Đề tài Nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa Cayenne bằng phương pháp marker phân tử

trung bình lớn hơn so với các dòng trồng từ dạng hom (biểu đồ 4.3) nhưng độ ngọt của trái thì thấp hơn. Hình dạng trái và kích thước trái của giống Cayenne cũng có sự đa dạng giữa các dòng (hình 4.3). 34 3.2 2.84 1 2.09 2.85 2.3 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 Min Max Trung bình Nă ng su ất trá i Dạng hom Nuôi cấy mô Biểu đồ 4.3: Năng suất trái của những dòng dứa trồng từ nuôi cấy mô và dạng hom. Hình 4.1: A: hình cây Thơm Trung An, B: hình cây Thơm Hà Nội Hình 4.2: Hình dạng và màu sắc lá với A: xanh đậm không gai, B: xanh đốm nâu không có gai, C: xanh đốm đỏ tía có gai, D: xanh có gai E: xanh đốm nâu gai viền. 35 Hình 4.3: A: Thơm Cần Thơ, B: Thơm Hà Nội Hình dạng và màu sắc lá của giống Cayenne cũng phân ly thành nhiều dạng khác nhau: - Màu sắc lá của giống đa dạng với 3 màu: xanh, xanh có đốm nâu và xanh có đốm đỏ tía (hình 4.1 và 4.2) đều này cho thấy có sự phân ly đối với tính trạng này giữa các dòng trong giống. Sự khác biệt này còn thể hiện ở những dòng dứa có cùng nguồn gốc như dòng OMK44 có màu xanh, OMK48 có màu xanh đốm nâu (Phụ lục II). - Hình dạng lá của giống Cayenne thường không có gai hoặc rất ít ở ngọn nhưng qua khảo sát cho thấy có sự khác biệt giữa các dòng trong giống (biểu đồ 4.4) với số dòng có hình dạng lá không có gai chiếm 60 %, có gai chiếm 20 % và lá viền (có gai nhưng chỉ ở một khoảng của lá như giữa, ngọn hoặc gốc lá) chiếm 20 %. Kết quả này đã chứng tỏ trong cùng một giống nhưng có sự phân ly về tính trạng được thể hiện qua kiểu hình. Đều này cho thấy có sự đa dạng nguồn gen giữa các dòng dứa từ Cayenne và sẽ là yếu tố góp phần phân loại làm cơ sở cho lai tạo giống. Đồng thời, tính trạng này khá ổn định, do vậy cần xét sự khác biệt về kiểu gen giữa các dòng dứa để tìm mối quan hệ liên kết giữa gen và tính trạng. A 36 Hình dạng lá 60%20% 20% không có gai Có gai Viền Biểu đồ 4.4: Sự đa dạng về hình dạng lá của 50 dòng Cayenne Dựa trên sự khác biệt có ý nghĩa về đặc tính nông học chiều cao cây, số lá trên bụi, chiều rộng tán, dài lá và rộng lá của 50 dòng dứa Cayenne, phân nhóm di truyền bằng phương pháp SAHN ( Sneath và Sokal, 1973) được thiết lập nhằm sắp xếp các dòng dứa thành những nhóm có mức độ tương quan gần nhau về mặt di truyền trên cơ sở biểu hiện kiểu hình. 37 PHAN NHOM KIEU HINH DUA CORR Coefficient -0.23 0.01 0.26 0.50 0.75 1.00 OMK12 OMK5 OMK47 OMK71 OMK40 OMK68 OMK16 OMK42 OMK29 OMK18 OMK70 OMK45 OMK65 OMK1 OMK66 OMK69 OMK72 OMK15 OMK64 OMK13 OMK62 OMK3 OMK73 OMK67 OMK43 OMK49 OMK75 OMK76 OMK56 OMK74 OMK6 OMK12 OMK59 OMK19 OMK17 OMK52 OMK50 OMK10 OMK11 OMK20 OMK63 OMK9 OMK8 OMK61 OMK2 OMK7 OMK48 OMK51 OMK44 OMK4 OMK77 Hình 4.4: Sơ đồ hình cây thể hiện mối tƣơng quan giữa 50 dòng dứa Cayenne trên cơ sở kiểu hình. Bảng 4.2: Kết quả phân nhóm 50 dòng dứa cayenne dựa trên đặc tính kiểu hình Nhóm Tên dòng Số dòng I OMK5, OMK47, OMK71, OMK40, OMK68, OMK16, OMK42, OMK29, OMK18, OMK70, OMK45, OMK65, OMK1, OMK66, OMK69, OMK72. 