Đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện đến quá trình lên men tĩnh chủng Bacillus sử dụng để sản xuất chế phẩm xử lý môi trường nuôi tôm

Mục lục Trang Lời nói đầu...................................................................................................... 2 Phần I: Tổng quan......................................................................................... 3 Vi sinh vật và vai trò của chúng I.1 Đặc điểm chung của vi sinh vật....................................................... 3 I.2 Dinh dưỡng của vi sinh vật.............................................................. 4 I.3 Yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh vật.................... 5 I.4 Vai trò của vi sinh vật trong việc bảo vệ môi trường....................... 7 II. Vi khuẩn Bacillus và vai trò phân giải các hợp chất hữu cơ........... 8 II.1 Vi khuẩn Bacillus........................................................................... 8 II.2 Quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ dưới tác động của các enzim proteaza, amylaza, xelluloza...................................................... 8 III. Vài nét về môi trường nuôi tôm ở nước ta III.1 Tình hình phát triển nghề nuôi tôm ở nước ta............................... 9 III.2 Đặc điểm và những thông số cơ bản đánh giá môi trường nước nuôi tôm..................................................................................... 10 III.3 Nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường nước nuôi tôm................. 12 III.4 Yêu cầu về nước nuôi................................................................... 13 III.5 Tình hình xử lý môi trường nước nuôi tôm.................................. 13 IV. Sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản.................. 14 V. Vi khuẩn Bacillus với chế phẩm sinh học xử lý môi trường nuôi tôm.15 Phần II: vật liệu và phương pháp nghiên cứu I. Vật liệu................................................................................................. 17 I.1 Chủng giống ................................................................................... 17 I.2 Thiết bị............................................................................................ 17 I.3 Hoá chất.......................................................................................... 17 I.4 Môi trường nghiên cứu.................................................................... 18 II. Phương pháp nghiên cứu................................................................... 19 II.1 Nghiên cứu đặc điểm cơ bản của các chủng Bacillus (D2, G1, PA).19 II.2 Nhân giống, lên men và thu hồi sinh khối..................................... 20 II.3 Nghiên cứu tạo chế phẩm Bioche.................................................. 20 II.4 Phương pháp xác định đơn vị tạo khuẩn lạc.................................. 20 Phần III: Hướng nghiên cứu........................................................................ 22 Tài liệu tham khảo Lời mở đầu Thế giới vi sinh vật xung quanh chúng ta rất đa dạng và phong phú. Sự tồn tại của chúng xác định những vai trò quan trọng không thể thiếu của chúng trong thế giới sinh vật. Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, vốn hiểu biết của chúng ta về thế giới nhỏ bé ấy dần được mở rộng. Con người đã biết sử dụng chúng vào những mục đích khác nhau, phục vụ lợi ích của con người. Từ rất lâu, chúng ta đã biết ứng dụng vai trò của vi sinh vật trong các ngành chế biến thực phẩm, nông nghiệp, công nghiệp, y học, môi trường... Trong những năm qua, nuôi trồng thuỷ sản đã có sự phát triển vượt bậc cả về sản lượng, diện tích, và cả đa dạng về đối tượng nuôi, góp phần chuyển đổi cơ cấu kinh tế nông thôn, tạo việc làm, tăng thu nhập, cải thiện mức sống cho ngư dân. Tuy nhiên, ở nước ta, sự phát triển của ngành thuỷ sản vẫn là sự phát triển tự phát, ít có quy hoạch và đặc biệt là vấn đề môi trường nuôi chưa có biện pháp xử lý thường xuyên và thích hợp nên môi trường nước nuôi tôm cá có nguy cơ bị ô nhiễm nghiêm trọng dịch bệnh có cơ hội phát triển. Điều đó ảnh hưởng lớn đến chất lượng và sản lượng tôm cá. Trước đây, để giải quyết tình trạng này, người ta sử dụng hoá chất. Tuy nhiên, ngoài tác dụng mong muốn, các hoá chất còn gây những tác hại ảnh hưởng xấu đến môi trường và cả con người. Cụ thể là lượng chất kháng sinh sử dụng còn tồn dư trong môi trường thuỷ sinh, tích tụ các trong vật nuôi, ảnh hưởng đến an toàn thực phẩm. Đó là rào cản lớn trong việc xuất khẩu thuỷ sản, gây thiệt hại cả về kinh tế và uy tín trên thị trường thế giới. Hướng tới sự phát triển bền vững đã và đang là chiến lược phát triển kinh tế đúng đắn nhằm tạo ra các sản phẩm sạch và đặc biệt là sản xuất không làm ảnh hưởng đến môi trường sinh thái. Việc chọn giải pháp thích hợp để xử lý môi trường nước nuôi tôm là hết sức quan trọng. Phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học chứa các vi sinh vật mang những đặc tính cần thiết để xử lý môi trường nước nuôi tôm, tăng khả năng đề kháng của tôm đang được sử dụng thành công ở nhiều nước trên thế giới. Hiện nay, chế phẩm sinh học đã và đang được nghiên cứu, ứng dụng tại Việt Nam và bước đầu đã có những kết quả khả quan. Trong đợt thực tập này, tôi được thực tập tại Viện công nghệ sinh học – Viện khoa học và công nghệ Việt Nam. Dưới sự hướng dẫn của TS. Võ Thị Thứ, tôi được giao đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện đến quá trình lên men tĩnh chủng Bacillus sử dụng để sản xuất chế phẩm xử lý môi trường nuôi tôm”. Đây là một đề tài có ứng dụng thực tế trong điều kiện nuôi trồng thuỷ sản ở nước ta. Phần I: Tổng Quan I. Vi sinh vật và vai trò cuả chúng trong việc bảo vệ môi trường I.1. Đặc điểm chung của vi sinh vật Vi sinh vật là tên gọi chung để chỉ tất cả các sinh vật có hình thể bé nhỏ, muốn thấy