Đề tài Nghiên cứu chiết tách chất nhuộm màu thực phẩm từ kinh nghiệm sử dụng thực vật của đồng bào dân tộc thiểu số

ng vào các hướng chủ yếu sau đây: - Điều tra, phát hiện và nghiên cứu chiết tách các chất nhuộm màu thực phẩm từ nguyên liệu tự nhiên, nhưng chủ yếu từ thực vật. Đây là hướng nghiên cứu được đặc biệt quan tâm, bởi chất màu thu được thường có tính an toàn cao, giá thành hạ. Theo hướng nghiên cứu này nhiều chất màu đã được sản xuất và đưa vào ứng dụng (Chất nhuộm màu tím thu từ vỏ quả Nho, chất nhuộm màu đỏ thu từ hoa của cây Điều nhuộm, chất indigotine nhuộm màu xanh thu từ lá cây Chàm...) - Nghiên cứu bán tổng hợp chất nhuộm màu từ các hợp chất thu nhận từ thực vật. Đây là hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng, có thể sản xuất nhiều chất màu khác nhau. Tuy nhiên giá thành sản phẩm cao và đòi hỏi công nghệ phức tạp. Mặc dù vậy, hiện nay nhiều chất màu đang sử dụng được sản xuất theo hướng này (Beta Carotenal, Beta- apro-carotenal...). Các chất nhuộm màu thực phẩm bán tổng hợp thường thuộc họ Carotene, họăc nhóm monoazo. - Nghiên cứu sản xuất chất nhuộm màu thực phẩm bằng công nghệ sinh học: đây là hướng nghiên cứu đang được triển khai ở một số nước có trình độ kỹ thuật cao. Theo hướng nghiên cứu này, các nhà nghiên cứu đang thử nghiệm thu nhận chất nhuộm màu từ nuôi cấy mô một số loài thực vật (Aralia armata,...), hoặc sử dụng một số hệ men, một số loài vi khuẩn để 20 chuyển hoá hợp chất hữu cơ thành chất màu. Tuy nhiên, hướng nghiên cứu này cho tới nay chưa đạt được kết quả thực tế. - Tổng hợp các chất vô cơ không có độc tính để nhuộm màu cho thực phẩm. Đây là hướng nghiên cứu được tiến hành từ lâu. Mặc dù vậy, các chất vô cơ có thể sử dụng cho thực phẩm còn rất hạn chế. Hiện nay các chất vô cơ được phép dùng cho thực phẩm mới chỉ có một số oxít sắt: FeO(OH)xH2O (màu đỏ), FeO.Fe2O3 (màu đen), FeO(OH).xH2O (màu vàng),…. Xu hướng hiện nay của thế giới là hạn chế dùng các chất nhuộm màu có nguồn gốc vô cơ trong công nghiệp thực phẩm. Do những tiêu chuẩn chặt chẽ về mức độ an toàn, cho tới nay thế giới mới chỉ thừa nhận 73 hợp chất (hoặc dịch chiết, phức chất) là chất nhuộm màu cho thực phẩm. Trong số này một số hợp chất chỉ được phép sử dụng trong một số quốc gia nhất định. Hiện nay có một số loại cây cho chất nhuộm màu thực phẩm được trồng và khai thác với số lượng lớn ở một số nước. Một vài sản phẩm trong số đó như "Cutch", là nước chiết sấy khô của cây Acacia catechu. Lượng sản xuất hàng năm trên thế giới của Cutch khoảng 6.000 - 9.000 tấn/ năm trong đó lượng được xuất- nhập khẩu giữa các nước khoảng 1.500 tấn/ năm. Nước sản xuất chính là Ấn Độ (các nước cũng sản xuất nhưng với số lượng ít hơn là Pakistan, Bangladesh, Myanmar và Thái lan), nước nhập khẩu chính là Pakistan. Trước đây, vào những năm giữa của thập kỷ 70, hàng năm các nhà máy công nghiệp của Ấn Độ đã sử dụng tới 63.000 tấn gỗ nguyên liệu. Trong thời gian từ 1988- 1993, Ấn Độ đã xuất sang Pakistan 1.000- 1.300 tấn/ năm. Ngoài Cutch ra, còn có một sản phẩm tự nhiên khác cũng được sản xuất và sử dụng với số lượng lớn, đó là Annatto (được lấy từ cây Điều nhuộm- Bixa orellana). Lượng sản phẩm trên thế giới hàng năm khoảng 10.000 tấn, lượng sản phẩm tham gia mậu dịch khoảng 7.000 tấn. Nước xuất khẩu chính các sản phẩm Annatto là Peru và Kenya, các nước nhập khẩu chính là Mỹ, Nhật và một số nước Đông Âu. Một số cây khác được trồng để làm nguyên liệu sản xuất các chất màu thực phẩm là: Indigofera tinctoria, Tagetes erecta, 21 Lawsonia inermis, Curcuma longa, Crocus sativus, Gardenia jasminoides, Medicago sativa, ... Riêng ở vùng Andhra Pradesh của Ấn Độ các cây sau được trồng với số lượng tương đối nhiều: Bixa orellana (1.200 ha), Indigofera tinctoria (800 ha), Tagetes erecta (120 ha) và Lawsonia inermis (20 ha). Bên cạnh việc sử dụng các chất màu thu được bằng các cách truyền thống thì ngày nay người ta còn áp dụng các kỹ thuật hiện đại để tăng nhanh quá trình tổng hợp tự nhiên. Trên thế giới trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu mới đã áp dụng công nghệ sinh học trong việc nâng cao sản lượng tổng hợp các chất màu tự nhiên. Các phương pháp mới chủ yếu dựa vào việc nuôi cấy tế bào các loài thực vật, vi sinh vật đã xác định là có các thành phần sắc tố được dùng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Năm 1995, Ajinomoto đã cho ra một phương pháp điều chế màu đỏ tự nhiên bằng cách nuôi cây mô sần của các cây thuộc chi Aralia (loài cho kết quả tốt nhất là Aralia cordata). Chất màu này được tổng hợp trong bóng tối, chất màu được tiết ra môi trường nuôi cấy. Năm 1995, Kondo T đưa ra phương pháp sản xuất anthraquinone từ một số cây thuộc họ cà phê (Rubiaceae). Tế bào được nuôi trong môi trường có nguồn Cac bon (C), muối vô cơ và muối Can xi (Canxi chloride hoặc Canxi nitrate) với nồng độ 5- 90mM/l. Lá Rubia akane được cắt thành những mảnh nhỏ và đưa vào một môi trường nuôi cấy có pH 5,8, các muối vô cơ (3 mM/l CaCL2), vitamin, 2,4- D, kinetin, đường mía và thạch... Sản lượng lớn anthraquinone được sản xuất ra ở các nồng độ CaCL2 từ 5- 90 mM/l. Narisu- Keshohin, 1991 đưa ra phương pháp sản xuất chất màu bằng cách nuôi cấy mô của lá cây Oải hương (Lavandula angustifolia). Nuôi tế bào trong điều kiện có ánh sáng thì cho hiệu suất cao hơn. Với phương pháp này sản phẩm được tạo ra ở dạng vảy lớn với hiệu suất cao. Phương pháp sản xuất màu đỏ hoa rum bằng nuôi trồng mô sần Hồng hoa (Carthamus tinctorius), Mitsui- Eng. Shipbldg được đề xuất vào năm 1990. Màu đỏ hoa rum được điều chế bằng cách nuôi mô sần hoa rum trong môi trường 22 kiềm, chất màu được tiết vào môi trường nuôi cấy. Chất màu này là màu tự nhiên, có màu sắc đẹp và ổn định . Các nghiên cứu về chất màu thực phẩm tự nhiên không chỉ được tiến hành đối với các loài thực vật mà còn được nghiên cứu đối với các tế bào vi sinh vật. Một số chi được quan tâm nhiều là Aspergillus, Pseudomonas... Năm 1996, Kasenkov O. I. đưa ra một phương pháp điều chế chất nhuộm thực phẩm màu đỏ từ các nguyên liệu thực vật. Theo phương pháp này các nguyên liệu thực vật phải