Đề tài Luận án Nuôi thu sinh khối tảo Nannochloropsis oculata và sử dụng các loại thức ăn khác nhau để nuôi luân trùng Brachionus plicatlis làm thức ăn cho ấu trùng cá biển

h hoá của luân trùng. Theo Olsen và ctv (1993) khi nhiệt độ thấp luân trùng tiêu thụ thức ăn chậm, tốc độ phát triển quần đàn thấp nhưng lại duy trì được hàm lượng lipit và carbohydrate trong thời gian dài (Như Văn Cẩn, 1999). Ngược lại, nhiệt độ cao tiêu thụ thức ăn nhanh, tốc độ tăng sinh khối nhanh (do tăng hoạt động sinh sản) nhưng nuôi luân trùng với nhiệt độ cao đi kèm với chi phí nhiều hơn cho thức ăn và thành phần sinh hoá cũng biến đổi rất nhanh, đặc biệt khi biên động về thức ăn. Sự thích ứng nhiệt độ cũng phụ thuộc vào từng dòng, dòng nhỏ có nhiệt độ cực thuận nằm trong khoảng 28-350C, trong khi đó dòng lớn là 18-250C (Fukusho, 1989 trích bởi Cái Ngọc Bảo Anh). Bảng 1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động sinh sản của Brachionus plicatlis (Theo Ruttner-Kolisko, 1972) Nhiệt đô (0C) 15 20 25 Thời gian để phát triển phôi (ngày) 1,3 1,3 0,6 Thởi gian đẻ các con cái non đẻ lần đầu (ngày) 3,0 1,9 1,3 Khoảng thời gian giữa hai lần đẻ (giờ) 7,0 5,3 4,0 Tuổi thọ (ngày) 15 10 7 Số trứng do 1 con cái đẻ trong cuộc đời của nó 23 23 20 –Độ mặn: Độ mặn thích hợp nuôi luân trùng được xác định nằm trong khoảng 4 – 35 ppt (Lubzens, 1987), tốt nhất là 25 ppt ( Spektorova, 1998 trích Như Văn Cẩn, 1999). Mặc dù, luân trùng có thể tồn tại ở độ mặn 1 -97 ppt, nhưng nó chỉ phát triển tốt ở độ mặn tối ưu, sự biến đổi đột ngột về độ mặn có thể làm luân trùng ngừng hoạt động , gây chết hoặc làm giảm chất lượng luân trùng, điều này có ý nghĩa khi ta sử dụng luân trùng để làm thức ăn cho ấu trùng động vật biển trước khi cho ấu trùng ăn ta cần phải làm thuần đến độ mặn thích hợp. Ngoài hai yếu tố chính là nhiệt độ và độ mặn thì các yếu tố như oxy hoà tan, NH3 … cũng có những ảnh hưởng theo các mức độ khác nhau. Trong nuôi sinh khối với mật độ cao cần quan tâm tới việc bổ sung ôxy, nhưng cũng không nên sục khí quá mạnh bởi có thể làm tổn thương tới luân trùng. Luân trùng có thể tồn tại trong nước với hàm lượng ôxy thấp tới 2 mg/L. Trong nuôi sinh khối luân trùng, mức pH trên 6,6; hàm lượng NH3 dưới 1 mg/L được coi là an toàn. - Ảnh hưởng của các yếu tố hữu sinh. –Vi khuẩn. Để nuôi luân trùng được ổn định, thì sự ảnh hưởng của vi khuẩn lên sinh khối luân trùng cần phải được xem xét một cách kỹ lưỡng cả về số lượng cũng như thành phần các vi khuẩn trong hệ thống nuôi. Psedomonas và Acinetobacter là những vi khuẩn cơ hội phổ biến, chúng có thể là nguồn thức ăn bổ sung quang trọng cho luân trùng. Ví dụ một vài loài Psedomonas tổng hợp vitamin B12, mà vitamin này có thể là yếu tố hạn chế trong các điều kiện nuôi (Yu và ctv, 1998, trích bởi Lavens và Sorgeloos, 1996). Mặc dù hầu hết các vi khuẩn đều không gây bệnh cho các luân trùng nhưng cần tránh để chúng sinh sôi nảy nở vì nếu chúng tích tụ lại và truyền qua chuỗi thức ăn có thể gây ra những ảnh hưởng có hại đến các sinh vật ăn mồi sống. Để nuôi luân trùng được ổn định, cần xem xét hệ vi khuẩn cũng như điều kiện sinh lý của các luân trùng. Ví dụ, người ta chứng minh rằng điều kiện thức ăn của luân trùng Brachionus plicatilis có thể được đo bằng hoạt động sinh lý và phản ứng của nó đối với dòng vi khuẩn gây bệnh được chọn lựa (Vibrio anguillarum TR27): dòng vi khuẩn V.anguillarum được xử lý ở nông độ 106-107 CFU/mL (đơn vị hình thành tập đoàn) đã ảnh hưởng xấu đến các luân trùng nuôi bằng khẩu phần thức ăn tối ưu không bị ảnh hưởng bởi dòng vi khuẩn này. –Trùng tiêm mao. Trong sản xuất, sự có mặt của số lượng ít trùng tiêm mao thì không phải là một vấn đề gì quá nghiêm trọng, nhưng với số lượng lớn có thể dẫn đến việc giảm đột ngột mật độ và khả năng thu sinh khối luân trùng. Các trùng tiêm mao Halotricha và Hypotricha như Uronema sp và Euplotes sp là những loài không mong muốn trong nuôi thâm canh vì chúng cạnh tranh thức ăn với các luân trùng (Lavens và Sorgeloos, 1996). Sự suất hiện những trùng tiêm mao này nói chung là do các điều kiện ở mức tối ưu dẫn đến kết quả làm cho luân trùng hoạt động kém và làm tăng cơ hội cạnh tranh thức ăn. Các trùng tiêm mao sản sinh ra các chất chuyển hoá làm tăng hàm lượng NO2-N trong nước và làm giảm độ pH. Tuy nhiên chúng có tác dụng tích cực trong việc loại bỏ vi khuẩn và các chất mùn bã ra khỏi bể nuôi. Việc cho thêm một nồng độ thấp 20 mg/L foocmalin vào bể nuôi cấy tảo, 24 giờ trước khi cấy luân trùng có thể làm giảm đáng kể sự nhiễm bẩn các động vật đơn bào. Sàng lọc và làm sạch các luân trùng bằng các lưới lọc thực vật phù du (<50) để giảm số lượng trùng tiêm mao hoặc các vật gây bẩn có kích thước nhỏ là cách phòng ngừa có thể thực hiện dễ dàng khi tiến hành việc nuôi cấy ban đầu. Theo kết quả nghiên cứu của Như Văn Cẩn (1999), mật độ nhiễm trùng tiêm mao trong các bể nuôi bằng tảo tươi thấp hơn rất nhiều khi nuôi bằng nấm men. –Virut và nấm. Virus Rotier Birnavirus (RBV) và nấm thuộc nhóm Lagenidiaceae được quan tâm nhiều và được xem như một trong những tác nhân nguy hiểm gây ra sự biến động lớn mật độ và hiện tượng chết đột ngột của quần thể luân trùng. Theo Võ Khả Tâm ( 1999), luân trùng nuôi sinh khối bằng tảo N. oculata mật độ 12x106 tb/mL cho sinh khối luân trùng cao và hạn chế sự phát triển của nấm. 1.2.8. Các loại thức ăn sử dụng trong nuôi sinh khối luân trùng. – Nuôi sinh khối luân trùng bằng vi tảo. Năm 1999, trong nghiên cứu của mình Như Văn Cẩn đã chỉ ra rằng: Luân trùng được nuôi bằng tảo có sức sống cao hơn, khả năng chịu được sự biến đổi độ mặn tốt hơn so với nuôi bằng men bánh mì. Tảo biển được coi là thức ăn tốt nhất nuôi luân trùng vì có giá trị dinh dưỡng cao, giàu vitamin, phân tán tốt trong nước và đặc biệt không làm ô nhiễm nước.Tuy nhiên trong thực tế các trại sản xuất khó có khả năng cung cấp đủ tảo cho nuôi luân trùng.Bởi vì, luân trùng có sức tiêu thụ thức ăn khá lớn, một con cái có thể tiêu thụ một lượng tảo tương đương 5-10 lần thể tích cơ thể chúng (Banabe, 1991 trích bởi Như Văn Cần, 1999). Trong khi đó, việc sản xuất tảo với số lượng lớn lại đòi hỏi phải có sự đầu tư lớn cơ sở vật chất và nhiều nhân công. Chi phí cao liên quan đến sản xuất tảo, những rủi ro do bị nhiễm bẩn và nhừng biến đổi theo thời gian trong giá trị thức ăn