Đề tài Nghiên cứu các điều kiện tối ưu của quá trình tạo sinh khối vi khuẩn lactic

ệu thành hạt nhỏ nên bề mặt tiếp xúc giữa vật liệu và môi chất sấy rất lớn nên cường độ sấy cao, thời gian sấy ngắn (vài giây đến vai chục giây). Sấy phun gồm có 4 giai đoạn: phun vật liệu thành bụi, quá trình tiếp xúc giữa bụi và không khí nóng, quá trình bay hơi ẩm, quá trình tách sản phẩm ra khỏi không khí. Các giai đoạn được trình bầy như sau: Giai đoạn 1: Phun vật liệu thành bụi à à M 1 2 3 S 1.Thiếu cơ chất 2.Không thiếu cơ chất 3.ức chế thừa cơ chất Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 14 Cường độ quá trình sấy phun tỷ kệ thuận với độ phân tán của vật liệu sấyđược phun thành bụi. Ta có thể dùng một trong ba phương pháp sau để phun chất lỏng thành bụi: ly tâm với tốc độ 2000 – 5000 v/p, dùng vòi phun trong đó chất lỏng được đẩy bằng bơm có áp suất 200 at, dùng khí nén đẩy chất lỏng với áp suất 2,5 – 5 at. Thiết bị sấy trong đề tài này sử dụng cách thứ 3 theo cách này thì ta dùng không khí để phun dung dịch. Trước hết không khí qua ống phun tăng tốc rồi phun ra miêng phun, dùng bơm đưa dung dịch đến miệng vòi, không khí có tốc độ cao sẽ thổi dung dịch văng ra thành hạt nhỏ. Tốc độ khí ra khỏi ống phun phụ thuộc vào tỷ số áp suăt trước và sau ống phun. Giai đoạn 2: Sự tiếp xúc giữa bụi và không khí Sự tiếp xúc giữa bụi và không khí phụ thuộc vào vị trí tương đối giữa vòi phun và đường không khí vào. Trong thiết bị sấy của chúng tôi, bụi được phun trực tiếp vào không khí nóng trong buồng sấy. Đây chính là cách hay sử dụng nhất đặc biệt đối với vật liệu nhậy cảm như vi khuẩn vì sự bay hơi nhanh, thời gian bay hơi ngắn, tránh được sự phá huỷ bởi nhiệt độ. Giai đoạn 3: Sự bay hưoi ẩm Sự bay hơi ẩm gồm hai giai đoạn: ở giai đoạn đầu khi lượng ẩm trong vật liệu nhiều, lượng ẩm khuyếch tán từ trong vật liệu ra đến bề mặt lớn hơn lượng ẩm bốc hơi thì vận tốc bay hơi ẩm là không đổi. ở giai đoạc thứ hai, khi lượng ẩm đến một giá trị giới hạn nào đó, lượng ẩm khuyếch tán nhỏ hơn lượng ẩm bay hơi, thì tốc độ bay hơi giảm. Giai đoạn 4: Tách sản phẩm khô ra khỏi không khí Toàn bộ hỗn hợp sinh khối khô và không khí được hút sang thiết bị tách cyclon. Trong thiết bị này, dưới tác dụng của lực ly tâm, sinh khối khô lắng xuống dưới còn không khí đựơc bơm hút ra ngoài ở phía trên. 1.3.2. Phương pháp đông khô Đông khô cũng là một trong những phương pháp tách ẩm ra khỏi vật liệu để bảo quản tốt vi khuẩn. Thực chất đây là một phương pháp sấy đặc biệt, sấy thăng hoa, ẩm từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi không thông qua trạng thái lỏng. Vật liệu được sấy ở môi trường chân không cao < 456mHg nhiệt độ sấy có thể đạt đạt đến –150C, nên ngăn chặn các nguy cơ phá huỷ bởi nhiệt độ, các phân tử hợp lại với nhau khi cô đặc, không sảy ra quá trình vi sinh. Trước khi tiến hành sấy, vật liệu được làm lạnh đông sâu nhanh nhằm biến đổi toàn bộ nước có trong vật liệu trong trạng thái rắn, các cấu tử hoà tan được cố định tránh trường hợp các cấu tử này được tập hợp với nhau. Khi sấy ở áp suất rất thấp nước sẽ bay hơi, hơi ẩm thoát sang thiết bị ngưng tụ và ngưng tụ thành nước đá. Thiết bị ngưng tụ này được làm lạnh bằng hơi nước muối có nhiệt độ vào là -100C và ra là 400C. Trong quá trình làm lạnh sâu có Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 15 thể vi sinh vật bị chết. Để khắc phục ta phải tiến hành nhũ hoá_keo bảo vệ hỗn dịch như: Sữa, huyết thanh, lòng trắng trứng, peptôn, muxin hay các loại đường. Thật vậy trong quá trình làm đông khô một số lớn vi sinh vật bị chết, tỷ lệ của những vi sinh vật sống sót còn 5% - 30%. Khi cho nước vô khuẩn vào phẩm vật đã đông khô, thì phục hồi được môi trường chứa vi sinh vật, giữ nguyên vẹn được toàn bộ khả năng phát triển và đặc tính trao đổi chất của vi sinh vật. Các chất độn trước khi làm đông khô cần phải có những yêu cầu sau: Đảm bảo cho môi trường giống sau khi đông khô là một khối đặc có chất bảo vệ giống cho khỏi bị khô quá mức có chất trung hoà nhóm cacbonyl Chủng làm đông khô là các chủng trưởng thành nhưng không già. Tốc độ làm lạnh lúc đầu (từ -100C tới -200C) khoảng 1 – 30 C/phút sau đó có thể nâng lên 100C/phút hoặc lớn hơn. Khi làm khô lúc đầu giữ nhiệt độ vật liệu không quá -230C đến –250C và cuối cùng không cao hơn –300C đến –450C. Không để làm tan băng trong khi đông khô. Phương pháp này có ưu điểm hơn hẳn so với các phương pháp sấy khác là tránh được sự phân chia tế bào, khả năng sống sót cao nhưng chi phí lại rất cao, thời gian sấy kéo dài. Do đó, không nên áp dụng phương pháp này trong sản xuất chế phẩm vi khuẩn với quy mô lớn. 1.3.3. Phương pháp sấy chân không Nhiệt độ sôi và áp suất hơi bão hoà là hai thông số phụ thuộc vào nhau, áp suất giảm thì nhiệt độ sôi cũng giảm và ngược lại. Dựa trên quy tắc này, phương pháp sấy chân không được áp dụng để sấy các vật liệu dễ bị biến đổi ở nhiệt độ cao. Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 16 Phần II Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên liệu, hoá chất và thiết bị 2.1.1. Nguyên liệu - Chủng giống vi khuẩn: sử dụng 4 chủng vi khuẩn lactic của Bộ môn Công nghệ các sản phẩm lên men với các kí hiệu sau: +VTP : Lactococcus lactis dùng để sản xuất axit lactic +SD16 : Lactococcus lactis sử dụng trong lên men sữa chua +Lc.340 : Lactococcus lactis sử dụng trong sản xuất sữa chua của Pháp +TL6 : Lactococcus lactis ứng dụng trong lên men rau quả - Sữa men của các xưởng sản xuất bia tại Hà Nội. - Enzym Neutrase 2.1.2. Hoá chất Tên Nguồn gốc Glucoza, saccaroza Pháp Cao thịt Pháp Cao nấm men Pháp CH3COONa Nga Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 17 K2HPO4 Trung Quốc Amoni xitrat Slovaki MgSO4.7H2O Hungari MnSO4.4H2O Trung Quốc Tween 80 Đức Bromocresol tía Trung Quốc Kali xitrat Trung Quốc Na2HPO4 Trung Quốc KNO3 Trung Quốc 2.1.3. Thiết bị Tên Nhãn hiệu Kính hiển vi OLYMPUS Model CHD, Japon Máy đo pH (744 pH Meter) METROHM, Suisse Máy đo OD 6300 JENWAY, Grande-Bretagne Nồi hấp 3850M TUTTNAUER, Allemagne Máy ly tâm Beckman ALLEGRA, Allemagne 2.1.4. Môi trường nuôi cấy Môi trường giữ giống : Môi trường MRS (Deman, Rogosa, Sharpe, 1960), g/l : Glucoza 20 ; Pepton 10 ; Cao nấm men 8 ; Cao thịt 10 ; CH3COONa 2 ; K2HPO4 2 ; (NH4)2CO3 2 ; MgSO4.7H2O 0,2 ; MnSO4.4H2O 0,04 ; Thạch 14 ; Tween 80 1ml ; Nước 1000ml. Thanh trùng ở 1210C trong 40 phút, pH = 6 - 6,2. Môi trường nhân giống : Glucoza 20 ; Pepton 10 ; Cao nấm men 8 ; Cao thịt 10 ; CH3COONa 2 ; K2HPO4 2 ; (NH4)2CO3 2 ; MgSO4.7H2O 0,2 ; MnSO4.4H2O 0,04 ; Tween 80 1ml ; Nước 1000ml. Thanh trùng ở 1210C trong 40 phút, pH = 6 - 6,2. Môi trường nuôi sinh khối : Glucoza 20 ; Cao men 6.4 ; Dung dịch nấm men thuỷ phân 20ml; CH3COONa 2 ; K2HPO4 2 ; (NH4)2CO3 2 ; MgSO4.7H2O 0,2 ; MnSO4.4H2O 0,04 ; Tween 80 1ml ; Nước 1000ml. Thanh trùng ở 1210C trong 40 phút, pH = 6 - 6,2. Chuẩn bị dịch nấm men thuỷ phân : Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 18 Sau khi rửa, men sữa được thuỷ phân trong 12h có bổ sung enzim Neutrase (0,05%) ở 52oC. Dịch thu được đem đi lọc ở 5 oC và được bảo quản lạnh trước khi sử dụng. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp vi sinh 1/ Hoạt hoá Quá trình hoạt hoá 4 chủng vi khuẩn lactic được tiến hành trên môi trường MRS theo sơ đồ sau : 2/Soi tiêu bản sống[4] Chuẩn bị một phiến kính và một lá kính tiệt trùng. Để pha loãng, trên phiến kính, nhỏ một giọt nước cất vô trùng. Dùng que cấy lấy canh trường cho vào giọt nước cất. Đặt lá kính sạch lên trên giọt nước tránh tạo bọt khí và tránh tràn nước ra ngoài nhờ giấy thấm. Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi. 3/ Nhuộm màu Gram[4] Phương pháp nhuộm màu Gram dựa trên sự khác nhau về cấu trúc thành tế bào của vi sinh vật. Phương pháp này cho phép phân chia vi sinh vật thành hai nhóm : Gram (+) và Gram (-). Canh trường sử dụng phải trẻ, được nuôi cấy sau 24 h. Chuẩn bị tiêu bản khô của canh trường cần nghiên cứu. Nhỏ vài giọt gentian tím lên vết bôi. Sau 2 phút, đổ dung dịch tím gentian đi. Nhỏ vài giọt Lugol lên vết bôi, giữ trong 1 phút. Nhúng phiến kính vào dung dịch cồn tuyệt đối trong 30 giây. Nuôi cấy ở 30oC trong 24 h Canh trường trên môi trường thạch nghiêng Môi trường MRS lỏng Môi trường MRS đặc trên đĩa Petri Môi trường thạch nghiêng Nuôi ở 30oC trong 48 h Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 19 Rửa cẩn thận vết bôi bằng nước. Nhuộm lại vết bôi bàng dung dịch fucsin 1% trong vòng 1 phút. Rửa vết bôi bằng nước. Sấy khô vết bôi bằng đèn cồn. Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi. 4/ Kiểm tra khả năng di động Cấy một giọt canh trường vi khuẩn lactic lên bề mặt môi trường MRS đặc chứa trong hộp Petri (môi trường này được nhỏ thêm vài giọt bromocresol tía 1,6%). Nếu vi khuẩn có khả năng di động, axit hữu cơ sinh ra sẽ di chuyển về mọi hướng và làm đổi màu môi trường từ xanh sang vàng. Nếu vi khuẩn không có khả năng di động, sự đổi màu của chỉ thị chỉ được quan sát thấy xung quanh giọt canh trường. 5/ Xác định kiểu hô hấp Nuôi cấy 4 chủng vi khuẩn lactic trên môi trường MRS thạch đứng cao 6-7 cm trong ống nghiệm. Quan sát sự phát triển của vi khuẩn dọc theo vết cấy. 6/ Xác định tỉ lệ sống sót (Phương pháp Kocch) Canh trường được pha loãng đến tỉ lệ thích hợp, sau đó được trang đều trên môi trường MRS đặc. Nuôi cấy trong 48 giờ. Đếm số khuẩn lạc và tính toán tỉ lệ sống sót. 2.2.2. Phương pháp hoá lý 1/Xác định lượng sinh khối vi khuẩn lactic bằng ly tâm Sau một thời gian nuôi cấy, canh trường được ly tâm ở 6000 v/p trong 10 phút. Sinh khối thu được tiếp đó được cân và tính toán. 2/ Xác định lượng sinh khối vi khuẩn lactic bằng đo OD Tồn tại sự tỉ lệ thuận trong một vùng giới hạn nào đó giữa OD của một canh trường và khối lượng tế bào có trong đó. Bằng việc đo OD của canh trường ở một thời điểm nào đó, ta có thể suy ra được sự phát triển của vi khuẩn lactic và nhờ đó vẽ được đường cong sinh trưởng. Trước tiên cần xây dựng đường chuẩn sinh khối : Mẫu canh trường cần xác định được ly tâm ở 6000 v/p trong 10 phút. Một lượng xác định sinh khối vi khuẩn được pha loãng trong nước cất đến các nồng độ : 1/1, 1/2, 1/4, 1/8,...Xác định OD của dung dịch sau pha loãng. Vẽ đường chuẩn sinh khối biểu diễn mói quan hệ giữa OD và lượng sinh khối. Như vậy cũng xác định được OD giới hạn của vùng tuyến tính. Bước sóng sử dụng trong trượng hợp này là OD giới hạn Vùng tuyến tính OD(620nm) Sinh khối (g/l) Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 20 2.2.3. Phương pháp hoá học 1/Xác định hàm lượng N tổng bằng phương pháp Kendan[5] Phương pháp này được dử dụng để xác định hàm lượng N tổng số trong dung dịch nấm men thuỷ phân. 2/Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp Grassianov[3] Phương pháp này được sử dụng để xác định hàm lượng đường trong môi trường lên men. 3/Xác định hàm lượng axit lactic[4] - Phương pháp chuẩn độ : Sử dụng dung dịch NaOH 0,1N để chuẩn, chỉ thị là phenolphtalein. - Phương pháp dựng đường chuẩn : Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa thể tích dung dịch NaOH 0,1N sử dụng và hàm lượng axit lactic. 2.2.4. Phương pháp sấy thu hồi sinh khối 1/ Sấy phun Ly tâm canh trường sau nuôI cấy ở 6000 v/p trong vòng 10 phút. Sinh khối thu được đem pha loãng với nước cất đến nồng độ thích hợp . Dịch thu được mang đI sấy phun. Nhiệt độ vào là 40oC, nhiệt độ ra là 30oC. 2/ Sấy đông khô Canh trường được trộn với chất độn theo tỉ lệ thích hợp rồi được ly tâm ở 6000v/p trong 10 phút. Hỗn hợp thu được được cho vào ống nghiệm (1/2 thể tích ống) rồi đem đi lạnh đông trong vòng 24 giờ. Sấy đông khô mẫu ở chế độ nhiệt độ - 84 o C. Chất độn sử dụng ở đây là pepton 1% và lactoza 30% so với lượng sinh khối ẩm. 3/ Sấy chân không Canh trường được trộn với chất độn theo tỉ lệ thích hợp rồi được ly tâm ở 6000v/p trong 10 phút. Hỗn hợp thu được mang đi sấy ở chế độ nhiệt độ 40oC. Chất độn sử dụng ở đây là hỗn hợp tinh bột: glucoza: sữa tách béo (86:11:33) với tỉ lệ chất độn : sinh khối ẩm là 14:1. 