Đề tài Nghiên cứu bào chế vi nhũ tương natri diclofenac dùng qua da

dạng keo của dược chất, với chế phẩm có tỷ lệ keo cao thì lượng dược chất giải phóng thấp hơn so với dạng có tỷ lệ keo thấp (chế phẩm có độ nhớt thấp giải phóng cao hơn so với chế phẩm có độ nhớt cao). Pieter van der Bijl, Ianda Viljoen và Cs trường đại học Stellenbosch (Nam Phi) nghiên cứu sự hấp thu của diclofenac và piroxicam dạng gel và dạng dung dịch qua da [9] kết quả cho thấy: Đối với diclofenac, dạng dung dịch có khả năng giải phóng cao hơn dạng gel, dung dịch có nồng độ cao hơn thì giải phóng cao hơn, lượng dược chất tích luỹ cũng cao hơn. Với piroxicam cũng tương tự nhưng lượng dược chất tích luỹ giữa hai nồng độ dung dịch 5% và 10% là giống nhau. Những nghiên cứu trên cho thấy diclofenac có thể áp dụng vào dạng bào chế vi nhũ tương, đồng thời với dạng bào chế vi nhũ tương, sự giải phóng diclofenac có thể được cải thiện hơn so với các dạng bào chế dùng qua da khác. 1.3.1.2. Các chất chống viêm phi steroid khác Để nghiên cứu khả năng cải thiện độ tan, độ ổn định và sinh khả dụng của các chất sơ nước, Indranil Nandi và Cs đã thử kết hợp vi nhũ tương và cyclodextrin (CDs) để cải thiện độ tan của indomethacin và progesteron. Tác giả tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các alkanol (methanol, ethanol, isopropanol, isobutanol, isopentanol) và hai cyclodextrin là Trappsol (beta -hydroxypropyl CD) và Captisol (sulfobutyl ether 4 beta - CD) tới VNT chứa IPM, sau đó 3 công thức VNT được chọn để thử hòa tan của indomethacin và progesteron, so sánh độ tan của hai chất trong dung dịch nước chứa Captisol và Trappsol. Tác giả nhận thấy VNT chứa IPM, Tween 80, Span 20, isobutanol và nước có thể tăng độ tan của progesteron lên 3300 lần, của indomethacin lên 500 lần so với độ tan trong nước. Tuy nhiên việc thêm hai CDs vào VNT lại không những không tăng độ tan mà còn làm giảm độ tan của hai chất [31]. Với mục đích tìm ra công thức VNT ibuprofen dạng thân nước dùng ngoài da, H. Chen và Cs đã thử với các loại dầu khác nhau: isopropyl myristat (IPM), isopropyl palmitat (IPP), acid oleic (OA), ethyl oleat (EO). Các mẫu thử được thử giải phóng invitro qua màng da tai lợn, kết quả cho thấy pha dầu EO có khả năng hòa tan tốt và tăng hấp thu của ibuprofen trong hệ VNT gồm pha dầu, chất diện hoạt Tween 80, chất đồng diện hoạt propylen glycol (PG) và nước. Với pha dầu là EO, thay đổi tỷ lệ Tween 80/PG (1/1, 2/1,3/1), xây dựng giản đồ pha và thử giải phóng dược chất qua màng cho mức độ giải phóng cao gấp 5,7 - 30,0 lần so với dung dịch bão hòa. Công thức tối ưu thu được bao gồm: 3% ibuprofen, 6% EO, 30% Tween 80/PG (2/1) và nước cho mức độ giải phóng cao (38,06 mg.cm-2.h-1). Gôm xanthan được cho thêm vào VNT với tỷ lệ vừa đủ là 1,5% để tăng độ nhớt cho hệ, thích hợp dùng ngoài da [12]. VNT ketoprofen kiểu D/N cũng được bào chế thành công bởi Y.S.Rhee và Cs. Để tìm ra loại dầu thích hợp cho công thức VNT ketoprofen, các tác giả đã thử độ tan và hấp thu qua da chuột của ketoprofen với nhiều loại dầu khác nhau. Kết quả acid oleic là loại dầu được lựa chọn do mức độ thấm qua da tốt nhất. Khi xây dựng giản đồ pha các tác giả thay đổi tỷ lệ chất diện hoạt/chất đồng diện hoạt với các tỷ lệ khác nhau: 1/2, 1, 3, 5, 7. Vùng VNT lớn nhất khi tỷ lệ chất diện hoạt/chất đồng diện hoạt là 1/1. Từ giản đồ pha thu được, lại thay đổi lượng pha dầu (OA) là 3%, 6%, 12% và tỷ lệ hỗn hợp chất diện hoạt - đồng diện hoạt là 30%, 55% và 80%. Công thức tối ưu thu được gồm: 3% ketoprofen, 6% acid oleic, 30% Labrasol/Cremophor RH40 (1/1) và nước. Sau đó tác giả cho thêm vào công thức tối ưu 5% các terpen làm chất tăng hấp thu. Trong đó Limonen cho mức độ tăng thấm qua màng cao nhất, gấp 3 lần so với khi chưa có chất tăng hấp thu [34]. Park và Cs đã đưa ra một vi nhũ tương D/N mới chứa 0,5% piroxicam. Tác giả chế thử với nhiều loại dầu khác nhau và kết quả cho thấy acid oleic cho khả năng hòa tan và tăng tính thấm qua da của piroxicam tốt nhất. Công thức tối ưu cho mức độ thấm qua da cao nhất (47,14 mg.cm-2.h-1) là: 0,5% piroxicam, 10% acid oleic, 60% Labrasol/ethanol (1 : 5) và nước [20]. 1.3.2. Các nghiên cứu về những thuốc khác Hua và Cs nghiên cứu vi nhũ tương vinpocetin dùng qua da. Vinpocetin là chất có khả năng hòa tan kém vì vậy nó được chế dưới dạng vi nhũ tương để tăng khả năng hòa tan và hấp thu in vitro của thuốc. Pha dầu là acid oleic có khả năng hòa tan và hấp thu tốt qua da. Cremophor RH 40 là được chọn làm chất diện hoạt, Transcutol P là chất đồng diện hoạt. Công thức vi nhũ tương tối ưu thu được gồm có: 1% vipocetin, 4% acid oleic, 20% Cremophor RH40, 10% Transcutol P và 65% nước. Với công thức đó, độ tan của thuốc tăng gấp 2100 lần so với độ tan trong nước và mức độ hấp thu qua da chuột đạt 15,0 ± 2,5 mg.cm-2.h-1. Nghiên cứu về tính kích ứng cũng cho thấy công thức tối ưu là hệ phân phối qua da an toàn [20]. Estradiol là một hormon được sử dụng nhiều trong điều trị, tuy nhiên nó bị chuyển hóa qua gan lần đầu, dạng vi nhũ tương dùng ngoài da được nghiên cứu để khắc phục nhược điểm này. Một số dầu, chất diện hoạt, chất đồng diện hoạt được sử dụng để bào chế dạng vi nhũ tương, sau đó thử hấp thu in vitro qua da bụng người cho mức độ thấm cao gấp 200 - 700 lần so với đối chứng, độ tan của estradiol tăng 1500 lần [33]. Với mục đích đánh giá khả năng dự trữ thuốc trong pha nội của VNT, Elena Peira và Cs sử dụng tạo cặp ion giữa apomorphin và acid octanoic làm cho thuốc có tính thân dầu. Sau đó các tác giả bào chế hai vi nhũ tương N/D với nồng độ 3,9% apomorphin hydroclorid và thử hấp thu in vitro qua da chuột đã cạo lông. Kết quả thu được mức độ giải phóng thuốc từ hai vi nhũ tương tương ứng 100 mg.cm-2.h-1. và 88 mg.cm-2.h-1. VNT apomorphin sau đó được cho thêm chất chống oxy hóa và bảo quản tránh ánh sáng cho thấy mức độ ổn định, không bị phân hủy kéo dài trong thời gian trên 6 tháng [32]. Như vậy vi nhũ tương mặc dù là một dạng bào chế mới nhưng đã được áp dụng thử nghiệm trên nhiều dược chất khác nhau. Vi nhũ tương dùng qua da thể hiện tính ưu việt đối với dược chất có độ tan kém, dễ bị chuyển hóa qua gan lần đầu hay các thuốc có nhiều tác dụng không mong muốn trên đường tiêu hóa như nhóm thuốc chống viêm phi steroid. Việc nghiên cứu bào chế vi nhũ tương natri diclofenac dùng qua da là một hướng đi đúng đắn, nhằm đem lại hiệu quả cao trong điều trị. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng Vi nhũ tương natri diclofenac 1% dùng ngoài da 2.1.2. Nguyên liệu Bảng 2.1. Nguyên liệu và hóa chất dùng cho nghiên cứu Nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn Natri diclofenac Trung Quốc USP 24 Tween 80 Singapore USP 24 Span 80 Singapore USP 24 Crodamol GTCC GT3907 Singapore Nhà sản xuất Isopropanol Trung Quốc Tinh khiết phân tích DMSO Bỉ USP 29 Natri hydroxyd Trung Quốc Tinh khiết phân tích Kali dihydrophosphat Trung Quốc Tinh khiết phân tích Natri dihydrophosphat Châu Âu Tinh khiết phân tích Methanol (HPLC) Merk – Đức HPLC Màng cellulose acetat 0,45 mm Đức Nhà sản xuất 2.1.3. Phương tiện nghiên cứu ­ Hệ thống đánh giá giải phóng thuốc qua màng: Hanson Research (Đức) ­ Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Thermo Finnigan (Mĩ) ­ Nhớt kế BROOKFIELD (Mĩ) ­ Cân phân tích Sartorius BP 121S (Đức) ­ Máy đo pH InoLab pH 730 (Đức) ­ Máy ly tâm HERMLE Z 200A (Đức) ­ Máy lắc siêu âm Ultrasonic LC 60H (Đức) ­ Khúc xạ kế ABBE – Refractometer (Ba Lan) ­ Tủ vi khí hậu Climacell MMM group (Mĩ) Hình 2.4. Hệ thống giải phóng dược chất qua màng 2.2. Nội dung nghiên cứu P Xây dựng giản đồ pha và nghiên cứu bào chế vi nhũ tương natri diclofenac P Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố trong công thức bào chế đến sự hình thành và giải phóng dược chất từ vi nhũ tương. P Tìm ra công thức có khả năng giải phóng dược chất tốt. P Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và đánh giá độ ổn định của vi nhũ tương. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thiết kế thí nghiệm Sau khi khảo sát giản đồ pha và tìm được các thành phần cơ bản tạo thành vi nhũ tương, sử dụng phần mềm MODDE 5.0 dựa trên nguyên tắc hợp tử tại tâm để thiết kế thí nghiệm [4], [6]. 2.3.2. Phương pháp bào chế vi nhũ tương Cân khối lượng của từng thành phần có trong các công thức đã được thiết kế. Phối hợp các thành phần của pha nước, của pha dầu và chất diện hoạt của mỗi pha, sau đó phối hợp hai pha nước - dầu với nhau, thêm chất đồng diện hoạt kết hợp với khuấy nhẹ. Đánh giá bằng cảm quan và sơ bộ xác định công thức nào có thể tạo được vi nhũ tương. 2.3.3. Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của vi nhũ tương 2.3.3.1. Độ bền pha Độ bền pha là khả năng VNT giữ được trạng thái ổn định, không bị tách lớp trong một điều kiện xác định, sau một khoảng thời gian xác định. Ở điều kiện thường: Mẫu VNT được đựng trong lọ kín để tránh sự bay hơi dung môi hữu cơ, để trong điều kiện nhiệt độ phòng, sau một khoảng thời gian xác định quan sát sự tách pha của VNT có xảy ra hay không. Ở điều kiện lão hóa cấp tốc: Mẫu VNT được đem ly tâm bằng máy HERMLE trong thời gian 60 phút với tốc độ 3000 vòng/phút, sau đó quan sát sự tách pha có xảy ra hay không. 2.3.3.2. Độ nhớt Sử dụng nhớt kế Brookfield tiến hành đo độ nhớt với các thông số: Kim LV1 - code S61, tốc độ quay 60 vòng/phút, nhiệt độ đo 250C ± 20C. 2.3.3.3. Chỉ số khúc xạ ánh sáng Sử dụng khúc xạ kế ABBE - Refractometer để đo chỉ số khúc xạ của mẫu VNT ở điều kiện nhiệt độ 250C ± 20C. Các bước được tiến hành như sau: ­ Đo nước cất, chỉnh vi trường về giá trị của nước cất (1,333). ­ Cho VNT vào bộ phận đựng mẫu, chỉnh vi trường giống với nước cất, đọc kết quả độ khúc xạ của VNT. 2.3.3.4. Xác định tỷ trọng Cân khối lượng chính xác của 50 ml vi nhũ tương, tính khối lượng riêng theo công thức sau: D = D: Khối lượng riêng (g/ml) : Khối lượng trung bình của các lần cân(g) V: Thể tích (ml) 2.3.3.5. Phương pháp thử nghiệm giải phóng dược chất qua màng Tiến hành thử khả năng giải phóng dược chất qua màng các mẫu đã thiết kế để tìm ra công thức VNT natri diclofenac tối ưu. Phương tiện thực hiện là hệ thống đánh giá giải phóng dược chất qua màng Hanson reseach với các điều kiện sau: - Môi trường giải phóng : Dung dịch đệm phosphat pH 7,4 (USP 29) - Thể tích môi trường : 7 ml - Nhiệt độ : 32,00C ± 0,50C - Tốc độ khuấy : 400 vòng/phút - Lượng chế phẩm thử : » 0,33 g - Màng thử : Cellulose acetat - Thời gian thử : 4 giờ - Lượng mẫu hút : 0,5 ml Mẫu thử được lấy cách nhau 1 giờ, mỗi lần 0,5 ml và được đem chạy sắc ký (HPLC) để tính ra nồng độ dược chất trong mẫu thử, từ đó tính ra phần trăm natri diclofenac được giải phóng từ chế phẩm. Tham khảo chuyên luận natri diclofenac gel (BP 2005) chúng tôi tiến hành chạy HPLC với các điều kiện sau: - Pha động: Methanol : Đệm phosphat pH 2,5 với tỷ lệ 66 : 34 (tuy nhiên trong quá trình thực hiện chúng tôi đã điều chỉnh tỷ lệ MeOH : Đệm là 75 : 25 để giảm thời gian lưu của NaDC). - Cột sắc ký: Cột Lichrospher RP8, kích thước 250 mm x 4 mm, kích thước hạt nhồi cột 5 mm (Merck). - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Thể tích tiêm: 20 ml - Detector UV: 254 nm Cách tính kết quả: Công thức tính % dược chất giải phóng %NaDCgp = (Ct.V + v.).(%) Trong đó: %NaDCgp: Phần trăm NaDC được giải phóng (%) Ct : Nồng độ mẫu thử trong môi trường giải phóng tại thời điểm t (mg/ml) V : Thể tích môi trường giải phóng (ml) v : Thể tích mẫu hút (ml) m : Khối lượng VNT đem giải phóng (g) 2.3.3.6. Phương pháp định lượng natri diclofenac trong vi nhũ tương Định lượng natri diclofenac trong VNT bằng phương pháp HPLC, điều kiện sắc ký được trình bày trong mục 2.3.3.5. Chuẩn bị mẫu sắc ký như sau: ­ Mẫu chuẩn: Pha dung dịch mẫu chuẩn NaDC trong isopropanol với nồng độ 100mg/ml, lọc qua màng lọc 0,45mm. ­ Mẫu thử: Cân một lượng vi nhũ tương tương ứng với 5 mg natri diclofenac sau đó hòa tan bằng isopropanol trong bình định mức 50ml, lọc qua màng lọc 0,45mm. Công thức tính hàm lượng dược chất trong VNT: %NaDC = .100 (%) Trong đó: St : Diện tích pic của mẫu thử (mAU.phút) Sc : Diện tích pic của mẫu chuẩn (mAU.phút) mc : Khối lượng chất chuẩn (g) C : Hàm lượng chất chuẩn (%) m : Khối lượng VNT thử (g) 2.3.4. Tối ưu hóa công thức Căn cứ vào kết quả giải phóng qua màng sau các khoảng thời gian của các công thức đã được thiết kế, sử dụng phần mềm INFORM 3.2 để tối ưu hóa công thức, phần mềm này được thiết kế dựa trên nguyên tắc mạng neuron nhân tạo ANN (Artificial Neural Network) [4], [6]. Thông số cần tối ưu là phần trăm natri diclofenac giải phóng qua màng sau thời gian 1h, 2h, 3h, 4h. Từ đó đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố trong công thức bào chế đến sự hình thành và giải phóng dược chất từ vi nhũ tương. 