rõ được người ta phải sử dụng tới kính hiển vi. Vi sinh vật không phải là một nhóm riêng biệt trong sinh giới, chúng thậm chí thuộc về nhiều giới sinhvật khác nhau. Giữa các nhóm có thể không có quan hệ mật thiết với nhau. Chúng có chung các đặc điểm sau: I.1.1. Kích thước nhỏ bé. Vi sinh vật có kích thước vô cùng nhỏ bé, đơn vị để đo kích thước của chungs là micromet, 1mm = 10–3 mm. Chính vì kích thước nhỏ bé như vậy nên diện tích bề mặt của một tập đoàn vi sinh vật là rất lớn. I.1.2. Hấp thụ nhiều, chuyển hoá nhanh. Mặc dù kích thước nhỏ bé, nhưng vi sinh vật lại có năng lực hấp thu và chuyển hoá của chúng có thể vượt xa các sinh vật bậc cao. Chính năng lực chuyển hoá nhanh đó đã đóng vai trò lớn trong hoạt động sống của chúng và có tác động đến cuộc sống của con người. I.1.3. Sinh trưởng nhanh, phát triển nhanh. Vì chúng có khả năng thu và chuyển hoá nhanh nên so với những vi sinh vật khác chúng có tốc độ sinh trưởng cũng như sinh sôi nảy nở vô cùng lớn. I.1.4. Năng lực thích ứng mạnh, dễ phát sinh biến dị. Do khả năng sinh sôi nảy nở nhanh nên khả năng thích ứng của chúng với môi trường cũng nhanh hơn so với những vi sinh vật khác. trong quá trình tiến hoá lâu dài vi sinh vật đã tạo cho mình những cơ chế điều hoà trao đổi chất để thích ứng với những điều kiện sống bất lợi. Người ta nhận thấy lượng enzim thích ứng chiếm tới 10% lượng chứa protein trong tế bào vi sinh vật. Phần lớn vi sinh vật có thể giữ nguyên mức sống ở nhiệt độ của N2 lỏng (–1960 C), thậm chí ở nhiệt độ (– 2530 C), một số vi sinh vật có thể sinh trưởng ở 2500C, một số vi sinh vật có thể sinh trưởng ở 3000C. Vi sinh vật rất dễ sinh biến dị bởi chúng thường có cấu tạo đơn bào, sinh sản mạnh với số lượng nhiều, tiếp xúc trực tiếp với môi trường sống. Tần số biến dị ở vi sinh vật thường là 10–5 –:– 10–10. Hình thức biến dị thường gặp là đột biến gen và dẫn đến những biến đổi về hình thái, cấu tạo, kiểu trao đổi chất, sản phẩm trao đổi chất, tính kháng nguyên, kháng thể... I.1.5. Phân bố rộng, chủng loại nhiều Vi sinh vật phân bố ở khắp nơi trên trái đất. Chúng có mặt trên cơ thể người, động vật, thực vật, trong đất, trong nước, trong khôngkhí, trên mọi đồ dùng, vật liệu, từ biển khơi đến núi cao, từ nước ngầm đến nước mặt...Trong đường ruột của con người thường có không dưới 100–400 loài vi sinh vật khác nhau, chúng chiếm tới 1/3 khối lượng khô của phân. Về chủng loại: Trong khi toàn bộ sinh giới động vật có khoảng 1,5 triệu loài, thực vật có khoảng 0,5 triệu loài thì vi sinh vật có tới trên 100 nghìn loài bao gồm 30 nghìn loài động vật nguyên sinh; 69 nghìn loài nấm; 23 nghìn loài vi tảo; 2,5 nghìn loài vi khuẩn lam; 1,5 nghìn loài vi khuẩn; 1,2 nghìn loài virut ... I.2. Dinh dưỡng vi sinh vật Vi sinh vật không có cơ quan dinh dưỡng riêng biệt, các chất dinh dưỡng vào tế bào và các sản phẩm của quá trình sống từ tế bào tiết ra môi trường qua toàn thể tế mặt tế bào nhờ quá trình khuếch tán, thẩm thấu và hấp thụ. I.2.1. Dinh dưỡng cacbon Tuỳ thuộc vào khả năng đồng hoá các nguồn cacbon mà có thể chia vi sinh vật thành 2 nhóm: tự dưỡng và dị dưỡng. Vi sinh vật tự dưỡng Vi sinh vật tự dưỡng có khả năng tổng hợp các hợp chất hữu cơ từ CO2, H2O và muối khoáng. Dựa vào nguồn năng lượng dùng cho tổng hợp, chúng lại được chia thành các vi sinh vật quang hợp và hoá hợp. – Các vi sinh vật quang hợp dùng nguồn năng lượng mặt trời, chúng có các màu tựa như diệp lục ở cây xanh. Những vi khuẩn có sắc tố màu đỏ thuộc phân nhóm này. – Các vi sinh vật hoá hợp dùng nguồn năng lượng được giải phóng trong các phản ứng oxy hoá các chất vô cơ. Vi khuẩn nitơ sử dụng nguồn năng lượng trong phản ứng oxy hoá NH3 để tổng hợp các hợp chất hữu cơ. Những vi khuẩn nitrat, vi khuẩn lưu huỳnh không màu, vi khuẩn sắt thuộc phân nhóm này. – Ngoài nguồn CO2, một số loài vi sinh vật tự dưỡng có thể sử dụng nguồn cơ chất là H2S để quang hợp thành các vật chất tế bào và không giải phóng ra O2. Vi sinh vật dị dưỡng. Vi sinh vật dị dưỡng chỉ đồng hoá được các hợp chất hữu cơ. Chúng được chia làm 2 nhóm hoại sinh và kí sinh. – Vi sinh vật hoại sinh dinh dưỡng bằng các thức ăn hữu cơ đã chết. Thuộc phân nhóm này là các vi khuẩn gây thối, lên men, các nấm men, nấm mốc. – Vi sinh vật ký sinh thường là các vi sinh vật gây bệnh, những virut và thực khuẩn thể sống bám vào những cơ thể sống. I.2.2 Dinh dưỡng Nitơ. Nguồn Nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 (NH4+). Nguồn Nitơ có dự trữ nhiều nhất trong tự nhiên là nguồn Nitơ tự do (N2) trong khí quyển. Đa số vi sinh vật không có khả năng đồng hoá N2 trong không khí. Tuy nhiên, có những vi sinh vật có thể chuyển hoá N2 thành NH3 nhờ hoạt động xúc tác của một hệ thống enzim có tên là Nitrogenaza. Các vi sinh vật gọi là vi sinh vật cố định Nitơ. Ngoài ra, vi sinh vật còn có khả năng đồng hoá tốt Nitơ chứa trong thức ăn hữu cơ. Các thức ăn này sẽ vừa là nguồn Cacbon vừa là nguồn Nitơ cung cấp cho vi sinh vật. Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân tử. Chỉ có các polypeptit chứa không quá 5 gốc axitamin mới có thể di chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh vật. Rất nhiều vi sinhvật có khả năng sản sinh proteaza xúc tác việc thuỷ phân protein thành các hợp chất phân tử thấp có khả năng xâm nhập vào tế bào vi sinh vật. Nguồn Nitơ hữu cơ thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật là pepton – loại chế phẩm thuỷ phân không triệt để của một loại protein nào đó. Các hợp chất hữu cơ chứa cả Cacbon và Nitơ (pepton, nước thịt, nước chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết giá đậu, nước chiết đại mạch...) có thể sử dụng vừa là nguồn Cacbon vừa là nguồn Nitơ đối với vi sinh vật. I.2.3 Nguồn dinh dưỡng khoáng của vi sinh vật Những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật đòi hỏi phải được cung cấp với liều lượng lớn