2.2.5. Phương pháp toán học [19] Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 21 Để đạt được mục đích nghiên cứu tối ưu của mình, chúng tôi đã chọn ma trận DOEHLERT. Ma trận này cho phép tìm được vùng tối ưu trongkhoảng thời hạn đã xhọn và thường dùng để tối ưu hoá. Ma trận còn cho phép phân chia rất cân đối các điểm thí nghiệm trong giới hạn cùng đang nghiên cứu và cho phép đi xa hơn ra ngoài giới hạn theo bất kì hướng nào. Dựa vào ma trận, chúng ta có thể thêm các biến số khác nữa mà không làm mất đi tính đúng đắn của ma trận. Số thí nghiệm cần tiến hành : N = k2 + k + 1 ( k là biến số độc lập) Với k = 3, số thí nghiệm cần tiến hành là 13. Từ ma trận và kết quả thực nghiệm, chúng ta sẽ tìm ra được giá trị của các hệ số trong các phương trình thực nghiệm có dạng : Yi = bo + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b11(X1) 2 + b22(X2) 2 + b33(X3) 2 + b12X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 Yi : Các đại lượng cần xác định bi : Giá trị của các hệ số Xi : Các biến số Kết quả thí nghiệm được xử lí bằng phần mềm NEMROD – New efficient methodology for research using optimal design. Phần 3 : Kết quả và thảo luận 3.1. Sơ tuyển chủng giống vi khuẩn lactic dùng cho quá trình tạo sinh khối Trong sản xuất, chất lượng chủng giống là yếu tố quan trọng quyết định sự thành công của các quá trình lên men. Chủng giống càng đáp ứng được các yêu cầu thì xác suất thành công của quá trình càng cao. Vì vậy, việc lựa chọn chủng giống là cần thiết và phải tiến hành trước tiên. Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 22 Với mục đích nghiên cứu chọn chủng có khả năng tạo sinh khối cao để sản xuất tạo chế phẩm vi khuẩn lactic , chúng tôi sử dụng 4 chủng có kí hiệu như sau: VTP, TL6, Lc.340, SD16. 3.1.1. Kiểm tra lại đặc tính của các chủng Các chủng vi khuẩn lactic được hoạt hoá trong môi trường MRS lỏng trong 24 h rồi cấy lên môi trường MRS đặc trong các hộp petri. Sau 48h, lựa chọn các khuẩn lạc mọc riêng rẽ cấy giữ giống trong các ống thạch nghiêng. Các chủng tiếp đó được kiểm tra lại các đặc tính trước khi sử dụng. Kết quả thu được được tổng kết lại trong bảng 1 dưới đây. Bảng 1 : Đặc tính của các chủng kiểm tra Đặc điểm VTP SD16 TL6 Lc.340 Đặc điểm khuẩn lạc Tròn, trắng ngà,d<2mm Tròn, trắng ngà, d<2mm Tròn, trắng sữa, d<2mm Tròn, trắng ngà, d<4mm Hình dáng và cách sắp xếp tế bào Hình cầu, xếp đơn hoặc đôi Hình cầu, xếp đơn hoặc đôi Hình cầu, xếp đơn hoặc đôi Hình cầu, xếp đơn, đôi hoặc chuỗi ngắn Tạo bào tử Không Di động Không Tạo catalaza - Kiểu hô hấp Yếm khí tuỳ tiện Nhuộm màu Gram + 4 chủng trên đều hình cầu, có đường kính khuẩn lạc <2mm, riêng khuẩn lạc của chủng Lc.340 lớn hơn (4mm), Gram(+), yếm khí tùy tiện, không tạo bào tử, không có khả năng di động, không có hoạt tính catalaza. Như vậy, cả 4 chủng đều có các đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của nhóm vi khuẩn lactic. Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 23 Hình 1a : Khuẩn lạc chủng VTP Hình 1b : Nhuộm Gram chủng VTP, x 1000 Hình 1c : Khuẩn lạc chủng SD16 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 24 Hình 1d : Nhuộm Gram chủng SD16, x 1000 Hình 1e : Khuẩn lạc chủng Lc.340 Hình 1f : Nhuộm Gram chủng Lc.340, x 1000 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 25 Hình 1g : Khuẩn lạc chủng TL6 Hình 1h : Nhuộm Gram chủng TL6, x 1000 3.1.2. Nghiên cứu khả năng tạo sinh khối của các chủng vi khuẩn lactic Yêu cầu chúng tôi đặt ra là lựa chọn được những chủng có khả năng tạo sinh khối cao, và có khả năng chịu nhiệt tương đối tốt. Dựa trên các yêu cầu này, quá trình chọn chủng được tiến hành như sau: Cỏc chủng vi khuẩn được nhân giống và nuôi cấy trong 100ml môi trường MRS lỏng trong 24h. Việc lấy mẫu được tiến hành sau mỗi 4h trong các điều kiện như nhau với cả 4 chủng. Mẫu được đem đi xác định hàm lượng axit lactic (g/l) và đo OD. Ta thu được kết quả sau: Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 26 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 T(h) O D 6 2 0 n m VTP SD16 Lc.340 TL6 Hình 2. So sánh khả năng tạo sinh khối của 4 chủng vi khuẩn lactic Hai chủng Lc.340 và VTP có pha tiềm phát tương đối dài hơn so với hai chủng TL6 và SD16. Nhưng khi đã làm quen với môi trường, chủng Lc.340 lại phát triển mạnh mẽ, vượt trội hơn hẳn các chủng còn lại. Chủng TL6 có pha tiềm phát ngắn, sinh trưởng tương đối tốt. Lượng sinh khối đạt được cao nhất sau 20 h đối với cả 4 chủng. Để tiện cho việc so sánh, lựa chọn các chủng, chúng tôi tiến hành tính toán hiệu suất thu hồi, hiệu suất lên men của các chủng. Kết quả được chỉ ra ở bảng 2. Bảng 2. So sánh hiệu suất thu hồi của 4 chủng Các chỉ tiêu Chủng vi khuẩn lactic VTP TL6 Lb340 SD16 Sinh khối (g/l) 14,3 16,6 18,7 15,1 HS thu hồi sinh khối(%) 35,8 41,5 46,9 37,7 axit lactic(g/l) 5,2 6,5 8,4 5,5 HS lên men lactic(%) 26,1 32,4 42,2 27,5 HS thu hồi thực tế(%) 61,9 73,9 89,1 65,2 Dựa vào đồ thị và kết quả thu được, ta có thể kết luận: trong số 4 chủng so sánh, chủng Lc.340 và chủng TL6 cú hiệu suất thu hồi sinh khối và lượng axit lactic tạo thành cao, hiệu suất thu hồi sinh khối theo thứ tự là 46.9 %, 41,5%, lượng axit lactic tạo thành là 42,2% và 32,4%. Do đó, hai chủng này được lựa chọn để nghiên cứu quá trình tạo sinh khối. Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 27 3.2. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối: pH, nhiệt độ, nồng độ đường,Để thu được lượng sinh khối lớn, cần tạo điều kiện thích hợp nhất cho sinh trưởng phát triển của các chủng. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu các yếu tố sau:  Nhiệt độ  Mức độ thông khí  Nguồn N  Loại đường và nồng độ đường  Tỉ lệ tiếp giống  pH 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ là một trong số các yếu tố ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình sinh trưởng phát triển của vi sinh vật. Nhiệt độ có thể kích thích, kìm hãm, thậm chí ức chế hoàn toàn sự sống của vi sinh vật. Mỗi chủng lactic đều có khoảng nhiệt độ hoạt động tối ưu, vì vậy, ảnh hưởng của nhiệt độ được chúng tôi khảo sát trước hết: Tiến hành nuôi cấy hai chủng vi khuẩn lactic Lc.340 và TL6 trên môi trường MRS lỏng trong 48h ở các nhiệt độ khác nhau: 25oC, 30oC, và 37oC. Đo OD của canh trường sau mỗi 6h. Vẽ đường cong sinh trưởng của các mẫu và trên cơ sở đó chọn ra nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển của mỗi chủng. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 T(h) O D 6 2 0 n m 25 oC 30 oC 37 oC Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 28 Hình 3a. ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo sinh khối của chủng Lc.340 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 T(h) O D 6 2 0 n m 25 oC 30 oC 37 oC Hình3b ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo sinh khối của chủng TL6 Hình 7 và 8 thể hiện rõ tỉ lệ thuận giữa nhiệt độ với khả năng tạo sinh khối của cả hai chủng TL6 và Lc.340. Lượng sinh khối thu được lớn nhất ở 37oC. Để có thể đưa ra kết luận chính xác, việc tính toán các hiệu suất thu hồi và hiệu suất lên men là thiết yếu.(Bảng 3) Bảng 3: ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng của các chủng Các chỉ tiêu Nhiệt độ (oC) Lc.340 TL6 25 30 37 25 30 37 Sinh khối(g/l) 12,2 18,8 23 12 16 19 HSTH sinh khối(%) 30,6 47 57,5 30 41 47,5 axit lactic(g/l) 7,4 8 7,9 7 8.8 8,4 HSLM lactic (%) 36,9 40 40 35 44 41,8 HSTH thực tế(%) 67,5 87 97,5 65 84 89,3 Trong vùng nhiệt độ nghiên cứu, chủng Lc.340 phát triển mạnh hơn chủng TL6. Đối với cả hai chủng, từ 25-37oC, khả năng phát triển của các chủng tăng cùng với sự tăng nhiệt độ. Hiệu suất thu hồi sinh khối đạt cao nhất ở 37oC (57,5% đối với chủng Lc.340 và 47,5% đối với TL6). Điều này chứng tỏ khả năng chịu nhiệt tương đối tốt của các chủng. Lượng axit lactic tạo thành không có sự khác nhau đáng kể. Vậy nhiệt độ 37oC là nhiệt độ thích hợp cho quá trình tạo sinh khối. Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 29 3.2.2 ảnh hưởng của điều kiện thông khí Điều kiện thông khí cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến lượng sinh khối nhận được. Vì lý do này, cần phải lựa chọn điều kiện thông khí thích hợp để nâng cao chất lượng của quá trình tạo sinh khối. Nuôi cấy các chủng ở các điều kiện đảo trộn khác nhau: nuôi cấy tĩnh hoặc lắc với tốc độ 100 vòng/phút, 200 vòng/phút, và khuấy trộn bằng khuấy từ. Lấy mẫu và đo OD. Từ kết quả thu được, chọn ra chế độ thích hợp nhất cho quá trình tạo sinh khối. 0 2 4 6 8 0 6 12 18 24 30 T(h) O D 6 2 0 n m TÜnh 100v/p 200v/p KhuÊy tõ Hình 4a ảnh hưởng của điều kiện thông khí lên khả năng tạo sinh khối của chủng Lc.340 0 2 4 6 8 0 6 12 18 24 30 T (h) O D 6 2 0 n m TÜnh 100 v/p KhuÊy tõ Hình 4b ảnh hưởng của điều kiện thông khí lên khả năng tạo sinh khối của chủng TL6 Lượng sinh khối tạo thành có sự khác nhau đáng kể khi thay đổi các chế độ thông khí khác nhau. Tốc độ khuấy càng cao thì sinh khối thu được càng lớn. Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 30 Chủng Lc.340 pha tiềm phát được rút ngắn khi tăng cường thông khí. Còn đối với chủng TL6, khi thông khí bằng cách sử dụng khuấy từ thì pha tiềm phát thể hiện không rõ rệt. Bảng 4: ảnh hưởng của chế độ khấy trộn lên sinh trưởng phát triển các chủng Môi trường Lc.340 TL6 Tĩnh Lắc (v/p) Khuấy từ Tĩnh Lắc(v/p) Khuấy từ 100 200 100 Sinh khối(g/l) 18,7 22 25 33 16,4 23,9 31,3 HSTH sinh khối 46,9 55,1 62,5 82,5 40,9 47,8 62,5 axit lactic(g/l) 6,6 6,3 5,79 2,2 6,5 5,69 3,21 HSLM lactic(%) 33 31,7 29 11 32,4 28,5 16,1 HSTH thực tế 79,9 86,8 91,5 93,5 73,3 76,3 78,6 Chế độ đảo trộn có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi khuẩn lactic. Nuôi cấy với tốc độ khấy trộn càng cao thì khả năng tạo sinh khối càng lớn, cụ thể khi nuôi cấy dùng khuấy từ ở mức 5, hiệu suất thu hồi sinh khối đạt được đối với chủng Lc.340 là 82,5% và đối với chủng TL6 là 62,5% (tăng gấp đôi hoặc gấp rưỡi). Lượng axit lactic sinh ra giảm dần khi tăng tốc độ đảo trộn. Như vậy để đạt được hiệu suất thu hồi sinh khối lớn thì phải tăng cường quá trình đảo trộn, tuy nhiên do điều kiện thí nghiệm, quá trình nghiên cứu tiếp theo chúng tôi chỉ tiến hành ở điều kiện đảo trộn là 100 v/p. 3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn Nitơ Môi trường MRS sử dụng pepton, cao men, cao thịt làm nguồn N. Các sản phẩm này tuy có chất lượng cao nhưng giá thành rất đắt, đặc biệt là pepton. Như vậy, việc ứng dụng sản xuất lớn sinh khối ở qui mô công nghiệp sử dụng MRS làm môi trường nuôi cấy là không kinh tế. Chúng tôi đó sử dụng dịch nấm men thủy phõn để thay thế dần các nguyên liệu đắt tiền này. Do điều kiện thí nghiệm, quá trình khảo sát chỉ tiến hành với chủng Lc.340. Chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường với các tỉ lệ thay thế dịch nấm men thủy phân khác nhau, từ 0% đến 100%. Canh trường được đo OD sau mỗi 6h nuôi cấy. Tỉ lệ tốt nhất thay thế nguồn N bằng nấm men thuỷ phân được xác định dựa vào hiệu suất thu hồi sinh khối tính toán. Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 31 0 10 20 30 40 50 60 0% 25% 50% 75% 100% Sinh khèi (g/l) HiÖu suÊt (%) Hình 5 ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men thuỷ phân thay thế lên khả năng tạo sinh khối của chủng Lc.340 Bảng 5: ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men thuỷ phân thay thế lên sinh trưởng và phát triển của chủng Lc.340 Các chỉ tiêu Tỉ lệ NMTP thay thế (%) 0 25 50 75 100 Sinh khối(g/l) 22,6 22,3 21,6 176 14,5 HSTH sinh khối(%) 56,5 55,7 54 43,9 36,2 axit lactic(g/l) 6,5 4,3 3,7 3,8 3,3 HSLM lactic (%) 32,4 21,4 18,5 19,2 16,6 HSTH thực tế(%) 88,9 77,1 72,5 63,1 52,8 Với tỉ lệ dịch nấm men thuỷ phõn thay thế là 50%, hiệu suất thu hồi sinh khối đạt 54%. Ở tỉ lệ này, hiệu suất thu hồi sinh khối khụng nhỏ hơn nhiều so với hiệu suất thu được khi sử dụng nguồn N từ pepton, cao men, cao thịt mà lại thay thế được đáng kể nguồn N đắt tiền. Hơn nữa, lượng axit lactic tạo thành ở tỉ lệ thay thế này ít hơn nhiều so với khi sử dụng môi trường MRS. Như vậy, cú thể núi , thay thế nguồn N bằng dịch nấm men thuỷ phõn với tỉ lệ 50% là chấp nhận được. Quá trình lên men từ đây trở về sau sẽ thay thế 50% nguồn nitơ bằng dịch nấm men thuỷ phân. 3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường Khả năng chuyển hoá các nguồn cacbon khác nhau là không giống nhau đối với các chủng vi khuẩn lactic. Lựa chọn nguồn cacbon thích hợp sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển của các chủng. Với điều kiện cho phép, chúng tôi chọn hai loại đường glucoza và Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 32 saccharoza để nghiên cứu. Các chủng được nuôi cấy trên các môi trường khác nhau về loại đường và nồng độ đường. Vùng nồng độ nghiên cứu từ 25-100 g/l đối với glucoza và từ 25-50 g/l đối với saccaroza. Vẽ đường cong sinh trưởng của các mẫu và chọn ra loại đường cũng như nồng độ đường thích hợp cho mỗi chủng. 