Đề tài Khảo sát khả năng xua đuỗi rầy nâu của chế phẩm chứa hoạt chất salicylic acid

ột đốm đen, khi 2 cánh xếp lại, 2 đốm này chồng lên nhau tạo thành 1 đốm đen to trên lưng. Bộ phận đẻ trứng bén nhọn màu đen. Thành trùng cánh ngắn có thân dài 3.5 – 4mm, cánh trước kéo dài tới 2/3 chiều dài phần bụng, kéo dài đến đốt bụng thứ 6. Khả năng đẻ trứng: số trứng do rầy cái đẻ thay đổi theo cá thể, tuổi thọ, thời kỳ đẻ trứng và tình trạng phát triển của cây lúa. Mỗi con rầy cái cánh ngắn có thể đẻ 300 trứng, rầy cái cánh dài đẻ 100 trứng. Khả năng bắt cặp: rầy nâu thường vũ hóa vào buổi sáng, thành trùng đực không thể giao phối trong vòng 24 giờ sau khi vũ hóa. Rầy cái dẫn dụ rầy đực bằng cách rung bụng, cả xa nhau khoảng 80cm. Khả năng giao phối của rầy đực tăng lên đến ngày thứ 5, sau đó giảm. Một rầy đực có thể giao phối nhiều nhất với 9 rầy cái trong vòng 24 giờ. Thành trùng rầy nâu thường đẻ trứng vào ban đêm hay buổi chiều mát (Phạm Văn Lầm, 2006). Hình 1.3: Vòng đời sinh trưởng của rầy nâu 1.2.6 Tập tính sống và cách gây hại 1.2.6.1 Tập tính sinh sống Theo Reisig và cs (1993) thì rầy nâu thường tập trung gây hại ở những nơi có nước hơn ở gò khô và từ đó lan qua nơi khác. Do đó, rầy nâu thường gây cháy rầy cục bộ thành từng chòm, đốm trên ruộng. Ẩm độ tương đối của không khí ở khoảng 70 – 85% là thích hợp cho sự phát triển của rầy nâu, độ ẩm ổn định 50 -60% lại thích hợp nhất với sự gia tăng số lượng của rầy nâu (Nguyễn Xuân Hiển, 1979). Rầy nâu thích sống quần tụ. Cả rầy non và rầy trưởng thành đều không thích ánh sáng trực xạ nên rầy nâu sống gần gốc lúa, chích hút ngay thân lúa, chỉ khi râm mát rầy trưởng thành mới ở trên mặt lá. 1.2.6.2. Cách gây hại của rầy nâu Rầy nâu trưởng thành và rầy non đều thích chích hút nhựa cây lúa. Chúng dùng khẩu biện (vòi) ghim vào bẹ lá lúa và hút nhựa luyện từ mạch libe. Lượng nhựa rầy hút vào nhiều hơn lượng nhựa mà chúng có khả năng tiêu hóa cho phép. Lượng nhựa dư thừa được tiết ra ngoài cơ thể của rầy là chất dinh dưỡng cao có chứa nhiều đường là nguồn thức ăn của nấm bù hóng, do đó những giọt mật này thời gian sau biến thành màu đen do nấm bù hóng tạp nhiễm. Mật độ rầy cao sẽ làm đen gốc lúa, lá chân bị vàng, làm cản trở quang hợp, cây lúa bị chết khô. Trong lúc rầy nâu chích hút nhựa cây lúa, rầy tiết ra một chất rắn đưa vào thân cây lúa và chất này kết lại làm thành ống hút thức ăn cho rầy. Chính chất này làm tắt nghẻn hệ thống mạch dẫn nhựa bên trong của cây lúa làm cho cây bị héo khô và chết. Rầy non chích tấn công cây lúa còn nhỏ nhưng nếu mật số cao có thể gây hại mọi giai đoạn của cây lúa: - Lúa đẻ nhánh : rầy chích hút nơi bẹ tạo thành những sọc màu nâu đậm theo thân do nấm và vi khuẩn tấn công tiếp. Nếu mật độ rầy cao thân lúa biến màu đen, hệ thống dẫn nhựa bên trong bị phá hoại nghiêm trọng làm cây lúa bị vàng, khô héo và chết. - Lúa từ làm đòng đến trổ: rầy thường tập trung chích hút ở cuống đòng non. Mật độ rầy cao tạo điều kiện cho nấm xâm nhập và phát triển làm thân cây lúa bị thối, mềm dễ bị đổ ngã, làm bông lúa lép một nữa hay toàn bộ. - Lúa chín: rầy tập trung lên thân ở phần non mềm. 1.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của rầy nâu 1.2.7.1. Thức ăn Thức ăn cần thiết cho rầy nâu để tăng kích thước cơ thể, phát triển cơ quan sinh dục, để bù lại năng lượng bị mất trong hoạt động sống của chúng (Phạm Văn Lầm, 2006). Trong các giai đoạn phát triển thì rầy tuổi 5 hút nhiều nhựa hơn rầy trưởng thành và rầy cái hút nhiều hơn rầy đực (Nguyễn Xuân Hiển và cs.,1979). Thức ăn có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến độ mắn đẻ, tốc độ phát triển tuổi thọ và số lượng của chúng (Phạm Văn Lầm, 2006). Thời vụ kéo dài, ruộng làm lúa quanh năm, rầy có nguồn thức ăn liên tục tạo điều kiện cho rầy gia tăng mật số. Ruộng sạ dày, bón nhiều đạm tạo nguồn thức ăn, nơi ẩn nấp của rầy và là điều kiện tốt để rầy phát triển. 1.2.7.2. Giống lúa Theo Phạm Văn Lầm (2006), thì trong những năm gần đây ở các vùng trồng lúa nước ta, diện tích trồng các giống lúa nhiễm rầy nâu đã gia tăng đáng kể. Tại miền Bắc có 81.8% giống lúa lai trồng tại Đồng Bằng Sông Hồng bị nhiễm rầy nâu nặng. Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long gia tăng trồng các giống lúa thơm chất lượng cao, không kháng rầy nâu (Jasmine 85, Nàng Thơm Chợ Đào). Các giống lúa ngắn ngày này, đáp ứng phân đạm cao, lá xanh, thân mềm, năng suất cao nhưng không kháng rầy được trồng nhiều là nguồn thức ăn ưa thích của rầy nâu (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004). 1.2.7.3. Thời tiết Nhiệt độ: theo Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen (2004) thì nhiệt độ thích hợp để rầy nâu phát triển từ 25 – 300C. Thành trùng cái có thời gian đẻ trứng dài 21 ngày ở 200C, thời gian sẽ giảm 3 ngày nếu nuôi những thành trùng cái rầy nâu ở 300C (Pathak và Khan, 1994). Ẩm độ, gió, lượng mưa: - Ẩm độ thích hợp để rầy nâu phát triển là từ 80 - 86%. Mưa lớn liên tục trong nhiều ngày sẽ làm rầy trưởng thành suy yếu, rầy cám bị rửa trôi, đồng thời rầy cũng dễ bị nấm bệnh tấn công; trong khi mưa nhỏ hoặc mưa nắng xen kẻ, trời ấm rất thích hợp để rầy phát triển mật số. - Trời âm u, nhiều mây rầy gây hại đang ở giai đoạn phát triển thì dễ gây cháy rầy hơn trong điều kiện trời quang mây. Do cây lúa không quang hợp được để bù đấp lại lượng nhựa bị mất đi do rầy hút. - Rầy nâu di chuyển đi xa chủ yếu nhờ luồng gió. Theo Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen (2004), yếu tố thức ăn và thời tiết có ảnh hưởng rất lớn đến sự hình thành số