gọi là những nguyên tố đa lượng . Những nguyên tố đa lượng cần thiết cho vi sinh vật như:K, P, Ca, Mg,.... Còn những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật chỉ đòi hỏi với liều lượng rất nhỏ được gọi là các nguyên tố vi lượng. Những nguyên tố vi lượng như:Zn, Mn, Ni, Cu,.... Phần lớn các vi sinh vật dinh dưỡng các nguyên tố này ở dạng muối khoáng. Nguồn K và P có thể dùng K2HPO4, KH2PO4 hoặc (NH4)HPO4, NH4H2PO4 và K2SO4. Nguồn Mg và S là MgSO4, nguồn Fe là FeCl3, FeSO4. Các nguyên tố vi lượng có sẵn trong thành phần cơ chất hoặc trong dạng muối khoáng có trong nước. I.2.4 Nhu cầu về Vitamin Vitamin là các chất sinh trưởng đóng vai trò quan trọng trong thức ăn bổ sung cho vi sinh vật. Một số vi sinh vật cần vitamin trong môi trường dinh dưỡng, một số khác thì có thể tự tổng hợp được. Những vitamin có ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi sinh vật là PP, B1, B2, B5, H... I.3. Các yếu tố bên ngoài ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh vật Mọi hoạt động sống của vi sinh vật đều liên quan đến môi trường. Các vi sinh vật không chỉ có nhu cầu về dinh dưỡng mà còn chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác ngoài môi trường như: nhiệt độ, độ ẩm, pH...Các yếu tố này có thể làm kích thích hoặc ức chế , thậm chí tiêu diệt vi sinh vật. Đồng thời sự phát triển của vi sinh vật cũng làm thay đổi môi trường. Các yếu tố này chia làm 3 nhóm chính: I.3.1 Các yếu tố vật lý: Nhiệt độ: có ảnh hưởng rất lớn đối với hoạt động sống của vi sinh vật. Mọi loài vi sinh vật chỉ có khả năng hoạt động trong một giới hạn nhiệt độ nhất định. Có vi sinh vật ưa lạnh, ưa ấm, ưa nóng. Độ ẩm: Tế bào vi sinh vật chứa lượng nước khá lớn (70%–80%), muốn trao đổi chất và tiến hành mọi hoạt động sống khác, vi sinh vật cần có lượng nước nhất định trong môi trường. Những vi sinh vật khác nhau có yêu cầu độ ẩm khác nhau, thường mỗi loài vi sinh vật có một giới hạn về độ ẩm tối thiểu để phát triển. Đối với nấm mốc có độ ẩm cực tiểu là 15% Đối với vi khuẩn có độ ẩm cực tiểu là 20%–30% Nồng độ các chất hoà tan: Lượng chất hoà tan của môi trường có ảnh hưởng nhiều đến hoạt động sống của vi sinh vật. Nừu nồng độ dung dịch môi trường quá cao sẽ làm cho tế bào lâm vào tình trạng khô hạn sinh lý. Nừu nồng độ dịch ngoài tế bào quá thấp ví dụ như đặt tế bào trong nước cất sẽ làm tế bào trương phồng lên. Các tia năng lượng: ánh sáng mặt trời có tác dụng trực tiếp đối với đại đa số vi sinh vật. ánh sáng khuếch tán ức chế một số vi sinh vật có thế gây chết khi có tác dụng trong thời gian dài. Tia tử ngoại có tác dụng mạnh với vi sinh vật, làm phân huỷ một số các chất hữu cơ trong tế bào, làm đông tụ protein, tia hồng ngoại ít có tác dụng đối với vi sinh vật, chỉ làm tăng nhiệt môi trường thường dùng để sấy khô sản phẩm. Siêu âm: Siêu âm được tạo thành do những dao động với tần số cao trên 200.000 dao động/ giây (200.000Hz). Siêu âm có tác dụng rất mạnh lên tế bào vi sinh vật. Nhiều vi sinh vật chết chỉ sau khi tác dụng siêu âm trong 1 phút. I.3.2 Các yếu tố hoá học pH môi trường: pH môi trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống của vi sinh vật, pH thay đổi làm diện tích màng tế bào chất thay đổi, vì thế sự hấp thụ các loại thức ăn cũng thay đổi, làm thay đổi chiều hướng của một số phản ứng. Mỗi loại vi sinh vật có một khoảng pH tối thích khác nhau, thường thì vi khuẩn, xạ khuẩn, nguyên sinh động vật phát triển thích hợp ở pH = 6,5 – 7,5; vi khuẩn gây thối thường phát triển trong môi trường kiềm, nấm men và nấm mốc phát triển thích hợp trong khoảng pH = 3–6 Thế oxy hoá– khử: Thế oxy hoá – khử của môi trường có thể kích thích hay ức chế hoạt động sống của vi sinh vật. Vi sinh vật hiếu khí hoạt động ở thế oxy hoá – khử cao, vi sinh vật kỵ khí thì ngượo lại, vi sinh vật tuỳ tiện thì có thể phát triển trong điều kiện thế oxy hoá – khử thay đổi. Các chất độc đối với vi sinh vật: Nhiều hoá chất có thể làm ức chế hoạt động của vi sinh vật hoặc tiêu diệt chúng. Các chất độc thường tác dụng trực tiếp đối với nguyên sinh chất, phá hoại cấu trúc của nó và các quá trình hoạt động sống bình thường của tế bào bị ảnh hưởng hoặc đình chỉ. Ví dụ như: Muối của các kim loại nặng, axit, kiềm, các hợp chất oxy hoá mạnh, các chất có áp suất thẩm thấu cao, kháng sinh... Cùng một loại hoá chất tác dụng lên các loài vi sinh vật khác nhau cho hiệu quả khác nhau, nó còn phụ thuộc vào nồng độ và dạng tế bào: Bào tử có sức chịu cao hơn thể dinh dưỡng. I.3.3 Các yếu tố sinh học Các sinh vật ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh vật thông qua mối quan hệ tương hỗ khá phức tạp trong tự nhiên. Các quan hệ đó là: Quan hệ cộng sinh Quan hệ hỗ sinh Quan hệ ký sinh Quan hệ kháng sinh I.4. Vai trò của vi sinh vật trong bảo vệ môi trường Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc phân giải các phế thải nông nghiệp, phế thải đô thị, phế thải công nghiệp và vì vậy có vai trò hết sức quan trọng trong việc bảo vệ môi trường. Ngày nay với sự phát triển của ngành công nghệ sinh học, việc xử lý làm sạch môi trường ô nhiễm bằng phương pháp sinh học đã được tiến hành. Phương pháp này dựa trên hoạt động sống của vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn dị dưỡng hoại sinh có trong nước bị nhiễm bẩn. Quá trình hoạt động của chúng cho kết quả là các chất hữu cơ gây nhiễm bẩn được khoáng hoá và trở thành các chất vô cơ, các chất khí đơn giản và nước. Cho đến nay người ta đã xác định được rằng các vi sinh vật có thể phân huỷ được tất cả các chất hữu cơ có trong thiên nhiên và nhiều hợp chất hữu cơ tổng hợp nhân tạo. Mức độ phân huỷ và thời gian phân huỷ phụ thuộc trước hết vào cấu tạo của chất hữu cơ, độ hoà tan trong nước và hàng loạt các yếu tố ảnh hưởng khác. Vi sinh vật có trong nước nhiễm bẩn sử dụng các hợp chất hữu cơ và một số chất khoáng làm nguồn