được nghiền nát và tẩy trùng, sau đó ngâm trong môi trường lên men bởi Aspergillus, cuối cùng chúng được chọn lọc và cô đặc. Nguyên liệu thực vật là thành phần môi trường để nuôi cấy các loài thuộc chi Trichoderma (tốt nhất là Trichoderma koningi và Trichoderma longibrachiatum). Sử dụng phương pháp này, môi trường được đơn giản hoá và hiệu suất chất màu được tăng lên đáng kể. Cùng sử dụng Pseudomonas để sản xuất ra các sản phẩm màu, House- Food (1991) đã chỉ ra một số dòng có thể cho ra sản phẩm với hiệu suất cao. Các dòng đó là FERM BP- 2933, FERM BP- 2932. Trong dung dịch nuôi cấy Linsmaier- Skoog nếu có thêm một loại thực vật nhất định và muối sắt thì chúng có thể cho tới trên 400 ug sản phẩm/ ml. Chất màu ferropyrimine có thể thu trực tiếp từ môi trường nuôi cấy. Loài thực vật được chọn có thể thuộc các họ như: Liliaceae, Cruciferae, Polygonaceae, Leguminosae, Solanaceae và Gesneriaceae. Sử dụng các chất màu thực phẩm do có quan hệ trực tiếp đến sức khoẻ và tính mạng con người. Vì vậy ở nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ đã ban hành luật về sử dụng chất màu trong thực phẩm. Trong các Bộ luật về chất màu thực phẩm, các chất màu có nguồn gốc là sắc tố thực vật (chất mầu tự nhiên) được quy định ưu tiên. Ví dụ : điều Điều 26 trong Luật sử dụng chất màu của Ấn Độ : Điều 26: Các chất màu tự nhiên được sử dụng. Trừ những trường hợp được quy định cụ thể trong bộ luật này, các yếu tố màu tự nhiên cơ bản sau đây được sử dụng trong các loại thực phẩm. 1. Beta-carotene 2. Beta-apo-8-carotenal 3. Axit Methylester of Beta-apo-8' carotenoic 4. Axit Ethylester of Beta-apo-8' carotenoic 23 5. Canthaxanthin 6. Chlorophyll 7. Riboflavin (Lactoflavin) 8. Caramel 9. Annatto 10. Saffron 11. Curcumin (or turmeric) Danh mục các chất nhuộm màu thực phẩm trên thế giới được quy đinh chặt chẽ về Mã số và giới hạn sử dụng. Theo quy định của Liên minh Châu Âu (EU), các CMTP có mã số từ E100 đến E172. Đây là quy chế được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Tuy nhiên, Australia và một vài nước thuộc khu vực Thái Bình Dương sử dụng hệ thống Mã số với chữ đầu là A, nhưng ít được sử dụng. Luật sử dụng chất màu thực phẩm ở châu Âu cũng quy định rõ các sản phẩm màu được sử dụng trong chế biến thực phẩm. Tuy vậy, mỗi quốc gia có thể có quy định riêng cho từng chất cụ thể . Vì thế, có một số chất màu ở đây không được sử dụng trên tất cả các nước trong cộng đồng châu Âu (E 128 red 2F, E129 allura red, E133 brilliant blue FCF, E154 brown FK, E155 brown HT), hoặc được sử dụng nhưng hạn chế (ở Đức, các chất sau bị hạn chế sử dụng: E102 tartrazine, E110 sunset yellow, E123 amarnath, E127 erythrosine). Ở Đức cũng như ở một số nước khác có đưa ra danh sách các thực phẩm được sử dụng chất màu. Trong luật sử dụng chất màu thực phẩm ở châu Âu, các phụ lục từ II- V có đưa ra chi tiết về các thực phẩm đó. Tóm lại, hiện nay nghiên cứu chất màu thực phẩm trên thế giới được quan tâm rất lớn ở nhiều quốc gia với nhiều hướng nghiên cứu mới. Trong các hướng nghiên cứu đó, tìm kiếm và chiết tách chất màu từ thực vật vẫn được ưu tiên hàng đầu trong các nghiên cứu. 24 II. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN, PHƯƠNG PHÁP LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II. 1. Địa điểm nghiên cứu Các cuộc điều tra thực địa để thu thập thông tin, kinh nghiệm, tri thức nhuộm màu được tiến hành tại các cộng đồng người dân tộc thiểu số ở các địa phương sau: - Tại cộng đồng người Khơ mú, xã Nà Tấu, huyện Điện Biên, Tỉnh Điện Biên. - Cộng đồng người Thái tại xã Nà ớt, Chiềng Yên, (Mai Châu, tỉnh Sơn La). - Cộng đồng người Tày tại xã Việt Lâm (Vị Xuyên, Hà Giang), xã một số xã thuộc huyện Tràng Định và Cao Lộc (Lạng Sơn), - Cộng đồng người Dao và Hmông tại các xã Bản Khoang, Sa Pả, Tả Phìn (Sapa, Lào Cai), Nà Hang (Tuyên quang). - Cộng đồng người Tày-Nùng-Pa dí-Tu dí,… thuộc các xã Mường Khương, Pha Long (Mường Khương, Lào Cai) Nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành tại Viện Sinh thái – Tài nguyên sinh vật (Viện KHCNVN) và Viện Dược liệu (Bộ Y tế) và Bộ môn Hóa Hữu cơ (ĐH Bách khoa Hà Nội). II. 2. Thời gian nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành trong hai năm: từ tháng 10 năm 2003 đến tháng 10 năm 2005. III. 3. Phương pháp luận và phương pháp nghiên cứu Phương pháp luận: Theo nguyên tắc nghiên cứu thực vật dân tộc học (Ethnobotany) các cây thực phẩm dân tộc thuộc nhóm ưu tiên trong các nghiên cứu sàng lọc, bới đã được thực tế chứng minh và đào thải. Các kinh nghiệm được sử dụng đến ngày nay chứng tỏ đây là các sản phẩm không độc hại với người dùng. Tuy nhiên không phải bất cứ kinh nghiệm nào của các dân tộc cũng có thể ứng dụng với sự kết hợp khoa học hiện đại. Vì vậy, về nguyên tắc, các tri thức, 25 kinh nghiệm bản địa là khởi đầu hiệu quả nhất cho các nghiên cứu sàng lọc và phát triển. Trong quá trình nghiên cứu, các phương pháp sau đây được sử dụng: a. Phương pháp nghiên cứu thực vật Các nghiên cứu về thực vật được thực hiện theo theo các phương pháp điều tra truyền thống. Mẫu vật được cố định tạm thời tại thực địa bằng dung dịch Ethanol 50%, sau đó được được làm tiêu bản cố định. Các tiêu bản được lưu giữ và định tên tại viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật. b. Phương pháp điều tra thu thập thông tin Nhằm thu thập các thông tin, kinh nghiệm chế biến và sử dụng thực vật để nhuộm màu cho thực phẩm trong các cộng đồng dân cư của nước ta. Để thu các thông tin, số liệu của lĩnh vực này, đã sử dung các phương pháp điều tra thực vật dân tộc học và xã hội học, bao gồm: - Phương pháp phỏng vấn (phỏng vấn mở, phỏng vấn sâu và phỏng vấn kiểm tra) - Phương pháp lập phiếu điều tra - Phương pháp tái hiện tri thức và kinh nghiệm c. Phương pháp chiết tách và nghiên cứu chất màu Sử dụng các phương pháp chiết tách phổ biến trong nghiên cứu hoá học với các hệ dung môi khác nhau. Các dung môi sử dụng trong các thí nghiệm chiết tách gồm: ethanol, ethanol-nước, ether petrol. Chiết tách được tiến hành trong điều kiện chiết nóng và chiết lạnh. Đồng thời sử dụng phương pháp Sắc ký lớp mỏng để tách các phức hợp màu và so sánh thành phần các sản phẩm màu với các hệ dung môi sau: - ethylacetic: acid acetic: acid formic: nước (10:1:1:2), - n-butanol: a. acetic: nước (4:1:2), - n-butanol: ethanol: amoniac: nước (7:2:2:2) Độ bền màu được đánh giá với tác động của các yếu tố - thời gian: theo rõi từ khi chiết tách tới hết 12 tháng 26 - nhiệt độ: đun sôi chất màu (100 oC) trong 120 phút - pH: nghiên cứu trong các môi trường pH từ 3 tới 11. d. Phương pháp đánh giá độc tính Độc tính của chế phẩm được đánh giá tại Viện Dược liệu, Bộ Y tế, thông qua độ độc cấp tính. Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng thuần chủng (SWISS) trọng lượng 20-22 gam do Trung tâm chăn nuôi, Viện Quân y 103 cung cấp. Liều bán cấp (50% chuột chết) được tính theo phương pháp Behrens-Karber (chi tiết phương pháp ghi trong Phụ lục) 27 III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN III.1. Kinh nghiệm sử dụng các loài cây để nhuộm màu thực phẩm của đồng bào dân tộc thiểu số miền Bắc Việt Nam a. Thành phần loài cây nhuộm màu Cho tới nay đã điều tra phát hiện và ghi nhận 46 loài thực vật bậc cao thuộc 27 họ thực vật được đồng bào các dân tộc thiểu số ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam sử đụng để nhuộm màu thực phẩm (Xem chi tiết trong phụ lục). Trong số này, một số loài (khoai vạc, mận, ngấy,…) thực chất là các loại thực phẩm có màu được sử dụng để nhuộm màu cho các loại thực phẩm khác. Mặc dù số lượng loài cây nhuộm màu được phát hiện không lớn, nhưng với kinh nghiệm truyền thống người ta có thể nhuộm thực phẩm thành hầu hết các màu trong tự nhiên (Bảng 2) Bảng 2. Phân nhóm các cây theo màu nhuộm (theo kinh nghiệm sử dụng) tt Màu nhuộm Số loài Các loài quan trọng 1 Đỏ 14 Gấc, Bụp dấm, Vang, Dền đỏ, Diễn (lá) 2 Hồng 2 Sim (hoa), Cẩm 3 Tím tươi 6 Cẩm, Mồng tơi, … 4 Tím đen 1 Cẩm (mẫu Tuyên Quang) 5 Nâu 1 Rè hoa đẹp 6 Xanh lá cây 9 Gừng (lá), Bồng bồng (lá), Dứa thơm (lá), Chít (lá) 7 Xanh rêu 2 Mơ leo (lá), Rau khúc (lá) 8 Xanh đậm 1 Đậu biếc 9 Vàng 11 Nghệ (củ), Mật mông (hoa), Cẩm, Vang (gỗ), Lõi thọ (hoa), Gạc nai (gỗ), Núc nác (gỗ) 10 Đen 6 Sau sau (lá), Gai (lá), Núc nác (than), Lúa (than), Muối (than), 28 Qua thống kê, thấy rõ rằng số loài dùng để nhuộm màu đỏ và vàng có số lượng lớn (tương ứng 14 và 11 loài); trong khi đó số lượng loài để nhuộm các màu nâu, xanh đậm và tím đen chỉ có 1 loài cho mỗi sắc màu. Điều này phần nào thể hiện thực tế tồn tại hợp chất có màu trong giới thực vật. Đáng chú ý là trong số các loài để nhuộm thực phẩm thành màu đen, chỉ có 3 loài chứa hợp chất tự nhiên cho màu đen (vỏ hạt đỗ đen, lá cây sau sau và lá cây gai), các loài còn lại được sử dụng dưới dạng than gỗ. Trong thực tế số lượng các loài cây được sử dụng phổ biến để nhuộm màu không nhiều. Một số loài chỉ được sử dụng trong một cộng đồng rất hẹp. Các loài cây nhuộm màu phổ biến trong hầu hết các dân tộc thiểu số gồm có: - Các loài cây dùng để nhuộm màu vàng: Nghệ vàng, Mật mông - Các loài cây dùng để nhuộm màu đỏ: Gấc, Cẩm, gỗ Vang - Các loài cây dùng để nhuộm màu xanh: Bồng bồng, Mơ dây, Dứa thơm - Các loài cây dùng để nhuộm màu tím: Cẩm, Mồng tơi - Các loài cây dùng để nhuộm màu đen: Sau sau (lá), Núc nác (than gỗ), cây Muối (than gỗ). Với cây Gai, lá được sử dụng phổ biến tại các vùng đồng bằng để làm bánh gai, nhưng rất ít được đồng bào dân tộc thiểu số sử dụng. Trong số các loài cây đã nghiên cứu, một số loài có sự đa dạng rất lớn về sắc màu. Nổi bật nhất trong nhóm này là loài Cẩm (Pristrophe bivalvis) thuộc họ Ô rô (Acanthaceae). Từ các mẫu thu tại một số địa phương, hiện đã phân biệt được 5 chủng hóa học (chemotype) theo các màu khác nhau (Bảng 2). Ngoài ra, hiện tượng này cũng gặp thấy ở loài Vang (Caesalpinia sappan) với 2 chủng màu đỏ (thu tại Cao Lộc, Lạng Sơn) và màu vàng (thu tại Sơn La). So với các kết quả trước đây đã công bố (Lưu Đàm Cư, 1995, 2002, 2003) chủng Cẩm cho màu vàng lần đầu tiên được phát hiện tại Việt Nam và thế giới. Bảng 3. Đa dạng sắc màu của loài Peristrophe bivalvis Tên Màu sắc Nơi thu mẫu P. bivalvis No.1 Đỏ tươi Hòa Bình, Lào Cai P. bivalvis No.2 Tím đen (thẫm) Na hang (Phú thọ) 29 P. bivalvis No.3 Tím tươi Mai Châu (Sơn La), Sa Pa (Lào Cai), Nà Tấu (Điện Biên) P. bivalvis No.4 Đỏ nâu Mường khương (Lào Cai) P. bivalvis No.5 Vàng Mường Khương, Sa Pa (Lào Cai) Ngoài loài Cẩm (P. bivalvis), loài gỗ Vang (Caesalpinia sappan L.) cũng phát hiện thấy các mẫu cho màu vàng (thu tại Chiềng Yên, Sơn La) và các mẫu cho màu đỏ tươi (thu tại Cao Lộc, Lạng Sơn). Như vậy, tiềm năng về chất nhuộm màu trong hệ thực vật Việt Nam rất lớn, không chỉ biểu thị ở số lượng các loài cây chứa chất nhuộm màu, mà trong mỗi loài cũng có thể cho nhiều chất màu khác nhau. Nhìn chung, do thời gian và địa điểm điều tra còn hạn chế, kết quả thu được mới chỉ là kết quả ban đầu. Trong tương lai số lượng các cây nhuộm màu thực phẩm truyền thống của Việt Nam chắc chắn sẽ còn tăng thêm trong các nghiên cứu sau này. Trong số các cây nhuộm màu thực phẩm nêu trên, một số loài được phát hiện lần đầu tiên, tới nay chưa được giới thiệu trong các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước (Lõi thọ, Rè hoa đẹp, chủng Cẩm cho màu vàng). b. Kinh nghiệm sử chế biến cây nhuộm màu của đồng bào dân tộc thiểu số Tất cả các dân tộc ở Việt Nam đều biết sử dụng thực vật để nhuộm màu trong quá trình chế biến thực phẩm. Tuy nhiên, qua thực tế điều tra có thể nhận thấy dân tộc Dao, Tày Nùng và Giáy là các cộng đồng thiểu số có nhiều kinh nghiệm đặc sắc trong lĩnh vực nhuộm màu thực phẩm. Bới lẽ nhuộm màu thực phẩm với họ không chỉ là vấn đề ẩm thực mà còn gắn truyền thống văn hoá và tâm linh (xôi trai-gái của người Giáy, xôi cúng mừng thọ của người Dao, xôi cúng năm mới của người Nùng,…). Để chiết tách hất màu khỏi nguyên liệu, hiện nay đồng bào các dân tộc thiểu số chủ yếu sử dụng phương pháp chiết bằng dung môi nước. Với kỹ thuật này, có thể chia ra 2 nhóm chính : 30 - Chiết bằng dung dịch nước nóng: Thường sử dụng với các loại nguyên liệu mà chất màu ở dạng liên kết chỉ hiện màu sau khi đun (ví dụ Cẩm, Sau