lượng rầy cái hoặc rầy đực cũng như dạng cánh ngắn hay cánh dài. Nhiệt độ thấp, độ ẩm cao, thức ăn đầy đủ thì rầy cánh ngắn xuất hiện nhiều hơn rầy cánh dài. Rầy cánh ngắn sống lâu hơn rầy cánh dài, tỉ lệ con cái cao hơn con đực, số lượng rầy đẻ trứng cao hơn, cho lượng trứng nhiều hơn rầy cánh dài. Do đó khi thấy rầy cánh ngắn xuất hiện thì khả năng rầy thành dịch rất cao. Ở thời kỳ lúa đẻ nhánh đến trổ, nếu giống lúa thích hợp, thức ăn non mềm, số lượng rầy cái có thể gấp 4 lần số lượng rầy đực. Ở thời kỳ lúa chín, số lượng rầy cái và rầy đực tương đương nhau. 1.2.7.4. Thiên địch của rầy nâu Trong đồng ruộng có nhiều loài côn trùng ăn thịt, ký sinh và nấm gây hại rầy nâu. Đối với nước ta thu thập và xác định được 82 loài thiên địch. Bọ rùa: có nhiều loài tấn công rầy nâu, mỗi ngày cả thành trùng và ấu trùng của bọ rùa có thể ăn từ 5 – 10 con rầy nâu. Kiến ba khoang: mỗi ngày cả thành trùng và ấu trùng của kiến ba khoang ăn từ 3 -5 con rầy nâu. Bọ xít nước: ấu trùng và thành trùng chích hút chất dịch bên trong cơ thể ấu trùng và thành trùng rầy nâu, mỗi ngày 1 con bọ xít nước có thể gây hại từ 4 -7 ấu trùng và thành trùng rầy nâu. Bọ xít mù xanh: tấn công trứng, ấu trùng và thành trùng rầy nâu. Một ngày 1 con bọ xít mù xanh có thể ăn từ 7 -10 trứng rầy hoặc 1 – 5 con rầy. Các loài nhện : mỗi ngày 1 con nhện có thể ăn từ 5 – 15 con rầy. Theo Phạm Văn Lầm (2002) thì rầy nâu bị ký sinh ở tỷ lệ thấp (<10%) và các vật gây bệnh cho rầy cũng phát hiện với mật số thấp. Do đó, vai trò của các loài thiên địch bắt mồi rất lớn trong việc hạn chế số lượng rầy nâu trên ruộng đồng. 1.3. ĐẶC TÍNH CỦA HOẠT CHẤT SALICYLIC ACID 1.3.1 Giới thiệu về Salicylic Acid Tên hoá học: C7H6O3 Tên khác: 2-hydroxylbenzoic acid Dạng kết tinh dài, màu trắng tan trong nước nóng, aceton, cồn. Salicylic acid (acid o – hydroxybenzoic), tự do hay liên kết, là một phenol thiên nhiên hiện diện ở mọi thực vật, có nhiều trong vỏ và lá Salix alba. Được cô lập năm 1838 ở dạng liên kết (salicin) và tổng hợp trong phòng thí nghiệm năm 1874, salicylic acid (Sa) là thành phần cấu tạo của aspirin (acid acetylsalicylic). Sa được tổng hợp từ acid trans – cinamic, một dẫn xuất của phenylalanin. Salicylic acid là hợp chất phenol tham vào phản ứng bảo vệ cây trồng chống lại mầm bệnh, được thể hiện ở dạng kích thích tính kháng (Malamy và cs, 1990). Mannandhar và cs, (1998) đã chứng minh Sa có khả năng kích thích tính kháng bệnh trên lúa mạch Theo Trịnh Ngọc Thuý (2000), ghi nhận khi xử lý Salicylic acid bằng cách ngâm hạt hay phun lên lá đều có khả năng kích kháng đối với bệnh cháy lá lúa. Ngoài ra, Sa có khả năng kích thích tính kháng cây dưa leo chống lại bệnh do nấm colletochutrum gây ra (Manand, 1998) và giúp kích thích kháng trên cây dưa leo chống lại virut CMV (Mayers và cs, 2005). 1.3.2. Cơ chế tính kháng của thực vật Ở cây trồng luôn xảy ra những con đường sinh tổng hợp có thể cho phép cây nhận biết và phản ứng đối với tín hiệu từ môi trường. Con đường này gồm có bộ phận cảm nhận, hormon, thông tin, những biến đổi của gen. Thế nhưng, những hiểu biết về cách truyền thông tin trong cây khi có sự xâm nhiễm của ký sinh vẫn còn hạn chế. Cho đến gần đây, có một số nghiên cứu về đặc tính kháng và nhiễm của cây đối với ký sinh. Trong đó, được biết phản ứng siêu nhạy cảm (Hypersensitive reaction - HR) là một trong những biện pháp ngăn chặn sự xâm nhiễm của ký sinh, nó tạo ra một vùng tế bào chết xung quanh điểm xâm nhiễm nhằm hạn chế sự phát triển của ký sinh. Phản ứng bảo vệ này như một tín hiệu cho các bộ phận khác chưa bị xâm nhiễm biết để có phương án phù hợp. Kết quả là toàn bộ cây được chuẩn bị và có thể chống lại sự xâm nhiễm thứ cấp của ký sinh. Hiện tượng này được gọi là hệ thống kháng tập nhiễm. Mà hệ thống tính kháng thu nhận được (Systemic Acquired Resistance - SAR) là hiện tượng trong đó cơ chế tự vệ riêng của cây trồng được tạo cảm ứng bởi việc xử lý trước có hoặc không có tác nhân sinh học hoặc hóa học. SAR là tính kháng của những mô mà vị trí cách xa vị trí của mô bị ký sinh xâm nhập. Vì vậy khác với phản ứng ban đầu LAR. SAR có ba thành phần chính: tích lũy PR protein (SAR protein, khi PR protein tích lũy ở vị trí của HR); tạo mô bần và những mối liên kết của vách tế bào có khoảng cách với vị trí của HR; và một số hiện tượng mang tính thích nghi. PR proteins là những protein được tích lũy sau khi bị ký sinh tấn công bao gồm: PR-1, nhóm protein kháng nấm – chức năng chưa được biết nhiều PR-2, nhóm protein của β-1,3-glucanase có hoạt tính kháng nấm PR-3, nhóm ezym chitinase kháng nấm và nhóm lysozyme kháng khuẩn PR-5, osmotin Proteinases, α-amylase, peroxidase và cysteine và glycine-giàu protein. Theo nghĩa rộng, enzym ức chế proteinase cũng kích thích SWR (systemic wounding response). PR proteins tích lũy ở cả hai loại một lá mầm và hai lá mầm và cũng đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn. PR1 làm giảm sự xâm nhập của nấm Peronospora tabacina vào mô cây thuốc lá một cách có ý nghĩa và đồng thời cũng xuất hiện β-1,3-glucanase và chitinase khi bị nấm Rhizoctonia solani. Những enzym cũng thể hiện hiệu quả tương hỗ lẫn nhau. Sự tích lũy PR protein cũng được sử dụng như là một thông số về sự có mặt của SAR. SAR là phản ứng tự vệ thực vật phổ tác động rộng đã có sẵn trong cây hoặc nó cũng có thể được kích thích bởi các yếu tố ngoại sinh như: vi sinh vật, các hợp chất salicylic acid, jasmonic acid Trong đó, salicylic acid là tín hiệu nội bào mạnh nhất của SAR. SAR đã được khảo nghiệm như là một biện pháp làm tăng tính kháng bệnh lại mầm bệnh nấm, vi khuẩn và virut trên cây trồng như khoai tây, lúa mì và lúa nước (Agrios, 1997). Nó có thể tồn tại từ hàng tuần đến hàng tháng sau khi bị xâm nhiễm và có khả năng chống lại sự xâm nhiễm của nhiều loại ký sinh. Chính đặc điểm này của SAR có thể là một biện pháp đầy hứa hẹn trong việc phòng trừ tổng hợp bệnh cho cây trồng. 