dinh dưỡng và tạo ra năng lượng. Quá trình dinh dưỡng làm cho chúng sinh trưởng, phát triển đồng thời làm sạch nước, có thể làm sạch gần như hoàn toàn các chất hữu cơ hoà tan hoặc các hạt keo phân tán nhỏ. II. Vi khuẩn Bacillus và quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ II.1. Vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Bacillus là trực khuẩn rất phổ biến trong tự nhiên, có cấu tạo hình que, là vi khuẩn gram dương, đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi hoặc thành sợi. Chúng có đặc điểm là: – Sống hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ tiện – Sinh bào tử, khi sinh bào tử không biến dạng hình thái tế bào. Bào tử có tính kháng nhiệt, kháng bức xạ, kháng hoá chất, kháng áp suất thẩm thấu. Ví dụ: Bacillus aureus chịu được nhiệt độ 1000C trong 2 phút, Bacillus subtilis chịu được 180 phút, Bacillus mesentericus chịu được 380 phút. Năng lực đề kháng với tia phóng xạ của bào tử Bacillus megaterium gấp 36 lần của tế bào dinh dưỡng vi khuẩn E.coli. Đặc biệt đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống 200 – 300 năm của bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis.\ – Sinh tổng hợp các enzim phân huỷ các hợp chất hữu cơ (protein, tinh bột...). Các enzim do Bacillus sinh ra có hoạt tính cao là a–amylaza, proteaza. II.2 Quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ dưới tác dụng của các enzim proteaza, a-amylaza, xenluloza. II.2.1 Sự phân giải protein dưới tác dụng của hệ enzim proteaza Protein là các enzim xúc tác sự thuỷ phân các liên kết peptit (CO–NH) trong phân tử protein và các chất tương tự. Sản phẩm thuỷ phân cuối cùng là các axit amin, sản phẩm trung gian là các peptit có mạch dài, ngắn khác nhau và có loại thương phẩm là pepton (sản phẩm thuỷ phân dở dang của protein). Protein polypeptit oligopeptit peptit axit amin Protein còn bị thuỷ phân sâu hơn trong quá trình thối rữa, sau các axit amin là các amit, rồi amon hoá thành NH3 cùng với các khí thối (H2S,...). II.2.2 Sự phân giải tinh bột dưới tác dụng của enzim a-amylaza a–amylaza hầu như không có tác dụng lên tinh bột nguyên thể, tác dụng mạnh lên tinh bột đã hồ hoá. Quá trình thuỷ phân xảy ra theo nhiều giai đoạn. – giai đoạn đầu (Giai đoạn dextrin hoá ): Chỉ một số liên kết trong phân tử cơ chất bị thuỷ phân tạo thành một lượng dextrin, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh. – Giai đoạn 2 (Giai đoạn đường hoá ): các dextrin vừa được tạo thành bị thuỷ phân tiếp tục tạo thành các dextrin phân tử thấp hơn là maltoza và glucoza. Tinh bột Dextrin Dextrin phân tử thấp Matoza, Glucoza. Thường a–amylaza chỉ thuỷ phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp và một ít đường Maltoza. II.2.3 Sự phân giải xenluloza dưới tác dụng của enzim xenlulaza Xenlulaza là một hệ enzim xúc tác sự thuỷ phân xenluloza thành xenlobioza và cuối cùng thành glucoza. Sự phân giải xenluloza dưới tác dụng của hệ enzim xenlulaza xảy ra theo 3 giai đoạn sau: – Giai đoạn 1: Dưới tác dụng của tác nhân C1, xenluloza nguyên thể chuyển thành xenluloza hoà tan. Người ta cho rằng tác C1 gây ra sự biển đổi xenluloza trong giai đoạn này không phải là enzim mà là bao gồm một số tác nhân nào đó đặc trưng của môi trường có vi sinh vật phát triển. – Giai đoạn 2: xenluloza sau khi qua giai đoạn 1 sẽ tiếp tục bị thuỷ phân dưới tác dụng xúc tác của hệ enzim thuỷ phân Cx tạo thành đường xenlobioza. Enzim Cx còn gọi là enzim b.1,4–gluconaza. – Giai đoạn cuối: dưới tác dụng của enzim xenlobioza (b – glucozidaza), đường xenlobioza bị thuỷ phân thành glucoza. Xenluloza xenluloza xenlobioza glucoza C1 Cx b–glucozidaza III. Vài nét về nghề nuôi tôm ở nước ta III.1 Tình hình phát triển nghề nuôi tôm ở nước ta Tôm là mặt hàng xuất khẩu quan trọng của nhiều nước, đặc biệt là các nước Châu á. Sản lượng nuôi tôm và nghề nuôi tôm đã dần dần chiếm vị trí quan trọng trong nuôi trồng thuỷ sản của nhiều nước như Thái Lan, Đài Loan, Malaysia, Trung Quốc và đặc biệt ở Việt Nam. Với đường bờ biển trải dài hàng nghìn km, vùng biển mở rộng ra ngoài khơi hàng trăm hải lý, diện tích ao hồ trong đất liền lớn, Việt Nam có nhiều tiềm năng và lợi thế để phát triển kinh tế thuỷ sản trên tất cả các lĩnh vực: khai thác, nuôi trồng, chế biến và xuất khẩu Hiện nay, nghề nuôi tôm ở Việt Nam đang phát triển mạnh, đặc biệt là các tỉnh ven biển. Trong đó các giống tôm được đầu tư hơn cả là tôm sú và tôm he. Diện tích nuôi tôm gia tăng nhanh chóng từ 50.000ha năm 1985 đến 295.000ha năm 1998; mở rộng ở cả 3 miền Bắc, Trung, Nam. Trong hơn một thập niên qua, sản lượng thuỷ sản từ khai thác và nuôi trồng tăng đáng kể: đạt 120,7 triệu tấn năm 1995, nếu tính từ năm 1989 sản lượng hàng năm tăng khoảng 15,6 triệu tấn. Hỗu hết sản lượng tăng đến từ nuôi trồng thuỷ sản. Riêng tôm sú năm 2003 đã vượt 200 nghìn tấn, đóng góp trên 1 tỷ đô la trong tổng số 2,24 tỷ đô la giá trị xuất khẩu của toàn ngành. Nhu cầu thị trường đối với tôm nuôi vẫn ngày càng tăng lên làm cho con tôm có một giá cả hấp dẫn và ngành công nghiệp nuôi tôm có được đầu ra ổn định. Nuôi tôm công nghiệp có thể đạt lợi nhuận từ 50 – 80% tổng doanh thu. Tuy nhiên, từ namư 1990–1995 sản lượng nuôi tôm có xu hướng giảm do các nguyên nhân từ sự suy thoái môi trường, quản lý ao nuôi không hợp lý và sự thất thu do dịch bệnh. Các số liệu thống kê cho thấy sản lượng tôm nuôi trên thế giới giảm từ 733.000 tấn năm 1994 xuống còn 712.000tấn năm 1995 và còn 693.000tấn năm 1996. Tại Việt Nam, 2 năm 1994–1995 hiện tượng tôm nuôi chết hàng loạt và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỷ đồng. Việc khống chế mầm bệnh bằng cách dùng hoá chất theo phương pháp truyền thống cho thấy ngày càng mang lại hiệu quả thấp đối với mầm bệnh mới xuất hiện. Ngược lại, Công nghệ sinh học ngày càng gia tăng vai trò hữu hiệu của mình trong chẩn