0 2 4 6 8 0 12 24 36 48 60 T(h) O D 6 2 0 n m 25g/l 50g/l 75g/l 100g/l Hình 6a ảnh hưởng của nồng độ đường glucoza lên chủng Lc.340 Chủng Lc.340 có khả năng hấp thụ đường glucoza rất tốt. Lượng sinh khối thu được tăng cùng với sự tăng của nồng độ đường. Sự chênh lệch về sinh khối là đáng kể trong vùng nồng độ đường từ 25 – 50g/l, khi nồng độ đường lớn hơn 50g/l sự chênh lệch này là không nhiều. Vì vậy, khi xét ảnh hưởng của sacaroza, chúng tôi chỉ khảo sát vùng nồng độ từ 25 – 50g/l. 0 1 2 3 0 12 24 36 48 60 T(h) O D 6 2 0 n m 25g/l 37.5g/l 50g/l Hình 6b ảnh hưởng của nồng độ đường saccaroza lên chủng Lc.340 So với glucoza, khả năng hấp thụ sacaroza của chủng Lc.340 kém hơn hẳn. Nếu tăng nồng độ đường thì lượng sinh khối thu được cũng tăng, nhưng Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 33 không nhiều. 0 2 4 6 8 10 0 12 24 36 48 60 T(h) O D 6 2 0 n m 25g/l 50g/l 75g/l 100g/l Hình 6c ảnh hưởng của nồng độ đường glucoza lên chủng TL6 0 2 4 6 8 0 12 24 36 48 60 T(h) O D 6 2 0 n m 25g/l 37.5g/l 50g/l Hình 6d ảnh hưởng của nồng độ đường saccaroza lên chủng TL6 Ngược lại với chủng Lc.340, chủng TL6 hấp thu sacaroza tốt hơn glucoza. Sinh khối thu được cũng tỷ lệ thuận với nồng độ đường. Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 34 Bảng 6: ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên sinh trưởng của chủng TL6 và Lc.340 Chủng Lc.340 Hàm lượng đường glucoza(g/l) Đường saccaroza(g/l) 25 50 75 100 25 37.5 50 Sinh khối(g/l) 28,3 44,9 42,9 56,4 9 11,9 14,8 HSTH sinh khối(%) 56,1 45 28,6 28,2 18 15,9 14,9 axit lactic(g/l) 8,3 10,0 12,7 14,5 8,9 9,1 10,2 HSLM lactic (%) 33,2 20,1 16,9 14,5 35,6 24,3 20,4 HSTH thực tế(%) 89,3 65,1 45,5 42,7 53,6 40,2 35,3 Chủng TL6 Sinh khối(g/l) 23,9 31,5 35,6 44,8 26,7 32,5 42,1 HSTH sinh khối(%) 47,8 32 23,7 22,4 53,5 43,3 42,1 axit lactic(g/l) 6,7 6,3 11,7 15,3 8,7 8,7 8,4 HSLM lactic (%) 26,8 12,6 15,6 15,3 34,9 23,3 16,7 HSTH thực tế(%) 74,6 44,6 39,3 37,7 88,4 66,6 58,8 Với chủng Lc.340, tăng nồng độ đường, lượng sinh khối và lượng axit lactic tạo thành tăng, nhưng hiệu suất thu hồi sinh khối lại giảm. Như vậy lên men với nồng độ đường thấp sẽ đạt hiệu quả kinh tế cao hơn. ở nồng độ đường 25g/l, hiệu suất thu hồi sinh khối đạt được khi sử dụng đường glucoza là 56,1% trong khi sử dụng saccaroza là 18%. Hiệu suất lên men lactic trong cả hai trường hợp là xấp xỉ nhau. Từ đây có thể kết luận rằng, loại đường thích hợp cho Lc.340 là glucoza ở nồng độ 25g/l. Tương tự, đối với TL6, khi tăng nồng độ đường, lượng sinh khối và lượng axit lactic tạo thành tăng, nhưng hiệu suất thu hồi sinh khối lại giảm. Tuy nhiên đối với chủng này, ở nồng độ đường 25g/l, hiệu suất thu hồi sinh khối đạt 53,5% đối với đường saccaroza và 47,8 % đối với đường glucoza. Lượng axit lactic tạo thành trong cả hai trường hợp chênh lệch nhau không đáng kể. Vì thế chúng tôi sử dụng đường saccaroza với nồng độ 25g/l trong môi trường nuôi cấy. 3.2.5 ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống Tỉ lệ tiếp giống đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men. Tỉ lệ giống thích hợp không những tiết kiệm được môi trường giống mà còn làm Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 35 cho quá trình lên men đạt hiệu quả cao. Môi trường được tiếp giống với các tỉ lệ khác nhau : 0,5g/l, 1g/l và 1,5 g/l sinh khối ẩm. Thời gian nuôi cấy là 24h, trong quá trình nuôi tiến hành lấy mẫu. Từ kết quả thu được, chọn ra tỉ lệ tiếp giống tốt nhất. 0 20 40 60 80 0.5 1 1.5 TØ lÖ tiÕp gièng (g/l) Sinh khèi (g/l) HiÖu suÊt sinh khèi (%) Hình 7 ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống lên khả năng sinh trưởng của chủng Lc.340 Tỉ lệ tiếp giống có ảnh hưởng không rõ rệt đến sinh trưởng và phát triển của chủng Lc.340. Để có thể đánh giá được chính xác, chúng tôi tiến hành tính toán các hiệu suất lên men và hiệu suất thu hồi. Kết quả trình bày trong bảng 8. Bảng 7: ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống lên sinh trưởng của chủng Lc.340 Các chỉ tiêu Hàm lượng tiếp giống(g/l) 0,5 1 1,5 Sinh khối(g/l) 27,2 29,9 30,1 HS thu hồi sinh khối(%) 44,4 59,8 60,2 axit lactic(g/l) 6,8 6,8 6,6 HS lên men lactic(%) 27,3 27,1 26,4 HS thu hồi thực tế(%) 71,7 86,9 86,6 ở tỉ lệ tiếp giống là 1g/l, hiệu suất thu hồi sinh khối đạt 59,8%, cao hơn hẳn so với khi tiếp giống 0,5 g/l (44,4%). Còn khi tiếp giống ở 1,5g/l, hiệu suất thu hồi sinh khối là 60,2%, không cao hơn nhiều so với tiếp giống ở 1g/l. Hiệu suất lên men lactic ở 3 tỉ lệ tiếp giống này là xấp xỉ nhau. Do đó, tỉ lệ tiếp giống 1g/l là thích hợp hơn cả. Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 36 3.2.6 ảnh hưởng của pH pH cũng là một yếu tố hết sức quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật vì thế cần phải quan tâm nghiên cứu vấn đề này. Nuôi cấy các chủng trên các môi trường có độ pH khác nhau trong 24h. Tiến hành lấy mẫu, đo OD ở bước sóng 620nm. Vẽ đường cong sinh trưởng, tính toán kết quả và chọn pH thích hợp nhất. 0 20 40 60 80 4 5 6 pH Sinh khèi (g/l) HiÖu suÊt sinh khèi (%) Hình 8 ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng của chủng Lc.340 pH càng thấp, sinh trưởng của chủng Lc.340 càng yếu. Trong khoảng pH từ 5-6, sự khác nhau giữa lượng sinh khối tạo thành hầu như không đáng kể. Bảng 8: ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng và phát triển của chủng Lc.340 Các chỉ tiêu pH 4 5 6 Sinh khối(g/l) 23,57 26,5 28,7 HS thu hồi sinh khối(%) 47,1 53 57,4 axit lactic(g/l) 1,94 4,39 6,69 HS lên men lactic(%) 7,8 17,6 26,8 HS thu hồi thực tế(%) 54,9 70,6 84,2 Tại pH=4, chủng Lc.340 hoạt động kém, lượng lactic tạo thành rất ít và lượng sinh khối cũng thấp hơn so với vùng pH=5-6. Tại pH=6, sinh trưởng của chủng Lc.340 khá tốt, sinh khối và axit lactic tạo ra nhiều, hiệu suất thu hồi cao. Lượng sinh khối thu được ở pH=5 tuy thấp hơn so với pH=6 nhưng hàm lượng đường chuyển hoá thành axit lactic lại ít hơn 10%. Đây cũng là một điểm có lợi cho quá trình tạo sinh khối. Như vậy, có thể kết luận vùng pH=5-6 thích hợp cho quá trình tạo sinh khối. Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 37 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo sinh khối, chúng tôi đã tìm ra môi trường và các điều kiện thích hợp để tạo sinh khối như sau:  Nhiệt độ thích hợp là 370C  Thông khí mạnh  pH thích hợp 5- 6  Tỷ lệ tiếp giống là 1(g/l)  Thay thế 50% nguồn N bằng dung dịch nấm men thuỷ phân 3.3.Tối ưu hoá quá trình tạo sinh khối vi khuẩn lactic. Mục đích chính của nghiên cứu này là xác định các điều kiện thích hợp nhất cho quá trình tạo sinh khối. Qua các thí nghiệm tiến hành ở phần trên chúng tôi đã tìm được các yếu tố ảnh hưởng đáng kể nhất tới quá trình tạo sinh khối vi khuẩn lactic đó là 3 yếu tố chính sau :  Hàm lượng đường(g/l)  Tỉ lệ nấm men thay thế(%)  Thời gian dừng quá trình lên men(h) Các biến số được chọn trong khoảng biến đổi như sau: Bảng 9 : Các biến số Tên biến Ký hiệu Mức dưới (-1) Mức trung bình (0) Mức trên (1) Hàm lượng Glucoza (g/l) X1 20 40 60 Tỷ lệ nấm men thay thế (%) X2 0 50 100 Thời gian kết thúc (giờ) X3 16 24 32 Các đại lượng cần xác định là:  Lượng sinh khối tạo thành (Y1) g/l  Hiệu suất thu hồi sinh khối (Y2) % Kết quả thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm NEMROD. Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 38 Bảng 10 – Ma trận DEOHLERT và kết quả thí nghiệm tối ưu STT Biến số mã hoá Biến số thực Kết quả X1 X2 X3 X1 X2 X3 Y1 Y2 1 0 0 0 40 50 24 43,8 36,6 2 1 0 0 60 50 24 40 10 3 -1 0 0 20 50 24 45,8 45,8 4 0,5 0,87 0 50 93,5 24 41,6 69,3 5 -0,5 -0,87 0 30 6,5 24 48,8 48,8 6 0,5 - 0,87 0 50 6,5 24 49,1 81,9 7 - 0,5 0,87 0 30 93,5 24 46,4 46,4 8 0,5 0,29 0,82 50 64,5 30,5 31 51,6 9 - 0,5 - 0,29 - 0,82 30 35,5 7,4 37,8 37,8 10 0,5 - 0,29 - 0,82 50 35,5 17,4 30,2 37,7 11 0 0,58 - 0,82 40 79 17,4 51,3 85,8 12 - 0,5 0,29 0,82 30 64,5 30,5 44,6 55,8 13 0 - 0,58 0,82 40 21 30,5 41,3 51,3 14 0 - 0,58 0,82 40 21 30,5 43,4 54,2 15 0 - 0,58 0,82 40 21 30,5 40,7 50,1 Quá trình phân tích xử lý toàn bộ kết quả thực nghiệm cho phép xác định các hệ số hồi quy (b). Nếu giá trị tuyệt đối của hệ số hồi quy càng lớn chứng tỏ ảnh hưởng của các biến số lên các đại lượng cần xác định càng lớn. Bảng 11 : Các hệ số hồi quy Y1 Y2 f b0 41,8 51,9 b1 1,7 -29 1,00 b2 1 2,5 1,00 b3 8,8 12,4 1,00 b11 0,1 16 1,19 b22 6 7,3 1,19 b33 - 4 - 5 1,20 b12 - 6 - 9 1,11 b13 - 5 - 12,4 1,11 b23 8 8,9 1,11 r 2 0.99 0.99 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 39  2 yếu tố thời gian và tỷ lệ nấm men thay thế đều có ảnh hưởng dương tới hiệu suất thu hồi sinh khối, còn hàm lượng đường có ảnh hưởng âm. Điều đó có nghĩa là khi tăng thời gian, tăng tỷ lệ nấm men thay thế, giảm hàm lượng đường trong khoảng đã chọn thì hiệu suất thu hồi sinh khối tăng.  Dựa vào hệ số hồi quy thu được ta thấy ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men thay thế là không đáng kể so với hai yếu tố còn lại lên hiệu suất thu hồi sinh khối.  Cả 3 yếu tố đều có ảnh hưởng dương lên khả năng sinh trưởng và pháp triển của chủng Lc340 và ảnh hưởng của 3 yếu tố này đều đáng kể tới sự pháp triển của chủng Lc340. Trong bảng, r2 là hệ số tương quan, nó cho biết sự sai số giữa các điểm thí nghiệm và tính toán, r2 càng gần 1 thì chứng tỏ kết quả tính toán theo phương trình hồi quy và kết quả thí nghiệm là rất gần nhau. Với Y1, r2 là 0,994 và Y2 là 0,9884. f là hệ số gia tăng , là số đo tuyệt đối thể hiện tính thích ứng của mô hình. Nếu hệ số nằm trong khoảng 1-2,5 chứng tỏ ma trận thực nghiệm đã chọn là hoàn toàn thích ứng và nếu lớn hơn 2,5 thì cần xem lại ma trận hoặc giới hạn các biến số đã chọn. Trong trường hợp cụ thể của chúng ta, f có giá trị từ 1-1,20 chứng tỏ ma trận đã chọn là thích ứng. Tuy nhiên chúng tôi nhận thấy cần thiết phải kiểm tra lại tính thích ứng của mô hình trên toàn vùng đã chọn, do đó chúng tôi đã tiến hành làm thêm 8 thí nghiệm nữa. Bảng 12 : Bảng kết quả kiểm tra sự thích ứng của mô hình. STT Biến số mã hoá Biến số thực Kết quả X1 X2 X3 X1 X2 X3 Y1 tn. Y1 tt. Y2 tn. Y2 tt. 1 0,5 0,29 0,24 50 64,5 25,9 43,8 44,4 43,8 43,3 2 -0,5 -0,29 -0,24 30 35,5 22,1 39,1 37,9 65,2 64,9 3 0,5 -0,29 -0,24 50 35,5 22,1 40,6 42,6 40,6 41,4 4 0 0,58 -0,24 40 79 22,1 41,2 40,9 51,5 51,3 5 0 0 0,62 40 50 29 45,4 45,7 56,7 57,7 6 -0,5 0,29 0,24 30 64,5 25,9 43,7 45,7 72,9 77,8 7 0 -0,58 0,24 40 21 25,9 43,3 44 54,1 54,4 8 0 0 -0,61 40 50 19 33,4 34,9 41,8 42,5 Kết quả thu được từ thực nghiệm và từ tính toán rất gần nhau, sai số tính toán nhỏ hơn 5%. Điều này chứng tỏ phương trình hồi qui thực nghiệm thu Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 40 được thích ứng trong vùng khảo sát. Để xác định vùng tối ưu, chúng tôi tiến hành vẽ các bề mặt đáp ứng của hàm sinh khối (Y1) và hiệu suất thu hồi (Y2). Vùng tối ưu chính là giao điểm của hai bề mặt đáp ứng. Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 41 Hình 9: Bề mặt đáp ứng của hàm sinh khối u temps de fermentation dans la zone ộtudiộe permettent d’accroợtre la teneur en biomasse formộe. Le taux de remplacement de solution de levures hydrolysộes est recommandộ de prốs de 50%. Hình 10: Bề mặt đáp ứng của hàm hiệu suất thu hồi sinh khối Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 42 Hình 11: Hợp nhất của hai bề mặt đáp ứng Kết quả tối ưu hoá Vùng tối ưu tìm được là:  Hàm lượng đường từ 20 – 30(g/l)  Thời gian từ 20 – 24(h)  Tỷ lệ nấm men thay thế là 40% Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 43 3.4. Thu hồi chế phẩm vi khuẩn lactic của chủng Lc.340 và TL6 3.4.1. Động thái quá trình tạo sinh khối. Từ các điều kiện thích hợp cho quá trình tạo sinh khối đã nghiên cứu ở phần 2 chúng tôi đi vào quá trình tạo sinh khối vi khuẩn để thu được lượng lớn để sau đấy mang đi sấy theo một số phương pháp đã chọn. Chủng vi khuẩn được lấy từ ống giống cấy vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MRS đã khử trùng. Sau 24 h phát triển thì cấy sang bình tam giác (tỷ lệ tiếp giống là 10%) Môi trường trong bình tam giác là môi trường có thành phần như đã xác định ở trên. Nuôi trong 16 giờ, lấy canh trường đem đi đo OD để xác định mật độ tế bào có trong canh trường. Cấy sang môi trường chứa 500ml môi trường lỏng ( tỷ lệ tiếp giống là 1g/l). Nuôi trong các điều kiện thích hợp cho quá trình tạo sinh khối trong thời gian 16 giờ thì tiến hành thu sinh khối bằng cách ly tâm tách tế bào vi khuẩn ra khỏi canh trường. 