của tảo vẫn còn là vấn đề tồn tại với bất kỳ trại sản xuất giống cá biển nào. Để hạn chế vấn đề này các nhà nghiên cứu cố gắng tìm cách thay thế tảo bằng các thức ăn nhân tạo làm thức ăn bổ sung hoặc thay thế hoàn toàn tảo. –Nuôi sinh khối luân trùng bằng men bánh mì Năm 1967, Hirata và Mori đã góp phần tạo ra một bước tiến quan trọng trong công nghệ nuôi thu sinh khối luân trùng bằng việc phát hiện ra loài nấm men Saccharomyces cerevisiae để thay thế tảo làm thức ăn nuôi luân trùng(Như Văn Cẩn, 1999). Việc sử dụng nắm men mang tính hiệu quả kinh tế cao, đỡ tốn kém nhân công và mang tính chủ động cao trong sản xuất. Tuy nhiên, việc chỉ sử dụng nấm men bánh mì làm thức ăn cũng có những vấn đề cần phải được xem xét một cách thận trọng. Những thử nghiệm đầu tiên để thay thế hoàn toàn thức ăn tự nhiên của luân trùng bằng men bánh mì được đặc trưng bởi sự thành công thất thường và thất bại đột ngột (Hiramaya, 1987 trích bởi Lavens & Sorgeloos, 1996). Nguyên nhân ở đây có thể dược giải thích do sự thiếu hụt vitamin B12, cystein và một số acid béo không no HUFA n – 3 trong thành phần của men bánh mì, mà đây là nhũng chát rất cần thiết cho sự phát triển của luân trùng, cũng như ấu trùng các sinh vật ăn mồi sống. – Nuôi sinh khối luân trùng bằng thức ăn tổng hợp (Culture selco). Thức ăn dạng này được chế biến để thay thế hoàn toàn cho các vi tảo sống và đồng thời đảm bảo sự hợp nhất ở mức độ cao các axit béo thiêt yếu (EFA) và vitamin ở luân trùng.Thành phần hoá sinh của thức ăn nhân tạo Culture selco gồm có 45% protêin, 30% hydratcacbon, 15% lipit (33% thức ăn này là các axit beo không no HUFA n – 3 ) và 7% tro. Các đặc điểm vật lý thứa ăn này là tối ưu đối với sự hấp thụ của luân trùng. Tuy nhiên, trong sản xuất khó có trại sản xuất nào có thể sử dụng loại thức ăn này để nuôi luân trùng. Bởi vì, giá thành của loại thức ăn này rất cao, nên thường thì chỉ có thể sử dụng trong việc “lam giàu” luân trùng trước khi đưa vào các bể ương ấu trùng. – Kết hợp các loại thức ăn để nuôi sinh khối luân trùng. Mỗi loại thức ăn riêng biệt dùng để nuôi luân trùng đều có những nhược điểm nhất định. Vì vậy, sự kết hợp giữa các loại thức ăn có thể là một giải pháp hữu hiệu trong việc nuôi sinh khối luân trùng ở các trại sản xuất. Nhiều công thức phối hợp đã được đưa ra và cũng ít nhiều cho thấy được hiệu quả. Spektorrora (1981) thí nghiệm phối hợp tảo và men bánh mì nuôi luân trùng theo 3 tỷ lệ 1:2; 1:1; và 2:1 cho ăn theo 3 khẩu phần: 5; 50 và 100 . Kết luận rút ra là luân trùng phát triển tốt nhất khi nuôi bằng tảo kết hợp với nắm men theo tỷ lệ tảo : men = 1:2 và khẩu phần tốt nhất là 100 ( Như Văn Cẩn, 1999). Năm 1999, kết quả nghiên cứu của Cái Ngọc Bảo Anh cho thấy nấm men bổ sung 10% dầu mực là một loại thức ăn có thể sử dụng nuôi sinh khối luân trùng B. plicatilis dòng nhỏ. 1.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi tảo trong nước và trên thế giới 1.3.1 Đặc điểm sinh học tảo Nannochloropsis oculata. A. Vị trí phân loại. Ngành Heterokontophyta Hocck, Mann và Jahns, 1985 Lớp Eustigmtophyceae Hibberd, 1981 Bộ Eustigmatales Hibberd, 1981 Họ Monopsidaceae Hibberd, 1981 Giống Nanochloropsis Hibberd, 1981 Loài N. Oculata Hibberd. 1981 B. Đặc điểm sinh học - Đặc điểm hình thái cấu tạo. Tảo N. oculata có kích thước nhỏ, tế bào có dạng hình cầu và hình trứng, đường kính dao động trong khoảng 2 – 4 m. Đây là tảo đơn bào không có khả năng di động (Phạm Thị Lam Hồng, 1999). -Cấu tạo hiển vi của tế bào. Năm 1986, Murayama đã nghiên cứu cấu trúc hiển vi của tế bào tảo N. Oculata dưới kính hiển vi điện tử cho thấy tế bào có một nhân. Thể sắc tố quang hợp chỉ có một thể sắc tố hình trứng. Thể sắc tố được bao bọc bởi hai lớp màng, lớp màng ngoài dính liền với màng nhân. Trong thể sắc tố có nhiều bản sắc tố, mỗi bản gồm 3 phiến sắc tố xếp song song, không có đai nối giữa các sắc tố. Sắc tố quang hợp duy nhất tìm thấy ở tảo N. Oculata là Chlorophyl a, không thấy sắc tố quang hợp chlorophyl b và c. Đây có thể coi là một đặc trưng sinh hoá chủ yếu để phân loại tảo Nannochloropsis nói riêng và ngành Eustigmataphyta nói chung. Các carotenoid bao gồm carotene 11%, violaxathin 51%, vaucherixathin 26% và các carotenoid khác chiếm 12% (Maruyama, 1986 trích bởi Phạm Thị Lam Hồng, 1999). -Hình thức sinh sản: N. oculata có hai hình thức sinh sản là sinh sản sinh dưỡng bằng cách phân đôi và sinh sản bằng tự bào tử. 1.3.2. Giá trị dinh dưỡng của tảo. Vi tảo là mắt xích thức ăn đầu tiên của chuỗi thức ăn ngoài tự nhiên. Chúng là thức ăn không thể thay thế cho giai đoạn ấu trùng và trong suốt giai đoạn trưởng thành của động vật thân mềm. Đối với ấu trùng giáp xác và ấu trùng một số loài cá, tảo cũng là thức ăn bắt buộc ở giai đoạn sớm. Tảo biển với giá trị dinh dưỡng cao và thoả mãn yêu cầu về kích thuớc nên có thể nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng, quyết định thành công trong việc sản xuất giống nhiều loài động vật biển có giá trị kinh tế. Vi tảo biển có hàm lượng dinh dưỡng cao, hàm lượng protein từ 6 – 34% khối lượng khô, hàm lượng lipit từ 5 – 23%, hàm lượng carbohydrate từ 5 – 12% khối lượng khô (Brown và ctv, 1997 trích bởi Phạm Thị Lam Hồng, 1999). Vi tảo biển là nguồn cung cấp acid béo không no cho các động vật biển. Acid béo không no có vai trò quan trọng đối với ấu trùng động vật thân mềm, cá biển và các loại động vật phù du. Các acid béo có giá trị dinh dưỡng nhất là EPA 20:5n-3 (Eicosapentaenonic acid), và DHA 22:66n-3 (Docosahexaenoic acid). Ngoài ra, các vi tảo biển còn rất giàu vitamin. Mười loại vitamin đã tìm thấy ở vi tảo, trong đó hàm lượng vitamin C và vitamin B12 cao nhất, tiếp theo là các Vitamin A, D, E, K... Ngoài vai trò cung cấp thức ăn cho luân trùng và ấu trùng cá, tảo còn tác dụng làm ổn định môi trường như cung cấp oxy hoà tan và hấp thụ NH3 trong bể ương ấu trùng. Tuy nhiên, giá trị dinh dưỡng của những loài tảo khác nhau rõ rệt giữa các loài, giữa các dòng trong cùng một loài và đặc biệt phụ thuộc vào điều kiện môi trường như độ mặn, ánh sáng, thời điểm thu hoạch... 1.3.