sau), hoặc chất màu không bị biến đổi ở nhiệt độ cao (hoa Lõi thọ, gỗ Vang,…). Phương thức phổ biến được sử dụng thường là đun nguyên liệu trong nước tới sôi trong khoảng thời gian thích hợp với từng loại. - Phương pháp chiết lạnh : Thường giã nát nguyên liệu trong nước lạnh sau đó lọc để thu dịch chiết có chất màu. Một số loại nguyên liệu chứa chất màu dễ bị biến đổi ở nhiệt độ cao (màu tím trong quả Mồng tơi, màu hồng trong cánh hoa Sim) thường được chiết theo phương hức này. Với các màu thuộc nhóm này, chỉ sử dụng vào giai đoạn cuối cùng của quá trình chế biến thực phẩm (ví dụ: cho dịch màu vào xôi khi đã đun chín gạo và đảo đều). Ngoài ra, một số loại cây được sử dụng như một loại thực phẩm màu để nhuộm màu (không chiết tách chất màu). Trong trường hợp này, nguyên liệu có màu được trộn lẫn với thực phẩm để tạo mầu cho thực phẩm (giã lá Mơ leo, lá Bánh khúc với bột làm bánh màu xanh, …) Phân tích két quả điều tra, có thể nhận thấy đồng bào dân tộc thiểu số có khả năng phối chế các cây nhuộm màu để tạo ra các màu theo ý muốn. Nhìn chung, kỹ thuật phối chế chất màu theo 3 nguyên tắc sau : i. Tạo màu bằng điều chỉnh pH môi trường Phương pháp thường dùng nhất là sử dụng nước muối măng chua để làm thay đổi pH của dịch chiết chất màu và qua đó làm thay đổi màu sắc của màu nhuộm. Thường được sử dụng phương pháp này để tạo các màu vàng đậm, vàng cam từ các dịch nhuộm có màu vàng tươi chiết từ củ Nghệ (Curcuma longa) và hoa Mật mông (Buddleja officinalis) khi đun với tro bếp. Thí nghiệm với dịch chiết từ củ Nghệ (Curcuma longa) cho thấy với thang pH từ cao xuống thấp (từ kiềm sang axit) màu sắc chuyển dần từ màu vàng tươi sang vàng đậm. Như vậy, cùng một loại nguyên liệu với các pH môi trường khác nhau có thể thu nhận được các màu sắc khác nhau. Kinh nghiệm này phù hợp với các quy định sử dụng chất màu trong các sản phẩm thực phẩm được chế biến trong các quy trình công nghiệp. ii. Tạo màu bằng kỹ thuật phối chế nguyên liệu 31 Đây là kinh nghiệm độc đáo của các dân tộc thiểu số lần đầu tiên được ghi nhận trong các cuộc điều tra tri thức bản địa ở Việt Nam. Với kỹ thuật truyền thống người dân tộc thiểu số phối chế một số loài cây khác nhau để tạo ra các màu không có sẵn trong nguyên liệu, thậm chí không có mặt trong cơ thể thực vật. Ví dụ : - Để tạo màu xanh cổ vịt cho thực phẩm, dùng dịch chiết từ cây Mật mông để nhuộm gạo thành màu vàng, sau đó gạo đã nhuộm màu được ngâm tiếp vào dung dịch thu được từ việc giã sống lá cây cẩm với tro bếp. - Để nhuộm xôi có màu xanh da trời, gạo được ngâm trong dịch chiết chủa cành lá cây Cẩm giã sống (tươi) với tro bếp. Kết quả thực nghiệm cho thấy, khi bổ sung tro bếp vào quá trình chế biến, dung dịch màu có pH thường bằng 9. Với môi trường kiềm, các hợp chất thuộc nhóm anthoxyanin thường hiện màu tím-xanh hoặc xanh. Tuy nhiên trong các trường hợp này, còn có vai trò của các ion (Ca++, Na+) trong than củi, nhưng chưa được làm rõ. iii. Tạo màu bằng chế biến nguyên liệu : Theo cách này, từ một loại nguyên liệu cho các sắc màu khác nhau khi chế biến khác nhau. Ví dụ : Lá Cẩm (Mường Khương) đun tươi cho màu tím tươi, nếu phơi tái hoặc sao cho tái đun sẽ cho màu tím đậm. Sự thay đổi màu sắc ở đây liên quan tới quá trình chuyển hoá các hợp chất hữu cơ thông qua hoạt hoá các hệ men. Nhìn chung tri thức và kinh nghiệm chế biến các cây nhuộm màu của các dân tộc thiểu số ở Việt Nam rất phong phú và độc đáo. Với thời gian hạn chế, các kết quả thu được mới chỉ là một phần của nguồn tri thức vô giá này. Nghiên cứu bản chất khoa học của các tri thức, kinh nghiệm dân tộc là vấn đề lý thú nhưng rất rất phức tạp. Đây là những kết quả lần đầu tiên được ghi nhận, cần được nghiên cứu sâu sắc trong thời gian tới. 32 III. 2. Nghiên cứu chiết tách chất màu từ nguyên liệu thực vật a. Nguyên cứu sàng lọc các loài cây cho chiết tách chất màu Để có thể sử dụng làm nguyên liệu cho công nghệ chiết tách chất màu, các loài cần đạt các tiêu chí sau : - Hàm lượng màu trong nguyên liệu đủ lớn đáp ứng kỹ thuật chiết tách - Chất màu bền vững trong quá trình chiết tách. - Màu nhuộm đáp ứng nhu cầu sử dụng. Ngoài các tiêu chí trên, việc lựa chọn các loài dùng để chiết tách còn thoả mãn các điều kiện sau : - Là các loài cây hoang dại có khả năng cung cấp nguyên liệu ổn định (Mật mông), thường được người dân trồng để sử dụng, dễ trồng và cho năng suất cao (Cẩm, Đậu biếc). - Chất màu thuộc nhóm ưa nước (với các chất màu phải dùng dung môi đắt tiền không được lựa chọn trong khuôn khổ đề tài này) Từ kết quả phân tích, các loài cây sau đây được lựa chọn để nghiên cứu chiết tách chất màu sử dụng cho thực phẩm (bảng 4) Bảng 4. Danh lục các cây sử dụng để nghiên cứu chiết tách chất màu tt Tên cây Loại nguyên liệu Màu nhuộm 1 Mật mông (B.officinalis) Hoa Vàng 2 Đậu biếc (Critoria ternatea) Hoa Xanh đậm 3 Cẩm (Peristrophe bivalvis) Cành lá Tím Đây là 3 loài cây có thể sử dụng làm nguyên liệu chiết tách chất màu có triển vọng thực tế. Ngoài 3 loài nêu trên, còn các loài khác có khả năng làm nguyên liệu để sản xuất chất màu tự nhiên nhưng chưa được nghiên cứu. 33 b. Nghiên cứu chiết tách chất màu từ nguyên liệu thực vật b1. Lựa chọn các hệ dung môi cho kỹ thuật chiết tách Các hệ dung môi được nghiên cứu gồm: Cồn (ethanol 90%), n-hexan, và nước nống. Dung môi được lựa chọn cho chiết tách 3 loài cây nghiên cứu là nước nóng, với các lý do sau: - Các nguyên liệu được chiết bằng nước nóng (đun sôi trong 60 phút) và rút kiệt trong 3 lần liên tiếp không còn chứa chất màu (kiểm tra bằng các hệ dung môi khác). - Trong thực tế, người dân tộc thiểu số cũng chiết chất màu theo phương pháp này (chỉ dùng dung môi nước nóng hoặc lạnh). - Sử dụng nước nóng để chiết cho sản phẩm giá thành hạ, không độc hại, có độ an toàn công nghiệp cao nếu tổ chức sản xuất công nghiệp. -b.2. Nghiên cứu kỹ thuật chiết tách chất màu từ nguyên liệu thực vật. Xác định nguyên liệu: - Nguyên liệu để chiết tách chất màu từ cây Mật mông là hoa phơi khô. Với loài này, chất màu phân bố cả trong lá, hoa và thân cây, nhưng hàm lượng trong lá, thân không đáng kể. - Nguyên liệu