hết chúng không gây hại cho người và động vật, giúp ổn định sinh lí đường ruột. Tuy nhiên cho đến nay đã phát hiện được 5 dòng có khả năng gây hại cho người và động vật: - EAEC (Enteroaggregative E.coli), E. coli kết tập ở ruột. - EHEC (Enterohemorrhagic E.coli), E. coli gây xuất huyết ở ruột. - EPEC (Enteropathogenic E.coli), E. coli gây bệnh đường ruột. - ETEC (Enterotoxigenic E.coli), E. coli sinh độc tố ruột. - EIEC (Enteroinvasive E.coli), E. coli xâm lấn niêm mạc ruột. E. coli là trực khuẩn hình gậy ngắn, gram âm bắt màu hồng,hiếu khí hay kị khí tùy nghi, kích thước dài hay ngắn tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy trung bình 2 – 3 μm x 0,5μm, hai đầu tròn, có lông quanh tế bào, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, di động không hình thành nha bào. Nhiệt độ phát triển thích hợp là 37oC, pH = 7,4. Mọc tốt trên môi trường dinh dưỡng thông thông thường được nhiệt độ biến thiên từ 4 – 45oC. Hình 2.6 Vi khuẩn Escherichia coli Bảng 2.12 đặc điểm hình thái khuẩn lạc E. coli trên một số môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy Đặc điểm Thạch dinh dưỡng Khuẩn lạc tròn ướt, màu trắng đục hơi lồi để lâu có dạng khô rìa hơi nhăn Thạch máu Chủng dung huyết α hoặc β Thạch gelatin Thạch không tan chảy Môi trường canh dinh dưỡng Đục đều môi trường, sau lắng xuống đáy, có màu tro nhạt đôi khi có màu xám, có mùi trứng thối Eosin mythylen (EMB) Khuẩn lạc có ánh kim tím MacConkey (MCK) Tạo khóm đỏ hồng Kligler iron agar (KIA) Lên men đường glucose và lactose (vàng/vàng), sinh gas, không sinh H2S Brilliant green agar (BGA) Khuẩn lạc xanh lá mạ 2.8 Các phương pháp thông thường phát hiện coliforms và Escherichia coli 2.8.1 Vật liệu và thiết bị - Đặt trong bể điều nhiệt duy trì ở nhiệt độ 45,5oC ±2oC, mực nước phải ngập môi trường. - Loại nhiệt kế giành cho phòng thí nghiệm 1- 55oC, với 0,1oC đơn vị. - Ủ ở 35oC ± 1oC. - Máy lắc. - Vô trùng pipet 1 và 10ml. - Vô trùng dụng cụ xử lí mẫu. - Chuẩn bị bình pha loãng bằng thủy tinh chịu nhiệt, cổ nhám, nắp nhám bằng polyethylen. - Chuẩn bị buret đã vô trùng chứa dung dịch đệm phosphat. - pH kế. 2.8.2 Môi trường và hóa chất - Brilliant green lactose bile (BGLB) broth, 2%. - Lauryl tryptose (LST) broth - EC broth - Levine's eosin-methylene blue (L-EMB) agar - Tryptone (tryptophane) broth - MR-VP broth - Koser's citrate broth - Plate count agar (PCA) (standard methods) - Butterfield's phosphate-buffered water or equivalent diluent (except for shellfish) - Kovacs' reagent - Voges-Proskauer (VP) reagents - Gram stain reagents - Methyl red indicator - Violet red bile agar (VRBA) - VRBA-MUG agar - EC-MUG medium - Lauryl tryptose MUG (LST-MUG) broth - Peptone Diluent, 0.1% 2.8.3 MPN kiểm tra cho Coliforms, Coliform phân và E.coli Cân 50g mẫu cho vào bình vô trùng và li tâm ở tốc độ cao. Nếu mẫu lưu trữ trên 18 giờ phải được đông lạnh ở nhiệt độ 2 – 5 oC. Thêm 450 ml dung dịch đệm phosphat và li tâm trong vòng 2 phút. Chuẩn bị dung dịch pha loãng với chất pha loãng vô trùng. Số lượng các dung dịch pha loãng phụ thuộc vào mật độ Coliforms dự đoán. Lắc 25 lần hoặc xoáy trộn 7giây. Không sử dụng pipets để cung cấp lớn hơn 10% tổng khối lượng của mẫu.Chuyển 1ml mẫu vào 3 ống nghiệm, mỗi độ pha loãng tiến hành lặp lại 3 lần. Chú ý: Sử dụng 5 ống MPN để phân tích động vật có vỏ và vùng nước thu hoạch sò ốc. Ủ các ống ở 35oC thời gian 24h. Các ống âm tính được ủ tiếp ở 24h để kiểm tra và ghi lại phản ứng. 2.8.4 MPN – kiểm tra các dạng vi khuẩn Coli Từ mỗi ống nghiệm sinh khí ở trên, lấy một phần chuyển sang ống nghiệm chứa môi trường BGBL.