đoán mầm bệnh, giải thích rõ quá trình phát sinh bệnh, phát triển các phương thức chẩn đoán và phòng ngừa hữu hiệu đối với dịch bệnh. III.2 Đặc điểm và những thông số cơ bản đánh giá nguồn nước nuôi tôm III.2.1 Đặc điểm của môi trường nước nuôi tôm Môi trường nước nuôi tôm nói riêng và môi trường nuôi trồng thuỷ sản nói chung đều có hàm lượng chất hữu cơ rất lớn và có diễn biến phức tạp. Thời gian đầu khi nước chưa bị ô nhiễm thì tôm sinh trưởng và phát triển tốt, cho năng suất cao, nhưng chỉ sau một thời gian tôm sinh trưởng, bài tiết và lột xác cùng với lượng thức ăn thừa do tôm không sử dụng hết tích tụ lại dần dần và đây là nguyên nhân gây ô nhiễm cho các thuỷ vực. Sự phân giải các chất hữu cơ dư thừa này làm tăng nồng độ các loại khí độc như amoniac, metan, H2S, NH4+, NO3– ; sự hoà tan các chất này trong nước tuy ít đạt đến ngưỡng gây chết cho tôm nhưng sẽ rất có hại do tạo ra các stress và giảm sức đề kháng bệnh ở tôm nuôi, làm cho chúng dễ nhiễm bệnh mà chết. Bởi ngoài việc sinh ra các chất độc thì chất thải là nơi phát sinh ra các dòng vi sinhvật gây bệnh cho tôm đặc biệt là bệnh đen mang, mòn đuôi, cụt râu. Nước thường có khả năng tự làm sạch nhờ hệ vi sinh vật có trong nước. Tuy nhiên, do quá trình nuôi tôm thâm canh nên nước không có đủ thời gian và nguồn vi sinh vật thực hiện quá trình này. II.2.2 Những thông số cơ bản đánh giá nước nuôi tôm Nhiệt độ: Nhiệt độ là điều kiện xác định đặc điểm các quá trình sinh học, hoá học, lý học,...diễn ra trong nước. Chế độ oxy và cường độ quá trình tự làm sạch nguồn nước phụ thuộc vào nhiệt độ nguồn nước. Nhiệt độ nước nuôi ảnh hưởng nhiều đến việc bắt mồi của tôm, nhiệt độ thích hợp cho tôm là 18 – 300C. Độ pH: Độ pH đặc trưng cho hoạt tính phản ứng của môi trường. Giá trị pH được tính theo công thức: pH = –log[H+]. Độ pH của nước ao nuôi ảnh hưởng khá lớn đến sự sinh trưởng của tôm, cá vì nó ảnh hưởng đến tính độc và nồng độ của NH3, H2S. Tính độc của NH3 và H2S phụ thuộc vào dạng tồn tại của chúng trong môi trường (NH3 và H2S ở dạng khí độc hơn ở dạng ion). Khi pH cao, NH3 tồn tại ở dạng khí nhiều, còn H2S ở dạng khí ít, khi pH thấp thì NH3 tồn tại ở dạng khí ít, còn H2S ở dạng khí nhiều. Đặc biệt khi pH = 7,5 – 8,5 thì NH3 và H2S tồn tại ở dạng độc là ít nhất. Độ mặn: Đối với tôm càng xanh từ tôm bột đến tôm trưởng thành đều sống ở nước ngọt, chỉ có ấu trùng phải nuôi trong môi trường có độ muối là 140/00. Đối với tôm sú độ mặn thích hợp là 15–35 0/00 Độ oxy hoà tan: Oxy hoà tan trong nước rất cần cho vi sinh vật hiếu khí và cho vật nuôi. Lượng oxy hoà tan trong nước phụ thuộc vào nhiều yếu tố: mức độ ô nhiễm của nguồn nước, hoạt động sống của vi sinh vật trong thế giới thuỷ sinh, các hoạt động hoá sinh, hoá học và vật lý của nước,... Oxy hoà tan được tôm cá sử dụng trong quá trình hô hấp, đồng thời oxy hoà tan còn tham gia vào quá trình phân huỷ các thức ăn thừa, các chất thải của tôm, cá, xác động thực vật trong nước,... Khi môi trường bị ô nhiễm nặng thì oxy hoà tan được dùng nhiều cho các quá trình sinh hoá dẫn đến hiện tượng thiếu oxy làm ảnh hưởng đến hoạt động sống của tôm cá. Nước nuôi đủ tiêu chuẩn để nuôi tôm cá có hàm lượng oxy hoà tan là 5–8mg/l. Nhu cầu oxy sinh hoá (BOD = Biochemical oxygen Demand): BOD là lượng oxy cần thiết để oxy hoá các chất hữu cơ có trong nước bằng vi sinh vật hoại sinh hiếu khí. Quá trình này còn được gọi là qúa trình oxy hoá sinh học. Quá trình này được tóm tắt như sau: Chất hữu cơ + O2 CO2 + H2O +Q Vi sinh vật tế bào mới Chỉ số BOD thường được dùng để đánh giá độ nhiễm bẩn của nguồn nước, BOD càng cao thì mức độ nhiễm bẩn càng lớn. Môi trường nước nuôi tôm, cá do sử dụng nhiều thức ăn nên hàm lượng các chất hữu cơ trong nước cao. Vì vậy, chỉ số BOD thường cao. Nhu cầu oxy hoá học (COD = chemical oxygen demand): COD là lượng oxy cần thiết cho quá trình oxy hoá toàn bộ các chất hữu cơ có trong nước thành CO2 và H2O bằng một chất oxy hóa mạnh. COD là đại lượng dùng để đánh giá sơ bộ mức độ nhiễm bẩn của nguồn nước. COD biểu thị lượng chất không thể bị oxy hoá bằng vi sinh vật và lượng chất hữu cơ bị phân huỷ bằng vi sinh vật (BOD) Trong ao nuôi, các thông số BOD và COD càng nhỏ càng tốt. Hàm lượng chất rắn tổng số ( TS), chất rắn huyền phù (SS) – Chất rắn tổng số: Chất rắn tổng số là toàn bộ lượng chất rắn ở dạng hoà tan và lơ lửng trong nước. TS được xác định bằng trọng lượng khô phần còn lại sau khi cho bay hơi 1 lit nước mẫu trên bếp cách thuỷ rồi sấy khô ở 103 – 1050C đến khối lượng không đổi. – Chất rắn huyền phù: Chất rắn huyền phù là lượng chất rắn lơ lửng có trong nước. Chất rắn huyền phù được xác định bằng trọng lượng khô của chất rắn còn lại trên giấy lọc rồi sấy khô ở 1030C đến khối lượng không đổi. Hàm lượng Nitơ: Nitơ là nguyên tố chủ yếu trong tế bào vi sinh vật, động vật nguyên sinh và là nguồn dinh dưỡng, tác nhân kích thích sinh học để thực vật phát triển. Nitơ có thể tồn tại ở các dạng chủ yếu sau: nitơ hữu cơ( N–CH), amoniac (NH3), Nitrit (–NO2–) và Nitơ tự do. Hàm lượng Nitơ trong nước cũng được xem là chất chỉ thị tình trạng ô nhiễm của nước. Vì các dạng tồn tại của Nitơ ở trong nước là các khâu trong chuỗi phân huỷ các hợp chất chứa Nitơ hữu cơ (ví dụ như protein và các hợp phần của protein). – Nếu nước chứa hầu hết là các hợp chất Nitơ hữu cơ, amoniac (hoặc NH4OH) thì chứng tỏ nước mới bị ô nhiễm. NH3 trong nước sẽ gây ngộ độc cho tôm cá và các sinh vật khác trong nước. – Nếu trong nước có hợp chất Nitơ chủ yếu là nitrit (NO2– ) là nước đã bị ô nhiễm trong một thời gian dài hơn. – Nếu nước chứa chủ yếu là hợp chất Nitơ ở dạng nitrat (NO3–) chứng tỏ quá trình phân huỷ đã kết thúc. Tuy vậy, các nitrat chỉ bền ở điều kiện hiếu khí, khi ở điều kiện thiếu khí hoặc kỵ khí các nitrat dễ bị khử thành N2O, NO và Nitơ phân tử tách khỏi nước bay vào không khí. Nừu