Đề tài Khảo sát vài yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp taxol của các hệ thống tế bào taxus wallichianazucc. in vitro

TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 13, SỐ T3 - 2010 Bản quyền thuộc ĐHQG-HCM Trang 67 KHẢO SÁT VÀI YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TỔNG HỢP TAXOL CỦA CÁC HỆ THỐNG TẾ BÀO TAXUS WALLICHIANA ZUCC. IN VITRO Lê Thị Thuỷ Tiên(1), Bùi Trang Việt (2), Nguyễn Đức Lượng(1) (1) Trường Đại học Bách khoa, ĐHQG-HCM (2) Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM (Bài nhận ngày 08 tháng 01 năm 2009, hoàn chỉnh sửa chữa ngày 30 tháng 11 năm 2010) TÓM TẮT: Mô sẹo và dịch treo tế bào hình thành từ sự phân chia của các tế bào nhu mô vỏ thân cây thông ñỏ Lâm Đồng Taxus wallichiana Zucc. trên môi trường B5 có bổ sung 2,4-D và kinetin. Sự sinh tổng hợp taxol của các hệ thống tế bào chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như thời gian nuôi cấy, nhiệt ñộ, áp suất thẩm thấu, chất cảm ứng... Sự kéo dài thời gian nuôi cấy làm giảm sự tăng trưởng của mô sẹo nhưng làm tăng sự tích luỹ taxol trong tế bào. Ánh sáng ngăn cản sự tăng trưởng của mô sẹo nhưng làm tăng sự tổng hợp taxol. Sự gia tăng áp suất thẩm thấu môi trường nuôi cấy (với saccharose 60 g/l), sự bổ sung phenylalnine (20 mg/l) với vai trò là tiền chất hữu cơ, methyl jasmonate (10 mg/l) với vai trò là tác nhân cảm ứng ñều làm tăng sự tích luỹ taxol trong tế bào. Hàm lượng taxol trong các hệ thống tế bào ñược ñánh giá thông qua tác ñộng cản sự tạo phác thể rễ của trụ hạ diệp cây mầm ñậu xanh. Từ khóa: Mô sẹo, dịch treo tế bào, Taxus wallichiana Zucc., taxol. 1. GIỚI THIỆU Taxol (paclitaxel), một alkaloid diterpenoid tự nhiên ñược thu nhận từ vỏ cây thông ñỏ Thái Bình Dương (Taxus brevifolia), ñược FDA (the Food and Drug Administration) công nhận là tác nhân hoá trị hiệu quả và quan trọng ñối với một số bệnh ung thư vào năm 1992 (Woo và cộng sự, 1994) [22]. Việc cung cấp taxol bị hạn chế do thu nhận từ cây ngoài tự nhiên với số lượng giới hạn, ñồng thời với nhu cầu sử dụng ñể ñiều trị ung thư ngày càng tăng. Nhiều phương pháp thu nhận taxol ñược nghiên cứu như tổng hợp hoá học, bán tổng hợp từ tiền chất là 10- deacetylbaccatin III, nuôi cấy tế bào thực vật... Các hệ thống tế bào Taxus in vitro ñược xem như một phương tiện ñầy hứa hẹn ñể sản xuất taxol (Jaziri và cộng sự, 1996) [10]. Tuy nhiên, vẫn còn một số hạn chế khi ñưa vào sản xuất phục vụ nhu cầu thương mại do sản lượng thấp và không ổn ñịnh. Vì vậy, ñể có thể thương mại hoá taxol cần phải có những dòng tế bào tăng sinh nhanh, có khả năng sản xuất cao và ổn ñịnh. Việc chọn dòng tế bào kết hợp với ñiều kiện môi trường tối ưu, chất cảm ứng thích hợp là yếu tố quyết ñịnh trong sản xuất (Collins- Pavao và cộng sự, 1996) [5]. Các nhà khoa học ñã tập trung vào nghiên cứu vấn ñề này và nâng cao hiệu suất theo các hướng: bổ sung các tiền chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy (Silvestrini và cộng sự, 2002) [18], tạo áp suất Science & Technology Development, Vol 13, No.T3- 2010 Trang 68 Bản quyền thuộc ĐHQG-HCM thẩm thấu của môi trường nuôi cấy (Kim và cộng sự, 2001) [11]; sử dụng các chất cảm ứng như methyl jasmonate (Luo và cộng sự, 2003) [13] … Tất cả những yếu tố này khi ñược xử lý ñộc lập với nhau ñều có thể làm tăng sản lượng taxol trong môi trường nuôi cấy. Các hướng nghiên cứu trên cho thấy khả năng nâng cao quá trình sinh tổng hợp taxol có thể thực hiện ñược. Sự sinh tổng hợp taxol ñược ñánh giá bởi các phương pháp tiên tiến (HPLC) nhưng ñồng thời cũng có thể ñánh giá qua khả năng cản sự hình thành phác thể rễ từ trụ hạ diệp cây mầm ñậu xanh (Lê Thị Thuỷ tiên và cộng sự, 2010) [21]. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Vật liệu tạo mô sẹo và dịch treo tế bào là thân non 3 – 4 tuần tuổi trên cây Thông ñỏ Lâm Đồng (Taxus wallichiana Zucc.), ñược cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu Lâm sinh Lâm Đồng. Vật liệu dùng trong sinh trắc nghiệm sự tạo phác thể rễ là trụ hạ diệp cây mầm ñậu xanh (Phaseolus aureus Roxb.) 3 ngày tuổi. Phương pháp ● Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên sự sinh tổng hợp taxol Mô sẹo trên môi trường B5 (Gamborg và cộng sự, 1968) [9] bổ sung 2,4-D 4 mg/l và kinetin 1 mg/l (Lê Thị Thuỷ Tiên và cộng sự, 2006) [19], dịch treo tế bào trong môi trường B5 với 2,4-D 5 mg/l, kinetin 0,5 mg/l, casein hydrolysate 750 mg/l và PVP 1000 mg/l (Lê Thị Thuỷ Tiên và cộng sự, 2006) [20] ñược sử dụng trong các thí nghiệm cải tiến ñiều kiện môi trường nuôi cấy ñể thúc ñẩy sự sinh tổng hợp taxol của tế bào. Chỉ số tăng trưởng của mô sẹo và dịch treo tế bào ñược xác ñịnh theo Chen và cộng sự (2003) [3]. Thời gian nuôi cấy Mô sẹo ñược duy trì trong thời gian 7, 8, 9 và 10 tháng. Sự cấy chuyền ñược thực hiện ñều ñặn sau mỗi 4 tuần. Khảo sát sự tăng trưởng và hoạt tính taxol của mô sẹo 7, 8, 9 và 10 tháng tuổi. Ánh sáng Mô sẹo và dịch treo tế bào ñược duy trì trong 4 tuần ở ñiều kiện tối và sáng (cường ñộ ánh sáng 2800 ± 200 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày). Khảo sát sự tăng trưởng và hoạt tính taxol của mô sẹo và dịch treo tế bào. Nhiệt ñộ Mô sẹo và dịch treo tế bào ñược nuôi cấy ở các ñiều kiện nhiệt ñộ khác nhau: 22, 25, 28 và 31oC. Khảo sát sự tăng trưởng và hoạt tính taxol của mô sẹo và dịch treo tế bào. Methyl jasmonate Methyl jasmonate ñược bổ sung vào dịch treo tế bào ở ngày thứ 14 của quá trình nuôi cấy với nồng ñộ 10, 20, 30 và 40 mg/l. Khảo sát sự tăng trưởng và hoạt tính taxol của dịch treo tế bào. Phenylalanine Phenylalanine ñược bổ sung vào dịch treo tế bào ở ngày thứ 14 của quá trình nuôi cấy với nồng ñộ 10, 20 và 30 mg/l. Khảo sát sự tăng trưởng và hoạt tính taxol của dịch treo tế bào. Saccharose Dịch treo tế bào ñược nuôi trong môi trường có saccharose nồng ñộ 30, 40, 60, 80 và TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 13, SỐ T3 - 2010 Bản quyền thuộc ĐHQG-HCM Trang 69 100 g/l. Khảo sát sự tăng trưởng và hoạt tính taxol của dịch treo tế bào. ● Thu nhận taxol từ các hệ thống tế bào Taxol trong các hệ thống tế bào ñược ly trích với chloroform (Chattopadhyay và cộng sự, 2004) [2]. ● Xác ñịnh hoạt tính taxol bằng phương pháp trắc nghiệm sự tạo phác thể rễ Cao chloroform từ 1g (trọng lượng tươi) mô sẹo hay dịch treo tế bào ñược hòa tan trong 1ml cồn 5% và bổ sung vào 10 ml môi trường agar với saccharose 20g/l ñể trắc nghiệm sự tạo phác thể rễ từ trụ hạ diệp cây mầm ñậu xanh. Hoạt tính của taxol trong cao chiết tỷ lệ nghịch với sự sai biệt về số lượng rễ hình thành trong ñiều kiện chuẩn (không có taxol) sau 30 giờ xử lý trong tối và ñược tính bằng cách so sánh với dung dịch taxol tinh khiết 1mg/l (Lê Thị Thuỷ Tiên và cộng sự, 2010) [21]. 