Đề tài Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng tới quá trình tạo sinh khối của chủng VKL phân lập từ nem chua

Đôi khi lượng khí ít hơn và thường thay vào đó là lương axit fomic. Lên men lactic thì cần có sự lên men đồng thời của vi khuẩn lactic đồng hình và dị hình. Vì quá trình lên men lactic dị hình ngoài việc tạo thành axit lactic còn tạo ra các sản phẩm phụ như axit và rượu tạo nên este tạo nên mùi thơm đặc trưng cho sản phẩm [6]. • Đường disacarit Con đường chuyển hóa disacarit dựa vào các enzym hydrolase phân cắt mạch thành các monosacarit. Trong đó có chuyển hóa disacarit lactoza, lactoza có thể đi vào bên trong tế bào nhờ các chất mang lactoza và các lacto-pecmeaza để phân cắt lactoza thành glucoza và galactoza, hoặc theo con đường photphoenopyruvat photphotransferaza (PTS) bằng cách phân cắt thành glucoza và galactoza-6-photphat. Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 15 Chuyển hóa disacarit sacaroza, sacaroza có thể đi vào bên trong tế bào nhờ enzym sacaroza hydrolaza phân cắt sacaroza thành glucoza và fructoza theo nhiều con đường khác nhau. Như các giống lactococus chuyển hóa đường sacaroza theo con đường PTS và sacaroza-6-photphat hydrolaza, nó tách sacaroza-6-photphat thành glucoza-6-photphat và fructoza. Sacaroza-6-photphat hydrolaza và sacaroza PTS tăng lên khi trong môi trường có nhiều sacaroza. Sacaroza cũng có thể hoạt động như một chất cho monosacarit trong quá trình tạo ra exopolysacarit – làm tăng độ kết dính và cấu trúc của các sản phẩm sữa lên men - của vi khuẩn lactic [16, 22]. b) Chuyển hóa Protein Vi khuẩn lactic có nhu cầu rất lớn về các loại axit amin để phát triển, mà khả năng tổng hợp axit amin từ nguồn nitơ vô cơ của các vi khuẩn lactic là có giới hạn. Hoạt động thủy phân protein được nhắc đến khi trong môi trường không đủ axit amin cung cấp cho sự sinh trưởng và phát triển, ví dụ trong sữa chỉ có khoảng 10mg/100ml, vì vậy vi khuẩn lactic có thể thủy phân casein ở pH và nhiệt độ tối ưu để tạo các axit amin, di hoặc tri – peptit nhờ các enzym proteaza và peptidaza nằm trong tế bào chất, trên màng và thành tế bào. Trong một số trường hợp các proteaza ở thành tế bào không tổng hợp được do thiếu đoạn plasmit mã hóa thì lập tức các peptidaza ở màng tế bào và tế bào chất sẽ thực hiện quá trình thủy phân các peptit thành các axit amin tương ứng sau khi các oligopeptit đủ nhỏ để được vận chuyển vào trong màng nguyên sinh chất, vì chỉ có các phân tử thấp mới có khả năng xâm nhập vào tế bào qua màng nguyên sinh chất [8, 22]. Nhờ các loại enzim khác nhau mà vi khuẩn lactic có thể tham gia biến đổi tính chất một số sản phẩm thực phẩm trong quá trình sản xuất. I.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn lactic I.2.1 Quá trình tạo sinh khối Quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn được chia thành 4 giai đoạn sau: Pha tiềm phát, pha phát triển logarit, pha cân bằng và pha suy vong [1] - Pha thích nghi : Pha này được tính từ khi bắt đầu cấy đên khi tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn bắt đầu phát triển mạnh. Trong thời gian này vi khuẩn dần dần làm quen với môi trường và thích nghi với môi trường. ở giai đoạn này vi Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 16 khuẩn chưa sinh sản hoặc mới bắt đầu với tốc độ chậm. Thời gian của pha này phụ thuộc vào sự thích nghi của vi khuẩn đối với môi trường. - Pha phát triển logarit : Pha này là pha tăng trưởng mạnh nhất. Tế bào sinh trương với tốc độ nhanh nhất và sự tạo thành sinh khối được minh hoạ theo hàm số mũ. Tế bào ở pha này trẻ về sinh lý, có hoạt tính sinh học cao. Tế bào sinh ra nhanh , lượng cơ chất giảm mạnh và tỷ lệ nghịch với lượng tế bào sinh ra.Số lượng tế bào tăng theo phương trình: N= No.2n Trong đó: - No=Số tế bào ban đầu - N: tổng số tế bào -n: Số lần tế bào phân chia - Pha cân bằng : Việc chuyển từ pha logarit sang pha ổn định diễn ra dần dần. trong pha cân bằng, quần thế vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học, pha này thì lượng tế bào sinh ra bằng lượng tế bào chết đi,sinh khối sinh ra không tăng lên và cũng không giảm.Vì vậy khi nồng độ cơ chất giảm thì tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn cũng giảm. Nguyên nhân tồn tại pha này là do sự tích luỹ các sản phẩm độc của quá trình trao đổi chất (như các loại rượu, axit hữu cơ) và việc cạn dần các chất dinh dưỡng. Lượng sinh khối đạt được trong pha ổn định gọi là hiệu suất hoặc sản lượng. Sản lượng phụ thuộc vào tính chất và số lượng các chất dinh dưỡng sử dụng vào điều kiện nuôi cấy. Đó là sự sai khác giữa số lượng vi khuẩn cực đại và khối lượng vi khuẩn ban đầu. - Pha suy vong : Trong pha này lượng tế bào ngày càng già và chết đi, sự cân bằng bị phá vỡ, ngoài sự biến đổi về số lượng tế bào còn có sự biến đổi về kích thước. Từ việc đánh giá được sự phát triển của các pha, người ta có thể vẽ được đường cong sinh trưởng của vi khuẩn. nhìn vào đường cong sinh trưởng của vi khuẩn ta có thể thấy rõ vi khuẩn phát triển mạnh nhất ở giai đoạn nào và thời điểm nào là thu được số lượng sinh khối lớn nhất. Thời gian sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy ( như các chất dinh dưỡng cần thiết) và các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH, điều kiện thông khí, thời gian nuôi cấy Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 17 Vấn đề đặt ra ở đây đó là nên thu sinh khối ở giai đoạn nào là tốt nhất và chất lượng nhất, bởi chọn thời điểm lấy sinh khối nhằm tạo điều kiện cho quá trình sấy sau này. Nếu thu hồi sinh khối ở pha cân bằng thì sẽ có nhiều tế bào già và chết vì thế việc chịu đựng của việc xử lý sau này sẽ khó khăn. Theo một số tài liệu nghiên cứu thì sinh khối nên được lấy ra ở thời điểm đầu pha cân bằng là tốt nhất. I.2.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic I.2.