1.3.3 Vai trò của Salicylic acid trong cơ chế kháng bệnh của cây trồng Salicylic acid là tín hiệu nội bào mạnh của SAR và LAR. Nồng độ của Sa nội bào gia tăng kéo theo sự kích thích của SAR và như vậy Sa rất quan trọng với SAR. Khi cây sản suất Salicylate hydroxylase enzyme (NahG) chưa tác động đến SAR nếu nahG gene chuyển Sa thành catechol, chất này không kích thích SAR. Người ta cho rằng Sa là hệ thống tín hiệu của SAR khi nồng độ Sa chính xác trong phloem và hoạt hóa một số gen của SAR được kích thích bởi ký sinh. Điều này cũng có thể Sa tác động đến quá trình ức chế của catalase. Dẫn đến sự hình thành hydrogen peroxide như là tín hiệu thứ cấp. Ở thực vật, trong sự tương tác giữa các gen trội của ký chủ và ký sinh đã làm kích thích một nhóm chức gọi là eliciteurs trong đó PAL (Phenylalanine amonia lyase) là một eliciteurs quan trọng thúc đẩy quá trình sinh tổng Sa qua con đường cinamic acid từ phenylalanine và nhóm protein PR (Protein relative). Hình 1.4: Cơ chế tính kháng của thực vật Qua nhiều nghiên cứu cho thấy cơ chế tính kháng của thực vật đối với các ký chủ đặc thù được hình thành bởi sự tương tác gen – gen. Tính kháng (resistance) chỉ được thể hiện khi các ký chủ có gen kháng trội R và ký sinh có gen không trội Arv (Arvirulent) và ngược lại ký chủ sẽ dễ dàng xâm nhập. Theo tài liệu nghiên cứu của các tác giả T.P Metraux; Thomas Gaffney, Paul Silverman; H.Kessman, trong quá trình sinh tổng hợp Salicylic acid thì acid này luôn đóng một vai trò quan trọng, nồng độ của salicylic acid được gia tăng sau tương tác giữa ký chủ và ký sinh thông qua con đường shikimate từ glucose 6 – P của chu trình glycolytic và sản phẩm cuối là o – d – glucosysalicylate. Công thức phân tử của o – d – glucosysalicylate gồm có 2 phần chính l – glucosyl có cấu trúc dạng thuyền 2 – salicylic acid. Số lượng của glucosyl bị phụ thuộc bởi receptor. Vì mỗi một ký sinh gây bệnh đều mang một tính hiệu riêng và sẽ được receptor của tế bào giải mã. Ví dụ: trong trường hợp bộ gen của ký sinh Avr1, avr2 và bộ gen của ký chủ R1, r2 (kháng) cây sẽ tổng hợp o – d – glucosysalicylate và peroxydase xúc tác quá trình hình thành những hợp chất vòng phân tử lượng thấp, có khả năng oxy hoá cao những hợp chất này tham gia vào các phản ứng bảo vệ của cây. Một trong những phản ứng loại này được biết đến là phản ứng siêu nhạy cảm. QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP SALICYLIC ACID Hình 1.5: Con đường sinh tổng hợp Salicylic acid trong thực vật 1.3.4 Salicylic acid và quá trình trao đổi chất Người ta đã tìm thấy một số hợp chất của Hydroxylbezoic trong rất nhiều loại cây khác nhau và các hợp chất với Sa mà chủ yếu là với glucose hoạt hóa, ít thấy dạng ester của Sa. Trước đây ngọn phân sinh của cây Helianthus annus được sử dụng C14 đã tìm thấy rất ít Salicylic acid tự do mà chủ yếu là Sa glucoside - Sa – O – β – D glucoside được xác định như là sản phẩm chủ yếu của quá trình trao đổi chất của Sa trong tế bào cây. Trong những thí nghiệm với virus khảm thuốc lá TMV, Sa được tổng hợp nhanh chóng tạo thành Sa glucoside và được tích tụ xung quanh vết thương khi có sự xuất hiện phản ứng siêu nhạy cảm (Hypersensitive reaction HR). Mặc dù Sa glucoside đóng vai trò chính trong cây, tuy nhiên những ester và hydroxyl của những vòng thảm cũng có thể hình thành một con đường trao đổi chất khác. Ở cả hai loại Sa nội bào và ngoại bào đều được hình thành tạo nên Sa 2 – O – β – D glucoside khi có sự xâm nhiễm của TMV trên cây thuốc lá. Trong khi đó ở cây khỏe mạnh Sa glucoside rất ít không đáng kể. Đã xác định được hàm lượng lớn Sa glucoside xung quanh vết bệnh TMV (hơn 80% tổng số Sa), một lượng không đáng kể chất này ở dịch những cây không bị lây nhiễm TMV. Sự hình thành Sa glucoside từ Sa được xúc tác bởi GDP glucosid: Sa glucosyltransferase (Gtase). Gtase được tìm thấy trong tế bào của cây khi được xử lý Sa. Khi lây nhiễm TMV thuốc lá sự gia tăng của hoạt tính Gtase phù hợp với sự tích lũy của Sa và những sản phẩm kết hợp của Sa. Trọng lượng phân tử của Gtase trong một số cây khoảng 40 – 60 KDa. Trong những nghiên cứu trước đây, Gtase thường khu trú ở nguyên sinh chất hoặc ở màng tế bào Salicylic acid tự do độc cho cây ở nồng độ > 0.1mM. Tuy nhiên sự kết hợp có thể đóng vai trò giải độc của Sa cho cây. 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1. Phương tiện làm thí nghiệm Lồng lưới 40 x 40 x 45 cm, dùng để nuôi rầy nâu Lồng lưới (trụ tròn): f 10cm x 30cm bằng lưới muỗi Ly nhựa f 10cm x 20cm Xô nhựa trồng lúa, để nuôi rầy nâu Keo nhựa bắt rầy Ống hút rầy Bút lông Bình phun thuốc 500ml Xô tưới nứơc 2.1.2. Dụng cụ và hoá chất 2.1.2.1 Dụng cụ, thiết bị Máy so màu Tủ sấy Cân điện tử (Cân phân tích và cân kỹ thuật) Nồi đun cách thuỷ Bếp điện Tủ hút ẩm Cối phá mẫu Quang phổ kế Bộ phá mẫu Kjeldahl. Máy cất đạm Parnas Wargner. Máy quang phổ kế và cuvet 10mm. Máy cô quay chân không Bể làm lạnh Và các dụng cụ thuỷ tinh thông dụng dùng trong phòng thí nghiệm: arlen (50, 100, 250, 500 ml), ống nghiệm, pecher, phễu lọc, giấy lọc, pipette(1, 2,5,10 ml), bình định mức (100, 500 ml), pipette pasteur. 