3. KẾT QUẢ Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến sự tăng trưởng và hoạt tính taxol của mô sẹo Mô sẹo 7, 8, 9 và 10 tháng tuổi ñược sử dụng làm nguyên liệu ñể ly trích và xác ñịnh hoạt tính của taxol và các hợp chất liên quan. Sự tăng trưởng của mô sẹo giảm theo sự kéo dài thời gian nuôi cấy. Thời gian nuôi cấy càng dài, mô sẹo càng tăng trưởng chậm và màu sắc của mô sẹo càng ñậm hơn (ảnh 1, 2). Sự giảm tăng trưởng của mô sẹo xảy ra song song với sự gia tăng hoạt tính của taxol trong tế bào. Hoạt tính của taxol cao nhất (1,06 mg/l) thu ñược từ mô sẹo 10 tháng tuổi (bảng 1). Ảnh 1. Mô sẹo 7 tháng tuổi Ảnh 2. Mô sẹo 9 tháng tuổi Bảng 1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự sinh tổng hợp taxol của mô sẹo Thời gian (tháng) Chỉ số tăng trưởng Hoạt tính của taxol (mg/l) 7 0,33 ± 0,02d 0,62 ± 0,03a 8 0,21 ± 0,01c 0,78 ± 0,04b 9 0,09 ± 0,00b 0,93 ± 0,04c 10 0,03 ± 0,01a 1,06 ± 0,03d Science & Technology Development, Vol 13, No.T3- 2010 Trang 70 Bản quyền thuộc ĐHQG-HCM Các mẫu tự khác nhau biểu diễn mức ñộ sai biệt có ý nghĩa (theo cột) ở ñộ tin cậy 95%. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt tính taxol của mô sẹo và dịch treo tế bào Nhiệt ñộ thích hợp cho sự sinh tổng hợp taxol của mô sẹo và dịch treo tế bào là 28oC. Tuy nhiên, sự tăng trưởng của các hệ thống tế bào này tốt hơn ở 25oC. Sự giảm tăng trưởng của mô sẹo và dịch treo tế bào xảy ra cùng với sự gia tăng tổng hợp taxol trong tế bào. Hoạt tính taxol của mô sẹo cao hơn của dịch treo tế bào trong tất cả các nghiệm thức (bảng 2). Bảng 2. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ lên sự tăng trưởng và hoạt tính taxol của mô sẹo và dịch treo tế bào Mô sẹo Dịch treo tế bào Nhiệt ñộ (oC) Chỉ số tăng trưởng Hoạt tính của taxol (mg/l) Chỉ số tăng trưởng Hoạt tính của taxol (mg/l) 22 0,43 ± 0,04a 0,43 ± 0,02a 0,28 ± 0,09ab 0,39 ± 0,04a 25 0,58 ± 0,05c 0,59 ± 0,03b 0,43 ± 0,09b 0,50 ± 0,09bc 28 0,31 ± 0,04ab 0,76 ± 0,03c 0,17 ± 0,06a 0,59 ± 0,03c 31 0,25 ± 0,03a 0,64 ± 0,03b 0,07 ± 0,01a 0,42 ± 0,03ab Các mẫu tự khác nhau biểu diễn mức ñộ sai biệt có ý nghĩa (theo cột) ở ñộ tin cậy 95%. Ảnh hưởng của ánh sáng ñến hoạt tính taxol của mô sẹo và dịch treo tế bào Mô sẹo trong ñiều kiện chiếu sáng tăng trưởng chậm, màu nâu. Mô sẹo trong ñiều kiện tối tăng trưởng nhanh hơn và có màu vàng nâu (ảnh 3). Tương tự, sự tăng trưởng của dịch treo tế bào ở ñiều kiện sáng thấp hơn ở trong tối. Điều kiện chiếu sáng kích thích sự sinh tổng hợp taxol của mô sẹo và dịch treo tế bào cao hơn ñiều kiện tối (bảng 3). Ảnh 3. Mô sẹo ñược nuôi trong ñiều kiện chiếu sáng khác nhau TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 13, SỐ T3 - 2010 Bản quyền thuộc ĐHQG-HCM Trang 71 Bảng 3. Ảnh hưởng của ánh sáng trên sự tăng trưởng và hoạt tính taxol của mô sẹo và dịch treo tế bào Mô sẹo Dịch treo tế bào Điều kiện nuôi cấy Chỉ số tăng trưởng Hoạt tính của taxol (mg/l) Chỉ số tăng trưởng Hoạt tính của taxol (mg/l) Sáng 0,220 ± 0,033 0,960 ± 0,075 0,175 ± 0,029 0,620 ± 0,015 Tối 