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố tới sự biến động quần thể vi tảo. - Sinh trưởng của tảo Trong các điều kiện thuận lợi của môi trường về dinh dưỡng, ánh sáng, độ mặn và nhiệt độ, các loài vi tảo sinh sản theo kiểu phân cắt tế bào làm số lượng tế bào tăng lên một cách nhanh chóng. Sự sinh trưởng của vi tảo được đặc trưng bởi 5 pha (Lavens & Sorgeloos, 1996): + Pha gia tốc dương (I): ở pha này tảo bắt đầu làm quen với môi trường nuôi, hấp thụ dinh dưỡng và bắt đầu phân chia tế bào nhưng số lượng tế bào tăng chậm. + Pha logarit (II): số lượng tế bào ở pha này tăng theo cấp số nhân. Tảo ở giai đoạn này hấp thụ dinh dưỡng mạnh. + Pha gia tốc âm (III): ở pha này môi trường dinh dưõng có chiều hướng giảm mạnh cùng với mật độ tế bào tảo cao làm tốc độ sinh sản giảm, tuy vậy số lượng tế bào vẫm còn tăng. +Pha cân bằng (IV): tảo đạt mật độ cực đại và số lượng ổn định. +Pha tàn lụi (V): tảo sau khi đạt mật độ cực đại, khả năng sinh sản giảm dần và số lượng tảo giảm một cách rõ rệt. Tốc độ tăng trưởng của các loài tảo khác nhau thì khác nhau, ngoài ra nó còn chịu sự chi phối lớn của các điều kiện môi trường. IV Số lương tế bào III V II I Thời gian - Ánh sáng Giống như bao loài thực vật khác, vi tảo cùng phải quang hợp, tức là chúng hấp thụ cacbon vô cơ để chuyển hoá thành các chất hữu cơ. Trong khi đó, ánh sáng chính là nguồn năng lượng cho quá trình quang hợp. Vì vậy, ảnh hưởng của ánh sáng cần phải được xem xét ở các khía cạnh như: cường độ ánh sáng, phổ ánh sáng, và thời gian chiếu sáng. Mặc dù, ánh sáng ban ngày đủ cung cấp cho tảo quang hợp. Nhưng cường độ ánh sáng ban ngày lại phụ thuộc rất lớn vào điều kiện thời tiết, khí hậu địa phương, những thay đổi đột ngột về cường độ ánh sáng, thời gan chiếu sáng (do thời tiết thay đổi) có thể làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của tảo, thậm chí làm cho tảo tàn lụi hàng loạt.Chính vì vậy, những nghiên cứu về ánh sáng nhân tạo cho việc nuôi tảo cũng được nghiên cứu nhiều. Theo Guillard (1975) tảo chỉ có thể chịu được ánh sáng mặt trời trực tiếp khi mật độ tảo nuôi đạt được mật độ khá cao (Phạm Thị Lam Hồng, 1999). Với cường độ ánh sáng quá mạnh có thể ức chế quá trình quang hợp (Lavens & Sorgeloos, 1996). Cường độ mạnh và thời gian chiếu sáng lâu có thể làm tăng nhiệt độ bể nuôi. Như vây, ánh sáng còn kết hợp với nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của tảo. -Nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn tới đời sống của tảo, đồng thời ảnh hưởng cả chất lượng dinh dưỡng cũng như sinh vật gây hại cho tảo. Hầu hết các loại tảo có thể sống trong khoảng nhiệt độ từ 16-300C. Nếu nhiệt độ cao hơn 350C thì tảo có thể bị chết và nếu thấp hơn 160C thì tảo chậm phát triển. Tảo N. oculata là loài có khả năng thích nghi với sự biến động nhiệt độ rộng, phát triển tốt nhất trong khoảng nhiệt đô từ 10-300C. - Độ mặn Mỗi loài tảo khác nhau có khả năng thích nghi với một khoảng dao động độ mặn khác nhau. Hầu hết các loại tảo dạng monas sinh trưởng trong khoảng độ mặn dao động 12-40 ppt, nhưng phát triển tốt nhất ở độ mặn 20-24 ppt. N. oculata là một loài rộng muối, thích ứng được trong khoảng độ mặn 7-35 ppt. Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Lam Hồng (1999) tảo N. oculata phát triển tốt nhất ở độ mặn 30-35 ppt nhưng có thể phát triển ở độ mặn 10-35 ppt. Tuy nhiên, theo Vũ Dũng(1998) Tảo N. oculata phát triển tốt ở độ măn 18-26 ppt (Đặng Đình Kiêm, 2002). Mặc dù có khả năng thích nghi với sự thay đổi độ mặn một cách đột ngột sẽ làm thay đổi nhanh chóng áp suất thẩm thấu của tế bào, thậm chí sẽ bị chết hàng loạt. Sự biến đổi độ mặn chỉ ảnh hưởng nhẹ đến hàm lượng protein, hydratcacbon, chlorophyl a. nhưng đối với lipit trong khoảng độ mặn từ 10 – 15 ppt, độ măn tăng hàm lượng lipit tăng, độ mặn thay đổi làm thành phần acid béo thay đổi. - pH pH của môi trường quá cao hoặc quá thấp đều làm chậm tốc độ tăng trưởng của tảo. Sự biến đổi của nhiệt độ, ánh sáng có tác động đến pH thông qua quá trình quang hợp của tảo. Mức pH tốt nhất cho sự phát triển của tảo là từ 8,2- 8,7. Sự biến động pH trong môi trường nuôi tảo phụ thuộc vào sự cân bằng sau: HCO3- CO2 + OH- Trong quá trình quang hợp tảo hấp thụ rất mạnh CO2 nên làm cho pH tăng cao. - Môi trường dinh dưỡng Trong nuôi sinh khối tảo, mật độ tảo sẽ cao hơn rất nhiều so với ngoài tự nhiên. Chính vì vậy, sau một thời gian chất dinh dưỡng trong môi trường sẽ bị giảm sút và ta phải bổ sung dinh dưỡng cho sự phát triển của tảo. Dinh dưỡng là yếu tố vô cùng quan trọng ảnh hưởng mạnh tới sự sinh trưởng và phát riển của tảo. Môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng cả trên phương diện số lượng và chất lượng. Mỗi loài tảo khác nhau có nhu cầu dinh duỡng về thành phần và số lượng từng chất là khác nhau. Nhu cầu về đạm giảm dần từ tảo Lục, tảo Lam và tảo Silic có nhu cầu về đạm là thấp nhất, Silic rất cần thiết chi sự phát triển của tảo Silic vì nó tham gia vào cấu tạo màng tế bào. Muối nitơ rất cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của tảo. Bởi vì nitơ là thành phần cơ bản tạo nên các loại prôtêin, trong đó có protêin cấu trúc và protêin chức năng. Ngoài ra, nitơ còn tham gia vào cấu tạo của nhiều loại vitamin B1, B2, B6, BP là thành phần quan trọng của hệ men oxy hóa khử và nhiều men quan trọng khác. Photpho được coi là chìa khoá của quá trình trao đổi chất. Hàm lượng photpho không cần thiết phải cao, xong nếu thiếu nó thì tảo không phát triển được. Bởi vì photpho có tác dụng lên hệ keo ở dạng các ion, photpho ở dạng liên kết với các kim loại tạo nên hệ đệm đảm bảo cho pH của tế bào luôn xê dịch trong một phạm vi nhất định (6-8) là điều kiện tốt cho các hệ men hoạt động. Photpho tham gia vào cấu trúc có vai trò quan trọng trong những khâu chuyển hoá trung gian và có ý nghĩa then chốt trong trao đổi năng lượng. Bên cạnh những nguyên tố đa lượng việc bổ sung những nguyên tố vi lượng cũng rất cần thiết. Các nguyên tố vi lượng gồm một số các muối kim loại với nồng độ thấp như: CuSO4, CoCl2, ZnSO4, FeCl3… Vai trò của các nguyên tố vi lượng này hầu như đều có tác dụng đến quá trình trao đổi chất của tảo. Trong đó, sắt là nguyên tố vi lượng được bổ sung nhiều nhất so với các muối kim loại khác trong môi trường nuôi. Tuy sắt không phải là chất tham gia vào cấu tạo của diệp lục nhưng nó là tác nhân bổ trợ hoặc là thành phần tham gia vào cấu trúc của các hệ men và chủ yếu là các men oxy hoá khử, tham gia tích cực vào dây chuyền sinh tổng hợp của các chất quan trọng. Sắt đóng vai trò quan trọng vào quá trình vận chuyển điện tử quang phân ly nước và quá trình photphoryl hoá quang hợp. Do vậy nhu cầu sắt cho sự sinh trưởng và phát triển của tảo là rất cần thiết nhưng chỉ ở hàm lượng thấp. Khi hàm lượng sắt quá cao có thể gây độc cho tảo. Ngoài ra vitamin cũng được sử dụng khá phổ biến để bổ sung vào môi trường nuôi tảo, dù chỉ với một lượng rất nhỏ nhưng có thể thúc đẩy sự gia tăng sinh khối của tảo. Vitamin B12 và B1 là hai vitamin rất cần cho tảo, sau đó là biotin. N. oculata phát triển rất nhanh trong môi trường Walne là môi trường được bổ sung thêm vitamin B1 (0,1 mg/L) và B12 (0,005 mg/L). 