2.1.2.2 Hóa chất - Cồn tuyệt đối (960), cồn 700 - Nước cất - Các hoá chất dùng xác định đường tổng số Phenol 5%: pha 5 gram phenol trong 100ml nước cất Cồn 800 Dung dịch H2SO4 60% Saccarose 0.1% Glucose 0,001% Glucose 0,2 mg/ml - Các hoá chất dùng xác định nitơ tổng số H3BO3 4% HCl 0.25N H2SO4 đậm đặc NaOH 32% Methyl đỏ Bromocresol xanh lá - Các hoá chất dùng xác định phospho tổng số HCl đậm đặc HNO3 đậm đặc Amoni molybdate Hydroquinone [C6H4(OH)2], pha khi sử dụng Kali dihydrophosphate (KH2PO4) Sodium sunphic (Na2SO3) - Các hoá chất dùng xác định hoạt tính enzyme catalase Bột thủy tinh CaCO3 KMnO4 0.1N H2SO4 10% H2O2 0.1% trong đệm phosphate pH 7.0 2.1.3. Giống lúa OM1490 (giống lúa nhiễm rầy): giống lúa này do phòng cây lương thực thuộc viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam cung cấp. Đây là giống lúa nhiễm rầy. 2.1.4. Nguồn rầy nâu: rầy nâu được bắt ở ruộng của ông Nguyễn Văn Dũng, Trần Văn Hai, Nguyễn Trí Tâm ở ấp 10 xã Mỹ Thành Nam, huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang. 2.1.5. Chế phẩm chứa hoạt chất Salicylic acid: Chế phẩm AIM (Anty Insect Micture), là chế phẩm xua đuổi rầy nâu do Viện Sinh Học Nhiệt Đới cấp. 2.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.2.1. Phương pháp chuẩn bị mẫu 2.2.1.1 Phương pháp nhân quần thể rầy nâu Bắt rầy nâu cái ở ngoài đồng đem về nuôi trên cây lúa khoẻ (cây lúa 20 ngày tuổi), đến 2 ngày sau rầy nâu cái đẻ trứng. Sau khi đẻ trứng dùng ống hút rầy bắt rầy nâu cái ra, khoảng 4 -7 ngày sau thì rầy cám tuổi 1 nở ra. Và bắt rầy tuổi 1 chuyển sang cây lúa khác nuôi phát triển thành rầy tuổi 2 -3 thì đem làm thí nghiệm. 2.2.1.2 Phương pháp chuẩn bị thức ăn cho rầy nâu Hạt giống: chọn những hạt lúa khỏe, đã được phơi khô, xử lý nước muối 15% để loại bỏ những hạt lép lửng và đem ngâm trong nước ấm với tỉ lệ 2 nóng 3 lạnh trong 24 giờ. Sau đó lấy ra và đem ủ thêm 36 giờ nữa thì quan sát mầm lúa và đem gieo vào chậu. Chuẩn bị đất trồng lúa: đất được phơi khô và nghiền nhỏ sau đó cho vào chậu khoảng 0.5 kg/chậu. Ngâm nước và bón phân hóa học rồi sau đó để khô 1 ngày trước khi gieo. Trồng và chăm sóc: Lúa được gieo 3 – 4 hạt vào mỗi chậu, sau 5 -7 sau khi gieo tuyển lại chỉ giữ lại hai (02) hạt cho mỗi chậu. Mực nước trong chậu luôn luôn giữ ở mức 2 cm Bón phân: dùng phân Urê, mỗi lần bón từ 5 – 7 hạt cho mỗi chậu. Bón vào các giai đoạn sau: - Giai đoạn 10 NSKG - Giai đoạn 20 NSKG - Giai đoạn 40 NSKG Cây lúa được trồng và chăm sóc cho đến các giai đoạn làm thí nghiệm. 2.2.2. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu sinh học Cách bố trí: thí nghiệm được thực hiện trong chậu, mỗi chậu gieo hai (02) hạt lúa và bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại với 4 nghiệm thức và mỗi nghiệm được khảo sát trên 30 chậu. - Nghiệm thức 1: xử lý với chế phẩm AIM với liều lượng theo hướng dẫn 10gr/8lit/250m2 . - Nghiệm thức 2: xử lý với chế phẩm AIM với liều lượng gấp đôi. - Nghiệm thức 3: Mẫu đối chứng không dùng thuốc (xử lý với nước cất) nhưng có thả rầy. - Nghiệm thức 4: Mẫu đối chứng không phun thuốc và không thả rầy. Cách tiến hành: mỗi chậu lúa được bao lại bằng một lồng lưới 30x2cm và lúa được phun thuốc vào ngày thứ 15, 30 và 45 sau khi gieo. Sau khi phun thuốc 1 giờ thì thả rầy nâu vào và mỗi lồng thả 4 -5 con rầy tuổi 2 - 3. Ba ngày sau lấy mẫu đem phân tích các chỉ tiêu sinh học. Hình 2.2: Lồng nuôi rầy làm thí nghiệm Hình 2.1: Đối chứng không thả rầy Hình 2.3: Các chậu lúa ở các nghiệm thức trước khi phun thuốc và thả rầy Hình 2.4: Các chậu ở các nghiệm thức sau khi phun thuốc và thả rầy 2.2.2.1 Phương pháp phân tích phổ tử ngoại a. Nguyên tắc Dựa trên cơ sở đo cường độ các bước sóng tử ngoại trong dung dung dịch đo nhằm xác định hàm lượng protein trong mẫu. b. Tiến hành Lấy 2 gram mẫu tươi nghiền nhỏ với cát thạch anh, cho thêm 10 - 15ml nước cất vào và nghiền tiếp. Tiếp tục lọc dịch chiết qua giấy lọc dưới ống nghiệm. Sau đó đem đo ở bước sóng 260 và 280nm. 2.2.2.2 Phương pháp phân tích phổ hồng ngoại a. Nguyên tắc Sự định tính này dựa trên các mũi và sự thể hiện với mật độ ít hay nhiều trên phổ, ta xác định được nhóm chức nào mới xuất hiện. b. Tiến hành Lấy 2 gam mẫu tươi nghiền nhỏ với cát thạch anh, cho thêm 10ml chloroform đậm đặc vào và nghiền tiếp. Tiếp tục lọc dịch chiết qua giấy lọc dưới ống nghiệm. Đem đi đo phổ ở phòng Phân Tích Hóa Lý ở Viện Khoa Học và Công Nghệ Miền Nam, số 1 Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, Tp. Hồ Chí Minh. 2.2.2.3 Phương pháp định lượng đường tổng số a. Nguyên tắc Sự định phân này căn cứ vào phản ứng đặc trưng của đường và nhiều chất hữu cơ (phenol) với sự hiện diện của H2SO4. b. Tiến hành Trích đường Lấy 2 gam nguyên liệu tươi đã nghiền nhỏ chứa khoảng 5 – 50mg đường cho vào cốc thủy tinh 50ml và thêm 10ml cồn 96o vào (nếu dùng nguyên liệu khô thì lấy ít mẫu hơn). Sau đó, dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều và đem cốc đun trên nồi cách thủy cho sôi 3 lần. Để cốc nguội và đem lọc qua giấy lọc không tro (khi lọc chỉ lấy phần rượu). Sau đó cho tiếp 10ml cồn vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun 2 lần tới sôi trong nồi cách thủy. Để nguội lại lọc tiếp tục, chiết rút như vậy khoảng hai lần, xong đưa bã lên lọc và rửa 2 – 3 lần bằng cồn 80o nóng. Cồn qua lọc cho bay hơi ở trong phòng hay trên nồi cách thủy. Sau khi cho bay hơi cồn thì mẫu có thể để lâu trong bình hút ẩm. Cặn khô trong cốc được pha loãng với 50ml nước cất. Nếu có cặn thì đễ lắng xuống. Khi đem làm hiện màu, dung dịch này có thể được pha loãng 5 – 10 lần tùy theo nồng độ cao hay thấp. Thực hiện phản ứng màu bằng phenol