0,789 ± 0,009 0,570 ± 0,021 0,258 ± 0,046 0,430 ± 0,017 Ảnh hưởng của methyl jasmonate ñến sự tăng trưởng và hoạt tính taxol của dịch treo tế bào Sự hiện diện của methyl jasmonate trong môi trường nuôi cấy kích thích sự sinh tổng hợp taxol của dịch treo tế bào, ñặc biệt với methyl jasmonate 10 mg/l (hoạt tính của taxol ương 0,74 mg/l). Tác ñộng của methyl jasmonate nồng ñộ 30 và 40 mg/l tương ñương nhau và hầu như sự tăng trưởng của dịch treo tế bào không bị ảnh hưởng bởi methyl jasmonate (bảng 4). Bảng 4. Ảnh hưởng của methyl jasmonate lên sự tăng trưởng và hoạt tính taxol của dịch treo tế bào Methyl jasmonate (mg/l) Chỉ số tăng trưởng Hoạt tính của taxol (mg/l) 0 0,23 ± 0,04a 0,50 ± 0,01a 10 0,21 ± 0,02a 0,74 ± 0,03c 20 0,23 ± 0,03a 0,67 ± 0,03bc 30 0,18 ± 0,03a 0,65 ± 0,03b 40 0,15 ± 0,01a 0,65 ± 0,02b Các mẫu tự khác nhau biểu diễn mức ñộ sai biệt có ý nghĩa (theo cột) ở ñộ tin cậy 95%. Ảnh hưởng của phenylalanine lên sự sinh tổng hợp taxol của dịch treo tế bào Hoạt tính của taxol trong dịch treo tế bào tăng theo sự gia tăng nồng ñộ phenylalanine trong môi trường nuôi cấy. Hoạt tính của taxol cao nhất với phenylalanine 20 và 30 mg/l. Phenylalanine không ảnh hưởng ñến sự tăng trưởng của dịch treo tế bào (bảng 5). Bảng 5. Ảnh hưởng của phenylalanine lên sự tăng trưởng và hoạt tính taxol của dịch treo tế bào Phenylalanine (mg/l) Chỉ số tăng trưởng Hoạt tính của taxol (mg/l) 0 0,23 ± 0,04a 0,50 ± 0,01a 10 0,28 ± 0,04a 0,61 ± 0,01b Science & Technology Development, Vol 13, No.T3- 2010 Trang 72 Bản quyền thuộc ĐHQG-HCM 20 0,20 ± 0,03a 0,70 ± 0,03c 30 0,23 ± 0,03a 0,72 ± 0,03c Các mẫu tự khác nhau biểu diễn mức ñộ sai biệt có ý nghĩa (theo cột) ở ñộ tin cậy 95%. Ảnh hưởng của saccharose lên sự sinh tổng hợp taxol của dịch treo tế bào Sự tăng trưởng của dịch treo tế bào càng giảm khi nồng ñộ saccharose trong môi trường nuôi cấy càng tăng. Hiện tượng co nguyên sinh của tế bào dịch treo ñược quan sát dưới kính hiện vi ở nồng ñộ saccharose 40 g/l (ảnh 4, 5). Ảnh 4. Tế bào dịch treo trong môi trường có nồng ñộ saccharose 30 g/l. Mũi tên chỉ các hạt tinh bột trong tế bào Ảnh 5. Tế bào dịch treo trong môi trường có nồng ñộ saccharose 40 g/l. Mũi tên chỉ tế bào ñang ở trạng thái co nguyên sinh Dịch treo tế bào gần như không tăng trưởng với saccharose 80 và 100 g/l. Ngược lại, hoạt tính của taxol tăng khi tăng nồng ñộ saccharose trong môi trường nuôi cấy và cao nhất (0,8 mg/l) với saccharose 60 g/l. Sự tiếp tục gia tăng nồng ñộ saccharose làm giảm hoạt tính của taxol trong dịch treo tế bào (bảng 6). Bảng 6. Ảnh hưởng của saccharose lên sự tăng trưởng và hoạt tính taxol của dịch treo tế bào Saccharose (g/l) Chỉ số tăng trưởng Hoạt tính của taxol (mg/l) 30 0,23 ± 0,02d 0,50 ± 0,01a 40 0,20 ± 0,02cd 0,67 ± 0,02b 60 0,16 ± 0,02c 0,80 ± 0,03c 80 0,08 ± 0,06b 0,65 ± 0,03b 100 0,02 ± 0,00a 0,44 ± 0,02a Các mẫu tự khác nhau biểu diễn mức ñộ sai biệt có ý nghĩa (theo cột) ở ñộ tin cậy 95%. TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 13, SỐ T3 - 2010 Bản quyền thuộc ĐHQG-HCM Trang 73 4. THẢO LUẬN Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự sinh tổng hợp taxol Thời gian nuôi cấy càng dài, sự tăng trưởng của mô sẹo càng giảm, nhưng sự sinh tổng hợp taxol càng tăng (bảng 1). Trong tế bào thực vật, taxol kết dính các tiểu ñơn vị tubulin của vi ống, trạng thái cân bằng ñộng của vi ống bị phá vỡ, ảnh hưởng ñến sự phân chia của tế bào (Morejohn và cộng sự, 1984) [14]. Do ñó, sự sinh tổng hợp và tích luỹ của taxol trong tế bào theo thời gian nuôi cấy sẽ cản sự phân chia của tế bào và làm chậm sự tăng trưởng của mô sẹo. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ lên sự sinh tổng hợp taxol Mỗi enzyme có một nhiệt ñộ tối thích ñể hoạt ñộng. Nhiệt ñộ ảnh hưởng trên sự tăng trưởng và sinh tổng hợp taxol của dịch treo tế bào thông qua hoạt ñộng của các enzyme trong các con ñường biến dưỡng có liên quan. Trong khoảng nhiệt ñộ ñược khảo sát (22 – 31 oC), sự tăng trưởng của mô sẹo và dịch treo tế bào Thông ñỏ Lâm Đồng tối ña ở 25oC, và càng giảm khi nhiệt ñộ của môi trường nuôi cấy càng tăng (bảng 2). Sự gia tăng nhiệt ñộ có thể ảnh hưởng ñến hoạt tính của các enzyme tham gia vào các con ñường biến dưỡng tạo các sản phẩm bậc một ñể cung cấp năng lượng và nguyên liệu cho sự tăng trưởng và phân chia tế bào (Choi và cộng sự, 2000) [4]. Sự sinh tổng hợp taxol của mô sẹo và dịch treo tế bào Thông ñỏ tăng dần theo sự gia tăng nhiệt ñộ của môi trường nuôi cấy, cao nhất ở 28oC (0,76 mg/l ñối với sẹo và 0,59 mg/l ñối với dịch treo tế bào), giảm ở 31oC. Như vậy nhiệt ñộ tối thích cho sự tăng trưởng tế bào khác với nhiệt ñộ tối thích cho sự tạo taxol. Choi và cộng sự (2000) cũng ghi nhận dịch treo tế bào Taxus chinensis tăng trưởng tốt nhất ở 24oC trong khi sự sinh tổng hợp taxol cao nhất ở 29oC [4]. Ảnh hưởng của ñiều kiện chiếu sáng lên sự sinh tổng hợp taxol Ở nhiều loài thực vật, ngoài tác ñộng lên sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo ñược nuôi cấy in vitro, ánh sáng còn ảnh hưởng ñến sự sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong tế bào do liên quan ñến sự hoạt ñộng của một số enzyme nội bào (Fett-Neto và cộng sự, 1995) [8]. Sự tăng trưởng của mô sẹo và dịch treo tế bào từ thân non cây Thông ñỏ Lâm Đồng bị cản mạnh trong ñiều kiện chiếu sáng nhưng hoạt tính của taxol cao hơn so với trong tối (bảng 3). Mặt khác, mô sẹo trong ñiều kiện chiếu sáng có màu nâu ñậm hơn khi ñược nuôi trong tối. Khác với kết quả trên Taxus cuspidata (Fett-Neto và cộng sự, 1995) [8], ánh sáng cản ñồng thời sự tăng trưởng của dịch treo tế bào và sự sinh tổng hợp taxol. Sự chậm tăng trưởng của mô sẹo dưới ánh sáng ñược giải thích qua sự tăng cường sinh tổng hợp các hợp chất phenol. Các hợp chất này liên kết với một số enzyme liên quan ñến sự tăng trưởng của tế bào và ngăn cản sự hoạt ñộng của các enzyme này (Page và cộng sự, 1987) [16]. Các hợp chất phenol sau khi tổng hợp có thể tiết ra ngoài và bị oxy hoá làm cho mô sẹo và môi trường nuôi cấy có màu nâu. Ánh sáng còn có thể cản sự tăng trưởng của tế Science & Technology Development, Vol 13, No.T3- 2010 Trang 74 Bản quyền thuộc ĐHQG-HCM bào thực vật do cản mHMGR, enzyme chìa khoá trong sự sinh tổng hợp mevalonate (tiền chất của gibberellin và cytokinin và của các sterol trên màng tế bào) ñang hoạt ñộng mạnh trong những tế bào ñang phân chia (Narita và cộng sự, 1989) [15]. Ảnh hưởng của methyl jasmonate lên sự sinh tổng hợp taxol Methyl jasmonate và acid jasmonic là những hợp chất