2.3.5. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn chất lượng Căn cứ vào kết quả thực nghiệm để đề xuất một số tiêu chuẩn nhằm đánh giá các chỉ tiêu: + Độ bền pha + Tỷ trọng + Độ nhớt + Chỉ số khúc xạ + Đánh giá khả năng giải phóng dược chất qua màng + Định lượng: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng với các tiêu chuẩn: Độ tuyến tính Khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ NaDC với diện tích pic Độ chính xác Độ chính xác của phương pháp được xác định bằng độ lệch chuẩn tương đối của 5 lần định lượng NaDC trong mẫu vi nhũ tương (RSD < 2%). Độ đúng Thêm vào mẫu định lượng một lượng chất chuẩn đã biết, áp dụng phương pháp định lượng để xác định phần trăm dược chất tìm lại được. 2.3.6. Phương pháp nghiên cứu độ ổn định Đánh giá độ ổn định bằng phương pháp lão hóa cấp tốc, thử nghiệm nhanh. ­ Đóng gói: Vi nhũ tương được đóng trong lọ thủy tinh, nút kín. ­ Bảo quản: Trong tủ vi khí hậu với nhiệt độ 40,00C ± 20C, độ ẩm 75,0% ± 5%. ­ Chỉ tiêu đánh giá: + Độ bền pha + Tỷ trọng + Độ nhớt + Chỉ số khúc xạ + Định lượng + Đánh giá khả năng giải phóng dược chất qua màng Phương pháp tiến hành cụ thể đã được mô tả trong phần 2.3.3.5. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu 3.1.1. Xây dựng đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ dược chất Để khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của dung dịch natri diclofenac trên hệ thống sắc ký HPLC, tiến hành pha một loại dung dịch NaDC chuẩn trong pha động với các nồng độ tương ứng: 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 300 mg/ml. Tiến hành chạy sắc ký theo phương pháp ghi trong mục 2.3.3.5. Bảng 3.2. Mối tương quan giữa nồng độ NaDC và diện tích pic Nồng độ (mg/ml) 50 100 150 200 250 300 Diện tích pic 4147383 8798481 13006572 17272693 21122861 24541979 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ NaDC Nhận xét: Kết quả cho thấy đồ thị có sự tương quan R2 = 0,9976 tức là có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ NaDC với diện tích pic ở bước sóng 254 nm, trong khoảng nồng độ khảo sát. Vì vậy có thể sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định nồng độ NaDC trong môi trường giải phóng cũng như xác định hàm lượng dược chất trong vi nhũ tương. 3.1.2. Thiết kế thí nghiệm và đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng giải phóng hoạt chất. 3.1.2.1.Thiết kế thí nghiệm Thành phần công thức bào chế: Tham khảo từ các kết quả nghiên cứu trước [5], [8] chúng tôi quyết định giữ nguyên thành phần có trong công thức bào chế VNT NaDC chỉ thay đổi pha dầu từ dầu đậu tương sang dầu Crodamol và tiếp tục khảo sát trên sự thay đổi này. Thành phần cơ bản trong công thức VNT: - Dược chất : Natri diclofenac - Chất diện hoạt : Tween 80, Span 80 - Chất đồng diện hoạt : Isopropanol - Pha dầu : Dầu Crodamol - Chất làm tăng hấp thu : Dimethyl sulfoxid - Nước Để khảo sát vùng tạo thành vi nhũ tương với các thành phần cơ bản trên, kết hợp với tham khảo tài liệu [5], [35] chúng tôi tiến hành khảo sát sự phối hợp của các thành phần có trong công thức với một số tỷ lệ nhất định - Dầu Crodamol : Span 80 với tỷ lệ 1 : 1; 1 : 2 (tương ứng với đỉnh thứ nhất của giản đồ pha - đỉnh A). - Tween 80 : Isp với tỷ lệ 1 : 1; 1 : 2; 4 : 3 (tương ứng với đỉnh thứ 2 của giản đồ pha - đỉnh B). Khảo sát tỷ lệ A/B là 60 : 40 sau đó thêm nước từ từ để xác định lượng nước cho vào có thể tạo thành vi nhũ tương (đỉnh thứ 3 của giản đồ pha). Kết quả thu được lượng nước dao động từ 0 đến 25% trong vùng tạo vi nhũ tương. Do trong công thức có thêm dược chất và chất tăng hấp thu, vì vậy khi phối hợp vào công thức sự hình thành vi nhũ tương bị ảnh hưởng không nhỏ. Từ kết quả của các tài liệu tham khảo được [5], [8] chúng tôi chọn lượng chất tăng hấp thu DMSO chiếm 5 - 12% trong công thức. Đồng thời để tạo được VNT N/D kết hợp với kết quả giản đồ pha chúng tôi quyết định thu hẹp khoảng dao động của lượng nước từ 5 - 10% Lựa chọn các biến: Sử dụng phần mềm MODDE 5.0, thiết lập các biến độc lập và biến phụ thuộc để xây dựng công thức thực nghiệm ngẫu nhiên. P Lựa chọn biến độc lập Bảng 3.3. Ký hiệu và các mức thay đổi của biến độc lập Thành phần Ký hiệu Mức thay đổi trong 100% công thức (%) Tween 80 X1 14 - 25 Span 80 X2 20 - 40 Isopropanol X3 12 - 20 DMSO X4 5 -15 Nước X5 5 - 10 Dầu Crodamol X6 Vừa đủ 100% công thức Giữ cố định 1% NaDC, dầu Crodamol cho vừa đủ 100% công thức P Lựa chọn biến phụ thuộc Để khảo sát biến đầu vào cũng như đánh giá khả năng giải phóng dược chất từ VNT natri diclofenac chúng tôi chọn biến đầu ra là phần trăm NaDC giải phóng qua màng tại các thời điểm 1h, 2h, 3h, 4h với tiêu chuẩn dược chất giải phóng ở mức cao nhất. Bảng 3.4. Ký hiệu và yêu cầu các biến phụ thuộc Biến phụ thuộc Ký hiệu Yêu cầu % NaDC giải phóng sau 1h Y1 Y1 ® max % NaDC giải phóng sau 2h Y2 Y2 ® max % NaDC giải phóng sau 3h Y3 Y3 ® max % NaDC giải phóng sau 4h Y4 Y4 ® max Sử dụng phần mềm MODDE 5.0 thiết kế thí nghiệm được các công thức thực nghiệm sau: Bảng 3.5. Thiết kế các công thức thực nghiệm CT NaDC (%) Tween 80 (%) Span 80 (%) Isp (%) DMSO (%) Nước (%) Crodamol (%) 1 1 20,2 26,4 12,2 10 6 24,2 2 1 20 24,4 14,2 10 6 24,4 3 1 16,6 26 12,2 10,2 10 24 4 1 20 22,2 12 10,6 10 24,2 5 1 20,2 21,2 14 10 10,2 23,4 6 1 20 36 12 5 10 16 7 1 16 36 16 5 10 16 8 1 20 36 16 5 5 17 9 1 20 20 16 10 5 28 10 1 16 36 16 10 5 16 11 1 20 36 16 10 10 7 12 1 18 28 14 7,5 7,5 24 13 1 21,1 21,4 12,5 10,5 5 28,5 14 1 20,1 20 16 11,2 9,4 22,3 15 1 20 20 12 5 5 37 16 1 16 20 16 5 5 37 17 1 20 20 12 10 10 27 18* 1 22,8 22,8 0 5,6 5,6 42,2 19* 1 19 23,8 0 6 6 44,2 20* 1 22,8 22,8 0 11,4 11,4 30,6 Nhận xét: Trong các công thức pha chế trên, công thức 1, 3 là trong, hơi mờ, công thức 15, 16, 17 khi phối hợp hai pha dầu - nước tạo ra dung dịch trong, đồng nhất nhưng khi phối hợp thêm chất đồng diện hoạt thì