Hút 1ml dung dịch đường có khoảng 10 – 70μg đường cho vào ống nghiệm và thêm vào 1ml dung dịch phenol 5%. Sau đó cho vào ống nghiệm 5ml H2SO4 đậm đặc. Tuyệt đối không để dây axit vào thành ống. Để yên 19 phút rồi lắc và để yên trên bể ổn nhiệt từ 10 – 20 phút ở 25 – 300C để xuất hiện màu. Màu bền vững trong vài giờ. Xác định màu trên quang phổ kế ở bước sóng 490nm. Xây dựng đồ thị mẫu Lấy 9 bình định mức 100 ml rồi cho vào đó theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9ml dung dich saccarose mẫu 0.1%, cho nước tới vạch mức. Từ mỗi bình lấy ra 1 ml cho vào ống nghiệm rồi nhuộm bằng phenol và H2SO4 như trên. Lắc đều 9 ống nghiệm, rồi để yên trong bể ổn nhiệt khoảng 20 – 30 phút, ở 25 – 300C để xuất hiện màu (màu bền vững trong vài giờ). Sau đó xác định màu trên quang phổ kế ở bước sóng 490 nm. Mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương đương 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70μg saccarose. So màu và vẽ đồ thị mẫu, luôn phải làm kèm với một ống thử trắng bằng 1ml nước cất thay cho dung dịch đường. Độ chính xác của phương pháp này là ± 0.2%. 2.2.2.4 Phương pháp định lượng đạm tổng số (phương pháp Kjeldahl) a. Nguyên tắc Dưới tác dụng của H2SO4 đặc và các chất xúc tác, tất cả các dạng đạm hữu cơ được chuyển thành NH4+ . Đẩy NH4+ bằng dung dịch kiềm và hứng NH3 thoát ra bằng dung dịch axit. b. Tiến hành Quá trình định lượng Nitơ tổng số được tiến hành theo trình tự 3 bước sau Bước 1: Xác định và phá mẫu Mẫu lúa cắt nhỏ đem sấy khô ở 1050C, trong 6 giờ. Sau đó, cân 0.2 gam mẫu đã sấy khô, nghiền kỹ cho vào ống phá mẫu, bổ sung 1 gam chất xúc tác và 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, nối vào bộ thu khí và bắt đầu phá mẫu. Khi thời gian phá mẫu kết thúc, đễ ống phá mẫu nguội (khoảng 5 phút), bổ sung 10ml nước cất, trộn đều, để nguội và lắc vào máy chưng cất. Bước 2: Chưng cất mẫu Lắp ống phá mẫu vào bộ chưng cất, bổ sung thêm 30ml dung dịch NaOH 32%. Khởi động qui trình chưng cất, dịch chưng cất được thu nhờ bình thu có bổ sung trước axit boric 4% và hỗn hợp chất chỉ thị. Ngừng cất khi thu được khoảng 125 – 150ml dịch chưng cất. Bước 3: Chuẩn độ Chuẩn độ bằng HCl 0.25N. Dừng chuẩn độ khi phát hiện màu phớt đỏ. c. Tính toán (mg/g mẫu) (2.1) Thông qua số HCl 0.25N, người ta biết được lượng axit boric kết hợp với NH3 và do vậy biết được số lượng NH3 giải phóng từ mẫu: trung bình cứ 1ml HCl 0.25N tương ứng với 0.0035g Nitơ hữu cơ. Kết quả tính toán thể hiện theo Nitơ hữu cơ hoặc Nitơ tổng số. Phần trăm Nitơ hữu cơ (%) = Trong đó: VHCl: thể tích HCl 0,25N chuẩn độ (ml) m: trọng lượng mẩu (g) 103: hệ số chuyển đổi từ g sang mg Phần trăm Nitơ tổng (%): thông thường protein chứa khoảng 16% N. Khí NH3 nhận được khi chưng cất nhân với hệ số qui đổi là 100/16 ≈ 6.25 sẽ cho biết giá trị protein tương đương (hay NH3 tổng). 2.2.2.5 Phương pháp định lượng phospho tổng số bằng quang phổ kế Xác định hàm lượng phospho trong giới hạn nồng độ từ 1 – 20mg/cm3. a. Nguyên tắc Phương pháp này dựa vào khả năng của ion orthophosphate phản ứng với amonium molybdate tạo thành phosphomolybdate, phức chất có màu xanh lơ. 2MoO2.4MoO3 + H3PO4 → (MoO2.4MoO3)2H3PO3.4H2O Hàm lượng phospho phụ thuộc vào cường độ màu của mẫu đo ở bước sóng hấp thu cực đại 650nm với cuvet có chiều dài 10mm. Dung dịch đối chứng là dung dịch không. b. Tiến hành Lấy mẫu thử và chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 4325-86. Nếu mẫu khô không khí, xử lý sơ bộ và bảo quản. Chuẩn bị dung dịch thuốc thử Dung dịch 1: dung dịch chuẩn gốc (chứa 100μg phospho/ml). Hòa tan 1,4394gam KH2PO4 trong bình định mức 1000ml bằng nước cất và định mức đúng 1000 ml. Chuẩn bị dung dịch chuẩn để lập thang chuẩn (chứa 25μg phospho/ml). Lấy 25ml dung dịch ở bình định mức 1000ml cho vào bình định mức 100ml và định mức bằng nước cất đúng 100ml, ta có dung dịch 1A. Dung dịch HCl 10%: 250ml HCl đậm đặc cộng với 750ml nước cất. Dung dịch 2: Dung dịch Na2SO3 20%: cân 20 gam Na2SO3 hòa vào trong 100ml nước cất. Dung dịch chuẩn bị khi sử dụng. Dung dịch 3: dung dịch hydroquinone 0.5%. Hòa tan 0.5 gam hydroquinone trong một ít nước và 3 giọt H2SO3 đậm đặc, thêm tiếp nước cho đủ 100ml. Dung dịch chuẩn bi khi sử dụng. Dung dịch 4: Thuốc thử Briggs hay dung dịch amoni molybdate 5%. Hòa tan 50 gam amoni molybdate trong 100ml nước cất. Cho 150ml H2SO4 đậm đặc vào trong 400ml nước. Để nguội thêm tiếp dung dịch amoni molybdate 5% đã chuẩn bị vào hỗn hợp, để nguội thêm nước cho đủ 1000ml. Hỗn hợp thuốc thử: trộn các dung dịch 2, 3, 4 theo tỷ lệ 1:1:1. Chuẩn bị dung dịch tro phân tích Cân chính xác 2 gam mẫu tươi, đem vô cơ mẫu ở 550oC trong 4 giờ. Để nguội. Thấm ướt tro bằng vài giọt nước cất và thêm 10ml dung dịch HCl 10% và 0.5ml HNO3 đậm đặc. Đun nhẹ trong 5 phút (đến khi thấy bay hơi), để nguội đến nhiệt độ phòng. Rửa sạch chén nung và định mức thể tích dung dịch tro đến 250ml bằng nước cất. Phản ứng lên màu Lấy 10ml dung dịch tro cho vào bình hình nón dung tích 100ml, định mức cho đủ 100ml ta có dung dịch thứ 2. Lấy 1ml dung dịch 2 cho vào trong ống nghiệm. Thêm 3ml hỗn hợp thuốc thử và hút nước cất thêm cho đủ 10ml. Trộn đều hỗn hợp, để 30 phút. Đo ở bước sóng 650nm. Tiến hành dựng đồ thị đường chuẩn Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Thể tích dd chuẩn 1A (ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Thêm nước cất cho đủ 5ml (ml) 5 4.9 4.8 4.7 4.6 4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 Hổn hợp thuốc thử (ml) 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Thêm nước cất (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Nồng độ 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Sau khi chuẩn bị thang dung dịch chuẩn tiến hành đo quang phổ ở bước sóng 650 nm. c. Tính toán kết quả (2.2) (µg/g mẫu) Trong đó: P: hàm lượng phosphos trong 1gam mẫu (µg/g) X: số µg phospho có trong dịch thử V: thể tích dịch thử (ml) Vddtro: thể tích dung dịch sau khi tro hoá (ml) α: hệ số pha loãng Sai số giữa hai lần phân tích song song với độ tin cậy p = 0.95 không vượt quá d =28 (0.05 + 0.031X)%. 