16 II OMK15, OMK64, OMK13, OMK62, OMK3, OMK73, OMK67, OMK43, OMK49, OMK75, OMK76, OMK56, OMK74, OMK6 8 III OMK12, OMK59, OMK19, OMK17, OMK52, OMK50, OMK10, OMK11, OMK20, OMK63, OMK9, OMK8, OMK61 13 IV OMK2, OMK7, OMK48, OMK51, OMK44, OMK4, OMK77 7 38 Kết quả ở hình 4.4 và bảng 4.2 cho thấy 50 dòng dứa Cayenne được phân thành 4 nhóm chính ở mức tương quan 26 % về kiểu hình như sau: - Nhóm I và nhóm II có ít có sự tương quan, nhóm III và nhóm IV tương quan chỉ 2%. - Những dòng trong cùng một nhóm thì có sự tương quan chặt với nhau cho thấy chúng có thể xuất phát từ những quần thể có quan hệ với nhau về mặt di truyền như dòng dứa OMK1, OMK66, OMK69, OMK72 trong nhóm I hay các dòng OMK43, OMK49, OMK75, OMK76, OMK74 trong nhóm II. Qua kết quả nghiên cứu trên từng tính trạng và phân nhóm dựa vào đặc tính hình thái của 50 dòng dứa Cayennne cho thấy giữa các nhóm dòng có sự khác biệt về kiểu hình và chứng tỏ có sự đa dạng nguồn gen trong cùng một giống. Tuy nhiên, sự phân nhóm dựa vào kiểu hình ảnh hưởng nhiều bởi yếu tố môi trường. Sự khác biệt và đa dạng của những tính trạng sinh trưởng như chiều cao cây, chiều dài lá, số lá trên bụi giữa các dòng dứa có thể không quy định bởi kiểu gen mà tùy theo đều kiện môi trường, đất đai, bóng rợp để cây phát triển. Do đó sự đa dạng nguồn gen của giống Cayenne cần phải được tiến hành dựa vào kiểu gen để xác định mức độ chính xác của việc phân nhóm. 4.2. Đánh giá đa dạng nguồn gen bằng kiểu gen 4.2.1. Kết quả kiểm tra chất lƣợng DNA Để thực hiện phản ứng PCR-RAPD nồng độ DNA được pha loãng từ 20 – 50 ng / µl cho phù hợp với lượng DNA cần thiết để thực hiện phản ứng PCR. Theo Antoni Raflski và một số tác giả khác thì nồng độ DNA thích hợp để chạy phản ứng PCR-RAPD từ 5 – 50 ng / 1 phản ứng (Antoni Rafalski và ctv, 1994). Các mẫu DNA của 50 dòng dứa sẽ được kiểm tra chất lượng trên môi trường agarose gel 0,8 % trong TAE 1X. Nếu DNA hiện diện trên gel không rõ và bị đứt đoạn thì cần phải tiến hành ly trích lại. DNA tốt khi xuất hiện những vạch sáng và mỏng. Kết quả kiểm tra được thể hiện trong hình 4.5. 39 Hình 4.5: Chất lƣợng DNA của các dòng dứa Cayenne trên gel agarose 0.8 %. 4.2.2. Sản phẩm phản ứng PCR với marker RAPD Để phát hiện sự đa hình, 13 primer đã được sử dụng trong phản ứng PCR trên DNA genome thu được từ các mẫu lá của 50 dòng dứa Cayenne. Sản phẩm khuếch đại tạo ra từ những primer này được quan sát trên gel agarose 1.5%. Kết quả quan sát cho thấy chỉ có 9 primer cho sản phẩm khuếch đại, với 38 allen đa hình được tạo ra trung bình 4,28 allen / 1 primer, sản phẩm khuếch đại có kích thước từ 0,3 – 3 kb (bảng 4.3). Dựa vào sự khác biệt giữa các allen thể hiện qua các băng trên gel ta có thể xác định được sự khác nhau giữa các dòng dứa về mặt di truyền. Bảng 4.3: Danh sách các primer sử dụng trong phân tích đa dạng di truyền của dứa Cayenne STT Ký hiệu Trình tự 5 ’ ..................................... 3 ’ Số băng phát hiện Kích thƣớc (kb) Ghi chú 1 OPD 02 GGACCCAACC 4 0,3 – 1,3 Primer từ bộ kit 2 OPA10 GTGATCGCAG 4 0,2 – 1,5 Primer từ bộ kit 3 RAPD3 GTAGACCCGT 4 0,2 – 3 Primer viện thiết kế 4 OPC15 GACGGATCAG 4 0,3 – 2,5 Primer từ bộ kit 5 RAPD2 GTTTCGCTCC 5 0,7 – 1,6 Primer viện thiết kế 6 RAPD4 AAGAGCCCGT 6 0,75 – 1,5 Primer viện thiết kế 7 RAPD6 CCCGTCAGCA 3 1,1 – 2,5 Primer viện thiết kế 8 AJ01 ACGGGTCAGA 3 0,4 – 1,018 Primer từ bộ kit 9 OPA04 AATCGGGCTG 5 0,3 – 2,5 Primer từ bộ kit 40 - Primer RAPD3: Sản phẩm khuếch đại được tạo ra với primer này là 4 và cả 4 sản phẩm đều đa hình, có kích thước từ 0,2 – 3 kb (hình 4.6a). Trong đó có duy nhất 3 băng có kích thước 3 kb ở các dòng Cayenne như OMK20 (11), OMK11 (13), OMK16 (19). Đều này có thể cho thấy sự