chiết chất màu từ cây Đậu biếc là hoa (cánh hoa) và chỉ sử dụng cánh hoa vì các bộ phận khác không chứa chất màu. Nguyên liệu có thể dùng tươi hoặc khô, tuy nhiên nếu dùng hoa khô sẽ thuận lợi cho thí nghiệm do chủ động nguyên liệu. - Nguyên liệu để chiết chất màu từ cây cẩm là lá tươi. Với loài này chỉ dùng lá tươi, nếu để khô chất màu thuộc nhóm anthocyan sẽ bị biến đổi. Kỹ thuật chế biến lá cẩm khô không làm biến đổi anthocyan hiện đang được Phòng Thực vật dân tộc Viện STTNSV nghiên cứu. 34 Kỹ thuật chiết tách: Bước 1 : Chiết chất màu thô từ nguyên liệu Nguyên liệu đun trong bình cầu tỷ lệ 0,5 kg nguyên liệu + 2 lít nước, sôi trong 60 phút. Dùng bơm chân không rút hết dịch chiết, sau đó cho nguyên liệu vào đun lần 2 trong 30 phút. Tiếp tục lặp lại quá trình chiết rút cho tới khi dịch chiết không còn màu. Trong thực tế, sau lần chiết thứ 3 nguyên liệu hầu như đã bị rút kiệt chất màu. Trong các thí nghiệm không sử dụng bơm chân không để rút dịch, có thể phải chết tới 5 lần. Bước 2: Cô đặc dịch chiết Tất cả dịch chiết các lần được gộp chung và cô cách thủy tới dạng cao mền, sau đó sấy ở nhiệt độ thấp (45-500C) tới khô. Trong giai đoạn sấy khô, không được sấy ở nhiệt độ cao (trên 500C) chất màu có thể biến đổi. Do chất màu được chiết từ nguyên liệu bằng nước nóng, chế phẩm thu được ngoài các chất có màu chủ yếu thuộc nhóm anthocyanin còn có một số chất hữu cơ khác (gluxit, protein,…). Quá trình sấy khô dịch chiết thường kéo dài, ở nhiệt độ cao các chất thuộc nhóm gluxit dễ chuyển thành caramen làm cho màu của chế phẩm bị tối. Để tránh hiện tượng này, một số nước chỉ sản xuất chất màu ở dạng dịch chiết cô đặc (đối với chất màu tím thu từ vỏ quả Nho, hoặc màu đỏ thu từ quả Ớt). Để chế phẩm màu có chất lượng tốt, cao mền được sấy trong thiết bị hút chân không ở nhiệt độ thấp. Sau khi sấy, tán nhỏ chất màu thành bột, đóng gói hoặc tiếp tục xử lý để nâng cao chất lượng. Bước 3: Loại tạp chất từ chất màu thô Chất màu thu được từ phương pháp chiết nước thường có độ tinh khiết không cao, do có lẫn một số hợp chất hữu cơ tan trong nước (proteins, gluxit,…). Trong thực tế sản phẩm trên có thể được sử dụng để nhuộm màu cho thực phẩm, nhưng hay bị vón cục trong quá trình bảo quản. Vì vậy, để nâng cao chất lượng., sử dụng hỗn hợp dung môi nước: ethanol (4:6) để loại bỏ tạp chất. Cô đặc và sấy khô dịch chiết sẽ thu được chế phẩm màu có độ tinh khiết cao hơn. Các thông số kỹ thuật chi tiết của chế phẩm sẽ được nghiên cứu trong thời gian tới. 35 Kết quả chiết tách chất màu chất màu được trình bày trong bảng 5. Bảng 5. Hàm lượng và dạng sản phẩm màu của các loài nghiên cứu tt Tên cây Nguyên liệu Hàm lượng (% Khô KK) Màu sắc Dạng sản phẩm 1 Mật mông Hoa khô Thô: 21,00 Loại tạp chất: 10,5 Vàng tươi Vàng tươi Bột khô Bột khô 2 Đậu biếc Hoa khô Thô: 33,0 Loại tạp chất: 28,3 Xanh đậm Xanh đậm Bột khô Bột khô 3 Cẩm Cành, lá tươi* Cành lá khô Thô: 1,75 Thô: 9,72 Tím Tím Bột khô Bột khô Ghi chú: * Với loài Cẩm chỉ dùng lá tươi, nếu để khô chất màu thuộc nhóm anthocyanin sẽ bị biến đổi. Kỹ thuật chế biến lá Cẩm khô không làm biến đổi anthocyanin hiện đang được Phòng Thực vật dân tộc Viện STTNSV nghiên cứu. Như vậy, từ với các thí nghiệm đã tiến hành, có thể rút ra các nhận xét sau: - Cả 3 loài cây nghiên cứu đều có thể sử dụng làm nguyên liệu để chiết chất nhuộm màu cho thực phẩm. Bản chất hoá học của các chất màu hiện đang được nghiên cứu (xem Phụ lục 3,4) - Hàm lượng chất màu thô trong các cây nghiên cứu khá cao. Quy trình tinh chế chất màu hiện chưa được nghiên cứu. Tuy nhiên, theo thông lệ quốc tế các chất màu thực phẩm không yêu cầu là tinh chất. - Các chế phẩm có màu sắc đẹp, dạng chế phẩm (bột khô) là dạng sản phẩm thương mại phổ biến hiện nay và phù hợp với thông lệ quốc tế. 36 III. 3. Nghiên cứu tính ổn định và độc tính của chế phẩm màu a. Tính ổn định sắc màu - Với pH môi trường Đây là đặc tính quan trọng của các chất nhuộm màu, qua đó nhà sản xuất có thể giới hạn sử dụng các sản phẩm trong chế biến các loại thực phẩm. Bảng 6. Biến đổi sắc màu của chế phẩm ở các mức pH khác nhau Chế phẩm pH ≤ 4 pH = 5-9 pH≥ 10 1 Từ Đậu biếc Xanh da trời Xanh đậm Xanh lá cây 2 Từ Mật mông Vàng Vàng Vàng 3 Cẩm Tím Tím Tím Như vậy, với các pH của môi trường khác nhau, chất màu thu từ các mật mông và Cẩm không biến đổi sắc độ. Đối với chất màu thu từ cây Đậu biếc chất màu biến đổi trên phông màu xanh. Việc nghiên cứu sự biến động sắc màu không với mục đích loại bỏ hay phủ nhận sản phẩm mà với mục tiêu định hướng cho việc ứng dụng. Kết quả trên cho phép khảng định, trong các sản phẩm nghiên cứu không có chất nào bị mất màu trong các độ pH (từ rất axit với pH = 3, tới rất kiềm với pH =13). - Với nhiệt độ Trong các thí nghiệm đun chế phẩm hòa tan trong nước ở nhiệt độ sôi (100 0C) trong 180 phút không có chất màu nào bị biến màu hoặc mất màu. Trong khi đó, trên một số mẫu thu từ cây khác để đối chứng đã xảy ra hiện tượng biến đổi màu rõ rệt. Ví dụ: Dịch chiết vỏ quả Thanh long có màu đỏ tươi, nhưng bị chuyển thành màu nâu hoặc đỏ-nâu khi đun ở nhiệt độ trên 700C. - Tính ổn định trong thời gian bảo quản Mức độ ổn định màu sắc trong thời gian bảo quản là một tiêu chí của sản phẩm thương mại. Các chất màu thu được trong nghiên cứu này chưa thấy biến đổi sắc độ trong khoảng thời gian 12 tháng. 