2.2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme catalase a. Nguyên tắc Để định lượng catalase có thể dùng KMnO4 0.1N để xác định lượng H2O2 trước và sau khi enzyme tác dụng, từ đó tính được lượng H2O2 đã bị thủy giải. 5H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 → 2MnO4 + K2SO4 + SO2 + 8H2O Từ phương trình phản ứng này ta tính được 1ml dung dịch KMnO4 0.1N tương ứng với 1.7mg H2O2. b. Tiến hành Cân 2g mẫu tươi cho vào cối, nghiền với cát thủy tinh. Thêm từ từ 2 -3ml nước cất và một ít (khoảng 0.3g) CaCO3 để trung hòa dịch chiết (đến khi ngừng tạo bọt CO2). Chuyển toàn bộ mẫu vật đã nghiền vào bình định mức 100ml, thêm nước đến 100ml. Lắc đều và để lắng khoảng 30 phút. Lọc thu dịch trong Xác định hoạt độ catalase: lấy 2 erlen − Bình 1 (thử thật): cho vào 20ml dịch enzyme và 25ml H2O2 0.1% − Bình 2 (thử không) : cho 20ml dịch enzyme, đun sôi cách thủy trong 3 phút. Sau đó thêm 25ml H2O2 0.1%. Đặt cả hai bình vào bể ổn nhiệt ở 300C. Sau 30 phút thêm vào mỗi bình 3ml H2SO4 10% và chuẩn độ bằng KMnO4 0.1N đến khi có màu hồng xuất hiện và bền trong một phút. c. Cách tính toán kết quả Số lượng H2O2 được giải phóng bởi enzyme trong 1g mẫu là (2.3.1) Trong đó: V0: thể tích KMnO4 dùng trong bình thử không (ml) Vt: thể tích KMnO4 dùng trong bình thử thật (ml). m: khối lượng mẫu sử dụng ( g). Số đơn vị catalase trong một gam mẫu/μmol H2O2 được giải phóng sau một phút là: (2.3.2) 3.1 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại Bảng 3.1: Kết quả đo quang phổ hồng ngoại ở các nghiệm thức Nghiệm thức Các nhóm chức xuất hiện DC - R AIM1 + R DC + R AIM2 + R - OH 0.261 0.265 0.094 0.066 Aryl- H nhân thơm 0 0 0.069 0.055 NH3+ 0.134 0.196 0.192 0.106 0.919 0.325 0.710 0.322 Aldehyde 0.157 0.184 0.530 0.522 Amino acid 0.071 0.067 0 0 P=O thơm 0.203 0.082 0.284 0.292 Arene nhiều nhân thơm 0.158 0.139 0.83 0.81 Phenol tự do 0.051 0.122 0.061 0 Biểu đồ 3.1: Các nhóm chức xuất hiện trong các mẫu phân tích Bảng 3.2: Bước sóng xác định các nhóm chức xuất hiện trong các mẫu phân tích Các nhóm chức xuất hiện Bước sóng cm-1 xác định - OH 3747.468 Aryl- H nhân thôm 3010.270 NH3 2918.173 2849.843 Aldehyde 1737.579 Amino acid 1652.350 P=O thôm 1164.176 Arene nhiều nhân thơm 723.646 Phenol tự do 475.685 Qua kết quả phân tích quang phổ hồng ngoại (ở bảng 3.1) ở tất cả các mẫu lúa trong suốt quá trình làm thí nghiệm, nhận thấy trong các mẫu lúa phân tích đều có sự hiện diện của các nhóm chức sau: nhóm –OH, NH3, các Aryl – H nhân thơm, nhóm Aldehyde, các amino acid, nhóm P=O thơm, các Arene nhiều nhân thơm và nhóm phenol tự do. Các chất này hiện diện trong các mẫu lúa thí nghiệm với cường độ (AU) rất khác nhau, cụ thể như sau: Nhóm –OH: (Xác định ở bước sóng: 3747.468cm-1) Bảng 3.3: Cường độ nhóm –OH hiện hiện trong các mẫu lúa Nghiệm thức Nhóm chức DC - R AIM1 + R DC + R AIM2 + R - OH 0.261 0.265 0.094 0.066 Biểu đồ 3.2: Cường độ nhóm –OH hiện diện trong các mẫu phân tích Qua kết quả phân tích (ở bảng 3.2), ta thấy nhóm –OH hiện diện ở cả nghiệm thức nhưng với cường độ khác nhau. Trong đó, cường độ của nhóm –OH hiện diện ở nghiệm thức AIM1 + R là cao nhất (0.265AU), nhưng ở nghiệm thức xử lý thuốc với liều lượng gấp đôi thì cường độ của nhóm –OH là rất thấp (0.066AU), thậm chí nó còn thấp ở cả nghiệm có nhiễm rầy mà không có xử lý thuốc. Ở mẫu đối chứng không nhiễm rầy thì cường độ hiện diện của nhóm –OH cũng rất cao (0.261AU). Nhóm Aryl-H nhân thơm (xác định ở bước sóng: 3010.2704cm-1) Bảng 3.4: Cường độ nhóm Aryl – H nhân thơm xuất hiện Nghiệm thức Nhóm chức DC - R AIM1 + R DC + R AIM2 + R Aryl- H nhân thơm 0 0 0.069 0.055 Biểu đồ 3.3: Cường độ nhóm Aryl-H nhân thơm có trong các mẫu Kết quả phân tích được biểu diễn ở biểu đồ 3.3, cho thấy nhóm Aryl – H nhân thơm là nhóm chức kích thích rầy ăn lúa chỉ xuất hiện ở 2 nghiệm thức DC + R và AIM2 + R. Trong đó, nghiệm thức DC + R có cường độ aryl – H là cao nhất (0.069AU), chứng tỏ ở các chậu lúa đối chứng có thả rầy sẽ có khả năng bị rầy tấn công cao. Tuy nhiên, cường độ nhóm aryl – H nhân thơm hiện diện ở nghiệm thức AIM2 + R cũng khá cao (0.055AU), cho các chậu lúa ở nghiệm thức cũng có khả năng bị rầy tấn công. Trong khi đó, nghiệm thức DC – R và AIM1 + R cường độ của nhóm Aryl – H nhân thơm là rất thấp (0AU). Nhóm NH3+ (xác định ở 2 bước sóng: 2918.173cm-1 và 2849.843cm-1) Bảng 3.5: Cường độ nhóm NH3 xuất hiện ở các mẫu phân tích Nghiệm thức Nhóm chức DC - R AIM1 + R DC + R AIM2 + R NH3 0.134 0.196 0.192 0.106 0.919 0.325 0.710 0.322 Biểu đồ 3.4: Cường độ hợp chất NH3 xuất hiện ở các mẫu phân tích Mũi hợp chất NH3 Nhận xét: NH3 là hợp chất gây độc cho cây trồng. Trong qúa trình hô hấp cây thải ra NH3, nhưng nếu trong điều kiện bị tấn công thì cây hô hấp càng mạnh, khi đó NH3 sinh ra nhiều. Qua kết quả phân tích (ở bảng 3.2 và bảng 3.5), nhận thấy cường độ của hợp chất NH3 được xác định ở bước sóng 2918.173cm-1 hiện diện ở nghiệm thức DC + R và AIM2 + R là rất cao (0.919AU và 0.71AU). Trong đó, ở nghiệm thức DC + R là cao