Ủ các ống ở 35oC, thời gian 48h. 2.8.5 MPN – thử nghiệm IMViC a. Indole: Cấy VSV thử nghiệm qua mơi trường canh trypton ủ khoảng 24 giờ ở 37oC. Nhỏ vài giọt ether để kéo indol lên bề mặt mơi trường, thêm vài giọt thuớc thử Kovac’s. Quan sát sau vài phút. Thử nghiệm (+): trên bề mặt mơi trường xuất hiện vòng màu đỏ cánh sen. Thử nghiệm (-): khơng xuất hiện vòng đỏ. Hình 2.7 Thử nghiệm Indole b. Voges – proskauer (VP): Cấy vi sinh vật vào trong mơi trường glucose phosphate (MR-VP Broth). Ủ ở nhiệt đợ 370C trong vòng từ 2-5 ngày. Thêm vào canh khuẩn dung dịch thuớc thử anpha- naphtol 5% trong cờn và dung dịch KOH 40% hay NaOH 40 %. với tỷ lệ 3:1. Quan sát phản ứng xảy ra trong 5 phút. Thử nghiệm (+):xuất hiện màu đỏ hay hồng sáng trên mặt mơi trường. Thử nghiệm (-): mơi trường khơng đởi màu. Hình 2.8 Thử nghiệm Voges – proskauer c. Methyl: sau khi thử nghiệm VP, tiếp tục ủ các ống nghiệm trên thêm 48h ở 35oC. Thêm 5 giọt dung dịch methyl đỏ vào mỗi ống. Nếu có màu vàng là phản ứng âm tính. d. Citrat: môi trường thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate sử dụng citrate làm nguồn cacbon duy nhất có chứa muối ammonium dùng làm nguồn đạm tăng giá trị pH của môi trường. Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường. e. Sử dụng đường lactose: cấy vào một ống của LST và ủ ở 48h ở 35oC. Nếu có khí sinh ra là phản ứng âm tính Bảng 2.13 Bảng kết quả thử nghiệm IMViC STT Thử nghiệm sinh hĩa Kết quả Kết quả Kết quả 1 2 3 4 Indol Methyl Red Voges Proskauer Khả năng sử dụng citrate + + - - + - + - - - + + Sự hiện diện của E.coli trong mẫu Cĩ Khơng khơng CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM 3.1 Định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN 3.1.2 Giới thiệu phương pháp MPN Phương pháp MPN là phương pháp có thể thay thế phương pháp đếm khuẩn lạc để xác định mật độ vi sinh vật trong mẫu, phương pháp này được dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân phân bố vi sinh vật trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu. Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lặp lại nhiều lần trong các môi trường lỏng đã được chọn, thông thường phải cấy lặp lại từ 3-10 lần tại mỗi nồng độ pha loãng. Các độ pha loãng được tiến hành sao cho trong các lần lặp lại có một số lần cho dầu hiệu dương tính và một số lần cho dấu hiệu âm tính. Số lần lặp lại cho dấu hiệu dương tính và âm tính được ghi nhận để đối chiếu với bảng thống kê ( bảng Mac Crady ) sẽ được giá trị ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu. Quy trình thực hiện của phương pháp này như sau: cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của từng loại vi sinh vật cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu đã được pha loãng .Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Ghi nhận lại số ống cho kết quả dương tính và âm tính của từng độ pha loãng .Sử dụng kết quả này và tra bảng Mac Crady để tính được mật độ vi sinh vật .Đô chính xác của phương pháp này phụ thuộc vào số ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng : số lần lặp lại ở mỗi độ pha loãng càng lớn thì độ chính xác của trị số MPN càng cao. Phương pháp MPN được dùng để phân tích Coliform và các nhóm vi sinh vật khác khi chúng phát triển được trong môi trường lỏng và tạo ra các tín hiệu dễ dàng nhận dạng như: sinh hơi, làm đục môi trường chọn lọc, làm thay đổi pH môi trường 1.1 1.2 1.3 10-1 10-2 10-3 1ml 1ml 2.1 2.2 2.3 3.1 3.2 3.3 Các nồng độ pha loãng Hình : Hệ thống định lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN 3.2 Xác định tổng số Coliforms 3.2.1 Định nghĩa Coliforms Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi, có khả năng lên men lactose. Sau khi ủ 37oC± 1oC trong 24 – 48 giờ. Nhóm Coliforms hiện diện khắp nơi trong tự nhiên, trong ruột người và động vật. Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện củ chúng trong thực phẩm trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. 3.2.2 Nguyên tắc Mẫu đã được đồng nhất được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Sau khi ủ ở 37oC ± 1oC trong 24 = 48h, đếm số lượng khuẩn lạc Coliforms điển hình. Xác định lại bằng các phản ứng đặc trưng. Môi trường chọn lọc Coliforms là môi trường chứa lactose, đây là nguồn carbon duy nhất, đồng thời môi trường còn chứa muối mật như một tác nhân chọn lọc các tác nhân chỉ thị như neutral red, crystal violet. Khẳng định các dòng khuẩn lạc đặc trưng bằng môi trường canh chọn lọc như canh BGBL. 3.2.3 Môi trường sử dụng ØBrilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) 3.2.4 Dụng cụ ØPipet, đầu type đã vô trùng ØỐng nghiệm đã vô trùng ØỐng Durnham đã vô trùng Ø thủy tinh 250 ml ØTủ ấm 37oC 3.2.5 Qui trình phân tích a. Chuẩn bị mẫu Mẫu dùng làm thí nghiệm: bia lon. Hút 10ml mẫu cho vào ống nghiệm đã có môi trường.Tất cả các thao tác trên đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ có dung dịch pha loãng là 10-1. Dịch pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette (pipetman) vô trùng chuyển 1ml từ ống nghiệm 10-1 vào ống nghiệm thứ hai, ta sẽ có được dịch pha loãng 10-2. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được độ pha loãng 10-3 . Nhưng quá trình pha loãng sao cho trong 1ml dung dịch pha loãng mẫu chứa khoảng <100 khuẩn lạc. Ủ mẫu ở 37oC, thời gian 24h. a. Đọc kết quả Các ống nghiệm đều không có hện tượng sinh hơi, hay gây đục. Điều này chứng tỏ mẫu bia không hề bị nhiễm Coliforms an toàn về vệ sinh thực phẩm. 3.3 Định tính Ecoli 3.3.1 Định nghĩa Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi, có khả năng lên men lactose. Sau khi ủ 37oC± 1oC trong 24 – 48 giờ. Coliforms chịu nhiệt là Coliforms có khả năng lên men lactose, sinh acid và sinh hơi ở nhiệt độ 44 oC trong 24 – 48h. Coliforms phân (feacal Coliform) là Coliform nhiệt có thử nghiệm indol trong môi trường trypton dương tính. E.coli là Coliforms phân có nghiệm pháp IMViC lần lượt là + + - - 3.3.2 Nguyên tắc Phương pháp này dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện E.coli trong một khối lượng mẫu xác định. Cấy mẫu vào môi trường tăng sinh (BGBL), kiểm tra trên môi trường phân lập (EMB) và thử nghiệm bằng các phương phản ứng sinh hóa phù hợp (nghiệm pháp IMViC) 3.3.3. Môi trường sử dụng ØMôi trường TSA Ø Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) ØMôi trường EMB ØCanh Trypton ØCanh MR – VP ØThạch Simon Citrate ØThuốc thử Kovac’s ØThuốc thử Methyl Red ØThuốc thử α– naphtol ØKOH 40% 3.3.4 Dụng cụ ØĐĩa petri ØỐng nghiệm - ống Durnham ØBể điều nhiệt 44oC 3.3.5 Quy trình phân tích a. Chuẩn bị mẫu Mẫu dùng làm thí nghiệm: bia lon Lấy 1ml mẫu cho vào 3 ống nghiệm đã có 10ml môi trường BGBL, ủ 44oc trong 24h. Tất cả các thao tác trên đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. b. Kết quả Các ống nghiệm đều không có hện tượng sinh hơi, hay gây đục. Điều này chứng tỏ mẫu bia không hề bị nhiễm E. coli an toàn về vệ sinh thực phẩm CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả đánh giá cảm quan 4.1.1Hình dạng bia lon Lon bia được đóng nắp chắc, lon không bị móp, nhãn còn nguyên vẹn. Tất cả các mẫu đều ở trạng thái trong , không có cặn. Kết cấu Các mẫu bia lon thành phần chính là nước, bên cạnh đó là ethanol, CO2 một số sản phẩm phụ tạo ra từ quá trình