ñược xem như nhóm chất ñiều hoà sinh trưởng thực vật có vai trò trong sự lão suy của thực vật, tham gia vào con ñường truyền tín hiệu ngoại sinh (stress, vết thương, sinh vật gây bệnh) và cảm ứng hoạt ñộng của hệ thống phòng thủ ở thực vật. Methyl jasmonate khởi ñộng sự phiên mã mRNA de novo của các gen PAL dẫn tới sự tạo Phenylalanine ammonia-lyase, enzyme ñầu tiên của con ñường phenylpropanoid liên quan chặt chẽ ñến sự sản xuất các hợp chất thứ cấp ở thực vật (Brincat và cộng sự, 2002) [1]. Methyl jasmonate hầu như không ảnh hưởng ñến sự tăng trưởng của dịch treo tế bào. Tuy nhiên, hàm lượng taxol trong dịch treo tế bào tăng cao khi methyl jasmonate ñược bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Hàm lượng taxol cao nhất trong tế bào dịch treo với methyl jasmonate 10 mg/l là 0,74 mg/l (bảng 4). Ở methyl jasmonate nồng ñộ 20, 30 và 40 mg/l, hoạt tính của taxol giảm có thể do methyl jasmonate nồng ñộ cao có những bất lợi ñến hoạt ñộng biến dưỡng của tế bào và thậm chí có làm chết tế bào (Kim và cộng sự, 2005) [12] ảnh hưởng ñến sự sinh tổng hợp taxol. Ảnh hưởng của phenylalanine lên sự sinh tổng hợp taxol Phenylalanine là tiền chất của nhiều hợp chất thứ cấp của tế bào thực vật như anthocyanin (Edahiro và cộng sự, 2005) [6] hay taxol (Fett-Neto và cộng sự, 1993) [7]... Taxol là một alkaloid diterpenoid, có mạch nhánh ñược tạo thành từ phenylalanine nhờ phản ứng xúc tác của aminomutase, enzyme xúc tác sự tái sắp xếp vị trí của nhóm amin, sự hydroxyl hoá ở vị trí C2 và sự benzoyl hoá khi gắn kết phenylisoleucin với baccatin III ñể tạo thành taxol (Brincat và cộng sự, 2002) [1]. Sự hiện diện của phenylalanine làm tăng hàm lượng taxol trong dịch treo tế bào (bảng 5), ñặc biệt là phenylalanine 20 và 30 mg/l nhưng dường như không ảnh hưởng ñến sự tăng trưởng của dịch treo tế bào. Như vậy, sự sự tăng trưởng của dịch treo tế bào và sự sinh tổng hợp taxol là hai quá trình khác nhau. Ảnh hưởng của saccharose lên sự sinh tổng hợp taxol Sự gia tăng nồng ñộ saccharose trong môi trường nuôi cấy làm giảm sự tăng trưởng của dịch treo tế bào. Ở nồng ñộ saccharose 100 g/l, sự tăng trưởng của dịch treo tế bào gần như hoàn toàn không xảy ra. Về mặt cơ bản, sự gia tăng nồng ñộ ñường có hai tác ñộng khác nhau trên các ñặc tính sinh lý của dịch treo tế bào thực vật. Tác ñộng thứ nhất là làm thay ñổi các yếu tố vật lý của môi trường xung quanh tế bào do sự gia tăng áp suất thẩm thấu và tác ñộng thứ hai là nguồn carbohydrate sẵn sàng ñể cung cấp cho các hoạt ñộng sống của tế bào (Kim và cộng sự, 2001) [11]. Sự tăng cao nồng ñộ TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 13, SỐ T3 - 2010 Bản quyền thuộc ĐHQG-HCM Trang 75 ñường gây ra trạng thái co nguyên sinh của tế bào, làm xáo trộn hoạt ñộng biến dưỡng của tế bào và kết quả là sự giảm tăng trưởng của tế bào. Ngược lại, áp suất thẩm thấu của môi trường tăng sẽ trở thành một tín hiệu cảm ứng con ñường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp (Panda và cộng sự, 1992) [17] bao gồm cả taxol. Tuy nhiên, một áp suất thẩm thấu quá cao (nồng ñộ saccharose 80 và 100 g/l) có thể làm xáo trộn các hoạt ñộng biến dưỡng, cản trở sự sinh tổng hợp taxol. Kết quả nghiên cứu này tương tự như kết quả nghiên cứu của Kim và cộng sự (2001) [11] trên ñối tượng là dịch treo tế bào Taxus chinensis. 