nhất, cho thấy các chậu lúa ở nghiệm thức này bị rầy nâu tấn công vào cây. Ngược với 2 nghiệm thức trên, ở nghiệm thức DC – R và AIM1 + R thì cường độ hợp chất NH3 hiện diện trong mẫu lại rất thấp (0.134AU và 0.192AU). Do ở mẫu AIM1 + R có thả rầy và có phun thuốc nên cường độ NH3 ở mẫu này có cao hơn ở mẫu DC – R nhưng không đáng kể. Nhưng nếu so với mẫu có nhiễm rầy mà không có phun thuốc (DC + R) thì cường độ NH3 ở mẫu này cao hơn rất nhiều so với mẫu có nhiễm rầy có phun thuốc (AIM1 + R). Tương tự ở bước sóng 2849.843cm-1 thì cường độ NH3 cao nhất ở 2 mẫu DC + R và AIM2 + R (0.325AU và 0.322AU). Còn cường độ NH3 ở hai mẫu DC – R và AIM1 + R thì thấp hơn (0.196AU và 0.106AU). Nhóm Aldehyde (được xác định ở bước sóng: 1737.579cm-1) Bảng 3.6: Cường độ nhóm Aldehyde xuất hiện ở các mẫu phân tích Nghiệm thức Nhóm chức DC - R AIM1 + R DC + R AIM2 + R Aldehyde 0.157 0.184 0.530 0.522 Biểu đồ 3.5: Cường độ của nhóm aldehyde có trong mẫu Như đã biết các chất chứa nhóm chức aldehyde là những chất chỉ thị cây có bị các tác nhân tấn công hay không? vì thế cây có tác nhân tấn công (cụ thể là rầy nâu) thì sự hiện diện của nhóm chức aldehyde trong cây càng nhiều và ngược lại. Vì vậy, mà ta thấy cường độ aldehyde ở nghiệm thức DC – R là rất thấp, còn DC + R là rất cao. Nhưng nếu so sánh với nghiệm thức AIM1 + R thì cường độ aldehyde trong các mẫu phân tích rất thấp so với nghiệm thức DC + R (0.184AU),cho thấy rầy ít tấn công vào các cây ở nghiệm thức này. Trong khi đó, nghiệm thức AIM2 + R, cường độ aldehyde hiện diện tương đương như ở nghiệm thức DC + R cũng khá cao (0.522AU). Chứng toả ở nghiệm thức này cây lúa cũng rầy nâu tấn công mạnh như ở nghiệm thức đối chứng có thả rầy. Nhóm amino acid (xác định ở bước sóng: 1652.350cm-1) Bảng 3.7: Cường độ nhóm amino acid hiện diện trong các mẫu phân tích Nghiệm thức Nhóm chức DC - R AIM1 + R DC + R AIM2 + R Amino acid 0.071 0.067 0 0 Biểu đồ 3.6: Cường độ của nhóm amino acid Qua kết quả phân tích (ở bảng 3.7), nhận thấy các chất chứa nhóm chức amino acid (-NH2) là những chất gây ngán ăn nội sinh xuất hiện ở 2 nghiệm thức DC – R (0.071AU) mà không thấy xuất hiện ở nghiệm thức DC + R (0AU). Trong khi ở nghiệm thức AIM1 + R xuất hiện mũi nhóm chức amino acid (0.067AU), những chất có hợp chất khác mang chức amino xuất hiện khi có AIM và có rầy. Nhóm P=O thơm (được xác định ở bước sóng 1164.176cm-1) Bảng 3.8: Cường độ nhóm P=O thơm xuất hiện Nghiệm thức Nhóm chức DC - R AIM1 + R DC + R AIM2 + R P=O thơm 0.203 0.082 0.284 0.292 Biểu đồ 3.7: Cường độ của nhóm P=O thơm Từ kết quả biểu diễn ở biểu đồ 3.8, nhận thấy nhóm P=O thơm hiện diện ở nghiệm thức AIM1 + R rất thấp (0.082AU). Ở hai nghiệm thức DC + R và AIM2 + R là cao nhất (0.284AU và 0.292AU). Còn nghiệm thức DC – R cũng khá cao so với AIM1 + R (0.203AU). Nhóm chức P=O thơm xuất hiện là do sự phân giải ATP tạo ADP, nếu nhóm chức P=O thơm thấp có nghĩa là phospho tự do thoát ra nhiều , ít phospho tự do thì cây ít bị ảnh hưởng. Nhóm Arene nhiều nhân thơm (xác định ở bước sóng: 723.646cm-1) Bảng 3.9: Cường độ nhóm Arene nhiều nhân thơm xuất hiện Nghiệm thức Nhóm chức DC - R AIM1 + R DC + R AIM2 + R Arene nhiều nhân thơm 0.158 0.139 0.83 0.81 Biểu đồ 3.8: cường độ của nhóm Arene nhiều nhân thơm trong các mẫu Kết quả biểu diễn ở biểu đồ 3.9 cho thấy, nhóm arene nhiều nhân thơm xuất hiện rất nhiều ở nghiệm thức DC + R và AIM2 + R, mà nhóm arene nhiều nhân thơm cũng có vai trò như nhóm aryl – H, là những nhóm chất kích thích cho rầy ăn. Qua đó, ta thấy ở các mẫu lúa ở nghiệm thức đối chứng có thả rầy mà được xử lý AIM trước nên đã tạo điều kiện cho rầy chít hút nhựa cây. Còn ở nghiệm thức xử lý AIM với liều lượng gấp đôi không những giúp cây có khả năng xua đuổi rầy mà đã giúp cho rầy ăn lúa nhiều hơn thể hiện qua cường độ của nhóm arene trong các mẫu phân tích là khá cao (0.81AU). Nhóm arene nhiều nhân thơm này lại hiện diện rất thấp ở 2 nghiệm thức DC – R và AIM1 + R, thậm chí nhóm arene ở nghiệm thức AIM + R xuất hiện ít hơn (0.139AU) so với DC – R (0.158AU), điều này cho thấy các mẫu lúa ở nghiệm thức có thả rầy nhưng có xử lý AIM trước nên đã hạn chế được sự tấn công của rầy nâu, làm cho rầy không ăn hoặc ăn rất ít trong điều kiện bắt buột như vậy. Nhóm Phenol tự do (được xác định ở bước sóng: 475.685cm-1) Bảng 3.10: Cường độ nhóm phenol tự do xuất hiện Nghiệm thức Nhóm chức DC - R AIM1 + R DC + R AIM2 + R Phenol tự do 0.051 0.122 0.061 0 Biểu đồ 3.9: Cường độ của nhóm phenol tự do trong các mẫu Phenol tự do là những nhóm chức gắn với chức amino acid tạo thành hợp chất ngán ăn nội sinh (chứa –OH và –NH2 ). Qua kết quả bảng 3.7 và 3.10 cho thấy, ở nghiệm thức DC + R cường độ phenol tự do ở đây không gắn với chất chứa nhóm chức amino aicd. Còn ở nghiệm thức AIM1 + R cường độ phenol tự do hiện diện rất cao (0.122AU), mà những phenol này có thể gắn với các chất chứa nhóm chức amino acid tạo thành hợp chất ngán ăn nội sinh trong cây lúa, từ đó cây lúa có khả năng xua đuổi rầy nâu. Cũng giống như nghiệm thức DC + R, AIM2 + R cũng có không hiện diện của nhóm phenol tự do và nhóm amino acid nên không có khả năng kết hợp tạo ra các hợp chất ngán ăn nội sinh. Do đó, không những không hạn được khả năng tấn công của rầy nâu mà còn tạo điều kiện tốt hơn để rầy nâu tấn vào cây lúa. 3.2 Kết quả định lượng đường tổng số (mg/g mẫu tươi) Bảng 3.11: Hàm lượng đường tổng số có trong 1gam mẫu sau các lần thử Nghiệmthức Lần đo DC - R DC + R AIM1 + R AIM2 + R 1 6.38 3.64 10.06 7.90 2 6.67 7.44 8.39 7.73 3 6.54 5.54 9.24 7.83 Trung bình 6.53 5.54 9.23 7.82 Biểu đồ 3.10: Hàm lượng đường tổng số trong các mẫu phân tích Qua bảng kết quả phân tích (xem bảng 3.11), nhận thấy hàm lượng đường ở nghiệm thức AIM1 + R là cao nhất (9.23mg/g), tiếp đến là nghiệm thức AIM2 + R cũng khá cao (7.82mg/g). Còn ở nghiệm thức DC – R và DC + R thì hàm lượng đường gần bằng nhau (6.53mg/g và 5.54mg/g). 