37 b. Xác định độc tính của chất màu chiết từ cây Đậu biếc Do kinh phí và thời gian, tới nay mới chỉ tiến hành xác định được độc tính cấp tính từ cây Đậu biếc (Clitoria ternatea) theo quy trình nghiên cứu của Viện Dược liệu (Bộ Y tế), (Chi tiết trình bày trong Phụ lục) Kết quả cụ thể: - Không xác định được liều bán cấp (LD/50) của dịch chất màu chiết từ hoa cây Đậu biếc. - Liều tối đa chuột không chết LD /0 = 100 g/kg (liều đạt 10% trọng lượng cơ thể và không thể tăng hơn) - Trình trạng chuột trong và sau 72 giờ theo rõi: hoạt động và ăn uống bình thường. Kết luận: Dịch chiết chất màu từ hoa đậu biếc có độ an tòan tương đối cao, với liều thí nghiệm khá cao không gây chết hoặc thay đổi trình trạng sinh lý và khả năng hoạt động của chuột thí nghiệm. III. 4. Ứng dụng thử chất màu thực vật trong chế biến một số loại thực phẩm a. Nhuộm màu xôi bằng chất màu chiết từ thực vật Xôi là một loại thực phẩm truyền thống, ở các vùng đồng bằng thường chỉ được nhuộm màu đỏ từ màng hạt gấc (Momordica cochinchinensis). Việc nhuộm xôi nhiều màu trước đây chỉ gặp thấy ở các vùng dân tộc thiểu số. Những năm gần đây xu hướng này bắt đầu xuất hiện ở một số thành phố lớn. Tiến hành thử nghiệm: hòa tan chất màu trong nước nóng cho tan hết, để nguội và dùng để ngâm với gạo đã rửa sạch trong 6-10 giờ. Vớt gạo để cho ráo và cho vào chõ đồ bình thường cho tới chín. Kết quả: Xôi có các màu (Tím, xanh, vàng) đẹp, tươi, không có mùi vị lạ. Lưu ý: Độ đậm nhạt của màu sắc tùy thuộc vào thị hiếu b. Cải thiệm màu sắc đối với rượu Nếp cẩm Hiện nay, rượu Nếp cẩm đang là sản phẩm thực phẩm truyền thống được ưa chuộng và có nhu cầu lớn trong những năm gần đây. Tuy nhiên, loại gạo Nếp cẩm 38 có màu tím đen rất hiếm gặp trên thị trường. Sản phẩm hiện nay thường có màu đỏ nâu hoặc nâu đậm. Vì vậy cải thiện màu của rượu nếp cẩm để tăng thêm giá trị thẩm mỹ và kinh tế. Tiến hành thử nghiệm: Chất màu từ cây Cẩm pha trong dung dịch cồn-nước để có màu đậm đặc, rót từ từ dịch chất màu vào rượu đã lên men xong. Đảo nhẹ nhàng cho đều. Liều lượng tùy thuộc vào thị hiếu và hiện trạng của màu rượu đã có. Đối với rượu nếp trắng (nếp cái) nếu pha màu sẽ rất giống với rượu làm từ nếp cẩm. Kết quả: Chất lượng rượu không thay đổi (không có mùi vị lạ) màu sắc được cải thiện rất tốt. c. Nhuộm màu cho nước ép lõi quả Dứa Nước dứa đóng hộp trong thực tế được sản xuất từ các phụ phẩm của quy trình sản xuất dứa khoanh (miếng đóng hộp). Hiện nay, tất cả các loại nước dứa đều phải bổ sung chất PGTP, trong đó có chất màu vàng. Việt Nam là nước có diện tích trồng dứa lớn và hàng năm sản xuất một khối lượng đáng kể nước dứa đóng hộp. Việc thử nghiệm pha màu cho nước dứa có ý nghĩa thực tiễn, nếu được áp dụng trong tương lai. Để dễ đánh giá hiệu quả nhuộm màu, trong thí nghiệm sử dụng nước ép từ lõi quả dứa. Đây là sản phẩm chính để sản xuất nước dứa, và không có màu hoặc màu rất nhạt. Thí nghiệm: Pha chất màu chiết từ cây Mật mông pha trong nước nóng cho tan hết, dịch màu có màu vàng đậm (nếu quá đặc sẽ có màu vàng nâu). Đổ nước lõi dứa đã thêm đường vào bình thủy tinh, rót từ từ dịch màu và khuấy đều cho tới khi có màu tương ứng với nước dứa thương phẩm. Kết quả: Nước dứa thí nghiệm có màu tương tự như sản phẩm thương mại, không có mùi vị lạ. 39 KẾT LUẬN 1. Bước đầu đã điều tra và ghi nhận 46 loài cây được đồng bào các dân tộc thiểu số ở một số khu vực miền Bắc Việt Nam sử dụng để nhuộm màu cho các loại thực phẩm. Ba loài cây được lựa chọn để nghiên cứu chiết tách chất màu là Đậu biếc (Clitoria ternatea), Cẩm (Peristrophe bivalvis) và Mật mông hoa (Buddleja officinalis). 2. Bằng phương pháp chiết nước đã thu được chế phẩm màu xanh từ hoa cây Đậu biếc với hàm lượng 33,0%, màu vàng từ hoa cây Mật mông với hàm lượng 21,0% và màu tím từ lá cây Cẩm với hàm lượng 1,75%. Các chế phẩm thu được dưới dạng bột khô phù hợp với thị hiếu và thông lệ quốc tế. 3. Các chế phẩm màu thu được tương đối ổn định, không bị mất màu ở nhiệt độ 100 0C trong 180 phút, trong môi trường có pH khác nhau (từ pH =1- 13) và trong thời gian bảo quản 12 tháng ở điều kiện thường. 4. Chế phẩm màu xanh thu từ cây đậu biếc có độ an toàn tương đối cao. Với Liều LD/0=100 g/kg, không xác định được độc tính bán cấp (LD/.50). Chất màu không ảnh hưởng tới trạng thái sinh lý và hoạt động của động vật thí nghiệm sau 72 giờ thí nghiệm. 5. Các chế phẩm màu thu được trong nghiên cứu được sử dụng để tạo màu cho một số loại thực phẩm (màu vàng cho nước dứa ép, màu tím cho rượu Nếp cẩm và các màu xanh, tím, vàng cho xôi) đã thu được sắc màu đẹp, phù hợp với sản phẩm và không gây mùi, vị lạ. 40 KIẾN NGHỊ 1. Sản xuất chất màu cho công nghiệp thực phẩm là một yêu cầu cấp thiết của thực tế Việt Nam. Hiện nay, tất cả các chất màu được sử dụng trong các cơ sở chế biến đều phải nhập khẩu. Cần nghiên cứu các vấn cần thiết có liên quan để sớm đưa chất màu chiết tách từ các cây được nghiên cứu trên đây vào ứng dụng trong thực tế. 2. Các kết quả thu được trong nghiên cứu này mới chỉ trong phạm vi một vài dân tộc thiểu số ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Để đánh giá hết tiềm năng các cây nhuộm màu thực phẩm của đất nước cần có nghiên cứu trên quy mô lớn hơn. 3. Ngoài nhuộm màu thực phẩm, các chất có màu trong cơ thể sinh vật còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực kinh tế – xã hội khác (nhuộm vải, sản xuất màu cho hội họa, …) cần nghiên cứu toàn diện các cây có chất màu ở Việt Nam để sử dụng hiệu quả nguồn tài nguyên thực vật và góp phần phát triển kinh tế-xã hội. 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Aoki H. , 2001. Phương pháp phân tích các chất màu trong thực phẩm. Shokuhin Eiseigaku Zasshi. Apr., 42(2), 84-90. ( đăng lại trong Bản tin dược liệu T.1. số 8/2002). 2. Ajinomoto C., 1995. Process for preparation of red natural dye, J. cell culture; vol. 14, 11-95. 3. Anthony C., 2002. Natural colours from Botanicals. London, 437 p. 4. Aroma-India.com., Natural food Colourants. V8879e/V8879e05.htm 5. Bộ Y tế, 1998. Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực, thực phẩm. H., 145 tr. 6. Casenkov O.I., 1997. Preparation of red food dye from plant materials, Canning Vegatables Drying, 97-04608. (P-Patent). 7. Caxumov M.A. ,1970. Một số cây hoang dại có chất màu và triển vọng ứng dụng trong phát triển kinh tế. TC. Tài nguyên thực vật. Lenigrad, T.3, No. 2, tr. 539-547. (tiếng Nga). 8. Võ Văn Chi, 1999. Từ điển cây thuốc Việt nam. Nxb. Y học, H., 1466 tr. 9. Lưu Đàm Cư, Trần Minh Hợi. 1995. Các cây nhuộm màu phổ biến ở Việt nam. Tuyển tập công trình nghiên cứu, Viện STTNSV. 10. Lưu Đàm Cư, nnk, 2002. Phân bố chất màu trong một số loài thực vật và nghiên cứu khả năng ứng dụng trong công nghiệp và đời sống. Các Báo cáo Hội nghị khoa học Liên Hiệp Các Hội KHKTVN. Hà Nội, 45-54. 11. Lưu Đàm Cư, 2003. Nghiên cứu cây nhuộm màu thực phẩm ở Việt nam. Hội nghị quốc gia lần 2: Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. Huế, tr. 47-51. 