5. KẾT LUẬN - Sự kéo dài thời gian nuôi cấy làm tăng sự sinh tổng hợp taxol ñồng thời với sự giảm tăng trưởng của mô sẹo. - Điều kiện chiếu sáng thúc ñẩy sự sinh tổng hợp taxol của mô sẹo và dịch treo tế bào. - Nhiệt ñộ tối ưu cho sự tăng trưởng và sự sinh tổng hợp taxol của mô sẹo và dịch treo tế bào là 25oC. - Các yếu tố có tác ñộng hiệu quả ñến sự sinh tổng hợp taxol của dịch treo tế bào là methyl jasmonate 10 mg/l và phenylalanine 20 mg/l. - Saccharose 60 g/l làm tăng sự sinh tổng hợp taxol nhưng làm giảm sự tăng trưởng của dịch treo tế bào. USING BIOTEST TO ESTIMATE TAXOL PRODUCTION FROM CELL SUSPENSION CULTURE OF TAXUS WALLICHIANA ZUCC. IN DIFFERENT CONDITIONS OF CULTURE Le Thi Thuy Tien(1), Bui Trang Viet(2), Nguyen Duc Luong (1) (1) University of Technology, VNU-HCM (2) University of Science, VNU-HCM ABSTRACT: Calli and cell suspension cultures were initiated from Lam Dong Yew (Taxus wallichiana Zucc.) young stem explants, on B5 medium supplemented with 2,4-D and kinetin at appropriate concentrations. Taxol content was estimated by using a root primordium biotest with hypocotyl cuttings of Phaseolus aureus Roxb. (green bean). Results showed that taxol production was influenced by different conditions of culture, such as culture time, temperature, medium osmotic pressure or methyl jasmonate... The growth of calli were inhibited if they were lighted or maintained for a long time on medium culture but taxol synthesis was stimulated. Phenylalanine (as organic precusor), methyl jasmonate (as biotic elicitor) as well as a high osmotic pressure induced taxol accumulation. Keywords: Calli, cell suspension, Taxus wallichiana Zucc., taxol. Science & Technology Development, Vol 13, No.T3- 2010 Trang 76 Bản quyền thuộc ĐHQG-HCM TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. M.C. Brincat, D.M. Gibson, M.L. Shuler, Alterations in taxol production in plant cell culture via manipulation of phenylalanine ammonia lyase pathway, Biotechnol. Prog, 18: 1149 – 1156 (2002). [2]. S. K. Chattopadhyay, S. Kumar, S.N. Srivastava, Singh A., K. R. S. Tirupadiripuliyur, A. K. Garg, S.P. Singh, Process for preparing brevifoliol. United State Patent application 20040127741 (2004). [3]. Y-Q. Chen, F. Yi, M. Cai, J-X. Luo, Effects of amino acids, nitrate, and ammonium on the growth and taxol production in cell cultures of Taxus yunnanensis. Plant Growth Regulation, 41: 265–268 (2003). [4]. H.K. Choi, S.I. Kim, J.S. Son, S.S. Hong, H.S. Lee, H.J. Lee, Enhancement of paclitaxel production by temperature shift in suspension culture of Taxus chinensis. Enzyme and Microbial Technology 27: 593–598 (2000). [5]. M. Collins-Pavao, C.K. Chin, H. Pedersen, Taxol partitioning in two-phase plant cell cultures of Taxus brevifolia. Journal of Biotechnology (49): 95 – 100 (1996). [6]. J. Edahiro, M. Nakamura, M. Seki, Enhanced accumulation of anthocyanin in cultured strawberry cells by repetitive feeding of L-phenylalanine into medium. Journal of Bioscience and Bioengineering, 99 (1):43-47 (2005). [7]. A.G. Fett-Neto, S.J. Melanson, K. Sakata, F. DiCosmo, Improved growth and taxol yield in developing calli of Taxus cuspidata