1.3.4 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi tảo trong nước và trên thế giới - Trong nước. Tại Việt Nam, những nghiên cứu về tảo dã được thực hiện từ rất lâu. Nhưng những nghiên cứu trước đây chủ yếu về phân loại, điều tra thành phần trong các thuỷ vực nội địa, những nghiên cứu về tảo biển còn rất hạn chế ở thời kỳ trước những năm 80 của thế kỷ trước, và những hiểu biết của chúng ta về tảo thường gắn liền với những báo cáo của một số ít tác giả. Trương Ngọc An và ctv (1970 – 1971) đã phát hiện 115 loài thực vật nổi trên sông Ninh Cơ ở Nam Hà. Dương Đức Tiến (1982) đã công bố 1389 loài tảo ở các thuỷ vật nội địa Việt Nam. Những nghiên cứu ứng dụng tảo trong sản xuất chỉ thực sự phát triển kể từ giữa thập kỷ 80 của thế kỷ 20, với thành công trong công trình của Lê Viện Trí (1980 – 1986) về ứng dụng nuôi tảo Skeletonema costatum làm thức ăn trong các trại sản xuất tôm giống ở Hạ Long. Trong những năm gần đây, những thành công của công nghệ sinh sản nhân tạo giống tôm sú, điệp quạt và đặc biệt việc nghiên cứu cho sinh sản nhiều loài cá biển đã góp phần thúc đẩy khoa học nghiên cứu ứng dụng tiến thêm một bước mới với những nghiên cứu mang tính thực tiễn hơn. Năm 1995, Hoàng Thi Bích Mai đã nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn, nhiệt độ ánh sáng, hàm lượng muối dinh dưỡng lên sinh trưởng, phát triển và đưa ra quy trình nuôi hai loài tảo Skeletonema costatum và Chaetoceros sp, làm thức ăn cho ấu trùng tôm sú. Tại viện nghiên cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản III ứng dụng nuôi tảo N. oculata và Chaetoceros muelleri làm thức ăn cho ấu trùng điệp quạt và đã thu được nhiều thành công. Phạm Thi Lam Hồng (1999), đã nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn, ánh sáng và tỷ lệ thu hoạch lên một số đặc điểm sinh học, thành phần sinh hoá của hai loài vi tảo N. oculata và C. muelleri trong điều kiện phòng thí nghiệm, thành công của nghiên cứu đã góp thêm những hiểu biết quan trọng về hai loài tảo và ứng dụng nuôi bán liên tục để cung cấp tảo cho việc sản xuất động vật phù du, trong quy trình ương các loại ấu trùng động vật biển. Năm 1999, Lục Minh Diệp đã có những công bố quan trọng khi nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ phân bón, tỷ lệ thu hoạch lên sự phát triển của hỗn hợp tảo tự nhiên và thử nghiệm nuôi tảo N. oculata. Những kết quả từ báo cáo này đã giúp cho chúng ta hiểu biết đầy đủ hơn về vi tảo và khả năng thay đổi thành phần loài tảo ưu thế của tảo tự nhiên theo tỷ lệ pha loãng và tỷ lệ phân bón. Hồng Thị Kiều Nga (2002), ảnh hưởng chế độ bón phân đến sinh trưởng của quần thể tảo N. oculata và I. galbana ngoài trời ; Hoàng Thị Ngọc (2003), ảnh hưởng của hàm lượng phân bón và sự bổ sung CO2 đến sinh trưởng của các quần thể tảo ; Mai Thi Thuỳ Linh (2004), nuôi thu sinh khối hai loài tảo N. oculata và I.galbana ở quy mô túi nylon 50 lít và 2 m3. Ý nghĩa của những báo cáo này là không thể phủ nhận nhưng chúng lại được tiến hành tại cùng một địa điểm trong điều kiện của một trại thực nghiệm, vì vậy mà tính thực tiễn là không cao. Nhìn chung, hiện nay nước ta đã có nhiều cơ quan nghiên cứu, phân lập, nhân giống, lưu giữ và nuôi sinh khối tảo và quy trình sản xuất các loài tảo cũng tương đối hoàn chỉnh. Tuy vậy, những nghiên cứu ứng dụng tại các cơ sở sản xuất còn rất hạn chế, cần phải được tiến hành nhiều hơn nữa. - Trên thế giới. Khoảng 1/3 sinh khối thực vật trên thế giới là sinh khối tảo. Trong tổng số khoảng 25.000 loài vi tảo hiên nay có khoảng 50 loài được nghiên cứu tỉ mỉ về mặt sinh hoá, sinh lý và sinh thái học (Đặng Đình Kim, 2002). Hiện nay, có trên 40 loài tảo khác nhau được phân lập ở các nên trên thế giới, đang được nuôi để làm các chủng tảo thuần khiết trong các hệ thống thâm canh (Lavens & SorgelooS, 1996). Việc nghiên cứu phân lập và nuôi tảo thuần khiết sạch vi khuẩn đã được Beijerkin tiến hành năm 1980 (Phạm Thị Lam Hồng, 1999). Năm 1993, Liao và ctv đã sử dụng thành công tảo Skeletonema costatum làm thức ăn cho ấu trùng tôm sú P. monodon. Trong những năm qua, cùng với sự phát triển của công nghệ sản xuất giống nhiều đối tượng hải sản, các nghiên cứu về sản xuất các loài tảo khác nhau cũng được tiến hành theo nhiều quy mô và đa dạng hoá đối tượng. Ở Nhật bản, nuôi N. oculata làm thức ăn cho trùng bánh xe rất phổ biến. Ở Úc các loài tảo đơn bào như Tetraselmis sp, Palova lutheri… được nuôi phổ biến làm thức ăn cho động vật thân mềm. Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, thời gian và phương pháp nghiên cứu. 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu: Luân trùng loài Brachionus plicatilis Muller, 1786 Tảo Nannochloropsis oculata Hibbred, 1981 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu : Trại thực nghiêm nuôi trồng thuỷ sản, trường đại học Nha Trang, Nha Trang, Khánh Hoà. 2.2.3. Thời gian nghiên cứu. Tư ngày 02/03/2009 đến ngày 13/06/2009. 2.2. Phương pháp nghiên cứu. 2.2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu. Nôi dung nghiên cứu Sử dụng các loại thức ăn khác nhau để nuôi luân trùng Brachionus plicatilis Các loại thức ăn Men bánh mì Men bánh mi + protein selco Tảo Nannochoropsis oculata + Men bánh mì Kết luận và đề xuát ý kiến Xác định, so sánh mật độ, tỷ lệ trứng, tốc độ tăng trưởng ngày của luân trùng  Hình 2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu nuôi Brachionus plicatilis  Nội dung nghiên cứu Nuôi thu sinh khối tảo N. oculata Xác định khả năng sinh khối tảo N. oculata Kết luận và đề xuất ý kiến Hình 2.2. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu tảo N. oculata 2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm nuôi sinh khối tảo N. oculata và xác định các chỉ số kỹ thuật -Tảo Nannochloropsis oculata: có kích thước từ 2-5µm, rất nhiều HUPA và giàu acid béo họ (n-3), thích hợp vùng nhiệt đới, dễ nuôi đại trà, có màu xanh nõn chuối hơi ánh vàng. Tảo giống được lấy từ trường Đại Học Nha trang . -Môi trường dinh dưỡng ( môi trường f2 (Guilliard, 1975)) : Dung dịch 1 : KNO3 : 89,6 mg/L KH2PO4 : 5,6 mg/L Na2SiO3.9H20 : 30 mg/L Dung dịch 2 : Na2EDTA : 4,36 mg/L FeCl3.6H2O: 3,15 mg/L CuSO4.5H2O: 0,01 mg/L ZNSO4.H2O: 0,022 mg/L CoCl2.6H2O: 0.01 mg/L MnCl2.4H2O: 0,18 mg/L Na2MoO4.6H2O: 0,006 mg/L Vitamin: Thiamin (B1): 0,1 mg/L Biotin (B6): 0,0005 mg/L Riboflavin (B12): 0,0005 mg/L Thao tác tiến hành: Buộc túi → cấp nước biển được xử lý Cholorine và lọc sạch (S‰: 28 - 31‰) → cấp tảo (350.104 tế bào/ml) → sục khí và bón phân → thu hoạch. Mỗi túi cho 50 mL dung dịch 1 + 50 mL dung dịch 2 + 50 mL vitamin. Bố trí sục khí mạnh để tránh kết tủa. -Bố trí thí nghiệm nuôi tảo. Tảo N. Oculata được nuôi với mật độ ban đầu là 350.104 tb/mL. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần theo không gian và thời gian.Tảo N. oculata được nuôi trong điều kiện độ măn 31 ppt, sục khí 24/24 và nuôi trong túi nylon 50L. Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Tảo N. oculata giống Túi nylon 50L Biến động nhiệt độ Biến động pH Biến động mật độ Đánh giá khả năng thu sinh khối tảo N. oculata -Phương pháp xác định các chỉ số kỹ thuật. +Phương pháp xác định mật độ tảo. – Dụng cụ hoá chất: + Buồng đếm hồng cầu + Kính hiển vi + ống hút tảo + Cốc đốt 500 mL + Formalin 3% Buồng đếm hồng cầu gồm có 9 ô lớn, khi đếm ta sẽ tiến hành đếm ở 5 ô A, B. C, D và E. Các ô lớn A,B, C, D gồm 16 ô nhỏ, ô E gồm có 25 ô nhỏ, trong mỗi ô nhỏ của ô E có 16 ô nhỏ hơn (ô E có 400 ô). Một ô lớn có diện tích là 1 mm2, độ sâu buồng đếm là 0,1 mm. –Phương pháp lấy mẫu tảo: Mẫu được lấy vào lúc 2 giờ chiều. Dùng ống hút tảo và hút vào ly đựng mẫu, lấy khoảng 25 mL. – Cách chuẩn bị mẫu: Mẫu tảo được thu vào cốc đốt, lắc đều mẫu tảo sau đó dùng ống hút hút nhỏ một giọt dung dịch tảo vào buồng đếm, để vài phút cho tảo ổn định, sau đó dùng lamen đậy nhẹ nhàng, để lắng một lúc rồi đưa vào kính hiển vi để đếm. – Cách đếm: Khi đếm cần chú ý nguyên tắc sau: Thứ tự các ô được đếm theo đường ziczác, tiến hành đếm những tế bào nằm trong khi có các tế bào nằm trên một cạnh của ô thì đếm những tế bào nằm ở cạnh trên và những tế bào nằm ở cạnh bên phải. Mật độ được tính theo công thức: MD=4 Trong đó: MD: là mật độ tế bào A : tổng số tế bào đếm được ổ 5 ô đường chéo của ô E Mỗi mẫu đếm 3 lần, kết quả là` giá trị trung bình của 3 lần đếm +Phương pháp xác định các yếu tố môi trường : – Đo pH : dùng test pH độ chinh xác 0,5 đo hàng ngày vào lúc 7 giờ và 14 giờ – Đo nhiệt độ : dùng nhiệt hế thuỷ ngân độ chính xác 10C đo hàng ngày vào lúc 7 giờ và 14 giờ. – Độ mặn : dùng tỷ trọng kế độ chính xác 1ppt đo khi chuẩn bị nước và hàng ngày vào lúc 7 giờ và 14 giờ. Trong thởi gian thí nghiệm các yếu tố này được duy trì trong suốt thời gian thí nghiệm. 2.2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm nuôi sinh khối luân trùng và phương pháp xác định các thông số kỹ thuật - Phương pháp bố trí thí nghiệm : Thí nghiệm được bố trí trong hệ thống 9 bể có dung tích 2,5 m3 với mật độ ban đầu là 100 ct/mL. Ba loại thức ăn được sử dụng trong thí nghiệm tương ứng với 3 nghiệm thức.Mỗi nghiệm thức được lập lai 3 lần. Nghiệm thức Thức ăn 1 Tảo N. oculata + men bánh mì 2 Men bánh mì + protêin selco 3 Men banh mì Sơ đồ bố trí thí nghiệm : Luân trùng Lô1 Lô 2 Lô 3 (Men) (Men + tảo) (Men + selco) -Phương pháp xác định các yếu tố môi trường. + Đo pH : dùng test pH độ chinh xác 0,5 đo hàng ngày vào lúc 7 h và 14 h + Đo nhiệt độ : dùng nhiệt kế thuỷ ngân độ chính xác 10C đo hàng ngày vào lúc 7 h và 14 h. + Độ mặn : dùng tỷ trọng kế độ chính xác 1ppt đo khi chuẩn bị nước và hàng ngày vào lúc 7 h và 14 h. Trong thởi gian thí nghiệm các yếu tố này được duy trì trong suốt thời gian thí nghiệm. -Phương pháp xác định mật độ luân trùng. + Điều kiện thí nghiệm : Độ mặn : 30ppt Sục khí nhẹ : 24/24 Chế độ thay nước : hàng ngày thay 30% lượng nước Công trình nuôi : bể ximăng dung tích 2,5 m3 Mật độ thả ban đầu : 100 ct/mL Các chỉ tiêu theo dõi : mật độ, tỷ lệ trứng, tốc độ tăng trưởng hàng ngày, nhiệt độ,pH -Phương pháp định lượng luân trùng. –Phưong pháp thu mẫu luân trùng. Thời gian thu mẫu : sau 24 giờ Dung cụ thu mẫu: pipet 1 mL cốc đốt 50mL hộp nhựa Các tiến hành: dùng pipet lấy 1 mL mẫu gần khu vực sục khí (Luân trùng phân bố đều), mỗi bể lấy 3 vị trí.Sau khi lấy mẫu cho vào hồp nhựa pha loãng 20 lần rồi định lượng luân trùng. -Phưong pháp định lượng luân trùng. Dụng cụ: Kính hiển vi soi nổi Pipet Lam kính Cách đếm: Trước khi lấy mẫu lắc đều hộp nhựa để luân trùng phân bố đều, sau đó dùng pipet lấy 0,1 mL nhỏ thành nhiều giọt lên lam kính, đưa lam kính lên kính hiển vi soi nổi đếm. Mỗi mẫu đếm 10 lần, kết quả là giá trị trung bình của các lần đếm, trong khi đếm xác định đồng thời mật độ, tỷ lệ trứng. –Mật độ luân trùng được tính theo công thức: MD = Trong đó: MD: mật độ luân trùng ( ct/mL) N: tổng số luân trùng trong các lần đếm (cá thể) n: số lần đếm (lần) hệ số pha loãng –Tỷ lệ trứng được tính theo công thức: TLT = Trong đó: TLT: tỷ lệ trứng (%) A: tổng số trứng trong các lần đếm N: tổng số luân trùng trong các lần đếm –Tốc độ tăng trưởng tương đối theo ngày của quần thể luân trùng; Ln( N1) – Ln(N0) Trong đó: : tốc độ tăng trưởng ngày N0: mật độ ngày hôm trước (ct/mL) N1: mật độ ngày hôm sau (ct/mL) - Bể bố trí thí nghiệm nuôi luân trùng Bể có dung tích 2,5 m3 , mỗi bể có hệ thống lọc nước để thu chất thải, thức ăn thừa và mỗi bể bố trí 3 sục khí. - Quản lý và chăm sóc. + Loại thức ăn sử dụng trong thí nghiệm; Bể 1: cho luân trùng ăn tảo N. ocultata kết hợp với men bánh mì Bể 2: cho luân trùng ăn men bánh mì kết hợp với protein selco Bể 3: cho luân trùng ăn men bánh mì – Tảo N. oculata: Sử dụng tảo N. oculata làm thức ăn cho luân trùng. Tảo N. oculata sau khi cấy được 3 ngày đạt mật độ 2879 + 12.73x104 tb/mL thì rút cho luân trùng ăn. Lượng tảo cho ăn: Tảo N. oculata mật độ 105 tb/mL Cho luân trùng ăn: lúc 6h 30 hàng ngày. –Men bánh mì: Men bánh mì cho vào máy xay sinh tố xay nhuyễn cho luân trùng ăn. Cho luân trùng ăn: 1 g/triệu cá