hàm lượng nitrat trong nước cao có thể gây ngộ độc với người và vật nuôi (vì khi vào cơ thể nó sẽ chuyển thành Nitrit, chất này sẽ kết hợp với hồng cầu thành chất không vận chuyển oxy gây bệnh thiếu máu). ngoài ra, khi hàm lượng Nitơ trong nước quá cao sẽ thúc đẩy quá trình phú dưỡng của nước, gây hiện tượng bùng nổ phát triển tảo gây thiếu oxy trong nước làm tôm cá bị chết. Khi tảo chết làm nước bị ô nhiễm thứ cấp. Ngược lại, nếu hàm lượng Nitơ trong nước quá nhỏ sẽ làm cho sinh vật trong nước chậm phát triển, dẫn tới nước lâu được làm sạch. Hàm lượng phospho: Photpho tồn tại trong nước dưới dạng orthophotphat như H2PO4–, HPO42–,PO4–3, các polyphotphat như Na3(PO3)6 và các photpho hữu cơ. Tất cả các dạng polyphotphat đều có thể chuyển hoá về orthophotphat trong môi trường nước, đặc biệt là ở môi trường axit và ở nhiệt độ cao. Photpho là một trong những nguồn dinh dưỡng cho thực vật dưới nước, khi hàm lượng photpho trong nước quá cao sẽ làm cho các loại tảo, các loại thực vật lớn phát triển, gây tắc thuỷ vực. Sau đó tảo chết bị tự phân, thối rữa làm nước bị ô nhiễm thứ cấp, thiếu oxy hoà tan và làm cho tôm cá bị chết. III.3 Nguyên nhân gây ô nhiễm nước nuôi tôm Các ao nuôi tôm thâm canh có môi trường rất phú dưỡng, nguyên nhân chủ yếu là do chúng ta đưa quá nhiều thức ăn tổng hợp vào ao nuôi. Thức ăn tổng hợp khá giàu protein (30–40%) làm cho 92% hàm lượng các chất hữu cơ chứa nitơ ô nhiễm trong các ao hồ nuôi có nguồn gốc từ thức ăn. Điều đáng quan tâm là chỉ có 17% thức ăn được đồng hoá thành sinh khối của tôm, 18% thức ăn tôm không ăn được do hoà tan trong nước, 48% do bài tiết ra ngoài, do lột xác và để duy trì hoạt động sống và 20% thải ra qua phân. Cùng với sự dư thừa thức ăn, sự bài tiết của tôm, xác tôm, các động thực vật thuỷ sinh phù du, các hoá chất làm vệ sinh và các loại kháng sinh dùng để loại bỏ các sinh vật gây bệnh cho tôm sẽ làm cho ao nuôi dần bị nhiễm bẩn. Các bệnh thường xảy ra cho tôm khi ao bị nhiễm bẩn: – Bệnh thân đỏ đốm trắng SEMBV: tôm bỏ ăn, dạt vào bờ, chết rải rác hoặc hàng loạt. Bệnh này phòng ngừa là chính. – Bệnh virut MBV: còi cọc, chậm lớn, thường xuất hiện nhiều bệnh khác: đen mang, cụt râu, ...gây chết hàng loạt – Bệnh phát sáng do vi khuẩn gây ra. – Bệnh hoại tử gan tuỵ – Bệnh vi khuẩn dạng sợi – Bệnh đóng rong do nguyên sinh vật gây ra. III.4 Yêu cầu về nước nuôi tôm Tôm thường sống ở vùng nước biển có độ mặn không cao hoặc vùng nước lợ. Vì vậy, nuôi tôm bán thâm canh thường ở các ao hồ với nước cấp là nước biển và nước ngọt pha trộn với nhau để đáp ứng được yêu cầu của tôm. Tiêu chuẩn chất lượng nước nuôi trồng thuỷ sản được thể hiện ở bảng sau: Chỉ tiêu Giới hạn Nhiệt độ nước (0C) 23–30 Màu nước Xanh nõn chuối pH 6,5–8,5 Oxy hoà tan (mg/l) 5–8 CO2 (mg/l) 3–10 NH4+ (mg/l) 1,0 PO3– (mg/l) 0,5 Fe tổng số (mg/l) <0,3 COD (mg/l) 10–20 H2S (mg/l) 0,0 Độ muối S0/00 18–30 III.5 Tình hình xử lý nước nuôi tôm Tôm sống được là phải có môi trường tốt, đồng thời chúng cũng phải có khả năng thích ứng với môi trường. Tôm mắc bệnh là kết quả tác động lẫn nhau giữa cơ thể và môi trường sống. Vì vậy, để đưa ra biện pháp phòng và trị bệnh cần phải quan tâm cả 3 yếu tố : môi trường, mầm bệnh, vật nuôi. Nhân tố nào dễ xử lý thì ta xử lý trước. Tạo ra một môi trường tốt là cho tôm một biện pháp phòng bệnh. Để xử lý các ao nuôi tôm bị ô nhiễm do các nguyên nhân nói trên có nhiều biện pháp có thể áp dụng như: biện pháp cơ học, lý học, sinh học. Tuy nhiên, do đặc tính nước nuôi tôm có hàm lượng chất hữu cơ cao nên người ta thấy sử dụng biện pháp sinh học đem lại hiệu quả cao. Trong phương pháp này thì các vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn đóng vai trò vô cùng quan trọng. Nhờ hệ enzim đa dạng, các vi sinh vật này chuyển hoá các chất hữu cơ phức tạp thành những chất hữu cơ đơn giản dễ phân huỷ như là CO2, H2O, N2, và sinh khối vi sinh vật. III.5.1 Quá trình xử lý nước ô nhiễm bằng phương pháp sinh học. Cơ sở của phương pháp xử lý sinh học là dựa trên hoạt động sống của vi sinh vật, chủ yếu là vi khuẩn dị dưỡng hoại sinh có trong nước bị nhiễm bẩn. Chúng chuyển hoá liên tục các chất hữu cơ để sinh năng lượng phục vụ cho hoạt động sống và xây dựng tế bào mới làm tăng sinh khối. Quá trình hoạt động sống của chúng cho kết quả là các chất hữu cơ gây nhiễm bẩn được khoáng hoá và trở thành những chất vô cơ, các chất khí đơn giản và nước. Quá trình đó diễn ra qua 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: di chuyển các chất gây ô nhiễm từ pha lỏng tới bề mặt màng tế bào của vi sinh vật do khuếch tán. Giai đoạn 2: di chuyển chất từ bề mặt ngoài tế bào qua màng bán thấm bằng khuếch tán do sự chênh lệch nồng độ các chất ở trong và ngoài tế bào. Giai đoạn 3: chuyển hoá các chất trong tế bào tạo ra năng lượng cho quá trình sinh sản và phát triển của tế bào. Giai đoạn này đóng vai trò quyết định mức độ và hiệu quả xử lý nước bị ô nhiễm. Có 3 phương pháp xử lý nước bằng biện pháp sinh học: – Phương pháp hiếu khí (aerobic): là phương pháp sử dụng vi sinh vật hiếu khí để phân huỷ các chất hữu cơ và loại chúng ra khỏi nguồn nước. – Phương pháp thiếu khí (anaerobic): phương pháp này được sử dụng trong điều kiện thiếu khí nhằm mục đích khử Nitrat NO3– NO2 NO N2O N2 – Phương pháp kỵ khí (anoxy): là phương pháp sử dụng vi sinh vật kỵ khí trong điều kiện không có oxy. Qúa trình này diễn ra theo 2 giai đoạn: + Giai đoạn thuỷ phân: là giai đoạn thuỷ phân các hợp chất cao phân tử thành các hợp chất thấp phân tử (đường đơn giản, pepton, axitamin, glyxeryl,...) nhờ các enzim thuỷ phân tiết ra từ vi sinh vật. + Giai đoạn tạo khí: là giai đoạn mà các sản phẩm của cuối quá trình thuỷ phân sẽ tiếp tục bị phân giải và tạo ra hỗn hợp các khí: CO2, H2O, CH4, H2, N2, H2S, và một ít muối khoáng. IV. Sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trổng thuỷ sản: Quá trình nuôi thuỷ sản đã dẫn đến việc tích tụ nhiều chất hữu cơ dư thừa trong ao nuôi, gây ô nhiễm không chỉ cho nguồn nước mà còn ảnh hưởng đến quá trình nuôi trồng thuỷ sản trong những lần tiếp theo. Để giải quyết tình trạng này, người ta đã sử dụng các loại vi khuẩn đã được chọn lọc có tác dụng thúc đẩy nhanh quá trình vô cơ hoá các chất hữu cơ, tạo ra môi trường thuận lợi cho sự phát triển của vi tảo trong các ao nuôi và vì thế nước thải ra các ao nuôi sẽ đáp ứng các tính chất về môi trường. Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, hiện nay đã có nhiều loại chế phẩm sinh học đã được đưa vào sử dụng không chỉ trong chăn nuôi gia súc, gia cầm mà cả trong nuôi trồng thuỷ sản và bước đầu đã đem lại những hiệu quả có giá trị như: Giảm các độc tố trong ao nuôi xuống mức thấp nhất (chủ yếu là NH3 và H2S), giảm mùi hôi thối của nước, hạn chế ô nhiễm nguồn nước thuỷ vực. Cải thiện màu nước, ổn định pH và cân bằng hệ sinh thái trong ao nuôi. Phân huỷ tối đa các chất hữu cơ, giảm độ nhớt của nước, phòng tảo nở hoa và hấp thu nguồn tảo chết trong ao, hạn chế hiện tượng “phì dưỡng” Cạnh tranh thức ăn, làm giảm lượng vi sinh vật gây bệnh cho vật nuôi Tăng sự hoà tan oxy trong ao. Giúp tôm hấp thụ thức ăn tốt, giảm hệ số tiêu thụ thức ăn. Kích thích hệ miễn dịch đề kháng bệnh, giảm sốc khi môi trường biến đổi. Hạn chế sử dụng các hoá chất và thuốc kháng sinh. V. Vi khuẩn Bacillus với chế phẩm sinh học xử lý môi trường nuôi tôm: Dựa trên những đặc điểm đã được tìm hiểu về các vi sinh vật, đặc biệt là chủng Bacillus (B.subtilis, B. lincheniformis, B.megarterium...), người ta thấy rằng các loài này không độc hại đối với thuỷ vật, dễ nuôi cấy, dễ tồn tại trong môi trường đất, nước nghèo dinh dưỡng. Chúng còn có tác dụng phân huỷ các cặn thức ăn thừa của tôm cá, phế thải hữu cơ, làm sạch môi trường nhờ hệ enzim thuỷ phân. Ngoài ra, chúng còn có khả năng sinh chất kháng khuẩn bacterioxin – có tác dụng làm giảm sự phát triển của vi sinh vật có hại. Một số loài vi khuẩn thường được sử dụng để sản xuất chế phẩm xử lý môi trường: +Nitrosomonas +nitrobacter + Bacillus laterosporus + Bacillus linchenifomis +Bacillus subtilis +Bacillus polymisa +Bacillus thuringiensis + Bacillus megaterium + Lactobacillus lactis + Lactobacillus helveticú + Pseudomoná putida + Streptococcus Phần II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Vật liệu: I.1 Chủng giống: Bacillus subtilis, Bacillus linchenifomis, Bacillus megaterium, Lactobacillus acidophillus của Phòng vi sinh vật phân tử thuộc Viện công nghệ sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. I.2 Thiết bị: Kính hiển vi Máy đo mật độ quang Máy li tâm Máy khuấy từ Thiết bị khử trùng Tủ ấm Box vô trùng Tủ sấy I.3 Hoá chất: Hoá chất nuôi cấy vi sinh vật: + Pepton, aga, glucoza. Saccaroza, muối khoáng (MgSO4, (NH4)2SO4, NaCl, MgCl2,...) Các dung dịch + Dung dịch Crystal Violet (tím kết tinh) + Dung dịch Lugol: +Dung dịch Fusin: I.4. Môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường nuôi cấy bao gồm: Nước thịt, cao men, pepton, muối khoáng, nước. Trong đó: cao men, nước thịt được sản xuất tại phòng thí nghiệm. Chuẩn bị nước thịt, cao men: Nước thịt: Thịt bò lọc hết mỡ, gân, đem say nhuyễn rồi bổ sung nước theo tỷ lệ ; 3 lít nước: 1 kg thịt, ngâm qua qua đêm trong tủ lạnh ở 4–50C. lọc bỏ bã, đun trên bếp đến sôi, vớt bọt rồi lọc lại bằng vải phin để loại bỏ cặn và protein tủa. Phân vào các bình rôi đem khử trùng ở nồi hấp áp lực. Cao men: bổ sung 3ml nước cất vào 1 kg men bia ép để trong tủ đá, để tự phân trong tủ ấm ở 50–520C đến khi tan hết, tiếp tục tăng nhiệt độ để nước men cô lại, hoặc có thể cô đặc bằng cách đun ở trên bếp có điều khiển nhiệt độ. Các loại môi trường được sử dụng: Môi trường NB (g/l) + Pepton 5 + nước thịt 50ml + cao men 4 + NaCl 5 + MgSO4 3 + (NH4)2SO4 0,3 + nước cất đủ 1000ml Môi trường NA: môi trường NB có bổ sung 1,5% agar–agar Môi trường sản sinh Amylaza của Bacillus (g/l) + pepton 5 + cao men 4 + nước thịt 50ml + NaCl 3 + Tinh bột tan 2 + agar–agar 15 + nước cất đủ 1000ml Môi trường sản sinh proteaza: môi trường NA có bổ sung 10% sữa. II Phương pháp nghiên cứu: II.1 Nghiên cứu đặc điểm cơ bản của các loài Bacillus subtilis, Bacillus linchenifomis, Bacillus megaterium (PA, G1, D2). II.1.1 Đặc điểm hình thái: Phương pháp nhuộm gram, soi kính hiển vi: Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn đã được nuôi cấy 24 – 48h bôi lên phiến kính rồi để khô. Cố định bôi bằng cách hơ phiến kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn. Sau đó nhuộm bằng dung dịch Crystal violet 1 phút, rửa lại bằng cồn. Tráng nước, làm khô vết bôi và nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fusin loãng trong 1–2 phút. Rửa lại bằng nước, làm khô rồi đem đi quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000x. Nếu thấy vi khuẩn màu hồng là vi khuẩn G–, còn nếu là màu tím thì đó là vi khuẩn G+. II.1.2 Đặc điểm sinh hoá Khả năng sinh proteaza: Sữa tách béo 10% thanh trùng để riêng. Cờy các chủng Bacillus dưới dạng điểm lên trên các đĩa thạch của môi trường NA có bổ sung 10% sữa đã tách béo, nuôi 24 giờ ở tủ ấm 370C. Quan sát bán kính vòng thủy phân trong suốt xung quanh khuẩn lạc. Khả năng sinh amylaza: Cấy các chủng từng điểm lên trên các đĩa thạch của môi trường đã có bổ sung 2% tinh bột tan. Sau 1 ngày nuôi trong tủ ấm 370C lấy ra rồi nhỏ dung dịch lugol. Quan sát bán kính vòng thuỷ phân, nếu các chủng có khả năng phân huỷ tinh bột chúng sẽ tạo thành một vòng trong suốt xung quanh chỗ có vi khuẩn phát triển, còn nếu quanh khuẩn lạc mà chỉ toàn màu xanh tím thì vi khuẩn không có khả năng phân huỷ tinh bột. Khả năng đối kháng với Vibrio: Đun sôi 2 bình, mỗi bình chứa 15 ml môi trường NA, đổ ra đĩa, để nguội tới 450C. Bổ sung vào bình thứ nhất 110ml Vibrio