by medium composition modification. Biotechnology 11: 731-734 (1993). [8]. A. G. Fett-Neto, J. J. Pennington, F. DiCosmo, Effect of white light on taxol and baccatin III accumulation in cell cultures of Taxus cuspidata Sieb and Zucc. J. Plant Physiol., 146: 584 – 590 (1995). [9]. O. L. Gamborg, R. A. Miller, K. Ojima, Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res (50): 151-158 (1968). [10]. M. Jaziri, A. Zhiri, Y.W. Guo, J. P. Dupont, K. Shimomura, H. Hamada, M. Vanhaelen, J. Homes, Taxus sp. cell, tissue and organ cultures as alternative source for taxoids production: a literature survey. Plant Cell Tissue Organ Cult. 46, 59 – 75 (1996). [11]. S-I. Kim, H-K. Choi, J-H. Kim, H-S Lee, S-S. Hong, Effect of osmotic pressure on paclitaxel production in suspension cell cultures of Taxus chinensis. Enzyme and Microbial Technology, 28: 202 – 209 (2001). [12]. B.J. Kim, D.M. Gibson, M.L. Shuler, Relationship of viability and apoptosis to taxol production in Taxus sp. suspension cultures elicited with methyl jasmonate. Biotechnol. Prog, 21, 700-707 (2005). [13]. J. Luo, G.Y. He, Optimization of elicitors and precursors for paclitaxel production TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 13, SỐ T3 - 2010 Bản quyền thuộc ĐHQG-HCM Trang 77 in cell suspension culture of Taxus chinensis in the presence of nutrient feeding. Process Biochemistry, 30: 1 – 8 (2003). [14]. L. C. Morejohn, D. E. Fosket, Taxol- induced rose microtubule polymerization in vitro and its inhibition by colchicine. The Journal of Cell Biology, 99, 141-147 (1984). [15]. J.O. Narita, W. Gruissem, Tomato hydroxymethylglutaryl CoA reductase is required early in fruit development but not during ripening. The Plant Cell, 1: 181 – 190 (1989). [16]. Y. M. Page, J. Van Staden, Hypoxoside production in tissue cultures of Hypoxis rooperi. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 9 (2): 131 - 136 (1987). [17]. A. K Panda., S. Mishram, V. S. Bisaria, Alkaloid production by plant cell suspension cultures of Holarrhena antidysenterica: I. Effect of major nutrients. Biotechnology and Bioengineering, 39: 1043 – 1051 (1992). [18]. A. Silvestrini, G. Pasqua, B. Botta, B. Monacelli, R. van der Heijden, R. Verpoorte, Effect of alkaloid precursor feeding on a Camptotheca acuminata cell line. Plant Physiology and Biochemistry, 40: 749-753 (2000). [19]. Lê Thị Thuỷ Tiên, Bùi Trang Việt, Nguyễn Đức Lượng, Sự tạo mô sẹo và dịch treo tế bào có khả năng sản xuất taxol từ lá và thân non cây thông ñỏ Taxus wallichiana Zucc. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 4(1): 1 – 6 (2006). [20]. Lê Thị Thuỷ Tiên, Bùi Trang Việt, Nguyễn ĐứcLượng, Tìm hiểu về sự tăng trưởng của dịch treo tế bào Taxus wallichiana Zucc. Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ ĐHQG TPHCM, 9(5): 47 – 51 (2006). [21]. Lê Thị Thuỷ Tiên, Bùi Trang Việt, Nguyễn Đức Lượng, Tác ñộng của taxol trên sự phân chia tế bào trụ hạ diệp cây mầm ñậu xanh (Phaseolus aureus Roxb.). Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ ĐHQG TPHCM, 1(13): 43 – 47 (2010). [22]. D.D.L. Woo, S.Y.P. Miao, J.C. Pelayo, A.S. Woollf, Taxol inhibits progression of congenital polycystic kidney disease. Nature 368, 750 – 753 (1994).