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống Tỷ lệ tiếp giống có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của vi khuẩn. Nếu tỷ lệ tiếp giống quá thấp sẽ kéo dài thời gian nuôi cấy, dễ nhiễm tạp, hiệu suất thu hồi sinh khối thấp. Nếu tỷ lệ tiếp giống quá cao, mặc dù thời gian nuôi cấy rút ngắn nhưng hàm lượng sinh khối không cao do vi khuẩn phát triển nhanh quá làm nguồn thức ăn chóng cạn kiệt, và chúng sinh ra một số sản phẩm gây ức chế quá trình sinh trưởng. Vì vậy chọn tỷ lệ tiếp giống thích hợp sẽ tiết kiệm canh trường giống, đảm bảo quá trình lên men hiệu quả, rút ngắn thời gian lên men. I.2.2.2. Ảnh hưởng của pH Sống trong môi trường lỏng, vi khuẩn chịu tác động của ion H+ và OH- trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự trao đổi chất và phát triển của vi khuẩn. Nếu pH không thích hợp, vi khuẩn lactic có thể bị ức chế, phát triển kém hay bị tiêu diệt. Chính vì vậy, trong quá trình lên men lactic khi axit lactic tích lũy đủ lớn thì ức chế luôn cả hoạt động của vi khuẩn lactic (pH<3.8). Nói chung quá trình lên men sẽ dừng lại khi pH đạt giá trị 4.0. Các loài vi khuẩn lactic khác nhau thì pH thích hợp khác nhau, dao động trong khoảng từ 4.5-6.5. , nhưng một số lại có thể phát triển ở pH=9.6 và một số hoạt động ở pH=3.2 như Lactobacillus fermentum có thể chịu được pH =3. Sự liên quan giữa pH và hiệu suất lên men của vi khuẩn lactic còn là vấn đề mà các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu. Các vi khuẩn lactic khác nhau sẽ thích hợp với khoảng pH khác nhau [4] + Leuconostoc : 6,3÷6,5 + Pediocccus : 5,5 + Lactobacillus, Lactococcus : 5,6÷6,2 Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 18 Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn, sản phẩm của quá trình lên men lactic sinh ra cũng làm giảm pH môi trường. Do đó, nó cũng gây ức chế tới sự phát triển của vi khuẩn lactic. Mỗi loại có khả năng chịu được những pH thấp khác nhau. + Leuconostoc : pHmin <5 + Pediocccus : pHmin = 3,5-4,4 + Lactobacillus : pHmin =3,2 -3,5 I.2.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng enzym của tế bào vi sinh vật. Nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzym, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất và do đó ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Mỗi loại vi khuẩn lactic có khoảng nhiệt độ thích hợp để phát triển. Như loại ưa ấm, sẽ phát triển ở khoảng nhiệt độ 25÷35°C ( ví dụ: Lactobacillus casei, Lactococcus lactic subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, Leuconostoc...); loại ưa nhiệt sẽ phát triển ở khoảng nhiệt độ 35÷45°C ( ví dụ: Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus reuteri...) [4]. I.2.2.4. Ảnh hưởng của Oxy Nói chung các vi khuẩn lactic chịu được môi trường giàu oxy. Nhưng có một vài loài (sống trong đường tiêu hóa của động vật) là yếm khí nghiêm ngặt như Lactobacillus gasseri. Khi có mặt của oxy các loại này không có khả năng photphoryl hóa, tổng hợp cytochrom, tổng hợp enzym. Mặc dù các vi khuẩn lactic thường được gọi là các vi khuẩn yếm khí tùy tiện, thông thường các chuỗi vận chuyển electron không hoạt động nhưng quá trình oxy hóa khử DNA vẫn xảy ra. Trong điều kiện hiếu khí, ở rất nhiều loại vi khuẩn lactic, phân tử DNA phản ứng với oxy để tạo nên H2O2 hoặc một phân tử nước nhờ NADH. Trong quá trình nuôi cấy với mục đích thu hồi sinh khối, vi khuẩn lactic vẫn cần hô hấp để sinh trưởng và phát triển. Vì thế trong nuôi cấy, ta cần kiểm tra khả năng sử dụng oxy để từ đó cung cấp oxy cho phù hợp, sao cho tốc độ hòa tan nó bằng tốc độ tiêu thụ của vi sinh vật Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 19 I.2.2. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng lên khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic Trong quá trình lên men một môi trường nuôi cấy tốt nhất phải là môi trường đảm bảo cho sản xuất tốt nhất với hiệu suất cao trong thời gian ngắn nhất và giá thành thấp nhất đối với chủng vi sinh vật cho trước [5].Vi khuẩn muốn sinh trưởng và phát triển tốt thì trong môi trường phải có đầy đủ các thành phần chủ yếu như C, H, N, và O. Mặt khác trong thành phần cũng phải có các nguyên tố vi lượng và một số tiền chất khác để kích thích sự phát triển của tế bào vi khuẩn Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này. I.2.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon Tất cả các hợp chất hữu cơ xây dựng nên cơ thể tế bào vi sinh vật đều là các hợp chất chứa cacbon, vì vậy vấn đề chuyển hóa các nguồn thức ăn cacbon thành các thành phần hữu cơ của tế bào vi sinh vật chiếm vị trí hàng đầu trong quá trình dinh dưỡng của tế bào vi sinh vật. Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexoza (glucoza, fructoza, manoza, galactoza), các đường đôi (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin). + Glucoza ở dạng D-glucoza, là loại monosacarit hấp thụ dễ dàng, được vi sinh vật sử dụng làm nguồn năng lượng. + Sacaroza là disacarit, dưới tác dụng của enzym invectaza bị thủy phân thành đường đơn giản glucoza và fructoza cho vi khuẩn sử dụng dễ dàng. + Lactoza là disacarit, hay còn gọi là đường sữa, vì có trong sữa người và động vật (5-8%). Lactoza cấu tạo từ một phân tử β-D-galactose and α -D- glucose. Lactoza được thủy phân bởi enzym β - galactosidaza. + Maltodextrin là sản phẩm trung gian khi thủy phân tinh bột thành đường, có 3 đến 20 chuỗi. Những chuỗi này được tạo bởi vài gốc dextroza liên kết với nhau bởi liên kết hidro yếu. Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là monosaccarit và disaccarit. Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ như axit citric, malic, pyruvic, fumaric, Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 20 axetic Một vài loài vi khuẩn lactic lên men dị hình, phân lập được từ các sản phẩm thực phẩm, có thế sử dụng các axit gluconic và galacturonic tạo thành CO2, axit axetic và axit lactic. Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả các axit amin như axit glutamic, arginin, tirozin làm nguồn cung cấp năng lượng. Khi đó xảy ra quá trình đề cacboxyl và tạo ra CO2. Các loại vi khuẩn khác nhau thì đòi hỏi nguồn cacbon khác nhau. Một số loài vi khuẩn lactic lại có thể sử dụng được dextrin, tinh bột [23]. Sự phát triển của một vi khuẩn lactic dưới các nguồn đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào có đặc điểm hình thái và sinh lý khác nhau và vì vậy cũng sẽ có khả năng chống chịu khác nhau trước những áp lực của các quá trình xử lý sau này. Nhóm các nhà khoa học của Carcalho đã khẳng định rằng khả năng sống sót của L.bulgaricus trong và sau sấy đông khô phụ thuộc vào loại đường được bổ sung trong quá trình nuôi cấy và thu hồi chế phẩm; nếu lên men từ matoza thì tỷ lệ tế bào chết nhiều hơn hẳn so với lên men từ fructoza và lactoza [11]. Tuy nhiên, việc lựa chọn loại đường nào cũng cần quan tâm đền vấn đề kinh tế nhằm giảm thiểu chi phí đầu vào. I.2.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ Vi sinh vật cũng như tất cả các cơ thể sống khác đều cần Nitơ trong quá trình sống để xây dựng tế bào. Tất cả thành phần quan trọng của tế bào đều chứa Nitơ (protein, axit nucleic...), vì vậy Nitơ có vai trò không thể thiếu được trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Vi khuẩn lactic đòi hỏi rất nhiều axit amin khác nhau do đó chúng cần môi trường có sẵn nguồn nitơ để đảm bảo sự phát triển của mình. Axit amin có thể được đồng hóa dưới dạng peptit nhờ vào tác dụng của enzym proteaza và peptidaza ngoại hay nội bào. Một số lớn các vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ nên chúng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Chỉ có một số ít loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ. Đôi khi trong một số trường hợp sự phát triển của một vài loài vi khuẩn lactic, như L. helyeticus, có thể bị kích thích bởi sự có mặt của muối amoni trong môi trường. Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 21 Bảng 1.2: Nhu cầu axit amin của một số loài vi khuẩn lactic Axit amin Vi khuẩn lactic có nhu cầu Nồng độ đảm bảo cho sự phát triển, µg / ml Alanin Leuconostoc citrovorum 0÷10 Arginin Lactobacillus casein 0÷10 Asparagin Leuconostoc mesenteroides 0÷40 Xisterin( hoặc Xistin) Leuconostoc mesenteroides 0÷10 Axit glutamic Lactobacillus arabinosus 0÷50 Glyxin Leuconostoc mesenteroides 0÷10 Histidin Streptococcus faecalis 0÷6 Isolơxin Lactobacillus arabinous 0÷10 Lơzin Lactobacillus arabinous 0÷10 Lyzin Leuconostoc mesenteroides 0÷20 Metionin Streptococcus faecalis 0÷10 Phenylalanin Leuconostoc mesenteroides 0÷15 Prolin Leuconostoc mesenteroides 0÷6 Serin Lactobacillus delbrrueckii 0÷20 Treonin Streptococcus faecalis 0÷10 Triptophan Lactobacillus pentosus 0÷3 Tyrozin Lactobacillus delbrrueckii 0÷6 Valin Lactobacillus arabinosus 0÷10 Để sinh trưởng và phát triển bình thường, ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các axit amin, vi khuẩn lactic còn cần những hợp chất hữu cơ chứa nitơ như các sản phẩm thủy phân protein từ lactanbumin, casein, pepton, peptit, dịch nấm men thủy phân, dịch chiết thịt, trypton Đây cũng chính là nguồn nitơ thường xuyên được sử dụng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 22 thì khó có thể sử dụng nguồn nitơ này vì nó rất tốn kém, vì vậy cần nghiên cứu phối trộn chúng với nhau để tăng hiệu suât thu sinh khối và giảm giá thành. Trong đó dịch nấm men thủy phân được sử dụng khá nhiều vì có hàm lượng nitơ cao, có 16 loại axit amin trong đó có 8 axit amin không thay thế [4, 7, 18] I.2.2.3. Ảnh hưởng của các muối vô cơ và chất kích thích sinh trưởng. Các muối vô cơ, các chất khoáng chỉ cần một lượng rất nhỏ nhưng có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn. Chẳng hạn đối với Lactobacillus, Mn2+, Mg2+, Fe2+ làm tăng cường sự phát triển của vi khuẩn lactic, hay Ca2+ tham gia vào cấu trúc enzym proteaza thủy phân một số protein là nguồn dinh dưỡng nuôi tế bào. Nhìn chung mangan và magie là những chất đóng các vai trò chủ yếu sau: + Tham gia cấu trúc và đảm bảo chức năng hoạt động của enzym. + Giải độc các tế bào khỏi sự có mặt của oxy. Mn2+ thay thế dioxyt dimustaza để thải các gốc O2-. + Ổn định cấu trúc tế bào. Mn2+ tham gia vào việc làm ổn định riboxom. Mg2+ là chất hoạt động trong quá trình lên men lactic bằng cách giúp vi khuẩn sử dụng tốt hơn các loại đường. Carvalho và cộng sự đã nhận thấy là khi bổ sung NaCl (chất điện ly) và saccaroza (chất không điện ly) vào môi trường MRS khi nuôi cấy L. bulgaricus đem lại những kết quả khác nhau trong quá trình tạo sinh khối và tỷ lệ sống sót của tế bào trong khi sấy và bảo quản sau này. Khi bổ sung NaCl ở nồng độ thích hợp (5g/l) thì có tỷ lệ sống sót cao hơn so với khi chỉ dùng saccaroza trong môi trường nuôi cấy L. bulgaricus [1, 11]. Đa số vi khuẩn lactic cần hàng loạt vitamin như riboflavin, tiamin, axit pantotenic, axit folic, biotin, axti niotinic để sinh trưởng và phát triển [20]. Trong đó, cao nấm men chứa rất nhiều loại axit amin, nhiều nhất là các vitamin nhóm B. Vì vậy, người ta thường nuôi cấy chung trên môi trường phức tạp có chứa dịch cà chua, cao nấm men và muối khoáng. Mỗi loại lại có nhu cầu khác nhau đối với mỗi loại vitamin. Ví dụ như Lactobacillus fermenti cần khoảng 1÷5 mg/l tiamin, Lb. casei cần 0÷0,15 g/l riboflavin, trong khi Lb. plantarum cần khoảng 0÷2,5 g/l axit pantotenic và 0÷0,1g/l nicotinic, Lb. lactis cần 0÷5g vitamin B12, 0÷5 g/l tiamin Ngoài ra các hợp chất chứa axit béo có mặt trong môi trường không những tác động đến quá trình sinh trưởng của vi khuẩn mà còn đóng vai trò trong Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 23 quá trình lạnh đông sau này. Ví dụ như Tween 80 sẽ làm thay đổi một số axit béo trong tế bào vi khuẩn lactic, sự thay đổi này ảnh hưởng đến khả năng chịu lạnh và khả năng chịu muối của vi khuẩn lactic [17]. Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 24 PHẦN II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1 Nguyên vật liệu – hóa chất- thiết bị nghiên cứu. II.1.1. Đối tượng nghiên cứu Chủng giống vi khuẩn: Chủng vi khuẩn lactic thuần khiết được phân lập từ nem chua tại phòng thí nghiệm Bộ môn công nghệ các sản phẩm lên men. II.1.2. Hóa chất Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu gồm: +Các loại đường: Glucoza, Sacaroza,Việt Nam +HCl, Tween, NaOH, Trung Quốc. +Thạch,Việt Nam. + Môi trường nuôi cấy Môi trường MRS ( Deman, Rogosa, Sharpe, 1960), g/l Glucoza 20 Pepton 10 Cao thịt 8 Cao men 4 CH3COONa 2 K2HPO4 2 Amonium citrat 5 MgSO4.7H2O 0.2 MnSO4.4H2O 0.04 Tween80 1 Thạch 15 (môi trường đặc) Môi trường được thanh trùng ở 1210C trong 20 phút, pH = 6.1 - 6.5. Môi trường nuôi cấy tạo sinh khối: thành phần muối như môi trường MRS có một số thành phần chính như nguồn cacbon, nguồn nitơ được thay đổi theo yêu cầu nghiên cứu ( hàm lượng đường, nguồn Nitơ được thay thế một phần...) Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 25 - Dịch nấm men thủy phân. II.1.3. Thiết bị Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được thể hiện qua bảng 2.1. Bảng 2.1. Thiết bị STT Tên thiết bị Nhãn hiệu 1 Kính hiển vi Niko, Nhật Bản 2 Máy đo pH cầm tay Thụy Sỹ 3 Tủ ấm Liên xô 4 Máy đo OD Trung Quốc 5 Nồi hấp Sanyo, Nhật Bản 6 Máy li tâm Trung Quốc 7 Cân điện tử 2 số Đức 8 Lò vi sóng 9 Cân điện tử 3 số II.2. Phương pháp nghiên cứu II.2.1. Chuẩn bị môi trường + Dịch nấm men thủy phân: Men sữa sau khi đã được rửa sạch bằng nước vô trùng 5 0C, bổ sung enzim Neutrase 0.1% và đem thủy phân ở 50-55 0C trong 48h ( men:nước là 1:1), Sau đó dịch trong được khử trùng ở 121 0C trong 20 phút, rồi được bảo quản lạnh trước khi sử dụng, có hàm lượng nitơ tổng là 4.5 g/l II.2.2. Phương pháp vi sinh • Hoạt hóa và giữ giống: Chủng VKL phân lập từ nem chua được giữ giống trong môi trường MRS có bổ sung 25% glyxerol, bảo quản ở -200C.Khi cần hoạt hóa giống trong môi trường lỏng rồi cấy sang thạch nghiêng để chuẩn bị cho các thí nghiệm khác. Giống bảo quản ở ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 40C trong vòng 1tháng sau thời gian đó phải cấy truyền. Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 26 • Nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram Mục đích: Đánh giá chủng giống nghiên cứu là Gram(+) hay không từ đó có thể khẳng định đặc điểm của chủng giống. Tiến hành: Nhỏ một giọt khuẩn lạc lên một lá kính, dàn đều.Làm khô vết bôi bằng cách hơ qua ngọn lửa đèn cồn. Tiếp đó, nhuộm vết bôi bằng gentian tím trong 30 giây, sau đó dùng nước cất rửa thuốc nhuộm đi. Nhỏ vài giọt lugol lên phiến kính rồi giữ trong 30 giây rồi dùng cồn 96% rửa lugol trong 2 giây. Rửa sạch tiêu bản bằng nước rồi nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fushin trong 10 giây. Sau đó rửa lại bằng nước sạch, đợi tiêu bản khô rồi đem đi soi dưới kính hiển vi vât kính dầu có độ phóng đại 1000 lần, đánh giá kết quả. Nếu vi khuẩn bắt màu tím là Gram(+), bắt màu đỏ là Gram(-). • Kiểm tra khả năng di động của chủng VKL phân lập từ nem chua. Để kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn lactic, tiến hành nuôi một giọt vi khuẩn này trên môi trường thạch MRS có bổ sung vài giọt Bromocresol tía 1.6%. Nếu vi khuẩn có khả năng di động thì axit lactic sinh ra sẽ làm đổi màu môi trường từ xanh sang vàng. Nếu vi khuẩn không di động thì sự đổi màu của chỉ thị chỉ quan sát xung quanh giọt canh trường. • Xác định khả năng sinh khí của VKL phân lập từ nem chua. Nguyên tắc: Dựa vào lượng khí CO2 sinh ra dâng lên trên ống Durham đẩy dịch lỏng khỏi ống. Tiến hành: Úp ống Durham vào ống nghiệm chứa môi trường MRS lỏng, khử trùng môi trường ở 121 0C trong 20 phút. Sau đó cấy giống vi khuẩn này vào và tiến hành nuôi trong 24h ở 300C , đánh giá xem có khí sinh ra không. • Hoạt tính catalaza Nhỏ 1 giọt vi khuẩn huyền phù lên đĩa, dùng que trang dàn đều và nuôi trong tủ ấm. Khi thấy khuẩn lạc mọc thì nhỏ một giọt H2O2 3% lên khuẩn lạc. Nếu có các bọt khí xuất hiện chứng tỏ có enzym catalaza trong tế bào. • Xác định số lượng tế bào Sử dụng phương pháp Koch để xác định số lượng tế bào. Tiến hành pha loãng theo tỷ lệ thích hợp và nuôi cấy trên môi trường thạch MRS trong 24h ở 300C, bỏ ra đếm số khuẩn lạc. Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 27 II.2.3. Phương pháp hóa lý • Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kendan Trong quá trình nghiên cứu, sử dụng dịch nấm men thủy phân để thay thế nhằm giảm giá thành sản phẩm. Do đó phải xác định hàm lượng N tổng số của dịch nấm men thủy phân, từ đó tính toán được lượng dịch nấm men bổ sung khi pha môi trường. Tiến hành: -Vô cơ hóa mẫu vật nghiên cứu: Hút 3ml dịch cho vào bình Kendan khô (chú ý không để mẫu dịch dính lên thành bình). Cho thêm 10ml H2SO4 đậm đặc, đồng thời cho khoảng nửa thìa sữa chua hỗn hợp K2SO4 và CuSO4 theo tỷ lệ 3:1 vào để tăng nhiệt độ sôi. Đậy bình, lắc nhẹ rồi đặt lên bếp đun. Khi dung dịch có màu vàng sẫm thì nhấc bình ra để nguội. Thêm vài giọt H2O2 30%. Tiếp tục đốt trên bếp khoảng 30 phút nữa đến khi dung dịch trong. Sau đó đem đi cất đạm. -Cất đạm: Dùng NaOH đẩy NH3 ra khỏi sunfat amon rồi thu khí NH3 vào bình tam giác có chứa sẵn 20ml axit Boric 3% và chỉ thị Tasiro. Axit Boric tác dụng với NH3 tạo thành tetraboric amon, giữ lại được NH3 thoát ra từ bộ cất đạm . Định phân: Dùng H2SO4 0.1N để chuẩn độ từ đó xác định được lượng tetraborat amon tạo thành rồi xác định được lượng N có trong mẫu vật. Đánh giá kết quả: Hàm lượng N tổng số có trong mẫu vật tính theo công thức. ( )%100.4,1. m aN = N: Hàm lượng N tổng số tính theo % a : Số ml H2SO4 dùng để định phân . 1.42: Số mg N ứng với 1ml H2SO4 0.1N. 100: Hệ số chuyển đổi % m: Lượng mẫu (ml). Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 28 • Xác đinh hàm lượng đường khử bằng phương pháp Grassianov Mục đích: Xác định hàm lượng đường khử có trong dịch thủy phân tinh bột sắn, Maltodextrin, làm môi trường nuôi cấy và xác định hàm lượng đường sót của các mẫu sau khi lên men. Tiến hành: Hút 20ml dung dịch Ferixianua 1% và 5ml dung dịch KOH 2.5N vào bình tam giác 250ml, sau đó nhỏ thêm vài giọt chỉ thị xanhmetylen ( nếu nồng độ dịch đường thấp hơn 0.25% thì lấy 10ml dung dịch Ferixianua 1% và 2.5ml dung dịch KOH 2.5N ).Lắc nhẹ và đặt bình lên bếp điện đun sao cho 1- 2 phút thì sôi. Tiếp đó dùng dung dịch đường đã xử lý và pha loãng để chuẩn tới mất màu của xanhmetylen.màu của hỗn hợp phản ứng sẽ thay đổi từ xanh sang phớt hồng và cuối cùng là vàng da cam thì kết thúc. Nếu để nguội màu của hỗn hợp sẽ trở lại tím hồng do bị oxy hóa.. Hàm lượng đường trong dịch pha loãng tính theo công thức: ( )lg V aD /1000.= D: hàm lượng đường có trong mẫu (g/l) a: Hàm lượng Glucoza tương ứng với 20ml(10ml) Ferixyanua 1% V: Số ml dịch đường tiêu hao khi chuẩn 20ml (10ml) Ferixyanua 1% • Xác định hàm lượng axit tổng số bằng phương pháp chuẩn độ Mục đích: Xác định hàm lượng axit tổng số của các mẫu nghiên cứu sau khi lên men, và xác định độ chua của sữa chua. Tiến hành: Dùng NaOH 0.1 N để chuẩn độ với chỉ thị phenolphtalein để xác định lượng axit tạo thành trong dịch nuôi cấy. Kết quả ( )lg V NVMHLaxit /.. 2 12= M2: Khối lượng phân tử của loại axit chính trong mẫu ( M2 = 90.08 là khối lượng của phân tử axit lactic) V1: Thể tích NaOH được chuẩn (ml) V2 : Thể tích mẫu (ml) (5ml) Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 29 N : Nồng độ NaOH chuẩn. Độ Thorner ( 0T) là độ axit chung biểu thị số ml NaOH 0.1 N đã dùng để trung hòa axit tự do có trong 100ml sữa. 1ml NaOH ứng với 10T • Xác định đường cong sinh trưởng của chủng Vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua theo mật độ quang OD620nm Có thể đánh giá tốc độ phát triển của vi khuẩn bằng cách đo sự tăng sinh khối thông qua giá trị OD(Optical Density). Các thí nghiệm được đo ỏ bước sóng 620 nm. • Xác định lượng sinh khối a ) Định lượng bằng cách ly tâm và xác định trọng lượng Mục đích: Ly tâm nhằm xác định lượng sinh khối của vi khuẩn sau khi nuôi cấy, tách sinh khối vi khuẩn khỏi môi trường để dễ dàng định lượng sinh khối tạo thành. Tiến hành: Cho 30ml dịch nuôi cấy vi khuẩn vào ống Falcon, ly tâm ở 7000 vòng trong 10 phút, rồi đem cân để suy ra hàm lượng sinh khối trong 1 lit môi trường. b) Định lượng sinh khối vi khuẩn bằng phương pháp mật độ quang. Mục đích: Sử dụng phương pháp đo OD của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic từ đó xác định được khối lượng sinh khối tạo thành. Cơ sở của phương pháp dựa vào sự phụ thuộc tuyến tính của OD giữa canh trường nuôi cấy vi khuẩn và khối lượng tế bào có trong canh trường đó khi ở một giới hạn nồng độ xác định. Tiến hành: Xây dựng đường chuẩn sinh khối trước. Mẫu canh trường cần xác định được ly tâm ở 7000 vòng trong 10 phút. Cân lượng sinh khối thu được rồi đem pha loãng với nước cất đến các nồng đô. 1/2, 1/3,1/4, 1/6, 1/8, 1/10 ... Sau đó đo OD của dung dịch sau pha loãng. Vẽ đường chuẩn sinh khối biểu diễn mối quan hệ giữa OD và lượng sinh khối sau pha loãng. Sử dụng đường chuẩn cho các tính toán sau này. Đo OD ở bước sóng 620 nm. Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 30 • Xác định độ ẩm sinh khối theo phương pháp sấy Nguyên tắc: Sinh khối vi khuẩn được sấy đến khối lượng không đổi. Căn cứ vào khối lượng sinh khối trước và sau khi sấy, tính được hàm lượng nước trong nguyên liệu. Tiến hành: Lấy một chén nhôm đem sấy ở 1050C đến trọng lượng không đổi, đặt chén trong bình hút ẩm đến khi nguội và cân chén chính xác đến 0.001g. Sau đó cho vào chén 3g mẫu, sấy ở 1050C trong 3 tiếng, sau đó lấy ra cho vào bình hút ẩm đến khi nguội bỏ ra cân, rồi lại đặt vào tủ sấy sấy tiếp trong 1 tiếng rồi đặt vào bình hút ẩm đến khi nguội và cân. Đến khi sai số giữa hai lần cân không quá0.001g thì quá trình sấy kết thúc. Kết quả: m1 – m2 X = m1 x 100 (%) X: Độ ẩm (%). m1: Khối lượng mẫu trước sấy (g). m2: Khối lượng mẫu sau sấy (g). • Một số công thức tính - Hiệu suất thu hồi sinh khối ( )lg H HHSSK /100. 2 1= H1: Hàm lượng sinh khối thực tế khô (g) H2: Hàm lượng sinh khối lý thuyết khô (g) - Tổn thất đường trong quá trình nghiên cứu ( ) %100. 1 4321 D DDDDT ++−= T: Tổn thất (%) D1: Hàm lượng đường tổng (g) Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 31 D2: Hàm lượng đường tạo sinh khối (g) D3: Hàm lượng đường sinh axit (g) D4: Hàm lượng đường sót (g) - Hiệu suất lên men HL axit thực tế HSLM = HL axit lý thuyết x 100 % - Hiệu suất chung HL đường đưa vào – HL đường sót HS chung = HL đường đưa vào x 100 % Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 32 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN III.1. Kiểm tra các đặc tính của chủng VKL phân lập từ nem chua. III.1.1. Đặc điểm hình thái: Để kiểm tra hình thái của chủng VKL, tiến hành quan sát khuẩn lạc đã nuôi trên môi trường MRS đặc ở 30oC sau 24h. Kiểm tra hình dạng của tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram, đồng thời kiểm tra xem chủng có khả năng tạo catalaza dựa trên khả năng phân hủy peroxit H2O2 3%, và khả năng di động. Hình 3.1: Hình dáng khuẩn lạc Hình 3.2: Hình ảnh nhuộm Gram Kết quả cho thấy chủng VKL phân lập từ nem chua có khuẩn lạc hình tròn, trắng bóng, mép phẳng (hình 3.1), tế bào hình que, đường kính khoảng 1µm, chiều dài 3÷71µm, mọc riêng rẽ thành đôi, là vi khuẩn Gram (+) (hình 3.2), Không tạo catalaza nên không quan sát thấy bọt khí nổi lên khi nhỏ dung dịch H2O2 3% lên trên. III.1.2. Kiểm tra khả năng sinh khí của chủng Để kiểm tra khả năng sinh CO2 của chủng VKL phân lập từ nem chua, chúng được nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng có chứa ống Durham ở nhiệt độ 30oC trong vòng 24h, kết quả cho thấy chúng không sinh khí trong ống Durham. điều này rất phù hợp với tính chất đặc trưng của sản phẩm nem chua bởi trong quá trình lên men nem chua nếu chủng có sinh khí sẽ gây hiện tượng nhớt sản phẩm và ảnh hưởng đến tính chất cảm quan của sản phẩm. Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 33 III.2. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng tới quá trình tạo sinh khối của chủng VKL phân lập từ nem chua. Đã có rất nhiều nghên cứu các điều kiện ảnh hưởng tới quá trình tạo sinh khối của chủng vi khuẩn lactic phân lập từ sữa sau đó làm chủng khởi động bổ sung vào trong quá trình làm sữa chua hoặc làm thực phẩm chức năng. Song để góp phần tạo một nguồn sinh khối với khối lượng lớn và có thể sản xuất với quy mô công nghiệp mà vẫn giữ được các đặc tính của chủng vi khuân lactic chúng tôi tiến hành nghiên cứu với chủng là vi khuân lactic phân lập từ nem chua và tiến hành nghiên cứu trên các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp như sau ( nhiệt độ, tỷ lệ tiếp giống, chế độ thông khí, thay thế Glucoza bằng Saccaroza, Thay thế nguồn Nitơ bằng DTPNM ) Nhìn vào đồ thị tốc độ sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua ta nhận thấy sinh khối đạt cực đại trong khoảng 16÷18h tức đầu pha cân bằng. Ở đầu pha cân bằng tế bào ở trạng thái trẻ, khoẻ, phát triển tốt, lượng sinh khối thu được ở đầu pha này thu hồi và sấy làm chế phẩm sẽ rất phù hợp vì ở đầu pha này ngoài những ưu điểm đã nói trên còn có ưu điểm nữa đó là thành tế bào cứngnên khi sấy sẽ không làm tổn thương đến tế bào vi sinh vật nên tỷ lệ sống sót cao hơn Tốc độ sinh trưởng của Vi khuẩn Lactic phân lập từ nem chua. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 5 10 15 20 25 30 Thời gian(h) Si nh k hố i(g /l) Sinh khối(g/l) Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 34 III.2.1. Lựa chọn các điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy chủng VKL phân lập từ nem chua. III.2.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ. Chủng vi khuẩn lactic có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ 15÷45oC. Xuất phát từ điều kiện thực tế, để nuôi cấy với quy mô công nghiệp, phù hợp với điều kiện khí hậu của Việt Nam nên chúng tôi tiến hành kiểm tra ở 30 và 37oC trên môi trường MRS thu được kết quả như sau: Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua Mật độ OD620 Tế bào sống CFU/mL Thời gian 30oC 37oC 30oC 37oC 0 0,076 0,110 3,55.106 4,55.106 3 0,4 0,803 6 3,64 2,795 2,81.108 3,2.108 9 4,18 3,75 12 4,98 4,78 5,9.109 3,12.108 15 5,54 5,1 18 6,13 5,37 7,52.109 2,51.109 21 6,17 5,64 24 6,23 5,72 4,6.109 1.3.109 30 6,28 5,77 36 6,31 5,81 42 6,33 5,83 Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 35 Đồ thị 3.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ theo thời gian củavi khuẩn lactic phân lập từ nem chua Nhìn vào bảng 3.1 và đồ thị 3.1 ta nhận thấy trong 3 giờ đầu của quá trình sinh truởng và phát triển thì mật độ tế bào ở 37oC có giá trị lớn hơn ở 30oC nhưng sự lớn hơn này không được duy trì sau 6 giờ tiếp theo,điều này chứng tỏ khả năng thích nghi với môi trường ở nhiệt độ 30oC và bắt đầu có sự phát triển. Sau 6 giờ tiếp theo mật độ tế bào ở 30oC lớn hơn điều đó được thể hiện ở giá trị OD và tế bào sống, ở 30oC tế bào sống đạt đến giá trị 109 CFU/mL nhanh hơn và lớn hơn trong các khoảng thời gian tiếp theo. Ở 12h tiếp theo thì mật độ tế bào tăng lên rõ rệt và ở cả 2 nhiệt độ giá trị đều đạt gần đến giá trị cực đại và phát triển ở mức cao trong các khoảng thời gian sau đó. Song ở 30oC các giá trị đều cao hơn ở 37oC. Điều này chứng tỏ ở 30oC chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua sinh trưởng và phát triển tốt hơn ở 37oC. Các nghiên cứu tiếp theo sẽ nuôi cấy ở 30oC. 0 1 2 3 4 5 6 7 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Thời gian (h) O D 62 0 OD(30oC) OD(37oC) Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 36 III.2.1.2. Ảnh hưởng của độ thông khí Đồ thị 3.2: Ảnh hưởng của độ thông khí Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật đó là oxy. Vi sinh vật sử dụng Oxy trong môi trường lỏng. trong nhiều nghiên cứu đã được chứng minh rằng trong quá trình tạo sinh khối thì thông khí ảnh hưởng đáng kế đến hàm lượng và hiệu suất tạo sinh khối. Tuy nhiên lượng Oxy hoà tan vào trong nước thường rất ít do đó trong quá trình nuôi cấy cần phải kiểm tra khả năng sử dụng Oxy để từ đó cung cấp lượng Oxy cho phù hợp sao cho tốc độ hoà tan nó bằng tốc độ tiêu thụ của vi sinh vật. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của độ thông khí ở 30oC ở các trạng thái tĩnh, lắc ở tốc độ khác nhau ( Đồ thị 3.2). Nhìn vào đồ thị ta nhận thấy trong quá trình tạo sinh khối thì cần có chế độ thông khí vì ở chế độ tĩnh lượng sinh khối tạo thành thấp hơn so với ở trạng thái nuôi có lắc. Tĩnh lượng sinh khối thu được sau 20h nuôi cấy là 19,4 g/l còn ở chế độ nuôi động thì các giá trị chênh lệch nhau rõ rệt ở chế độ lắc 100 v/p lượng sinh khối thu được sau 20h là 23,1 g/l, ở lắc 150v/p lượng sinh khối thu được là 26,2 g/l, khuấy từ ở mức 3 lượng sinh khối thu được sau 20h nuôi cấy là 22,8 g/l. Các kết quả này chứng tỏ VKL phân lập từ nem chua là loại yếm khí tuỳ tiện nên trong quá trình nuôi cấy để tạo sinh khối phải được thông khí và nhận thấy với 19.4 23.1 26.2 23.5 48.5 57.7 65.5 58.7 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Tỉnh Lắc 100v/p lắc 150v/p Khuấy từ mức 3 Các chế độ nuôi cấy Si nh k hố i ( g/ l), H ST SK (% ) HSTSK(%) Sinh khối(g/l) Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 37 tốc độ lắc 150v/p thì sinh khối tạo thành nhiều nhất. Các thí nghiệm tiếp theo sẽ nuôi cấy với trạng thái động ( lắc 150v/p). III.2.1.