lên men và các chất hòa tan không lên men còn lại trong bia. 4.1.3 Màu sắc Các mẫu bia thu được đều có màu vàng trong, sáng đặc trưng của bia. 4.1.4 Mùi vị Các mẫu thu được có vị đắng của hoa houblon, mùi thơm của malt đặc trưng cho bia. Không có mẫu nào có mùi vị lạ hay khó chịu. Nhìn chung, các mẫu được lấy vẫn trong tình trạng rất tốt, màu sắc, mùi và vị bình thường, không có biểu hiện của sự hư hỏng. Tuy các giá trị cảm quan của bia lon bình thường nhưng như vậy không có nghĩa là các sản phẩm này đạt chất lượng về các chỉ tiêu vi sinh. Đây là chỉ tiêu giúp tôi đánh giá sơ bộ về tình trạng mẫu trước khi đánh giá các chỉ tiêu vi si 4.2. Đánh giá các chỉ tiêu vi sinh vật 4.2.1 Đánh giá mức độ nhiễm Coliform ở các loại bia lon khảo sát Mức độ nhiễm là không có. Sản phẩm bia rất an toàn 4.2.1 Đánh giá mức độ nhiễm E.Coli ở các loại bia lon khảo sát Mức độ nhiễm là không có. Sản phẩm bia rất an toàn CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Trước tình hình các sản phẩm thực phẩm trên thị trường bị ảnh hưởng về vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm, người tiêu dùng có tâm lý lo ngại khi sử dụng các sản phẩm được sản xuất trong nước thì liệu sản phẩm bia lon có tránh khỏi sự ngờ vực này. Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn nên tôi chỉ tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh như: Coliforrms và Escherichia coli của các sản phẩm bia lon(: Zorok, Hanoi, Đại Việt, bigC, Sanmiguel) được bán tại hệ thống siêu thị BigC ở quận Gò Vấp. Nhằm mục đích khảo sát độ an toàn đối với các sản phẩm bia lon trên thị trường thành phố ngày nay. Sau khi tiến hành khảo sát 3 đợt liên tiếp với các mẫu bia lon: : Zorok, Hanoi, Đại Việt, Hudar Huế, Sanmiguel; điều cho kết quả đều âm tính. Sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh cho người tiêu dùng là không thể có. Và tôi có thể tin tưởng các nhà sản xuất bia lon trong nước, với hàng Việt Nam chất lượng cao. 5.2 Kiến nghị Từ kết quả khảo sát trên cho thấy rằng mức độ an toàn của dòng sản phẩm bia lon trên thị trường thành phố là rất cao. Mọi người có thể yên tâm, tin tưởng vào các nhà sản xuất bia lon trong nước, an toàn khi sử dụng không lo ngại đến sự ảnh hưởng của vi sinh vật đến sức khỏe. Nhưng người tiêu dùng cần lưu ý không có một sản phẩm thực phẩm nào hạn dùng là mãi mãi, mọi thực phẩm đều có hạn sử dụng.Vì thế mọi người hãy xem kĩ hạn sử dụng trước khi dùng. Đảm bảo quyền lợi và sức khỏe của người tiêu dùng là trách nhiệm của các nhà sản xuất và cơ quan nhà nước. Tạo cho người tiêu dùng có cảm giác yên tâm , a toàn khi sử dụng sản phẩm, không chỉ đối với sản phẩm bia lon mà còn đối với các sản phẩm thực phẩm khác trên thị trường, và đồng thời giá cả cũng phải hợp lí. Như vậy mới phát triển được khẩu hiệu người Việt dùng hàng Việt, giúp cho nền kinh tế nước ta phát triển mạnh hơn. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Aùi 2005. Công nghệ lên men ứng dụng trong công nghệ thực phẩm.NXB ĐH Quốc Gia Tp.HCM Bùi Aùi và Anh Thơ,1995.Kỹ thuật sản xuất bia. Trường ĐH BK TP.HCM Lâm Thanh Hiền, 2006. Công nghệ sản xuất nước giải khát (phần hai).Trường ĐH Nông Lâm Tp.HCM Nguyễn Thị Hiền, 2007. Khoa học - công nghệ malt và bia.NXB Khoa học và kĩ thuật Hoàng Đình Hoà,2000.công nghệ sản xuất malt và bia.NXB khoa học và kĩ thuật Hồ Sưởng,1992.Công nghệ sản bia.NXB khoa học và kĩ thuật Nguyễn Đức Lượng (2006). Công nghệ vi sinh tập 3 Thực phẩm lên men truyền thống. NXB Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí Minh KS.Phạm Minh Nhựt. Thực hành vi sinh thực phẩm. Đại học kĩ thuật công nghệ TP.Hồ Chí Minh