0 2 4 6 8 0 4 8 12 16 20 24 28 T (h) O D 6 2 0 n m Lc.340 TL6 Hình 12 Động học quá trình tạo sinh khối của chủng Lc.340 và TL6 Động học của quá trình tạo sinh khối cho thấy áp dụng các điều kiện thích hợp đã chọn có thể nâng lượng sinh khối lên 33g/l đối với chủng Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 44 Lc.340 và 31,3g/l đối với chủng TL6. Hiệu suất thu hồi theo thứ tự là 82,5% và 62,5%. 3.3.2 Thu hồi chế phẩm vi khuẩn lactic Để đảm bảo chế phẩm thu hồi vẫn chứa các tế bào vi khuẩn lactic còn sống, có hoạt lực lên men lactic cao, chúng tôi chọn các phương pháp sấy nhanh, sấy ở nhiệt độ thấp để tách nước ra khỏi dịch sau lên men để tạo ra chế phẩm vi khuẩn lactic ở dạng khô. Do đó, chúng tôi đã sử dụng 3 phương pháp sấy đặc biệt để tạo chế phẩm là:  Sấy phun  Sấy chân không  Đông khô Chế phẩm vi khuẩn lactic sau khi thu được ta tiến hành xác định khả năng lên men và hoạt lực của chủng. Việc xác định này giúp ta tìm ra phương pháp sấy thích hợp nhất. Đối với các phương pháp đông khô và sấy chân không ta cần trộn thêm vào dịch lên men những chất độn để tăng khả năng chịu nhệt của vi khuẩn, có nghĩa là làm tăng khả năng sống sót của vi khuẩn lactic sau quá trình sấy. Các chất độn ở đây với phương pháp đông khô là: sữa gây 30% (đối với chủng Lc340) lactoza 30% và pepton 1%(với chủng TL6). Chất độn dùng cho phương pháp sấy chân không là: sữa gầy, tinh bột, glucoza (với TL6 ta chỉ dùng tinh bột và glucoza) Kết quả được thể hiện trong bảng 13 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 45 Bảng 13: Kết quả sấy sinh khối vi khuẩn bằng các phương pháp khác nhau đối với chủng Lc340 và TL6 Phương pháp sấy Đông khô T= -86 o C t=48h Sấy chân không T=40 o C t=4h Sấy phun Tvao=40 o C Tra=30 o C t=1h Không chất độn Có chất độn Có chất độn Không chất độn Lc.340 M1 M2 M3 M4 Lượng sinh khối ẩm (g) 4 7,15 12,4 4,8 Lượng sinh khối khô (g) 0,89 1,63 2,8 0,94 Độ ẩm (%) 5,2 4,7 9,06 8,02 Tỉ lệ sống sót (%) 30 53 45 41,8 Hiệu suất thu hồi (%) 85 87 80,9 72,3 Tl6 Lượng sinh khối ẩm (g) 3,6 11,3 11,4 4,56 Lượng sinh khối khô (g) 0,78 2,5 2,5 0,89 Độ ẩm (%) 5,1 5 9,3 8,8 Tỉ lệ sống sót (%) 32 52 46 43,2 Hiệu suất thu hồi (%) 83 85 80 71 Khi sấy sinh khối vi khuẩn để tạo chế phẩm có bổ sung chất độn thì khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn tăng lên. Có nghĩa là khả năng sống và hoạt lực của chủng đem sấy sẽ tốt hơn. Với các phương thức sấy, ta thấy sấy phun cho chế phẩm có tỷ lệ sống sót, hiệu suất thu hồi thấp, độ ẩm tương đối thấp, thời gian sấy ngắn. Với phương pháp đông khô thì có tỷ lệ sống sót, hiệu suất thu hồi cao nhưng thời gian sấy dài, không kinh tế. Do đó, phương pháp này cũng không nên áp dụng vào trong công nghiệp. Còn phương pháp sấy chân không thì tạo chế phẩm có độ sống sót cao, hiệu suất thu hồi tương đối lớn, thời gian sấy vừa phải, kinh tế. Cho nên ta nên áp dụng phương pháp sấy Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 46 này để tạo chế phẩm để ứng dụng cho quá trình lên men lactic. Kết luận Chúng tôi đã chọn lựa ra hai chủng vi khuẩn lactic có khả năng tạo sinh khối cao, cho hiệu suất thu hồi sinh khối lớn là Lactococcus lactis TL6 dùng cho muối chua rau quả và Lactococcus lactis Lc.340 dùng trong lên men sữa chua. Kết quả nghiên cứu cho phép xác định được thành phần của môi trường và một vài điều kiện nuôi cấy như sau:  Thay thế 40%-50% nấm men thuỷ phân trên môi trường MRS  Hàm lượng đường : 20-30 g/l  Thời gian : 20-24h  pH :5- 6  Nhiệt độ : 37oC  Tỉ lệ tiếp giống : 1g/l  Nuôi cấy đảo trộn  Loại đường thích hợp cho chủng TL6 là saccaroza và cho Lc.340 là glucoza. Sinh khối thu được cuối cùng được kiểm tra hoạt tính bằng cách ứng dụng lên men sữa và muối chua rau cải bẹ cho kết quả tốt. Kết quả thu được có khả năng ứng dụng trong thực tiễn. Việc sử dụng các chủng vi khuẩn lactic thuần khiết rõ ràng là một biện pháp nhằm ổn định và nâng cao chất lượng của quá trình lên men lactic. Nhờ đó, quá trình lên men diễn ra một cách suôn sẻ, nhanh chóng và ít bị nhiễm tạp. Sản phẩm thu được có chất lượng tốt và ổn định. Như thế, lợi nhuận là một vấn đề nằm trong tầm tay của các nhà sản xuất. Chúng tôi hi vọng rằng đề tài này dần dần sẽ được hoàn thiện thêm ở qui mô thực nghiệm và công nghiệp, đồng thời cũng được ứng dụng thành công vào quá trình lên men lactic các sản phẩm rau quả, thịt, sữa Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 47 Mục lục mở đầu................................................................................................................................ 1 Phần 1: Tổng quan ...................................................................................... 2 1.1. Vi khuẩn lactic ......................................................................................................... 2 1.1.1. Đặc điểm hình thái ............................................................................................ 2 1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá ................................................................................ 3 1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic ........................................................... 3 a. Nhu cầu dinh dưỡng cacbon ............................................................................ 3 b. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ ................................................................................ 4 c. Nhu cầu vitamin .............................................................................................. 5 d. Các chất hữu cơ khác cần cho sự phát triển của vi khuẩn lactic .................... 6 e. Nhu cầu các muối vô cơ .................................................................................. 7 1.1.4. ứng dụng của vi khuẩn lactic ............................................................................ 7 1.2. Quá trình tạo sinh khối vi khuẩn lactic .................................................................... 8 1.2.1. Đường cong sinh trưởng ................................................................................... 8 1.2.2.1. Chủng giống ............................................................................................. 