12. Grinkevich H.N, Xaphronich L.I. Phân tích hóa học trong cây thuốc. Moskva, 1983, 174 tr. (tiếng Nga). 13. Harborne J.B. Phytochemical Methods - Guide to modern technique of plant analysis. Chapman and Hall. London-New Yorrk- Melbourne- Madras, 287 p. 42 14. Nguyễn Văn Đàn, Ngô Ngọc Khuyến, 1999. Hợp chất thiên nhiên dùng làm thuốc., nxb. Y học,. tr. 33-37. 15. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu, 1985. Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc. Nxb. Y học, tr. 234-242. 16. Phạm Hoàng Hộ, 1993. Cây cỏ Việt nam. Montreal, T. 1, 2,3. 17. Viện HLKH Liên xô, 1988. Tài nguyên thực vật Liên xô, Nxb. Khoa học, M., T.1-4 (Tiếng Nga). 18. Bảo Lộc và cs. Nghiên cứu trồng thử cây Bụp dấm (Hibiscus sabdariffa) phục vụ xuất khẩu. Báo cáo tổng kết chương trình nghiên cứu KHCN cấp nhà nước “ Tạo nguồn nguyên liệu dược 1991 - 1995”, mã số: KY02, tr. 245-256. 19. Micheal Gomez, 2003. Butterfly Pea (Clitoria ternatea). Pakistan Journal of Nutrition. Vol 2 (6), 374-379. 20. Mitsui-Petrochem., Production of secondary plant metabolite; J. cell culture, 10.02.98. (P-Patent 21. National institute of Materia medica, 1999. Selected medicinal plants in Vietnam. Vol.1,. Science and technology publishing house, Hanoi, p.316- 319 22. Eisai P. T., 1986. Medicinal herb index in Indonesia. Borgo, Indonesia, 159p. 23. PROSEA 3 , 1992. Dye and tannin-producing plants. Bogor, pp.16-21. 24. Nguyễn thị Phương Thảo, Lưu Đàm Cư, 2003. Triển vọng chiết tách chất màu từ cây Mật mông hoa. TC NN&PTNT, t.4, tr. 32-35. 25. Terahara N., Oda M., Matsui T. et al, 1996. Five new anthocyanins A3, B4, B3, B2 and D2 from Clitoria ternatea flowers. J. Nat. Prod. , feb.:59 (2), 139-144. 26. Tổng cục Tiêu chuẩn-Đo lường, Chất lượng, 1998. TCVN: 6470. Phụ gia thực phẩm- Phương pháp xác định cho phẩm màu thực phẩm. H., 31 tr. 43 PHẦN PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: DANH LỤC CÂY CHO CHẤT MÀU Mầu sắc/ bộ phận sử dụng Tên cây Xanh Đỏ Tím Vàng Đen Ghi chú 1. Họ Acanthaceae: Ô rô 1 Dicliptera chinensis (L.) Nees = Lá diễn Lá 2 Peristrophe bivalvis = Cẩm Lá Lá Lá 2. Họ Altingiaceae: Tô hạp 3 Liquidambar formosana = Sau sau, Thau gió Lá 3. Họ Amaranthaceae: Rau dền 4 Amaranthus caudatus L. = Dền tía Lá -thân 4. Họ Annacardiaceae: Điều 5 Rhus chinensis = Muối Than 5. Họ Asteraceae: Cúc 6 Gnaphalium affine D. Don = Rau khúc Lá 6. Họ Basellaceae: Mồng tơi 7 Basella alba L. = Mồng tơi Qủa 7. Họ Bignoniacea: Núc nác 8 Oroxylum indicum (L.) Kurz. = Núc nác Gỗ Than 8. Họ Buddleiaceae: Bọ chó 9 Buddleja davidii Franch. = Búp lệ da - vit Hoa 44 10 Buddleja macrostachya Benth. = Búp lệ chùm to Hoa 11 Buddleja officinalis Maxim. = Mật mông hoa hoa 12 Buddleja paniculata Wall. = Búp lệ chùm tụ tán Hoa 9. Họ Cucurbitaceae: Bầu bí 13 Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng. = Gấc Màng hạt 14 Momordica sp. = Gấc vàng Màng hạt 10. Họ Dioscoreaceae : Củ nâu 15 Dioscorea alata L. Khoai vạc Củ 11. Họ Dracaenaceae: Bồng bồng 16 Dracaena angustifolia Roxb. = Bồng bồng Lá 17 Dracaena cochinchinensis (Lour.) Merr. = Giang ông Lá 18 Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep. = Huyết giác Lõi gỗ 12. Họ Fabaceae: Đậu 19 Caesalpinia sappan L. = Vang Gỗ Gỗ 20 Clitoria ternatea L. = Đậu biếc Hoa 21 Vigna cylindrica (L.) Skeels = Đậu đen Hạt 13. Họ Iridaceae: Lưỡi đòng 22 Eleutherin subaphylla Gagnep. = Sâm đại hành Củ 14. Họ Lythracae: Bằng lăng 23 Lawsonia inermis L. = Lá móng Lá ít dùng 45 15. Họ Malvaceae: Bông 24 Hibiscus sabdariffa L. = Bụp dấm Đài hoa 16. Họ Marantaceae: Hoàng tinh 25 Phrynium dispermum Gagn. = lá dong Lá 26 Phrynium parviflorum Roxb. Lá dong Lá 27 Phrynium pubinerve Bl. = lá dong Lá 17. Họ Moraceae: Dâu tằm 28 Morus alba L. = Dâu tằm Quả 29 Morus cathayana Hemsl.= Dâu bầu Quả 18. Họ Myrsinaceae: Đơn nem 30 Embelia pulchella Mez. ) Mez. = Chua ngút hoa đẹp, Rè đẹp Gỗ Đỏ nâu 19. Họ Myrtaceae: Sim 31 Rhodomyrtus tomentosa = Sim Hoa Quả 20. Họ Pandanaceae: Dứa dại 32 Pandanus amarylifoelius = Dứa thơm Lá 21. Họ Poaceae: Lúa 33 Bambusa spp. = Tre Lá 34 Oryza sativa L. = Lúa Lá than 35 Oryza sativa L. var.japonica = Nếp cẩm Hạt 36 Thysanolaena latifolia ( Roxb. ex Hornem) Honda = Chít Lá 22. Họ Polygonaceae: Rau răm 46 37 Fagopyrum esculentum Moench = Mạch ba góc Lá ít sử dụng 23. Họ Rosaceae: Hoa hồng 38 Fragaria vesca L. = Dâu tây Quả 39 Prunus domestica L. = Mận Quả 40 Rubus spp. = Mâm xôi Quả 24. Họ Rubiaceae: Cà phê 41 Luculia sp. = Gạc nai Gỗ 25. Họ Urticaceae: Gai 42 Boehmeria nivea (L.) Gaudich. = Gai Lá 26. Họ Verbenaceae: Roi ngựa 43 Gmelina sp. Lõi thọ Hoa 27. Họ Zingiberaceae: Gừng 44 Alpinia officinarum Hance = Riềng Lá 45 Curcuma longa L. = Nghệ Củ 46 Zingiber officinale Roscoe = Gừng Lá 47 PHỤ LỤC 2 PHÂN BỐ CHẤT MÀU TRONG CÁC BỘ PHẬN CỦA MỘT SỐ LOÀI tt Tên cây Dung môi chiết Định khu Sắc màu 1 Peristrophe bivalvis (No.1) = Cẩm Nước nóng Lá: ++ Hoa: 0 Thân: + Đỏ nâu 2 P. bivalvis (No.2) = Cẩm Nước nóng Lá: +++ Hoa: 0 Thân: + Đỏ ánh tím 3 P.(bivalvis (No.3) = Cẩm Nước nóng Lá: +++ Hoa: 0 Thân: + Đỏ ánh xanh 4 P. bivalvis (No.4) = Cẩm Nước nóng Lá:+++ Hoa: 0 Thân: + Đỏ nâu 5 Buddleja davidii = Mật mông Nước nóng/ Cồn Lá: + Hoa: ++ Thân: + Vàng 6 B. macrostachya = Mật mông Nước nóng/ Cồn Lá: + Hoa: ++ Thân: + Vàng 7 B. officinalis = Mật mông Nước nóng Lá: ++ Hoa: +++ Thân: + Vàng 8 B. paniculata = Mật mông Nước nóng Lá: + Hoa: + Thân: + Vàng 9 Thysanolaena latifolia = Chít Nước nóng Lá: + Vàng chanh 48 10 Alpinia galanga = Riềng Nước lạnh Lá: + Xanh lá cây 11 Curcuma sp. = Nghệ . (M.Khương) Nước nóng Củ: +++ Da cam 12 Hibiscus sabdariffa = Bụt dấm Nước nóng Đài hoa:+++ Đỏ 13 Momordica cochinchinensis = Gấc Cồn Áo h¹t:+++ Đỏ 14 Caesalpinia sappan =Vang Mẫu Hòa Bình Mẫu Lạng Sơn Nước nóng Nước nóng Gỗ +++ Gỗ ++ Đỏ Vàng 15 Amaranthus sp.