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống Tỷ lệ tiếp giống cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến thời gian nuôi cấy đặc biệt là với quy mô công nghiệp thì yếu tố này ảnh hưởng đáng kể giá trị kinh tế. Nếu tỷ lệ tiếp giống quá nhiều dẫn đến nguồn thức ăn trong môi trường nuôi cấy nhanh cạn kiệt dẫn đến quá trình nuôi cấy sẽ kết thúc nhanh và lượng sinh khối tạo thành ít. Ngược lại với tỷ lệ tiếp giống quá ít sẽ kéo dài thời gian nuôi cấy, kéo theo rất nhiều chi phí sau đó, mặt khác nếu nuôi cấy trong thời gian dài thì quá trình nuôi cấy rất dễ nhiểm các vi sinh vật khác. Qua tìm hiểu của các nghiên cứu khác chúng tôi được biết lượng vi khuẩn lactic trong nem chua sau 24h nuôi cấy đạt được 105 CFU/mL. Xuất phát từ các yếu tố trên chúng tôi tiến hành nuôi cấy ở các tỷ lệ như sau: 105 FU/mL106 CFU/mL, 107 CFU/mL. Đồ thị 3.3: Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giốngtheo thời gian nuôi cấy 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 Thời gian (h) Si nh k hố i ( g/ l) 10^5CFU/mL 10^6CFU/mL 10^7CFU/mL Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 38 Đồ thị 3.4: Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống Kết quả thu được thể hiện ở đồ thị 3.3 và đồ thị 3.4 Từ đồ thị ta thấy tỷ lệ tiếp giống ảnh hưởng nhiều đến thời gian tạo sinh khối nhưng ảnh hưởng không đáng kể đến khối lượng sinh khối tạo thành, ở thời gian đầu do lượng giống đưa vào không phải là mức cực đại vì ở chủng này tế bào sống trong 24 giờ ở mức độ là 109 CFU/mL, nên khi cho các tỷ lệ tiếp giống 105,106, 107 CFU/mL thì ở pha thích nghi sẽ kéo dài hơn và ở pha này 107 là phát triển nhất, nhưng khi đã thích nghi với môi trường nuôi cấy thì 106CFU/mL có xu hướng đạt giá trị cực đại nhanh hơn 107CFU/mL còn ở tỷ lệ tiếp giống 105 CFU/mL thì chậm hơn. Qua đồ thị và qua bảng các chỉ tiêu khi lựa chọn chế độ tiếp giống chúng tôi nhận thấy để phù hợp với điều kiện kinh tế và nhằm sản xuất với quy mô lớn nên tỷ lệ tiếp giống 106 CFU/mL được lựa chọn. Mặt khác ở tỷ lệ tiếp giống 106 CFU/mL số lượng tế bào sau 24h nuôi cấy cũng phát triển rất tốt (2.3.109 CFU/mL) và lượng đường sót cũng thấp hơn so với tỷ lệ tiếp giống là 105 và 107 CFU/mL.Vì vậy tỷ lệ 106 CFU/mL được lựa chọn với các thí nghiệm tiếp theo. 15.7 19.3 18.2 39.2 48.2 45.5 33.5 39.5 31 0 20 40 60 80 100 120 140 Sinh khôí(g/l) HSTSK(%) HSLM(%) 10^5 10^6 10^7 Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 39 III.2.2. Lựa chọn nguồn dinh dưỡng thích hợp cho quá trình phát triển của chủng VKL phân lập từ nem chua III.2.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon Theo kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy các chủng vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại đường khác nhau, nhằm phù hợp với việc sản xuất với quy mô công nghiệp thì trong các nghiên cứu trước đây thì saccaroza là loại đường được sử dụng nhằm thay thế nguồn cacbon trong môi trường MRS. Mặt khác đường Saccaroza là nguồn đường thích hợp cho vi khuẩn sinh axit, là loại đường dễ kiếm và giá thành không cao nên phù hợp để lựa chọn.Trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát hàm lượng Saccaroza từ 20g/l, 40g/l, 60g/l và 80g/l sau đó lựa chọn hàm lượng phù hợp. Kết quả được thểm hiện ở đồ thị 3.4 Bảng 3.2: Lựa chọn hàm lượng đường Saccaroza thích hợp đến quá trình sinh trưởng và phát triển của VKL phân lập từ nem chua Hàm lượng đường Saccaroza(g/l) Chỉ tiêu MRS 20 40 60 80 Tế bào sống CFU/mL 4.1.109 9.3.107 3.5.109 2.7.109 2.1.109 Sinh khối(g/l) 18,6 14,9 33 29,5 24 HSTSK(%) 46,5 37,2 41,3 24,5 15 Đường sót(g/l) 1,5 2 2,7 11,9 26,9 Hàm lượng axit(g/l) 8,3 6,8 14,1 18,7 25,6 HSLM(%) 41,5 34,2 35,3 31,2 32 Tổn thất(%) 4,5 18,6 16,7 24,5 19,4 Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 40 Từ bảng 3.2 ta nhận thấy rằng hàm lượng đường càng cao thì lượng sinh khối tạo thành càng nhiều song HSTSK lại giảm. Điều này được lý giải như sau: Nếu hàm lượng đường tăng mà với một tỷ lệ tiếp giống không đổi gây nên hiệu ứng thừa cơ chất dẫn đến HSTHSK giảm. Mặt khác với hàm lượng đường nhiều sẽ gây ra hiện tượng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào vi khuẩn.Mặt khác ở nồng độ 40g/l lượng sinh khối thu được khá lớn và HSTSK cao hơn so với các nồng độ đường 20, 60, 80g/l. Vì vậy qua việc tính toán và cân nhắc về hàm lượng sinh khối, HSTSK, lượng đường sót, tổn thất Chúng tôi quyết định chọn hàm lượng đường 40g/l đưa vào nuôi cấy III.2.2.1. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ Bảng 3.3: Các axit amin trong dịch nấm men thủy phân [4] STT Tên axit amin Tỷ lệ % 1 Aspartic 9.9 2 Glutamic 11.7 3 Xerin 4.9 4 Histidin 1.3 5 Glyxin 8.9 6 Threonin 5.3 7 Alanin 4.7 8 Arginin 11.4 9 Tyrosin 3.5 10 Valin 6.4 11 Methionin 1.8 12 Phenylalanin 4.3 13 Isoleuxin 5.6 14 Leuxin 7.6 15 Lysin 8 16 Prolin 4.7 Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 41 Trong nghiên cứu này mục tiêu của chúng tôi luôn luôn đề cập đến đó là phải lựa chọn nguồn nguyên liệu thích hợp nhằm giảm giá thành sản phẩm. Trong môi trường MRS (môi trường nuôi vi khuẩn lactic) phải sử dụng một số nguồn Nitơ đặc biệt và khá đặt tiền như pepton, cao thịt, cao men. Vì vậy xu hướng sử dụng các nguồn nitơ thay thế để áp dụng trong quy mô công nghiệp nhằm giảm giá thành sản phẩm là một nhu cầu cần thiết. Đó là nguồn nitơ rẻ tiền, dễ kiếm, dễ sử dụng mà vẫn đảm bảo đủ hàm lượng và các loại axit amin cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Có rất nhiều nguồn nitơ thay thế khác nhau như dịch thủy phân từ tôm, cá, sữa đậu nành, dịch nấm men thủy phân...Trong đó dịch nấm men thủy phân dễ kiếm và dễ làm với số lượng lớn. Hơn nữa trong dịch còn chứa nhiều axit amin (16 loại với 8 axit amin không thay thế), đồng thời còn có cả một số chất kích thích sinh trưởng và một số vitamin cần thiết. Vì vậy chúng tôi quyết định chọn dịch nấm men thủy phân làm nguồn nitơ thay thế. Chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua được nuôi với các tỷ lệ dịch nấm men thủy phân khác nhau và đảm bảo đúng