thể/ngày và cho ăn ngày 4 lần vào lúc: 6h30, 11h, 15h30 và 23h. – Prôtêin selco: Cho men bánh mì + protêin selco vào máy xay sinh tố xay nhuyễn cho luân trùng ăn. Lượng cho ăn: 50% khối lượng men bánh mì và cho ăn vào lúc 6h30 hàng ngày Trước khi cho luân trùng ăn tắt hệ thống sục khí, cho ăn băng men bánh mì và protein selco xung quanh dây sục khí để thức ăn phân bố đều và phân tán nhanh trong nước. +Chế độ thay nước: hàng ngày thay khoảng 30% lượng nứơc trong bể. Bảng 2.2 Thành phần dinh dưỡng của protêin selco: Thành phần Hàm lượng dinh dưỡng Độ ẩm Protein Lipit Tro Chất xơ Calcium Phospho Vitamin A Vitamin D Vitamin E Vitamin C DHA/EPA tối đa 5% tối thiểu 24% tối thiểu 21% tối đa 15% tối đa 1 % tối thiểu 0.01% tối thiểu 0,05% 750.000 IU/kg 150.000 IU/kg 7.200 mg/kg 20.000 mg/kg tối thiểu 2.5 2.2.4. Nguồn nước bố trí thí ngiệm. Nước biển có độ mặn 29 – 31 ppt được bơm vào bể lắng. Sau đó sử lý bằng clorin nồng độ 10 ppm trong vòng 24 – 48 giờ. Trước khi đưa nước lên bể lọc thử dư lượng clorin, nếu còn clorin trung hoà lại bằng Natrithiosunfat 3 ppm, Nước từ bể lọc đã qua lọc được đưa vào bể chứa, từ đó cấp cho luân trùng và tảo. Clorin 10 ppm Bể lọc Bể lắng Nước biển Natrithiosunfat 3 ppm Bể chứa Nước dùng nuôi luân trùng và tảo 2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu. Các số liệu được sử lý thống kê sinh học trong chương trình MS EXCEL 2000. Phân tích phương sai một yếu tố (One-way ANOVA). Các số liệu được trình bày dưới dang: giá trị trung bình độ lệch chuẩn, các phân tích số liệu được tiến hành với độ tin cậy 95%. Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1.Kết quả thí nghiệm biến động của quần thể luân trùng ở các lô thí nghiệm. Quá trình thí nghiệm kéo dài 7 ngày và kết quả nuôi thu sinh khối ở các lô thí nghiệm thể hiện ở bảng 3.1 và và hình 3.1 Bảng 3.1 : Biến động của quần thể luân trùng ở các lô thí nghiệm Ngày nuôi Mật độ (ct/mL) Men Men + tảo Men + Selco 0 100 100 100 1 181 8,54 214 10,15 206 5,77 2 239 14,01 308 4,51 402 10,15 3 393 7,00 407 2,31 553 8,89 4 482 17,09 484 10,15 826 23,71 5 549 32,47 584 38,94 1271 32,81 6 310 105,04 464 109,23 875 10,15 7 173 60,83 308 208,70 952 102,89 Ngày nuôi Mật độ (ct/mL) Hình 3.1: Biến động của quần thể luân trùng ở các lô thí nghiệm Số liệu được thể hiện là giá trị trung bình độ lệch chuẩn. Theo Cái Ngọc Bảo Anh (1999), việc nuôi luân trùng với mật độ đủ lớn có ý nghĩa hết sức quan trọng, không chỉ giúp tăng nhanh thời gian đạt đến thời điểm thu hoạch mà còn nâng cao chất lượng luân trùng, tránh được hiện tượng nhiễm sinh vật cạnh tranh như trùng tiêm mao. Khi mật độ ban đầu quá thấp thì lượng thúc ăn đưa vào trong bể nuôi tính theo mật độ quần thể lại quá ít. Mật độ thức ăn ít làm giảm tần số bắt gặp thức ăn của các cá thể luân trùng, là nguyên nhân gây ra sự suy giảm mật độ luân trùng khi mật độ quá thưa. Thí nghiệm chúng tôi bố trí nuôi với mật độ ban đầu là 100 ct/mL, được nuôi trong điều kiện: độ mặn 30 ppt, biến động nhiệt độ thấp nhất là 28,50C, cao nhất là 30,50, biến động pH thấp nhất là 8,7 cao nhất là 9,0. Với chế độ chăm sóc như nhau thí nghiệm xác định sinh trưởng quần thể luân trùng ở các lô thí nghiệm khác nhau. Qua đố thị 3.1: Mật độ luân trùng ở các lô thí nghiệm tăng từ ngày đầu đến ngày nuôi thứ 5, sang ngày nuôi thứ 6 bắt đầu giảm xuống. Mật độ luân trùng nuôi ở các lô đều tăng đều và đạt cực đại vào ngày nuôi thứ 5. Đối với lô cho ăn bằng men bánh mì: sau 1 ngày nuôi mật độ tăng lên 181 8,54 (ct/mL), tăng 1,81 lần so với mật độ ban đầu, và chỉ sau 5 ngày nuôi đạt 549 32,47 (ct/mL), tăng 5,49 lần so với ngày nuôi đầu tiên. Đối với lô cho ăn bằng men bánh mì kết hợp với tảo: sau 1 ngày nuôi mật độ tăng lên 214 10,15 (ct/mL), tăng 2,14 lần so với mật độ ban đầu và chỉ sau 5 ngày nuôi đạt 584 38,94 (ct/mL), tăng 5,84 lần so với ngày nuôi đầu tiên. Đối với lô cho ăn bằng men kết hợp với prôtênin selco: sau 1 ngày nuôi mật độ tăng lên 206 5,77 (ct/mL), tăng 2,06 lần so với mật độ ban đầu và chỉ sau 5 ngày nuôi đạt 1271 32,81 (ct/mL), tăng 12,71 lần so với ngày nuôi đầu tiên. Sau khi đạt mật độ cực đại vào ngày nuôi thứ 5, sang ngày nuôi thứ 6 mật độ ở các lô đã bắt đầu giảm xuống. Lô cho ăn bằng men bánh mì giảm xuống còn 310 105,04 (ct/mL), lô cho ăn bằng men kết hợp với tảo mật độ giảm xuống chỉ còn 464 109,23 (ct/mL) và lô cho ăn bằng men kết hợp với protein selco là 875 10,15 (ct/mL) . Đặc biệt lô chỉ cho ăn bằng men bánh mì sang ngày nuôi thứ 7 mật độ giảm xuống còn 173 60,83 (ct/mL). Mật độ luân trùng giảm dần có thể là môi trường nuôi đã bắt đầu bị ô nhiễm. Môi trường ô nhiễm có thể là do nhiều nguyên nhân khác nhau có thể là do nuôi trong thể tích lớn, sự khuấy động các tầng nước không được tốt như trong thể tích nhỏ, do đó lượng men đưa vào bị lắng xuống rất nhanh, từ đó tạo điều kiện cho trùng tiêm mao, vi khuẩn, vi rut… phát triến. Ngoài ra, lúc này lượng chất thải của luân trùng rất nhiều, cho nên làm chất lượng nước xấu đi gây ô nhiễm và ảnh hưởng đến không gian hoạt động của luân trùng do đó làm giảm đột ngột mật độ luân trùng trong các ngày nuôi tiếp theo. Trong 3 lô thí nghiệm , lô cho ăn bằng men kết hợp với protein selco cho mật độ luân trùng cao nhất đạt 1271 32,82 (ct/mL). Điều này chứng tỏ nuôi luân trùng cho ăn bằng men kết hợp với protein selco cho kết quả tốt nhất đối với hai lô còn lại. Protein selco là loại thức ăn giàu hàm lượng dinh dưỡng, trong thành phần có chứa nhiều vitamin, EPA. DHA… Do đó selco là loại thức ăn rất tốt cho luân trùng. Đối với lô cho ăn bằng tảo N. oculata mật độ luân trùng tăng đều và cũng cho mật độ rất cao, sang ngày nuôi thứ 6 mật độ giảm nhưng không đáng kể 308 208,7 (ct/mL). Vi tảo cũng được xem là thức ăn rất tốt cho luân trùng, trong thành phần có chứa rất nhiều chất dinh dưỡng, HUFA n – 3 rất tốt cho sự sinh trưởng phát triển của luân trùng. Tuy nhiên trong thí nghiệm của chúng tôi cho mật độ không cao như lô cho ăn bằng protein selco, nguyên nhân có thể là do lượng tảo cung cấp cho luân trùng không đủ. Bảng 3.2. Tốc độ tăng trưởng của quần thể luân trùng ở các lô thí nghiệm Ngày nuôi Tốc độ tăng trưởng Men Men + tảo Men + Selco 0 0 0 0 1 0,59 0,05 0,76 0,05 0,73 0,03 2 0,280,11 0,36 0,06 0,67 0,01 3 0,50 0,05 0,28 0,02 0,32 0,01 4 0,20 0,02 0,17 0,03 0,40 0,02 5 