11 1.2.2.2. Thành phần của môi trường nuôi cấy ...................................................... 11 a. Nguồn cacbon................................................................................................ 11 b. Nguồn nitơ .................................................................................................... 11 c. Nguồn muối khoáng. .................................................................................... 11 1.2.2.3. Điều kiện nuôi cấy ................................................................................... 12 a. Nhiệt độ ........................................................................................................ 12 b. pH ................................................................................................................. 12 c. Nồng độ cơ chất ........................................................................................... 13 d. Tỉ lệ tiếp giống ............................................................................................. 13 1.3. Thu hồi sinh khối vi khuẩn bằng các phương pháp sấy ......................................... 13 1.3.1. Sấy phun.......................................................................................................... 13 1.3.2. Phương pháp đông khô ................................................................................... 14 1.3.3. Phương pháp sấy chân không ......................................................................... 15 Phần II Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ...................................................... 16 2.1. Nguyên liệu, hoá chất và thiết bị ........................................................................... 16 2.1.1. Nguyên liệu ..................................................................................................... 16 2.1.2. Hoá chất .......................................................................................................... 16 2.1.3. Thiết bị ............................................................................................................ 17 2.1.4. Môi trường nuôi cấy ....................................................................................... 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................... 18 2.2.1. Phương pháp vi sinh ....................................................................................... 18 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 48 1/ Hoạt hoá ............................................................................................................ 18 3/ Nhuộm màu Gram ............................................................................................ 18 4/ Kiểm tra khả năng di động ................................................................................ 19 5/ Xác định kiểu hô hấp ........................................................................................ 19 6/ Xác định tỉ lệ sống sót (Phương pháp Kocch) .................................................. 19 2.2.2. Phương pháp hoá lý ........................................................................................ 19 1/Xác định lượng sinh khối vi khuẩn lactic bằng ly tâm ...................................... 19 2/ Xác định lượng sinh khối vi khuẩn lactic bằng đo OD ..................................... 19 2.2.3. Phương pháp hoá học ...................................................................................... 20 1/Xác định hàm lượng N tổng bằng phương pháp Kendan .................................. 20 2/Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp Grassianov ...................... 20 3/Xác định hàm lượng axit lactic .......................................................................... 20 2.2.4. Phương pháp sấy thu hồi sinh khối ................................................................. 20 1/ Sấy phun ........................................................................................................... 20 2/ Sấy đông khô .................................................................................................... 20 3/ Sấy chân không ................................................................................................. 20 2.2.5. Phương pháp toán học .................................................................................... 20 Phần 3 : Kết quả và thảo luận........................................................................................ 21 3.1. Sơ tuyển chủng giống vi khuẩn lactic dùng cho quá trình tạo sinh khối ............... 21 3.1.1. Kiểm tra lại đặc tính của các chủng ................................................................ 22 3.1.2. Nghiên cứu khả năng tạo sinh khối của các chủng vi khuẩn lactic ................ 25 3.2. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối .............................. 27 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................ 27 3.2.2 ảnh hưởng của điều kiện thông khí .................................................................. 29 3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn Nitơ ........................................................... 30 3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường .............................. 31 3.2.5 ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống .......................................................................... 34 3.2.6 ảnh hưởng của pH ............................................................................................ 36 3.3.Tối ưu hoá quá trình tạo sinh khối vi khuẩn lactic. ................................................ 37 3.4. Thu hồi chế phẩm vi khuẩn lactic của chủng Lc.340 và TL6 ............................... 43 3.4.1. Động thái quá trình tạo sinh khối. ................................................................... 43 3.3.2 Thu hồi chế phẩm vi khuẩn lactic .................................................................... 44 Kết luận ............................................................................................................................ 46