= Dền đỏ Nước nóng Lá ++ Thân + Đỏ Ghi chú ký hiệu: +++: nhiều, ++: ít, +: rất ít 49 PHỤ LỤC 3. KẾT QUẢ SẮC KÝ LỚP MỎNG CHẤT MÀU CHIẾT TỪ LÁ CẨM Sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi: n-butanol : acid acetic : nước (4 : 1 : 2) Tên mẫu Quan sát dưới ánh sáng thường Sau khi phun thuốc thử KOH / ethanol Sau khi phun thuốc thử acid boric / acid oxalic Rễ Đại hoàng Cho 2 vết màu vàng Rf=0,8-0,9 2 vết chuyển thành màu đỏ Vết vàng cam, phát quang màu cam Đài hoa Bụp dấm Cho 2 vết: màu xanh Rf=0,5 và màu tím Rf=0,6 Các vết có màu xanh nhạt dần Vết đỏ hồng không phát quang Cây Cẩm M1 Cho 3 vết hồng Rf=0,45 ; 0,6 và 0,8 Màu của các vết nhạt dần Các vết màu xanh không phát quang. Xuất hiện thêm vết màu vàng phát quang, màu lục Rf=0,55 Cây Cẩm M2 Cho 2 vết màu tím Rf=0,5 (đậm) và 0,7 Các vết chuyển màu xanh nhạt dần Các vết có màu không thay đổi, không phát quang. Xuất hiện thêm vết vàng giống M1 nhưng nhạt hơn Cây Cẩm M3 Cho 2 vết màu tím Rf=0,5 đậm và 0,7 Các vết chuyển màu xanh nhạt dần Các vết có màu không thay đổi, không phát quang 50 PHỤ LỤC 4. KẾT QUẢ SKLM CHẤT MÀU TRONG HOA CỦA CÂY MẬT MÔNG Với hệ dung môi: ethylacetat : acid acetic : acid formic : nước (10 : 1 : 1 : 2) Tên mẫu Quan sát Dưới ánh Sáng thường Sau khi phun Thuốc thử acid boric/acid oxalic Sau khi phun Thuốc thử FeCl3 5 % Sau khi phun Thuốc thử H2SO4đậm đặc Runtin (hoa hoè) 1 vết màu vàng nhạt Vết màu vàng, phát quang vàng lục Vết màu xanh thẫm Màu vàng Rễ đại hoàng 2 vết màu vàng nhạt Màu vàng phát quang màu vàng cam Màu vàng cam Hạt dành dành 3 vết màu vàng Rf = 0,1 (đậm nhất), 0,3 và 0,5 3 vết màu vàng không phát quang Không cho màu 3 vết cho màu xanh Mật mông hoa 3 vết vàng đậm Rf = 0,1; 0,3 và 0,5 3 vết vàng nhạt Rf=0,4; 0,6 và 0,7 3 vết vàng đậm không phát quang. Các vết khác phát quang vàng lục Các vết có Rf=0,4; 0,6 và 0,7 cho màu xanh thẫm 3 vết vàng đậm cho mầu xanh 51 SO SÁNH KẾT QUẢ SKLM CHẤT MÀU TRONG HOA CỦA CÂY MẬT MÔNG VỚI MỘT SỐ DỊCH CHIẾT KHÁC Với hệ dung môi: ethylacetat : acid acetic : acid formic : nước (10 : 1 : 1 : 2) Tên mẫu Quan sát Dưới ánh Sáng thường Sau khi phun Thuốc thử acid boric/acid oxalic Sau khi phun Thuốc thử FeCl3 5 % Sau khi phun Thuốc thử H2SO4đậm đặc Runtin (hoa hoè) 1 vết màu vàng nhạt Vết màu vàng, phát quang vàng lục Vết màu xanh thẫm Màu vàng Rễ đại hoàng 2 vết màu vàng nhạt Màu vàng phát quang màu vàng cam Màu vàng cam Hạt dành dành 3 vết màu vàng Rf = 0,1 (đậm nhất), 0,3 và 0,5 3 vết màu vàng không phát quang Không cho màu 3 vết cho màu xanh Mật mông hoa 3 vết vàng đậm Rf = 0,1; 0,3 và 0,5 3 vết vàng nhạt Rf=0,4; 0,6 và 0,7 3 vết vàng đậm không phát quang. Các vết khác phát quang vàng lục Các vết có Rf=0,4; 0,6 và 0,7 cho màu xanh thẫm 3 vết vàng đậm cho mầu xanh 52 PHỤ LỤC 5 MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ CÂY NGHIÊN CỨU VÀ CHẤT MÀU AH.1. Cành hoa cây Mật mông H2. Chất màu chiết từ hoa Mật mông H3. Hoa Đậu biếc H4.. Gạo nhuộm bằng màu hoa đậu biếc H5. Cành và hoa cây Cẩm H.6. Xôi nhuộm bằng các màu từ lá Cẩm 53 H7. Màu đen nhuộm bằng lá Sau sau H8. Màu chiết từ gỗ cây Vang H9. Màu xanh nhuộm bằng lá Dứa thơm H10. Màu đỏ từ đài Bụp dấm H11. Màu chiết từ Sâm đại hành H12. Xôi nhuộm bằng màu thực vật 54 PHIẾU ĐĂNG KÝ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Tên đề tài: Nghiên cứu chiết tách một số chất màu thực phẩm từ kinh nghiệm sử dụng thực vật của đồng bào dân tộc thiểu số Mã số: Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam Địa chỉ: 18, Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Điện thoại: 04. 8360169 Cơ quan quản lý đề tài: Trung tâm Hỗ trợ nghiên cứu Châu á, Đại học Quốc gia Hà Nội Địa chỉ: Tầng 5, phòng 504, Nhà Điều hành, Đại học Quốc gia Hà Nội 144, Đường Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội. Điện thoại: 04. 7682587 Tổng kinh phí thực chi: 45.000.000 VND (bốn mươi năm triệu đồng VN) Trong đó - Từ kinh phí từ kinh phí được trung tâm 45.000 x 1.000 đ) Hỗ trợ nghiên cứu Châu á tài trợ - Từ nguồn kinh phí khác: 0 - Vay tín dụng 0 - Kinh phí tự có 0 - Thu hồi 0 Thời gian nghiên cứu: 24 tháng Thời gian bắt đầu tháng 10 năm 2003 55 Thời gian kết thúc: tháng 10 năm 2005 Các cán bộ phối hợp thực hiện 1. Lưu Đàm Cư, Viện Sinh thái-Tài nguyên sinh vật 2. Nguyễn Thị Phương Thảo, Viện Sinh thái-Tài nguyên sinh vật 3. Nguyễn Thị Thủy, Viện Sinh thái-Tài nguyên sinh vật 4. Trương Anh Thư, Viện Sinh thái-Tài nguyên sinh vật 5. Phạm Văn Thính, Viện Sinh thái-Tài nguyên sinh vật 6. Bùi Văn Thanh, Viện Sinh thái-Tài nguyên sinh vật 7. Hà Tuấn Anh, Viện Sinh thái-Tài nguyên sinh vật 8. Bùi Thị Bằng, Viện Dược liệu 9. Nguyễn Kim Phượng, Viện Dược liệu 10. Nguyễn Dũng, Đại học Bách Khoa Hà Nội 11. Tung Chải Lương, xã Mường Khương, Mường Khương, Lào Cai Số đăng ký đề tài Ngày…………………….. Số chứng nhận đăng ký kết quả nghiên cứu Ngày…………………. Tình trạng bảo mật  Phổ biến hạn chế Tóm tắt kết quả nghiên cứu : Đã điều tra, xác nhận 46 loài cây được đồng bào dân tộc thiểu số sử dụng để nhuộm màu cho các loại thực phẩm. Từ nghiên cứu sàng lọc, lựa chọn 3 loài cây : Mật mông (Buddleja officinalis), Đậu biếc (Clitoria ternatea) và Cẩm (Peristrophe bivalvis) dùng làm nguyên liệu chiết tách chất màu. Bằng phương pháp chiết nước nóng đã chiết được chất màu vàng từ cây Mật mông, chất màu tím từ cây Cẩm và chất màu xanh từ cây Đậu biếc. Các chất màu đã được nghiên cứu tính ổn định trong nhiệt độ cao (1000C), ở các pH từ 3 đến 13 và trong thời 56 gian bảo quản 12 tháng. Chất màu từ cây Đậu biếc được nghiên cứu độc tính và không xác định liều LD/50 với liều LD/0 = 100 g/kg. Các chất màu thu được đã được nhuộm màu thử cho một số loại thực phẩm đạt kết quả tốt. Kiến nghị về quy mô và đối tượng áp dụng kết quả nghiên cứu : Để các sản phẩm trước khi được áp dụng vào đời sống, đề nghị cần hoàn thiện một số nghiên cứu sau : - Cần nghiên cứu kỹ độc tính (độc tính bán trường diễn) của các sản phảm của đề tài nghiên cứu. . Nghiên cứu và hoàn thiện các chỉ tiêu an toàn thực phẩm đối với chất màu thực phẩm theo quy định, xin Bộ Y tế cấp giấy phép sử dụng. Chức vụ Chủ nhiệm Đề tài Thủ trưởng Cơ quan chủ trì đề tài Chủ tịch Hội đồng đánh giá chính thức Thủ trưởng cơ quan quản lý đề tài Họ và tên Lưu Đàm Cư Học hàm, học vị PGS. TS. Ký tên, Đóng dấu