0,13 0,09 0,19 0,07 0,43 0,01 6 -0,61 0,41 -0,25 0,19 -0,37 0,04 7 -0,59 0,14 -0,18 0,16 0,08 0,12 Ngày nuôi Tốc độ tăng trưởng Tảo . Hình 3.2: Tốc độ tăng trưởng của quần thể luân trùng ở các lô thí nghiệm Số liệu được trình bày là giá trị trung bình độ lệch chuẩn Tốc độ sinh trưởng của quần thể luân trùng ở 3 lô thí nghiêm đạt cao nhất vào các ngày nuôi đầu : lô cho ăn men đạt 0,59 0,05, lô cho ăn men với tảo đạt 0,76 0,05, lô cho ăn men kết hợp với selco đạt 0,73 0,03 . Vì lúc này quần thể luân trùng đang phát triến đến mật độ đủ lớn và chưa có sự cạnh tranh đáng kể về thức ăn cũng như môi trường sống giữa các cá thể trong quần đàn. Đối với lô cho ăn bằng men tốc độ tăng trưởng cao nhất vào ngày nuôi đầu tiên, đến ngày nuôi thứ 2 giảm xuống chỉ còn 0,28 0,11 và đến ngày nuôi thứ 3 lại tăng lên 0,50 0,05, sau đó giảm dần vào các ngày nuôi sau. Ở 2 lô còn lại tốc độ sinh trưởng giảm dần vào các ngày nuôi sau. Lô cho ăn men kết hợp với tảo tốc độ tăng trưởng giảm vào ngày nuôi thứ 2 (0,36 0,06), và sau đó giảm vào các ngày tiếp theo, đến ngày nuôi thứ 7 lại tăng lên -0,25 0,19. Lô cho ăn men kết hợp với protein selco tốc đọ tăng trướng giảm đến ngày nuôi thứ 5 lại tăng lên 0,43 0,01, sau đó giảm xuống và đến ngày thứ 7 lại tăng lên 0,08 0,12. Nhìn chung tốc độ sinh trưởng của quần thể giảm dần khi mật độ luân trùng càng tăng. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Cái Ngọc Bảo Anh (1999). Như vậy nếu ta tiến hành thu sinh khối luân trùng ở giai đoạn cực đại sẽ cho kết quả sinh khối không cao và hiệu quả kinh tế không lớn do tốc độ tăng trưởng chậm trong khi lượng thức ăn tăng lên. Bảng 3.3. Tỷ lệ trứng của quần thể luân trùng ở các lô thí nghiệm Ngày nuôi Tỷ lệ trứng (%) Men Men + tảo Men + Selco 0 0 0 0 1 11,07 0,52 14,82 0,93 19,71 0,01 2 10,63 0,50 11,92 1,90 13,68 0,34 3 7,89 0,14 10,79 0,08 16,63 0,26 4 8,23 0,31 9,03 1,20 12,91 3,11 5 7,86 0,68 7,72 0,53 9,45 0,25 6 4.49 1,65 5,16 1,30 5,90 0,61 7 3,22 1,42 2,51 0,48 1,22 0,07 Ngày nuôi Tỷ lệ trứng (%) Hình3.3 Tỷ lệ trứng của quần thể luân trùng ở các lô thí nghiệm Số liệu được trình bày là giá trị trung bình độ lệch chuẩn Tỷ lệ trứng của luân trùng là chỉ tiêu đánh giá tốc độ tăng trưởng. Dựa vào tỷ lệ trứng có thể đánh giá được tốc độ tăng trưởng của quần thể luân trùng.Tốc độ tăng trưởng giảm thì tỷ lệ lên trứng của quần thể luân trùng giảm xuống Dựa vào đồ thị 3.3 ta thấy vào các ngày nuôi đầu tiên tốc độ tăng trưởng cao nên tỷ lệ trứng cao. Đối với lô cho ăn bằng men kết hợp với protein selco vào ngày nuôi đầu tiên tỷ lệ trứng rất cao đạt 19,71 0,01%, sau đó giảm dần vào các ngày nuôi tiếp theo và đến ngày nuôi thứ 7 chỉ còn 1,22 0,07%. Đối với lô cho ăn bằng men và lô cho ăn bằng men kết hợp với tảo vào ngày nuôi đầu tiên tỷ lệ trứng lần lượt là là 11,07 0,52%, 14,82 0,01% sau đó giảm dần vào các ngày nuôi tiếp theo và đến ngày thứ 7 chỉ còn 3,22 1,42% và 2,51 0,48%. Tóm lại, càng về sau thì tỷ lệ mang trứng của quần thể càng giảm. Một lần nữa, khẳng định rằng : sau khi đạt mật độ tối đa, quần thể luân trùng giảm xuống và tốc độ tăng trưởng, tỷ lệ lên trứng của quần thể luân trùng cũng giảm theo. 3.2. Kết quả thu sinh khối của quần thể tảo Bảng 3.2. Biến động mật độ của tảo N. oculata Ngày nuôi Mật độ ( 104 tb/mL) 0 450 1 1478 81,32 2 2078 70,71 3 2879 12,73 4 2486 72,12 5 1377 228,40 6 418 81,02 7 91 3,54 Ngày nuôi 7 Mật độ (vạn tb/mL) Hình 3.4 Biến động mật độ của tảo N. oculata Số liệu được trình bày là giá tri trung bình độ lệch chuẩn Thí nghiệm nhằm xác định sinh trưởng của quần thể tảo N. oculata trong túi nilon 50 L, được nuôi với mật độ ban đầu là 450 x104 (tb/mL). Kết quả được thể hiện qua hình 3.4 Sau 7 ngày nuôi mật độ đạt cực đại vào ngày nuôi thứ 3, đạt 2879 + 12.73x104 (tb/mL) và sau đó giảm dần qua các ngày tiếp theo. Mức độ tăng mật độ của tảo là rất nhanh, chỉ sau 1 ngày mật độ tăng lên 1478 81,32x 104 (tb/mL), tăng gấp 3,28 lần so với mật độ ban đầu và chỉ sau 2 ngày mật độ đạt 2078 70,71x104 (tb/mL), tăng gấp 4,62 lần so với mật độ ban đầu. Điều này chứng tỏ tảo N. oculata được nuôi với điều kiện môi trường thuận lợi và môi trường dinh dưỡng tốt. Tuy nhiên mật độ tảo còn phụ thuộc vào nhiệt độ, ánh sáng của từng vùng miền. Ở thí nghiệm của chúng tôi chỉ sau 3 ngày mật độ đã lên đến cực đại là do tảo được nuôi trong điều kiện nhiệt độ cao, môi trường dinh dưỡng tôt. Mặt khác còn phụ thuộc vào mật độ ban đầu.Trong thí nghiệm của chúng tôi, cấy với mật độ tương đối cao 450 x104 tb/mL, điều này có thể giải thích tại sao mật độ tế bào tảo tăng lên rất nhanh. Thời gian đạt mật độ càng nhanh thì sự tàn lụi của tảo càng diễn ra nhanh chóng. Qua hình 3.4, sang ngày thứ 4 mật độ tảo bắt đầu giảm xuống (2486 72,12x104 tb/mL), giảm 0,86 lần, và giảm xuống nhanh vào ngày nuôi thứ 5 ( 1377 228,4x104 tb/mL) và chỉ giảm xuống chỉ còn 91 + 3.54x104 ( tb/mL) vào ngày nuôi thứ 7, giảm 4,59 lần trước khi tảo tàn. Điều này có ý nghĩa khi ta tiến hành các biện pháp kỹ thuật cấy pha loãng tảo và lấy tảo cho luân trùng ăn. Giá trị dinh dưỡng của tảo sẽ cao hơn khi chúng ta tiến hành thu tảo ở giai đoạn tăng mật độ tế bào và cũng trong giai đoạn này chúng ta nên tiến hành pha loãng tảo sang môi trường mới bổ sung dinh dưỡng khi hàm lượng dinh dưỡng trong môi trường đã sắp hết Sáng Chiều Nhiệt độ (oC) Ngày nuôi Hình 3.5 Biến động nhiệt độ trong thí nghiệm nuôi tảo N. oculata Số liệu được trình bày là giá trị trung bình độ lệch chuẩn Sự phát triển của mật độ tảo phụ thuộc vào biến thiên nhiệt độ, nhiệt độ cao tảo phát triển tốt và ngựơc laị nhiệt độ thấp thì mật độ tảo phát triến chậm lại. Yếu tố nhiệt độ khó kiếm soát vì phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, khí hậu của từng địa phương. Trong thời gian thí nghiệm nhiệt độ tương đối cao và ổn định cho nên tảo phảt triên rất mạnh. Nhiệt độ cao nhất vào buổi sáng là 29,5 0,71oC, vào buổi chiêu lả 32,75 30,50C Sáng Chiều Ngày nuôi Hình 3.6 Biến động pH trong thí nghiêm nuôi tảo N. oculata Số liệu được thể hiện trong hình là giá trị trung bình độ lệch chuẩn Giá trị pH trong thí nghiêm có sự biến động lớn giữa buổi sàng và buổi chiều. pH có mối quan hệ chặt chẽ với nhiệt độ và mật độ tế bào.Theo Couttaeu (1997) mức pH tốt nhất cho sự phát triển của tảo là 8,2 – 8,7 (Phạm Thị Lam Hồng, 