hàm lượng nitơ tổng có trong môi trường MRS là 2,5g/l ( theo chỉ tiêu của hãng Merck, Germany), trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua trên các hàm lượng dịch nấm men thủy phân trong 24 giờ ở 300C thông qua hàm lượng sinh khối. Kết quả thu được ở đồ thị 3.5 và bảng 3.4 Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 42 Đồ thị 3.5: Ảnh hưởng của DTPNM 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 5 10 15 20 25 30 Thời gian(h) Si nh k hố i(g /l) MRS 50%DTPSM 75%DTPSM 100%DTPSM Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 43 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của DTPNM Tỷ lệ sử dụng nguồn Nitơ từ dịch thuỷ phân nấm men(%) Chỉ tiêu MRS 50 75 100 Sinh khối(g/l) 17.68 15 12.5 8,5 HSTSK(%) 44,2 37,5 31,2 21,2 Đường sót(g/l) 1,5 4,5 4,4 4,1 Hàm lượng axít(g/l) 8,7 5.8 6.3 7.1 HSLM(%) 43,5 29 31.5 35.5 Tổn thất(%) 11,3 11 15,3 44 Từ đồ thị cho thấy với tỷ lệ dịch thuỷ phân sữa men khác nhau thì lượng sinh khối cực đại sau 16 ÷ 18h nuôi cấy và kết quả được thể hiện ở đồ thị 3.5 và bảng 3.4 Khi thay thế DTPNM càng nhiều thì lượng sinh khối càng giảm. Điều này được giải thích như sau: Mặc dù DTPNM có hàm lượng Nitơ tổng khá cao song hàm lượng Nitơ amin lại không đáp ứng nhu cầu bởi trong quá trình thuỷ phân có thể do điều kiện nên ta thuỷ phân chưa triệt để dẫn đến lượng Nitơ amin không đủ cho sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn lactic. Nhưng để sản xuất một lượng sinh khối lớn nhằm đáp ứng nhu cầu công nghiệp, chúng tôi quyết định chọn DTPNM làm nguồn thay thế Nitơ trong môi trường MRS. Với hàm lượng khảo sát là 50%, 75%, 100% DTPNM. So với môi trường không thay thế ( MRS sinh khối tạo thành sau 24h nuôi cấy là 17,68 g/l) lượng sinh khối tạo thành lần lượt là 15g/l, 12,5g/l, 8,5g/l. Ta nhận thấy lượng sinh khối ở thay thế 50% DTPNM không thấp hơn so với không thay thế, và HSTSK lớn hơn so với tỷ lệ thay thế 75% và 100%. Vì vậy hàm lượng 50% DTPNM được lựa chọn thay thế thành phân Nitơ trong môi trường MRS ở trong các thí nghiệm tiếp theo Sau khi quyết định lựa chọn nguồn cacbon thay thế là 40g/l Saccaroza và 50% dịch thuỷ phân sữa men chúng tôi tiến hành kết hợp và nuôi cấy. Kết quả thu được ở bảng 3.4 Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 44 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của 50% DTPNM và hàm lượng Saccaroza đến sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua. Thay thế 50% DTPNM và các hàm lượng Saccaroza khác nhau Chỉ tiêu MRS(40g Glucoza) 50%DTPN M+20gGlu+ 20gSac 50%DTPNM +10gGlu+30g Sac 50%DTPNM +40gSac Tế bào sống(CFU/mL) 3.2.1010 1.2.109 1.4.109 1.8.109 Sinh khối(g/l) 37,5 36 32,5 37 HSTSK(%) 46,9 45 40,2 46,2 Đường sót(g/l) 3,2 4,3 4,4 4,9 Hàm lượng axít(g/l) 14,2 13,3 12,4 12,9 HSLM(%) 35,6 33,3 31,1 32,5 Tổn thất(%) 9,5 11 17,7 10,3 Từ bảng 3.5 ta nhận thấy sau 24h nuôi cấy thì tế bào sống ở các tỷ lệ thay thế đều đạt ở mức cực đại và lượng sinh khối tạo thành ở 50% DTPNM với 40g Saccaroza tương đương với môi trường MRS.Điều này chứng tỏ việc thay thế 50% DTPNM cộng 40g Saccaroza là phù hợp với các kết quả đã nghiên cứu.Vậy tỷ lệ thay thế 50% DTPSM và 100% Saccaroza được chọn làm môi trường thay thế mới chovi khuẩn lactic phân lập từ nem chua. Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 45 III.2.3: Động học của quá trình sinh trưởng và phát triển của VKL phân lập từ nem chua. Sau khi đã tìm được điều kiên nuôi cấy thích hợp đó là nhiệt độ nuôi cấy ở 30oC, nuôi cấy động (lắc với 150v/p) tỷ lệ tiếp giống là 106 CFU/mL, thay thế 50% DTPSM và hàm lượng đường cho vào nuôi cấy là 40g/l chúng tôi nuôi cấy chủng VKL trong 26h ở 30oC thu được kết qủa như đồ thị 3.8 Đồ thị 3.8: Động học quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn lacticphân lập từ nem chua khi thay thế môi trường mới. Nhìn vào đồ thị ta nhận thấy trong quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua thì hàm lượng đường giảm trong 24h nuôi cấy, hàm lượng axit tăng, điều này phù hợp với quá trình tạo sinh khối. Lượng sinh khối phát triển trong khoảng 16÷18h nuôi cấy. Điều này khẳng định chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua sinh trưởng và phát triển tốt phù hợp với điều kiện và môi trường mới. Động học quá trình tạo sinh khối của VKL. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 5 10 15 20 25 30 Thời gian(h) H àm lư ợn g (g /l) Hàm lượng sinh khối (g/l) Hàm lượng axit(g/l) Hàm lượng đường sót(g/l) Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 46 Bảng 3.6: Các chỉ tiêu đạt được ở môi trường thay thế Các chỉ tiêu Môi trường mới (50% DTPNM+40g Saccaroza) Sinh khối (g/l) 38,7 HSTSK (%) 48,4 HSLM (%) 34 Tổn thất (%) 10,9 Từ bảng 3.6 ta nhậ thấy khi thay thế môi trường mới lượng sinh khối đạt được khá cao và hàm lượng đường tạo sinh khối khá triệt để, HSLM tăng trong quá trình tạo sinh khối.Điều này chứng tỏ đã chọn được môi trường nuôi cấy phù hợp với chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua. Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Sau quá trình làm thí nghiệm chúng tôi đã thu được các kết quả như sau: 1. Chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua có hinh que, mang đầy đủ tính chất của vi khuẩn lactic (vi khuẩn Gram (+), không di động, không tạo bào tử, không tạo catalaza) không sinh khí trong quá trinh lên men. 2. Chọn được điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy: Nhiệt độ tối ưu 30oC, nuôi cấy động (lắc 150v/p), tỷ lệ tiếp giống 106CFU/mL 3. Chọn được môi trường nuôi cấy thích hợp: Thay thế 50% dịch thuỷ phân nấm men làm nguồn Nitơ,đường Saccaroza là 40g/l, các thành phần còn lại giống môi trường MRS. KIẾN NGHỊ: Cần nghiên cứu thêm về việc chọn môi trường thay thế nhằm nâng cao hiệu suất tạo sinh khối của chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua. để có thể sản xuất với quy mô công nghiệp.