3.3 Kết quả định lượng đạm tổng số Hàm lượng đạm tổng số (mg/g mẫu khô) được xác định theo công thức (2.1) Bảng 3.12: Hàm lượng đạm tổng số trong 1g mẫu phân tích, sau các lần thử nghiệm Nghiệm thức Lần thử DC - R DC + R AIM1 + R AIM2 + R 1 9.95 5.17 15.70 16.02 2 7.54 12.19 12.20 13.96 3 9.65 6.96 10.45 14.12 Trung bình 9.05 8.11 12.78 14.70 Biểu đồ 3.11: Hàm lượng đạm tổng số trong các mẫu lúa Đạm (N) là chất dinh dưỡng thiết yếu của cây trồng, không thể thiếu đối với sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa. Do đó, nếu thành phần Nitơ trong cây càng cao thì cây phát triển càng mạnh. Qua kết quả phân tích (ở bảng 3.11) cho thấy, hàm lượng nitơ ở nghiệm thức có nhiễm rầy và phun AIM liều lượng gấp đôi là cao nhất (14.70mg/g mẫu khô), nhưng đối với nghiệm thức có thả rầy có phun thuốc AIM liều lượng 10gam/8lít thì cũng có hàm lượng nitơ khá cao (12.78mg/g mẫu khô). Ở nghiệm thức chứng không thả rầy thì hàm lượng nitơ thấp hơn chỉ chiếm khoảng 9.05mg/g mẫu khô. Còn hàm lượng nitơ ở nghiệm thức đối chứng có nhiễm rầy là thấp nhất (8.11mg/g mẫu khô). Đồng thời qua đó, cho thấy nguồn đạm ở nghiệm thức AIM2 + R là nguồn đạm tự do, nên không có khả năng tạo ra hợp chất ngán ăn nội sinh. Ngược lại, ở nghiệm thức AIM1 + R đây là nguồn đạm tạo ra các hợp chất mới mà cụ thể là hợp chất chứa nhóm chức amino acid và phenol (xem bảng 3.7 và 3.10) làm rầy ngán ăn. Từ đó rầy nâu không tấn công vào cây 3.4 Kết quả phân tích phospho tổng số (mg/g mẫu khô) Hàm lượng phospho tổng số được xác định theo công thức (2.2) Bảng 3.13: Hàm lượng phospho trong 1g mẫu sau thử Nghiệmthức Lần thử DC - R A1 + R DC + R A2 + R 1 4.08 5.21 2.57 5.66 2 5.37 6.01 2.66 4.93 3 4.74 5.61 2.63 5.28 Trung bình 4.73 5.61 2.62 5.29 Biểu đồ 3.12: Hàm lượng phospho trong các mẫu phân tích Các chất chứa nhóm chức P=O thơm hiện diện trong mẫu nhiều thì có phospho tổng số giảm. Kết quả được biểu diễn ở biểu đồ 3.13, cho thấy làm lượng phospho tổng số ở nghiệm thức DC + R là thấp nhất (2.26mg/g), kế đến là nghiệm thức DC – R là 4.73mg/g. Nghiệm thức phun AIM với liều lượng gấp đôi thì hàm lượng phospho cũng khá cao (5.29mg/g), Còn nghiệm thức AIM + R có hàm lượng phospho cao nhất (5.61mg/g). 3.5 Kết quả phân tích hoạt tính enzyme catalase Bảng 3.14: Hoạt tính enzyme catalase trong 1 gram mẫu/µmol H2O2 được giải phóng sau 1 phút Nghiệm thức Lần thử DC - R AIM1 + R DC + R AIM2 + R 1 0.91 0.33 1.66 1.29 2 1.24 0.42 1.53 1.04 3 1.09 0.42 1.79 1.15 Trung bình 1.08 0.39 1.66 1.16 Biểu đồ 3.13: Hoạt tính enzyme catalase trong các mẫu phân tích Catalase là enzyme phân giải hydrogen peroxide (H2O2) thành O2 và H2O. Hydrogen peroxide là một trong những thành phần của phản ứng tự vệ của cây, nên H2O2 là chất xác định mức độ bị ảnh hưởng của cây. Với kết quả phân tích ở trên (bảng 3.14), nhân thấy hoạt tính enzyme catalase ở nghiệm thức DC + R là mạnh nhất (1.66UI). Kế đó là nghiệm thức AIM2 + R và DC – R hoạt tính enzyme catalase cũng khá cao (1.16UI và 1.08UI). Khi đó, ở ngiệm thức AIM1 + R hoạt tính enzyme catalase là thấp nhất (0.39UI). Qua đó, chứng toả ở nghiệm thức này không bị rầy nâu tấn công hoặc có bị nhưng không đáng kể. 3.6 Kết quả đo quang phổ tử ngoại Hàm lượng protein được xác định theo công thức sau: Protein = 1552*A280nm – 757.3*A260nm (µg/g) Bảng 3.15: Hàm lượng protein trong các mẫu phân tích Nghiệm thức DC - R AIM1 + R DC + R AIM2 + R Protein 1270.50 1510.52 2077.01 1814.71 Biểu đổ.14: Hàm lượng protein Qua kết quả phân tích (xem bảng 3.15), cho thấy hàm lượng protein ở các nghiệm thức tương đối cao, trong nghiệm DC – R là cao nhất (2077.01µg/g), kế đó là nghiệm thức AIM2 + R cũng khá cao (1814.71µg/g). Nghiệm thức AIM1 + R có hàm lượng protein cao hơn so với DC – R (1510.12µg/g). Hàm lượng protein ở nghiệm thức DC – R là thấp nhất (1270.50µg/g). 4.1 KẾT LUẬN Qua kết quả thí nghiệm trên, rút ra được một số kết luận sau: Hoạt tính enzyme catalase và cường độ biểu hiện của nhóm NH3 ở mẫu có phun chế phẩm AIM theo liều lượng hướng dẫn là rất thấp so với mẫu đối chứng không thả rầy. Nhưng ngược lại ở nghiệm thức xử lý AIM với liều lượng gấp đôi thì hoạt tính enzyme và cường độ biểu hiện của nhóm NH3 là rất cao, thậm chí còn cao hơn cả ở nghiệm thức đối chứng có thả rầy, điều này cho ta thấy ở nghiệm thức xử lý AIM với liều lượng gấp đôi không những không có khả năng xua đuổi rầy, mà còn kích thích rầy ăn lúa nhiều hơn. Nhưng ở nghiệm thức phun AIM theo liều lượng hướng dẫn thì thấy có xuất hiện các chất nhóm chức ngán ăn nội sinh, mà không thấy xuất hiện ở nghiệm đối chứng có thả rầy và nghiệm thức xử lý AIM với liều lượng gấp đôi, thông qua cường độ biểu thị của các chất chứa chức –NH2, nhóm phenol trong các lần phân tích, các chất làm cho rầy ngán, nên rầy không tấn công vào cây lúa. 4.2 KIẾN NGHỊ Để có thể ứng dụng được các kết quả trong nghiên cứu này vào thực tiễn trong việc tròng trừ rầy nâu cho cây lúa, xin có một số đề nghị sau: Thử khả năng phòng xua đuổi của AIM vào từng giai đoạn phát triển trên cây lúa. Tìm hiểu về mối quan hệ rầy nâu và ký chủ. Tìm hiểu thêm về các chất có tác dụng kích thích tính kháng trong cây trồng. Sử dụng AIM trong điều kiện sản xuất đại trà.