1999).Thí nhiệm của chúng tôi, pH vào buổi chiều rất cao, cao nhất là 9,1 0,14 vào ngày nuôi thứ 3, lúc này mật độ tảo cao nhất.Với điều kiện nuôi nhiệt độ cao kết hợp với mật độ tế bào tảo cao có thể giải thích được tại sao giá trị pH cao như vậy. 3.7. Thảo luận chung về loài tảo N. oculata. Dựa vào kết quả trên cho thấy, thí nghiệm của chúng tôi nuôi tảo N. oculata đạt mật độ cực đại ở mức tương đối cao và thời gian cực đại tương đối ngắn so với những kết quả thí nghiệm tương đối ngắn so với những kết quả thí nghiệm của các tác giả khác. Hồng Thị Kiều Nga (2002), thí nghiệm nuôi tảo N. oculata trong túi nylon sau 8 ngày nuôi đạt mật độ tối đa 2616x104 (tb/mL). Tuy nhiên, mật độ tế bào tảo còn phụ thuộc vào mật độ nuôi cấy ban đầu. Trong thí nghiệm của chúng tôi tiến hành nuôi với mật độ ban đầu tương đối cao 450x104 (tb/mL) so với các tác giả khác. Hồng Thị Kiều Nga (2002) nuôi thí nghiệm với mật độ ban đầu là 385x104 tb/mL. Nguyễn Hữu Tích (2006) bắt đầu tiến hành thí nghiệm với mật độ ban đầu 450x104 (tb/mL) và cũng cho mật độ cao vào ngày nuôi thứ 2 (2988 368 tb/mL). Theo Hoàng Thị Bích Mai (1995), sự thay đổi mật độ cấy ban đầu ảnh hưởng đến số lượng tế bào tham gia phân cắt nên số lượng tế bào hình thành trong từng thời điểm là khác nhau, nếu số lượng tham gia phân cắt nhiều thì mật độ tế bào tảo tăng nhanh. Điều này có thể giải thích cho việc tăng mật độ nhanh chóng. Nhưng trong điều kiện sản xuất việc cần tảo liên tục thì thời gian đạt mật độ cực đại nhanh rất có ý nghĩa để cung cấp tảo cho nhu cầu làm thức ăn cho các đối tượng nuôi. Tuy nhiên, sự tăng trưởng của tảo còn phụ thuộc vào từng loài, nhiệt độ, độ mặn, ánh sáng….Thí nghiệm của chúng tôi được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ tương đối cao, cao nhất vào buổi sáng là 29,5 0,710C, vào buổi chiều là 35,75 30,50C, điều này giải thích tại sao mật độ cao như vậy. Tảo N. oculata phát triển tốt trong mấy ngày nuôi đầu tiên, đến ngày nuôi thứ 4 mật độ bắt đầu giảm xuống là do điều kiện nhiệt độ tương đối cao do thời tiết nắng nóng kéo dài, sự hạn chế ánh sáng do hiện tượng tự che khuất khi mật độ tế bào cao sự suy giảm dinh dưỡng trong môi trường nước. Mặt khác trong thời gian thí nghiệm nhiệt độ buổi sáng, buổi chiều cao nhưng đến chiều mát trời lại mưa. Đây có thể là nguyên nhân làm cho tảo mật độ không tăng thêm nữa mà nhanh chóng tàn lụi. Trong thực tế việc chỉ sử dụng sục khí thông thường thì không thể không chế được sự biến động của pH. Bởi CO2 là nhân tố quan trọng chi phối sự tăng giảm pH, mà lượng CO2 trong không khí chỉ chiếm 0,03%. Vì vậy, trong quá trình quang hợp tảo sử dụng CO2 rất mạnh mẽ là nguyên nhân gây ra pH tăng cao. Vì vậy phải có biện pháp điều chỉnh pH ổn định cho sự phát triển của tảo. Hoàng Thị Ngọc (2003), trong thí nghiệm trên hai loài tảo N. Oculata và Tetraselmis sp đã cho thấy sự hiệu quả khi sử dụng CO2 bổ sung vào môi trường nuôi tảo, khi không có CO2 giá trị pH dao động 6,8 – 10,1 còn khi bổ sung CO2 giá trị pH chỉ nằm trong khoảng 6,2 – 8,2. Thành công của thí nghiệm còn được thể hiện khi mật độ tảo cũng lần lượt cao hơn ở các thí nghiệm có bổ sung CO2, mật độ cực đại của tế bào tảo N. Oculata khi không bổ sung CO2 là 2417x104 (tb/mL), còn khi bổ sung CO2 mật độ đạt cực đại là 3292,8x104 tb/mL. Như vậy, xét về khía cạnh kỹ thuật thì việc bổ sung CO2 cũng có thể là một giải pháp nhằm hạ thấp pH, nâng cao sinh khối của tảo. Chương 4 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 4.1. Kết luận 4.1.1.Tảo N. Oculata. Tảo N. Oculata nuôi tại trại thực nghiệm nuôi trồng thuỷ sản thuộc bộ môn hải sản, Đại Học Nha trang, với mật độ nuôi ban đầu là 350.104 tb/mL, trong điều kiện độ mặn 31 ppt, sục khi 24/24, môi trường dinh dưỡng F2 cho kết quả như sau: Sau 3 ngày nuôi mật độ tảo đạt cực đại 2879 12.73 x 104 tb/mL và sau khi nuôi được 7 ngày tảo tàn mật độ chi còn 91 3,54 tb/mL.Vì vậy, khi tiến hành nuôi tảo N. Oculata sau 3 ngày chúng tôi sẽ tiến hành rút cấp cho luân trùng, ấu trùng cá và pha loãng cấy tảo mới, tránh kéo dài thời gian tảo sẽ tàn. 4.2.Luân trùng Nuôi luân trùng cho ăn các loại thức ăn khác nhau ; Lô 1: cho ăn men bánh mì. Lô 2 : cho ăn men bánh mì kết hợp với tảo Lô3: cho ăn men bánh mì kết hợp với selco Nuôi với mật độ ban đầu là 100 ct/m, độ mặn 30 ppt, nhiệt độ 28,50C – 30,50C , pH 8.7 -9,0. Sau 7 ngày nuôi chúng tôi thu được kết quả như sau: Lô cho ăn men bánh mì cho kết quả thấp nhất và mật độ giảm đột ngột vào ngày nuôi thứ 7 (103 ) Nguyên nhân ở đây có thể dược giải thích do sự thiếu hụt vitamin B12, cystein và một số acid béo không no HUFA n – 3 trong thành phần của men bánh mì, mà đây là nhũng chất rất cần thiết cho sự phát triển của luân trùng, cũng như ấu trùng các sinh vật ăn mồi sống.()Lô cho ăn men kết hợp với selco cho kêt quả cao nhất. Tuy nhiên prôtêin selco là loại thức ăn đắt tiền, dẫn đén chi phí thức ăn nuôi luân trùng rẩ cao, cho nên trong các trại sản xuất nuôi luân trùng bằng vi tảo.Vi tảo biển được xem là thức ăn rất tốt cho luân trùng nếu cung cấp đầy đủ cho luân trùng. Nuôi luân trùng bằng vi tảo sau 5 ngày nuôi mật độ đạt 2879 12,73 x 104 tb/mL.Tuy nhiên phải cung cấp đủ số lượng tảo thì luân trùng mới phát triên tốt.Việc này đòi hỏi phải tốn nhiều nhân công để cấy tảo. 4.2. Đề xuất ý kiến Sau quá trình thực hiện đề tài tại trại thực nghiệm hải sản chúng tôi đề xuất một số ý kiến sau: Về nuôi tảo N. oculata: Tảo N. Oculata sau 3 ngày nuôi đạt mật độ cưc đại, sang ngày thứ 4 có hiện tượng suy giảm mật độ.Vì vậy, sau 3 ngày nuôi phải tiến hành thu hoạch tảo cấy sang môi trường mới nhằm tránh giảm chất lượng tảo.Trong đợt thực tập vừa qua do số lượng nhân công hạn chế nên tiến hành cây tảo không đúng thời gian, do vậy trại cần bố trí thời gian hợp lý. Các dụng cụ nuôi tảo phải được dùng riêng, cẩn thận,trươc khi cấy phải rửa sạch qua nước mặn tránh tảo bị tạp nhiễm. Về nuôi luân trùng: Sau khi nuôi gần đạt mật độ tôi đa cần thu hoạch cho ấu trùng cá ăn, tránh kéo dài thời gian làm mật độ luân trùng giảm. Qua thí nghiệm của chúng tôi thì sau 4 đến 5 ngày nuôi tiến hành lọc,làm giàu luân trùng trước khi cho vào bể ương ấu trùng. Hàng ngày vệ sinh sạch sẽ bể nuôi và thay nước tránh nhiễm trùng tiêm mao, nấm.... ảnh hưởng tới tốc độ sinh trưởng và phát triển của luân trùng.