parahaemolytiscus, bình thứ hai 110ml Vibrio fuonissii. Cấy chấm điểm các chủng Bacillus trên hai đĩa thạch trên, nuôi trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Chủng nào có khả năng đối kháng sẽ tạo ra vòng kháng khuẩn xung quanh khuẩn lạc của nó. Các chủng thử nghiệm và vi sinh vật gây bệnh đều đã được hoạt hoá trước khi cấy. Khả năng chịu mặn: các chủng Bacillus được nuôi trong môi trường NB có bổ sung NaCl ở các nồng độ khác nhau từ 1 – 10% w/v, nuôi trong điều kiện lắc hoặc để tĩnh ở 370C trong 1 ngày đêm. Sau đó đếm số khuẩn lạc hoặc đo mật độ quang OD để đánh giá sị phát triển của các chủng sau thời gian nuôi cấy. II.2 Nhân giống, lên men và thu hồi sinh khối: Các chủng Bacillus được bảo quản trong các ống efedos, sau đó được hoạt hoá trên môi trường NA trong đĩa petri. Nhân giống cấp 1: giống từ đĩa petri hoạt hoá được cấy vào môi trường NB trong tủ vô trùng. Lắc các bình giống cấp 1 ở 370C trong 24 giờ, hoặc để tĩnh trong 48giờ. Nhân giống cấp 2: giống từ bình giống cấp 1 được chuyển sang bình môi trường NB theo tỷ lệ thích hợp trong tủ vô trùng, đem lắc hoặc để tĩnh và nuôi trong điều kiện như nuôi giống cấp 1. Lên men trong bình inox thể tích 10–20lit có sục khí trong 24 giờ ở điều kiện nhiệt độ phòng. II.2.1 Các phương pháp thu hồi sinh khối: Thu hồi bằng phương pháp ly tâm: Sau khi lên men, sinh khối của các chủng nuôi cấy được thu hồi bằng cách đem li tâm dịch lên men với tốc độ 7500 vòng/phút, sau đó bổ sung đường, muối theo tỷ lệ thích hợp để tạo chế phẩm. Thu hồi bằng phương pháp lắng: Sau khi lên men, sinh khối các chủng nuôi cấy được thu hồi bằng cách lắng ở 40C trong 24 giờ, sau đó bổ sung đường, muối theo tỷ lệ thích hợp II.3 Nghiên cứu tạo chế phẩm Bioche II.3.1 Tạo chế phẩm dạng bột: Sinh khối các chủng nghiên cứu sau khi thu hồi bằng các phương pháp trên được nuôi trên môi trường xốp có cơ chất là gạo, cám và có bổ sung đường theo công thức đã xác định, nuôi ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 ngày. Theo dõi CFU trong 1g chế phẩm trước khi sấy khô. Sau khi lên men xốp, chế phẩm được sấy khô rồi xay thành dạng bột, xác định CFU trong 1 g chế phẩm. II.3.2 Tạo chế phẩm dạng lỏng: Sau khi lên men thu hồi sinh khối bằng một trong các phương pháp trên, bổ sung thêm đường, muối theo tỷ lệ thích hợp. Kiểm tra độ tinh khiết và đóng chai. Theo dõi CFU trong 1ml chế phẩm sau hàng tuần. II.4 Phương pháp xác định đơn vị tạo khuẩn lạc Môi trường được sử dụng là môi trường NA. Các bước tiến hành: – Chuẩn bị dung dịch pha loãng: Dùng pipet vô trùng hút 0,1ml dịch nuôi cấy (nếu là chế phẩm bột thì lấy 1g chế phẩm hoà tan với 5ml nước cất, rồi lấy 0,1ml dịch trong đó) đưa sang ống nghiệm có chứa 0,9ml nước cất. Tiếp tục pha loãng để được các độ pha loãng 10–1,10–2,10–3,10–4,10–5,10–6... – Chuẩn bị môi trường thạch đĩa: Môi trường NA, khử trùng ở áp suất 1atm trong 30. Đợi nguội rồi đổ môi trường lên các đĩa petri vô trùng. Chờ thạch đông và hong khô mặt thạch trong tủ vô trùng. – Cấy và dàn đều dịch pha loãng: dùng pipetman với đầu côn vô trùng lấy 100ml dịch ở độ pha loãng cuối cùng và gần cuối cùng nhỏ vào đĩa thạch có môi trường, mỗi độ pha loãng được lặp lại 3 lần. Dùng que trang thuỷ tinh vô trùng trang đều lên mặt thạch – Nuôi và đếm khuẩn lạc: các hộp petri đã được cấy dịch tế bào, gói kín và đem nuôi trong tủ ấm 370C trong 24 giờ. Đếm số khuẩn lạc trên đĩa, tính trung bình. – Tính kết quả: số lượng tế bào vi khuẩn trong 1ml dịch nuôi cấy được tính theo công thức sau: a: số khuẩn lạc có trong hộp petri b: độ pha loãng. c: lượng dịch tế bào có trong hộp petri phần III: Hướng nghiên cứu: Hiện nay chế phẩm Bioche đang được đem sử dụng trên thực tế và đã mang lại những hiệu quả nhất định. Tuy nhiên, quá trình sản xuất ra chế phẩm trong phòng thí nghiệm hiện nay phải qua quá trình lên men có sục khí; nếu xét về mặt ứng dụng thì chưa thật tối ưu về mặt kinh tế. Bởi thế, hướng nghiên cứu đặt ra cho đề tài tốt nghiệp của em là: + Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình lên men chủng Bacillus trong điều kiện tĩnh không có quá trình sục khí bổ sung oxy. Các yếu tố đó là: * Thời gian lên men * Thành phần môi trường nhân giống * Nhiệt độ * Điều kiện lên men: sục khí, tĩnh khuấy, tĩnh không khuấy. + Nghiên cứu tạo các dạng chế phẩm: dạng bột, dạng lỏng + Nghiên cứu điều kiện bảo quản chế phẩm Tài liệu tham khảo Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Tỵ. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản giáo dục. 2000 Lê Ngọc Tú, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Quẩn, Lê Doãn Diên. Hoá sinh công nghiệp. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật. Hà Nội, 2000. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến. Công nghệ enzim. Nhà xuất bản nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh. 1998. TS Nguyễn Văn Hảo. Một số vấn đề kỹ thuật nuôi tôm sú công nghiệp. Nhà xuất bản nông nghiệp.2003 TS Bùi Quang Tề. Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trị. Nhà xuất bản nông nghiệp 2003. PGS. TS Nguyễn Xuân Thành, GS.TS Nguyễn Như Thành, GS.TS Dương Đắc Tiến. Vi sinh học nông nghiệp. Nhà xuất bản Đại học sư phạm.2003 Quản lý chất thải trong ao nuôi tôm sú thâm canh và bán thâm canh. Trung tâm khuyến ngư Ninh Thuận Một số khái niệm chung về bệnh học thuỷ sản và biện pháp phòng trị bệnh tổng hợp. Trung tâm khuyến ngư Ninh Thuận. Võ Thị Thứ, La Thị Nga, Trương Ba Hùng, Nguyễn Minh Dương, Nguyễn Liêu Ba. Nghiên cứu tạo chế phẩm Bioche và đánh giá tác dụng của chế phẩm đến môi trường nước nuôi tôm, cá. Hội nghị CNSH toàn quốc 12–2003 Võ Thị Thứ, La Thị Nga, Trương Ba Hùng, Nguyễn Minh Dương, Nguyễn Liêu Ba. Đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus và Lactobacillus có khả năng ứng dụng để xử lý môi trường nuôi tôm, cá. Hội nghị CNSH toàn quốc 12–2003.