dung dịch trở nên đục và bị phân lớp sau 1 giờ, vì vậy chúng tôi tiến hành pha thử lại công thức 15, 16, 17 mà không có sự có mặt của chất đồng diện hoạt được công thức 18*, 19*, 20* và tiến hành khảo sát trên sự thay đổi này. Các công thức trên được đựng trong lọ kín, để ở nhiệt độ phòng và theo dõi trong 3 tháng, kết quả VNT vẫn trong và không bị tách lớp. - Tiến hành thử giải phóng các mẫu VNT pha chế được bằng hệ thống giải phóng dược chất qua màng Hanson Research với màng giải phóng chúng tôi sử dụng màng cellulose acetat thu được kết quả ở bảng 3.6. Bảng 3.6. Kết quả giải phóng dược chất qua màng cellulose acetat Công thức Y1 (%) Y2 (%) Y3 (%) Y4 (%) 1 8,4 11,4 14,2 18,9 2 11,6 15,9 22,5 30,0 3 7,6 12,1 16,3 19,8 4 7,2 9,3 16,1 19,8 5 3,1 8,0 10,9 15,4 6 3,6 7,3 10,1 12,4 7 2,6 9,5 11,6 14,8 8 4,0 6,5 10,6 14,7 9 4,0 9,7 17,1 25,5 10 7,7 11,1 14,3 18,8 11 3,1 6,1 10,1 17,3 12 3,3 6,2 8,9 12,5 13 8,6 15,3 24,2 28,9 14 10,1 20,1 31,2 36,0 18* 3,5 7,3 9,2 11,2 19* 2,9 6,1 7,5 9,8 20* 4,8 9,6 12,7 15,4 Nhận xét: Trong 17 công thức tiến hành khảo sát giải phóng qua màng, công thức 14 cho kết quả giải phóng cao nhất và đều đặn trong các khoảng thời gian khảo sát. Công thức 19* cho kết quả giải phóng thấp nhất, điều này có thể do trong công thức không có mặt của chất đồng diện hoạt cùng với lượng dầu Crodamol lớn đã làm tăng kích thước giọt của vi nhũ tương và ngăn cản quá trình khuếch tán của dược chất ra khỏi hệ. 3.1.2.2. Phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng giải phóng của dược chất qua màng Để hiểu rõ hơn sự tác động của các yếu tố đầu vào đối với quá trình giải phóng dược chất chúng tôi sử dụng sự hỗ trợ của phần mềm INFORM 3.2. * Ảnh hưởng của Tween 80 và Span 80 đến khả năng giải phóng natri diclofenac sau 4 giờ Hình 3.6. Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của Tween 80 và Span 80 tới % giải phóng natri diclofenac sau 4 giờ, cố định các yếu tố: isopropanol (14%), DMSO (7,5%), nước (7,5%), dầu Crodamol (24%) Khi lượng Tween 80 tăng (20 - 23%) và Span 80 giảm mức độ giải phóng dược chất tăng vì Tween 80 là chất diện hoạt tan trong nước có thể làm tăng khả năng hòa tan và phân tán của dược chất trong pha nước, Span 80 là chất diện hoạt tan trong dầu có vai trò chính để tạo vi nhũ tương kiểu N/D, tuy nhiên lượng Span 80 cho vào chỉ vừa đủ để tạo cấu trúc của hệ nếu nhiều quá sẽ làm tăng độ nhớt ngăn cản quá trình giải phóng dược chất. Tuy nhiên, khi lượng Tween 80 dao động trong khoảng 16 - 20% thì lượng Span 80 có trong công thức ít ảnh hưởng đến mức độ giải phóng dược chất. * Ảnh hưởng của isopropanol và DMSO đến khả năng giải phóng natri diclofenac sau 4 giờ Hình 3.7. Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của isopropanol và DMSO đến % giải phóng natri diclofenac sau 4 giờ, cố định các yếu tố: Tween 80 (18%), Span 80 (28%), nước (7,5%), dầu Crodamol (24%). Phân tích mặt đáp ở hình 3.3 cho thấy khi lượng isopropanol và DMSO tăng thì khả năng giải phóng dược chất cũng tăng. Isopropanol là chất đồng diện hoạt quyết định đến khả năng hình thành vi nhũ tương, đồng thời isopropanol tăng sẽ làm giảm kích thước tiểu phân của vi nhũ tương do đó làm tăng khả năng hòa tan và giải phóng dược chất tuy nhiên isopropanol chỉ tăng đến một giới hạn nhất định, nếu tăng quá sẽ làm thay đổi tỷ lệ pha dầu/nước có thể dẫn đến phá vỡ cấu trúc của hệ. Dimethyl sulfoxyd là một chất tăng hấp thu, làm tăng tính thấm của dược chất qua màng do đó tăng lượng dược chất giải phóng qua màng. * Ảnh hưởng của nước và dầu Crodamol đến khả năng giải phóng natri diclofenac sau 4 giờ Hình 3.8. Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của dầu Crodamol và nước tới % giải phóng của natri diclofenac sau 4 giờ, cố định các yếu tố: Tween 80 (18%), Span 80 (28%), Isp (14%), DMSO (7,5%). Phân tích mặt đáp trên cho thấy khi lượng dầu Crodamol giảm sẽ làm tăng lượng dược chất giải phóng vì dược chất tan trong pha nước không tan trong dầu do đó khi khối lượng dầu tăng sẽ ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của dược chất đồng thời tạo ra hàng rào ngăn cản dược chất giải phóng từ pha nước, mặt khác ta cũng thấy rằng với tỷ lệ dầu lớn lượng nước ít ảnh hưởng đến khả năng giải phóng dược chất nhưng với tỷ lệ dầu nhỏ lượng dược chất giải phóng tăng khi lượng nước giảm, điều này được giải thích rằng khi lượng nước tăng lên sẽ làm thay đổi tỷ lệ pha dầu/nước, vi nhũ tương tiến dần tới giới hạn hình thành hệ do đó sẽ làm kích thước giọt tăng lên đồng thời làm cho khả năng giải phóng dược chất giảm. 3.1.3. Tối ưu hóa công thức Mục đích của quá trình tối ưu là tìm ra được một công thức bào chế vi nhũ tương natri diclofenac có khả năng giải phóng dược chất cao. Để thực hiện quá trình tối ưu hóa chúng tôi sử dụng phần mềm INFORM 3.2 dựa trên nguyên tắc mạng neuron nhân tạo với điều kiện tối ưu hóa được trình bày trong bảng 3.4, các thông số được trình bày trong bảng sau: Bảng 3.7. Các thông số của quá trình tối ưu hóa Biến đầu ra Số đơn vị lớp ẩn Số lần lặp R Y1 1 1000 0,7383 Y2 1 1000 0,8774 Y3 1 1000 0,9212 Y4 1 1000 0,9673 Kết quả tối ưu hóa được trình bày trong bảng sau: Bảng 3.8. Thành phần công thức tối ưu VNT natri diclofenac NaDC (%) Tween 80 (%) Span 80 (%) Isp (%) DMSO (%) Nước (%) Crodamol (%) 1,0 22,2 21,4 16,0 11,2 5,2 23,0 Bảng 3.9. Dự đoán khả năng giải phóng dược chất của công thức tối ưu Y1 (%) Y2 (%) Y3 (%) Y4 (%) 8,4 18,2 27,4 32,5 Tiến hành pha chế 500g công thức tối ưu, sau đó đánh giá một số chỉ tiêu vật lý của chế phẩm và tiến hành thử giải phóng dược chất qua màng để so sánh với dự đoán của phần mềm. 3.1.3.1. Đánh giá một số chỉ tiêu vật lý của công thức tối ưu - Cảm quan: Quan sát bằng mắt thường, theo dõi sự ổn định và phân lớp của VNT. - Độ bền pha: Sử dụng máy ly tâm được tiến hành theo mục 2.3.3.1. - Tỷ trọng: Tiến hành cân một lượng VNT với thể tích xác định, công thức tính theo mục 2.3.3.4. - Độ nhớt: Tiến hành theo phương pháp đo độ nhớt ở mục 2.3.3.2. - Chỉ số khúc xạ: Tiến hành đo chỉ số khúc xạ ánh sáng của chế phẩm theo mục 2.3.3.3. Tiến hành với 5 lần thử rồi lấy kết quả trung bình. Bảng 3.10. Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu vật lý của công thức tối ưu (n = 5) Chỉ tiêu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 TB ± SD Cảm quan Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Độ bền pha Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Tỷ trọng (g/ml) 0,977 0,977 0,978 0,979 0,973 0,977 ± 0,002 Độ nhớt (cP) 44,9 44,8 44,9 44,9 45,0 44,9 ± 0,1 Chỉ số khúc xạ 1,447 1,448 1,447 1,446 1,446 1,447 ± 0,001 3.1.3.2. Đánh giá khả năng giải phóng qua màng của mẫu tối ưu Tiến hành thử khả năng giải phóng natri diclofenac trong công thức VNT tối ưu theo phương pháp ghi trong mục 3.2.3.5 (Tiến hành trên 6 mẫu thử). Bảng 3.11. Kết quả giải phóng NaDC qua màng % giải phóng Y1 (%) Y2 (%) Y3 (%) Y4 (%) Dự kiến 8,4 18,2 27,4 32,5 Thực tế 12,2 22,7 30,2 34,5 Hình 3.9. Đồ thị so sánh khả năng giải phóng NaDC của công thức tối ưu so với dự đoán Nhận xét: Phần trăm natri diclofenac giải phóng thực tế cao hơn so với dự đoán của phần mềm, có thể do sai số gặp phải trong quá trình khảo sát các công thức thực nghiệm. So sánh hai đồ thị trên cho thấy trong giờ đầu lượng dược chất giải phóng thực tế cao hơn nhiều so với dự đoán, nhưng càng những giờ sau lượng dược chất giải phóng càng tiến tới gần với dự đoán của phần mềm, điều này cũng phù hợp với kết quả luyện mạng (hệ số R tăng từ 0,7383 đến 0,9673 sau các khoảng thời gian). 3.1.3.3. Định lượng dược chất natri diclofenac trong mẫu tối ưu Tiến hành định lượng dược chất natri diclofenac trong mẫu tối ưu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, điều kiện tiến hành cụ thể và công thức tính được ghi trong mục 2.3.3.6. Tiến hành định lượng trên 3 mẫu thử. Bảng 3.12. Kết quả định lượng NaDC trong mẫu tối ưu (n = 3) Số lần tiến hành Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± SD RSD (%) Hàm lượng NaDC (%) 101,46 102,06 101,26 101,59 ± 0,416 0,409 Nhận xét: Kết quả định lượng trên 3 mẫu thử không có sự khác nhau nhiều, độ lệch chuẩn tương đối RSD = 0,409 < 2% cho thấy phương pháp định lượng bằng phương pháp HPLC cho kết quả đáng tin cậy. 3.1.4. Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho vi nhũ tương natri diclofenac Vi nhũ tương là một dạng chế phẩm mới, do vậy các tiêu chuẩn đánh giá chúng còn ít và chưa phổ biến. Một số dược điển hiện nay đang sử dụng chưa có một chuyên luận riêng về vi nhũ tương. Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi dự kiến tiêu chuẩn cho công thức VNT natri diclofenac: 3.1.4.1. Các chỉ tiêu vật lí Bảng 3.13. Các chỉ tiêu vật lí dự kiến TT Chỉ tiêu Yêu cầu 1 Cảm quan Trong suốt hoặc trong mờ, không tách lớp 2 Định tính Xác định bằng phương pháp HPLC sao cho thời gian lưu của natri diclofenac trong mẫu thử tương đương với mẫu chuẩn. 2 Độ bền pha Ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong thời gian 60 phút, VNT không bị tách lớp 3 Khối lượng riêng (g/ml) 0,97 - 0,99 (với t0 = 250C ± 20C) 4 Độ nhớt (cP) 43 - 47 (với t0 = 250C ± 20C) 5 Chỉ số khúc xạ 1,44 - 1,46 (với t0 = 250C ± 20C) 6 Khả năng giải phóng dược chất qua màng Sau 4h lượng dược chất giải phóng qua màng cellulose acetat không nhỏ hơn 30,0% 3.1.4.2. Định lượng Lựa chọn phương pháp sắc ký lòng hiệu năng cao để định lượng NaDC có trong thành phần vi nhũ tương. Tiến hành phương pháp theo mục 2.3.3.6 và thẩm định một số tiêu chuẩn sau: Độ tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng. Sắc ký đồ của natri diclofenac Mỗi mẫu sắc ký được chạy với thời gian là 10 phút, thời gian lưu của NaDC khoảng 6,7 phút Hình 3.10. Sắc ký đồ của natri diclofenac Độ tuyến tính Tiến hành pha một loạt dung dịch chuẩn với nồng độ khác nhau, sau đó tiến hành chạy sắc ký để xác định mối tương quan giữa nồng độ dược chất và diện tích píc. Kết quả tiến hành được ghi trong mục 3.1.1 với R2 = 0,9976 tức là có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ NaDC với diện tích pic ở bước sóng 254 nm trong khoảng nồng độ khảo sát. Độ lặp lại Chúng tôi khảo sát độ lặp lại của phương pháp trên cơ sở định lượng hoạt chất natri diclofenac trong mẫu nghiên cứu. Số lần tiến hành là n = 5. ­ Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 50 mg natri diclofenac chuẩn vào bình định mức 50ml, hoà tan và thêm vừa đủ bằng isopropanol, pha loãng 10 lần, lọc qua màng lọc 0,45 mm. ­ Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,5 g VNT hoà tan và thêm vừa đủ bằng dung môi isopropanol vào bình định mức 50ml, lọc qua màng lọc 0,45 mm. Tiến hành chạy sắc ký lấy kết quả diện tích pic của mẫu chuẩn và mẫu thử. Công thức tính hàm lượng natri diclofenac trong VNT được ghi trong mục 2.3.3.6. Kết quả định lượng được ghi trong bảng 3.14. Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng natri diclofenac trong mẫu VNT TT Lượng cân (g) Spic Hàm lượng (%) Số liệu thống kê 1 0,5159 8455913 99,16 n = 5 TB = 99,82% SD = 0,519 RSD = 0,520% 2 0,5064 8345263 99,69 3 0,5178 8503027 100,59 4 0,5114 8429166 99,71 5 0,5069 8376778 99,97 Nhận xét: Phương pháp có độ lặp lại cao, độ lệch chuẩn tương đối RSD = 0,52% < 2% nên phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao là tương đối chính xác. Độ đúng của phương pháp Để khảo sát độ đúng của phương pháp, chúng tôi tiến hành bằng phương pháp “thêm”. Thêm một lượng chính xác natri diclofenac chuẩn vào mẫu thử (hàm lượng mẫu thử được lấy trong mục khảo sát độ lặp lại) sau đó tiến hành chạy sắc ký lỏng để xác định lượng natri diclofenac tìm lại. Phương pháp này được tiến hành như sau: ­ Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 50 mg natri diclofenac hoà tan và thêm vừa đủ 50ml bằng isopropanol (dd A). Hút chính xác 5 ml dung dịch A và thêm vừa đủ isopropanol vào bình định mức 50 ml, lọc qua màng lọc 0,45 mm. ­ Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,5 g VNT cho vào bình định mức 50 ml sau đó thêm chính xác 5ml dung dịch A hoà tan và thêm vừa đủ 50 ml bằng isopropanol, lọc qua màng lọc 0,45 mm. Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng natri diclofenac trong VNT. TT Lượng thêm vào (mg) Spic Lượng tìm thấy (mg) Tỷ lệ % tìm thấy Số liệu thống kê 1 5,170 8483367 5,143 99,47 n = 5 TB = 100,99% SD = 1,059 RSD = 1,049% 2 5,170 8683031 5,264 101,80 3 5,170 8559783 5,188 100,37 4 5,170 8701252 5,275 102,00 5 5,170 8642850 5,239 101,34 Nhận xét: Tỷ lệ tìm lại natri diclofenac chuẩn đạt từ 99,47% đến 102,00% với độ lệch chuẩn tương đối RSD = 1,049% < 2,0% cho thấy phương pháp có độ đúng khá cao, nên kết quả định lượng bằng phương pháp này có thể tin cậy được. Từ kết quả nghiên cứu trên chúng tôi đề xuất yêu cầu chỉ tiêu định lượng cho vi nhũ tương natri diclofenac: phải đạt từ 90,0% đến 110,0%. 3.1.5. Bước đầu nghiên cứu độ ổn định của VNT NaDC Trong phạm vi của đề tài, do điều kiện thời gian có hạn, chúng tôi chỉ áp dụng điều kiện lão hóa cấp tốc để nghiên cứu độ ổn định của VNT NaDC, phương tiện sử dụng là tủ vi khí hậu với các thông số: Nhiệt độ 400C ± 20C, độ ẩm 75% ± 5%. Độ ổn định của chế phẩm được đánh giá thông qua các yếu tố: Chỉ tiêu vật lý, khả năng giải phóng qua màng và định lượng hàm lượng hoạt chất. Tiến hành nghiên cứu độ ổn định VNT NaDC tối ưu trong thời gian 3 tháng và các thông số được đánh giá sau từng khoảng thời gian xác định. 3.1.5.1. Đánh giá các chỉ tiêu vật lý Bảng 3.16. Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu vật lý của mẫu LHCT LHCT Chỉ tiêu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 TB ± SD 1 tuần Cảm quan Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Độ bền pha Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Tỷ trọng (g/ml) 0,974 0,977 0,976 0,974 0,976 0,975 ± 0,001 Chỉ số khúc xạ 1,447 1,448 1,447 1,450 1,447 1,448 ± 0,001 2 tuần Cảm quan Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Độ bền pha Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Tỷ trọng (g/ml) 0,977 0,978 0,976 0,974 0,978 0,976 ± 0,002 Chỉ số khúc xạ 1,447 1,448 1,447 1,447 1,448 1,447 ± 0,001 3 tuần Cảm quan Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Độ bền pha Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Tỷ trọng (g/ml) 0,974 0,977 0,975 0,974 0,975 0,975 ± 0,001 Chỉ số khúc xạ 1,447 1,448 1,447 1,447 1,447 1,447 ± 0,001 1 tháng Cảm quan Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Độ bền pha Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Tỷ trọng (g/ml) 0,982 0,980 0,977 0,975 0,976 0,978 ± 0,003 Chỉ số khúc xạ 1,450 1,450 1,449 1,449 1,448 1,449 ± 0,001 1,5 tháng Cảm quan Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Độ bền pha Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Tỷ trọng (g/ml) 0,974 0,978 0,978 0,980 0,978 0,978 ± 0,002 Chỉ số khúc xạ 1,449 1,448 1,449 1,447 1,449 1,447 ± 0,001 2 tháng Cảm quan Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Độ bền pha Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Tỷ trọng (g/ml) 0,980 0,977 0,979 0,979 0,981 0,979 ± 0,001 Chỉ số khúc xạ 1,448 1,448 1,449 1,449 1,449 1,449 ± 0,001 2,5 tháng Cảm quan Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Độ bền pha Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Tỷ trọng (g/ml) 0,979 0,977 0,983 0,981 0,978 0,980 ± 0,002 Chỉ số khúc xạ 1,449 1,448 1,450 1,450 1,450 1,449 ± 0,001 3 tháng Cảm quan Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Trong, màu vàng Độ bền pha Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Không tách lớp Tỷ trọng (g/ml) 0,974 0,979 0,977 0,980 0,980 0,978 ± 0,003 Chỉ số khúc xạ 1,449 1,448 1,449 1,450 1,449 1,449 ± 0,001 Hình 3.11. Một số hình ảnh của mẫu LHCT A: Mẫu LHCT 1 tháng, B: Mẫu LHCT 2 tháng, C: Mẫu LHCT 3 tháng Nhận xét: Sau 3 tháng bảo quản ở điều kiện lão hóa cấp tốc, hình thức của vi nhũ tương vẫn trong, không bị tách lớp, chỉ số khúc xạ ổn định, ít thay đổi. Điều đó chứng tỏ không có sự thay đổi hay phá vỡ cấu trúc của hệ bởi nhiệt độ và độ ẩm trong điều kiện khảo sát. 3.1.5.2. Đánh giá khả năng giải phóng qua màng Chúng tôi tiến hành thử khả năng giải phóng của mẫu VNT NaDC sau mỗi khoảng thời gian LHCT là 3 mẫu thử. Bảng 3.17. Kết quả giải phóng qua màng của mẫu LHCT (n = 3) % giải phóng Mẫu đánh giá Y1 ± SD (%) Y2 ± SD (%) Y3 ± SD (%) Y4 ± SD (%) Mẫu ban đầu 12,2 ± 1,05 22,7 ± 1,95 30,2 ± 2,83 34,5 ± 3,12 LHCT 1 tuần 12,2 ± 0,72 23,0 ± 1,76 30,0 ± 2,36 34,0 ± 2,50 LHCT 2 tuần 11,9 ± 1,10 22,7 ± 2,30 29,7 ± 2,60 33,9 ± 2,30 LHCT 3 tuần 12,4 ± 1,26 23,5 ± 2,15 29,6 ± 2,75 34,0 ± 2,83 LHCT 1 tháng 11,6 ± 0,62 22,0 ± 1,56 28,2 ± 2,00 33,4 ± 3,30 LHCT 1,5 tháng 11,4 ± 0,60 22,4 ± 0,85 28,7 ± 1,18 33,1 ± 1,12 LHCT 2 tháng 12,0 ± 1,00 23,1 ± 2,50 29,2 ± 2,59 33,2 ± 2,59 LHCT 2,5 tháng 12,3 ± 1,10 23,5 ± 2,40 29,2 ± 2,53 33,4 ± 1,00 LHCT 3 tháng 12,1 ± 1,08 22,4 ± 1,98 28,9 ± 2,32 33,1 ± 2,35 Hình 3.12. Đồ thị so sánh khả năng giải phóng NaDC của một số mẫu LHCT Nhận xét: Mức độ giải phóng natri diclofenac từ vi nhũ tương hầu như không thay đổi sau các khoảng thời gian bảo quản, tuy nhiên để thu được kết quá chính xác cần phải đánh giá thêm ở khoảng thời gian dài hơn. 3.1.5.3 Định lượng Bảng 3.18. Kết quả định lượng NaDC trong các mẫu LHCT Mẫu đánh giá Lần 1 (%) Lần 2 (%) Lần 3 (%) Trung bình (%) SD RSD (%) Mẫu ban đầu 101,46 102,06 101,26 101,59 0,416 0,409 LHCT 1 tuần 101,44 100,98 102,05 101,49 0,536 0,529 LHCT 2 tuần 101,13 100,74 101,51 101,12 0,385 0,380 LHCT 3 tuần 100,77 100,83 102,00 101,20 0,693 0,685 LHCT 1 tháng 100,30 100,90 101,31 100,83 0,508 0,504 LHCT 1,5 tháng 100,40 100,89 100,56 100,62 0,250 0,248 LHCT 2 tháng 100,93 101,00 100,23 100,72 0,440 0,437 LHCT 2,5 tháng 100,43 100,34 99,97 100,25 0,244 0,243 LHCT 3 tháng 99,56 99,10 100,23 99,63 0,568 0,570 Hình 3.13. Biểu đồ hàm lượng NaDC sau các khoảng thời gian LHCT Nhận xét: Hàm lượng NaDC tương đối ổn định, mặc dù có giảm nhẹ sau 3 tháng bảo quản trong điều kiện lão hóa cấp tốc nhưng kết quả này chỉ nằm trong khoảng sai số thực nghiệm. 3.2 Bàn luận 3.2.1. Vi nhũ tương natri diclofenac và các thành phần cơ bản có trong công thức Thành phần cơ bản trong công thức - Pha dầu: Dầu crodamol - Chất diện hoạt: Tween 80, Span 80 - Chất đồng diện hoạt: isopropanol - Chất tăng hấp thu: Dimethyl sulfoxyd - Nước Natri diclofenac là chất ít tan trong nước, có độ tan thay đổi theo pH môi trường, hơn nữa natri diclofenac dễ bị thủy phân và oxy hóa dẫn tới phân hủy dược chất. Vì vậy chúng tôi nghiên cứu bào chế natri diclofenac dùng ngoài dạng vi nhũ tương nhằm bảo vệ dược chất tránh sự tác động của yếu tố ngoại cảnh cũng như cải thiện khả năng hấp thu qua da của dược chất này. Với độ tan trong nước thấp 9 mg/ml, để pha chế được nồng độ 1% mà lượng nước trong công thức chỉ chiếm khoảng 5 – 10%, Tween 80 được chúng tôi lựa chọn sử dụng, Tween 80 là một chất diện hoạt thân nước không chỉ sử dụng để phối hợp với Span 80 làm giảm sức căng bề mặt phân cách pha mà nó còn góp phần làm tăng độ tan của natri diclofenac đáng kể trong pha nước, thực nghiệm cho chúng tôi thấy rằng khi NaDC phân tán trong pha nước với sự có mặt của Tween 80 sẽ hòa tan rất nhanh và dễ dàng. Ngoài Tween 80, một số chất diện hoạt thân nước khác cũng được sử dụng trong các công thức VNT NaDC như: natri lauryl sulfat [8], Brij 58 [22], PEG 40 stearat [35]... Để tăng cường khả năng nhũ hóa cho hệ thì sự phối hợp các chất diện hoạt với nhau là cần thiết. Span 80 là một chất diện hoạt thân dầu đóng vai trò quyết định đến việc hình thành dạng VNT N/D, khi phối hợp pha nước vào pha dầu Span 80 sẽ tiến tới chia nhỏ, bao lấy các giọt nước và phân tán chúng trong pha dầu, tuy nhiên nếu sử dụng Span 80 lớn quá sẽ làm tăng độ nhớt của VNT và ảnh hưởng đến khả năng giải phóng hoạt chất ra khỏi tá dược. Isopropanol được sử dụng đóng vai trò là chất đồng diện hoạt, quyết định đến việc hình thành vi nhũ tương vì nó có khả năng phân chia pha phân tán thành các hạt siêu nhỏ, tuy nhiên Isp cũng chỉ nên sử dụng ở một tỷ lệ nhất định, nếu sử dụng nhiều quá sẽ làm tăng kích thước giọt, tăng khối lượng pha nước dẫn đến đảo pha hoặc phá hủy hệ thống. Để tăng hấp thu dược chất qua da chúng tôi sử dụng DMSO là loại dung môi có khả năng làm giảm tính đối kháng của da vì nó hòa tan các lipid trong da, làm thay đổi cấu trúc của các lipoprotein và làm tăng quá trình hydrat hóa của da, làm cho lớp biểu bì da trở nên xốp hơn giúp dược chất thấm qua dễ dàng hơn, ngoài DMSO một số dung môi khác cũng được sử dụng: DMF, PG, PEG 400... tuy nhiên việc lựa chọn chất tăng hấp thu cho một công thức bào chế còn phụ thuộc rất nhiều vào các thành phần khác có trong công thức sao cho sự phối hợp giữa chúng đem lại hiệu quả cao nhất. Theo Gulten Kantarci và Cs khi nghiên cứu khả năng thấm của natri diclofenac từ các công thức VNT qua da thỏ [22] cho thấy rằng: Đối với VNT khi sử dụng isopropanol làm chất đồng diện hoạt phối hợp với chất tăng hấp thu propylen glycol (PG) hiệu quả hơn là phối hợp với DMSO. Ngược lại, VNT sử dụng chất đồng diện hoạt là propanol phối hợp với chất tăng hấp thu DMSO tốt hơn là phối hợp với PG. Trong nghiên cứu của chúng tôi, do thời gian có hạn nên chưa có điều kiện nghiên cứu so sánh kiểm chứng đối với chất tăng hấp thu PG. Cũng với nghiên cứu này, Dương Nhật Quang và Đặng Thị Hiền đã xây dựng thành công hai công thức VNT natri diclofenac với pha dầu là dầu đậu tương, có sử dụng hai cặp chất diện hoạt là NaLS/Span 80 (CT 1) và Tween 80/Span 80 (CT 2 ). Tỷ lệ NaDC giải phóng qua da thỏ của công thức 1 sau 4 giờ là 11,4%, tỷ lệ NaDC giải phóng qua màng polysulfon của công thức 2 sau 4 giờ là 20,9%. Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi sử dụng dầu Crodamol phối hợp với cặp chất diện hoạt Tween 80/Span 80 cho tỷ lệ NaDC giải phóng qua màng cellulose acetat sau 4 giờ là 34,5%. Từ các kết quả này đã gợi ý cho chúng tôi rằng phải chăng dầu Crodamol là loại dầu thích hợp cho việc nghiên cứu xây dựng công thức VNT natri diclofenac... Tuy nhiên để có một kết luận chính xác cần phải khảo sát giải phóng trên cùng một loại màng và tiến hành trong cùng một điều kiện. Các công thức VNT thiết kế Cùng với sự hỗ trợ của phần mềm MODDE 5.0 chúng tôi đã pha chế thành công 17 công thức VNT natri diclofenac, tuy nhiên khi thử khả năng giải phóng qua màng cellulose acetat cho các kết quả khác nhau. Các công thức 18*, 19*, 20* là những công thức không có sự có mặt của chất đồng diện hoạt cho tỷ lệ giải phóng dược chất rất thấp điều này có thể do khi không có chất đồng diện hoạt kích thước giọt vi nhũ tương lớn, mặt khác tỷ lệ pha dầu trong các công thức này cao hơn hẳn so với các công thức khác, do đó sẽ làm tăng độ nhớt và ngăn cản quá trình khuếch tán dược chất ra khỏi hệ. Các công thức 2, 9, 13, 14 là những công thức cho tỷ lệ giải phóng dược chất khá cao, nhìn vào thành phần của những công thức này chúng tôi nhận thấy tỷ lệ Tween 80 : Span 80 : Crodamol » 1:1:1 và có tỷ lệ chất tăng hấp thu cao (» 10%) cũng như tỷ lệ nước thấp (» 5%) phải chăng đó là những tỷ lệ thích hợp cho công thức giải phóng hoạt chất tốt, tuy nhiên với số liệu còn chưa đủ lớn nên chúng tôi chưa tìm ra được quy luật phù hợp, để có dự đoán chính xác cần có nhiều nghiên cứu thêm. 3.2.2. Nghiên cứu khả năng giải phóng natri diclofenac in vitro qua màng cellulose acetat. Natri diclofenac là chất chống viêm, giảm đau hiện nay đang được sử dụng rất phổ biến, có nhiều dạng bào chế cho dược chất này đang được nghiên cứu và sản xuất. Dạng bào chế dùng ngoài da đối với natri diclofenac nói riêng và các chất giảm đau, chống viêm phi steroid nói chung được nghiên cứu nhằm làm giảm tác dụng phụ kích ứng tại chỗ trên đường tiêu hóa cũng như tránh được chuyển hóa qua gan lần đầu. Tuy nhiên để thuốc phát huy tác dụng điều trị, trước hết dược chất phải được giải phóng ra khỏi tá dược, rồi từ đó thấm qua da và hấp thu vào hệ thống tuần hoàn chung. Quá trình thấm của dược chất qua da chủ yếu theo cơ chế khuếch tán thụ động do đó bị ảnh hưởng rất lớn bởi quá trình giải phóng dược chất ra khỏi tá dược. Mức độ giải phóng càng nhiều sẽ càng tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình hấp thu vào tuần hoàn. Tuy nhiên, tùy thuộc vào mục đích điều trị (tác dụng nhanh hay chậm) mà yêu cầu mức độ giải phóng khác nhau. Vì vậy, việc đánh giá khả năng giải phóng trên in vitro là cần thiết để định hướng chọn công thức có mức độ giải phóng phù hợp với yêu cầu của dạng bào chế. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng màng giải phóng là màng cellulose acetat, mặc dù là một màng tổng hợp có cấu trúc khác hẳn với màng sinh học (màng phospholipid kép) nhưng mức độ thấm của dược chất qua màng cellulose acetat cũng có mối tương quan nhất định đến khả năng giải phóng dược chất ra khỏi tá dược. Một số nghiên cứu thử nghiệm giải phóng dược chất natri diclofenac qua màng sinh học là da động vật: Da thỏ, da lợn, da chuột... nhưng chưa có một nghiên cứu nào chứng minh có thể ngoại suy các kết quả này đối với da người. Mặt khác, khi nghiên cứu khả năng thấm của diclofenac qua da của những động vật khác nhau thì cho kết quả cũng rất khác nhau. Trong nghiên cứu của Amnon C. Sintov và Cs cho thấy rằng tốc độ thấm của natri diclofenac qua da chuột nhắt là 53,35 ± 8,19 mg.cm-2.h-1, chuột nhắt cạo lông là 31,70 ± 3,83 mg.cm-2.h-1, chuột cống là 31,66 ± 4,45 mg.cm-2 .h-1, chuột lang cạo lông là 22,89 ± 6,23 mg.cm-2.h-1 và da lợn là 2,06 ± 0,08 mg.cm-2.h-1 [35] còn trong nghiên cứu của chúng tôi lượng natri diclofenac thấm qua màng cellulose acetat là 162 ± 1,41 mg.cm-2.h-1, tuy nhiên để so sánh một cách chính xác cần nghiên cứu trên cùng một công thức bào chế và tiến hành trong cùng một điều kiện. Như vậy thử nghiệm giải phóng qua màng cellulose acetat không phản ánh chính xác mức độ hấp thu dược chất natri diclofenac qua da người nhưng giúp chúng tôi định hướng và lựa chọn được công thức tối ưu cho khả năng giải phóng dược chất cao. 3.2.3. Lựa chọn công thức tối ưu Với sự hỗ trợ của phần mềm INFORM 3.2 dựa trên nguyên tắc mạng neuron nhân tạo, từ số liệu thực nghiệm thu được phần mềm này sẽ xử lí và tìm ra công thức tối ưu đạt yêu cầu tốt nhất trong giới hạn mong muốn của người làm thí nghiệm. So sánh kết quả thực nghiệm của công thức tối ưu với dự đoán của phần mềm cho thấy kết quả thực tế không hoàn toàn giống chính xác với dự đoán nhưng nhìn vào đồ thị hình 3.9 ta vẫn thấy có sự tương quan tuyến tính nhất định giữa hai tập hợp giá trị, kết quả này có thể do những sai số gặp phải trong quá trình làm thực nghiệm mà chúng tôi chưa kiểm soát hết được. So với các công thức thực nghiệm khác, công thức tối ưu cho tỷ lệ giải phóng dược chất cao nên đó cũng là công thức chúng tôi lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu. 3.2.4. Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng Trong phạm vi của đề tài, căn cứ vào kết quả nghiên cứu thực nghiệm, chúng tôi chỉ bước đầu đề xuất một số tiêu chuẩn cho vi nhũ tương natri diclofenac (là một dạng bào chế mới mà chưa có một tiêu chuẩn chính thức để đánh giá). Đối với phương pháp định lượng natri diclofenac trong vi nhũ tương: Dựa trên tiêu chuẩn định lượng natri diclofenac gel của dược điển BP 2005, chúng tôi thay đổi một số thông số cho phù hợp dạng bào chế cũng như điều kiện tiến hành, thay đổi tỷ lệ pha động MeOH : Đệm phosphat 2,5 từ tỷ lệ 66 : 34 sang tỷ lệ 75 : 25 nhằm rút ngắn thời gian phân tích để nâng cao hiệu suất làm việc của thiết bị. Thay đổi dung môi pha mẫu là pha động sang isopropanol vì isp vừa dễ dàng hòa tan vi nhũ tương vừa ít độc hại cho người làm thực nghiệm. Phương pháp này được thẩm định với 3 chỉ tiêu: Độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng cho thấy phương pháp này có thể hoàn toàn tin cậy được. 3.2.5. Bước đầu nghiên cứu độ ổn định Để có được kết quả nghiên cứu về tính ổn định của dược chất bảo quản ở điều kiện bình thường cần phải theo dõi trong một thời gian dài. Vì vậy chúng tôi sử dụng phương pháp lão hóa cấp tốc để bước đầu nghiên cứu về độ ổn định của natri diclofenac trong thời gian 3 tháng. Từ kết quả nghiên cứu trên cho thấy các chỉ tiêu vật lí, khả năng giải phóng dược chất và hàm lượng hoạt chất vẫn giữ được tính ổn định so với khi mới bào chế. Mặc dù natri diclofenac là dược chất dễ bị thủy phân và oxy hóa nhưng khi bào chế ở dạng vi nhũ tương dược chất được bảo vệ, bởi pha dầu trong công thức có vai trò như một lớp áo bao bọc xung quanh bảo vệ cho dược chất tránh được sự tác động của nhiệt và ẩm. Đồng thời vi nhũ tương là một dạng bào chế mà kích thước tiểu phân của pha nội đạt tới siêu nhỏ nên đảm bảo sự phân tán đồng nhất và bền vững trong pha ngoại do đó không bị tách lớp trong một thời gian bảo quản dài thậm trí bền vững với cả sự tác động của lực ly tâm. CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1. Kết luận Sau thời gian thực hiện đề tài “Nghiên cứu bào chế vi nhũ tương natri diclofenac dùng qua da” chúng tôi xin rút ra một số kết luận sau: 1. Bào chế thành công được vi nhũ tương natri diclofenac với cặp chất diện hoạt Tween 80 và Span 80, chất đồng diện hoạt isopropanol, chất tăng hấp thu dimethyl sulfoxyd và dầu Crodamol. 2. Đánh giá được ảnh hưởng của các thành phần trên tới khả năng giải phóng dược chất qua màng cellulose acetat: Tween 80, isopropanol, DMSO trong công thức tăng sẽ làm tăng khả năng giải phóng dược chất qua màng cellulose acetat. Span 80, dầu Crodamol làm giảm lượng dược chất giải phóng qua màng, còn lượng nước trong công thức ảnh hưởng không đáng kể tới khả năng giải phóng hoạt chất. Tuy nhiên, mỗi thành phần trong công thức không thể tăng hay giảm quá nhiều mà phải phụ thuộc vào các thành phần khác thì vi nhũ tương mới hình thành được. Cấu trúc của vi nhũ tương tạo ra cũng sẽ ảnh hưởng đến khả năng giải phóng hoạt chất của hệ. 3. Xây dựng được công thức vi nhũ tương cho khả năng giải phóng dược chất cao. Natri diclofenac : 1,0 % Tween 80 : 22,2 % Span 80 : 21,4 % Isopropanol : 16,0 % DMSO : 11,2 % Nước cất : 5,2 % Dầu crodamol : 23,0 % 4. Bước đầu xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở cho vi nhũ tương natri diclofenac căn cứ trên điều kiện trang thiết bị của phòng thí nghiệm hiện có. 5. Bước đầu nghiên cứu được độ ổn định của vi nhũ tương natri diclofenac ở điều kiện lão hóa cấp tốc trong thời gian 3 tháng. Sau thời gian nghiên cứu, chúng tôi thấy rằng các chỉ tiêu vật lý, khả năng giải phóng dược chất qua màng cũng như hàm lượng dược chất trong vi nhũ tương tương đối ổn định, tuy nhiên để có một kết luận chính xác và đầy đủ cần có thêm thời gian nghiên cứu. 4.2. Đề xuất - Tiếp tục nghiên cứu độ ổn định của vi nhũ tương natri diclofenac trong điều kiện thường cũng như trong các điều kiện khắc nghiệt khác để có một kết quả hoàn chỉnh về độ ổn định của dược chất natri diclofenac trong dạng bào chế vi nhũ tương. - Tiến hành nghiên cứu thử tác dụng chống viêm in vivo trên mô hình gây viêm thực nghiệm trên chuột và so sánh với một số dạng bào chế ngoài da khác hiện đang lưu hành phổ biến trên thị trường.