khác biệt về di truyền của các dòng dứa này so với những dòng khác. Đối với primer này thì có 50 % số dòng dứa tạo sản phẩm khuếch đại, trong đó phần lớn các dòng dứa Hà Nội đều không tạo sản phẩm. - Với primer RAPD4 số lượng băng tạo ra là 6, có kích thước từ 0,75 – 1,5 kb, và đều là băng đa hình, có một vị trí băng duy nhất ở mẫu số 20: OMK44 có kích thước 1,05 kb (hình 4.6b). Primer RAPD4 cũng ít có sản phẩm với dòng dứa Hà Nội và có 48 % số dòng dứa cho sản phẩm với các băng đa hình thể hiện rỏ trên gel. Hình 4.6: Kết quả điện di sản phẩm PCR với primer RAPD3 và RAPD4 trên gel agarose 1,5 % Chú thích : số 1 - 25 tương ứng với danh sách giống ở bảng 3.1, a: sản phẩm với primer RAPD3, b: sản phẩm với primer RAPD4. - Với primer OPC15 có 4 sản phẩm khuếch đại được tạo ra có kích thước từ 0,3 – 2,5 kb, số băng đa hình là 4 và có một băng duy nhất xuất hiện ở mẫu 19: OMK16 do đó có thể phân biệt được dòng này với các dòng dứa khác (hình 4.7). Số dòng cho sản phẩm khuếch đại là 25 chiếm 50 % tổng số và sản phẩm dễ nhận biết trên gel. Những dòng OMK61 – OMK75 không có sản phẩm với primer này. 41 Hình 4.7: kết quả điện di sản phẩm PCR với primer OPC15 trên gel agarose 1,5% - Primer RAPD2: số lượng dòng dứa cho sản phẩm khuếch đại ít chiếm 36%, với 5 băng đa hình được tạo ra có kích thước từ 0,7- 1,6 kb. Primer này cũng không cho sản phẩm khuếch đại với các dòng dứa Hà Nội (hình 4.8). Hình 4.8: kết quả điện di sản phẩm PCR với primer RAPD2 trên gel agarose 1,5%. - Tương tự đối với primer OPA04 tạo ra 5 băng đa hình có kích thước từ 0,3 – 2,5 kb (hình 4.9) và OPA10 có 4 băng đa hình có kích thước từ 0,2 – 1,5 kb (hình 4.10) cũng cho thấy sự đa dạng về nguồn gen giữa những dòng trong cùng một giống. Cả hai marker này cũng ít có sản phẩm với những dòng dứa có nguồn gốc từ Hà Nội và không có sản phẩm duy nhất. Các băng đa hình tạo ra rõ và dể dàng thấy được sự khác biệt giữa các dòng. 42 Hình 4.9: kết quả điện di sản phẩm PCR với primer OPA04 trên gel agarose 1,5% Hình 4.10: kết quả điện di sản phẩm PCR với primer OPA10 trên gel agarose 1,5%. - Ngoài ra, primer RAPD6 với 3 sản phẩm khuếch đại có kích thước từ 1,1 – 2,5 kb, primer OPD02 với 4 sản phẩm đa hình được tạo ra có kích thước từ 0,3 – 1,3 kb cũng cho thấy sự khác biệt về di truyền giữa các dòng dứa Cayenne. Trong tổng số những primer khảo sát thì primer AJ01 có số lượng dòng dứa có sản phẩm khuếch đại PCR thấp nhất chỉ chiếm 18 % trên tổng số dòng thí nghiệm và số băng đa hình được tạo ra là 3 băng với kích thước từ 0,4 – 1,018 kb. Đối với primer này thì các dòng dứa Hà Nội có sản phẩm khuếch đại. Hiệu quả tạo sản phẩm PCR của primer này không cao so với các primer khác có thể do bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố trong phản ứng PCR như lượng DNA, nồng độ Taq polymerase, đều này đã được chứng minh bởi Boonsermuk và ctv (1997). 43 Từ kết quả phân tích sản phẩm PCR với 9 primer cho thấy các primer đều tạo ra các băng đa hình có thể phân biệt được sự khác biệt về di truyền giữa các dòng dứa trong cùng một giống và số lượng dòng dứa có đa hình cũng khác nhau ở từng primer (bảng 4.4). Primer OPA10 cho đa hình với số lượng dòng cao nhất (58 %) và thấp nhất là AJ01 (18 %), RAPD4 có số lượng allen tạo ra trên một dòng cao nhất. Trong 50 dòng dứa Cayenne nghiên cứu thì các dòng có nguồn gốc từ Hà Nội ít có sản phẩm khuếch đại. Do vậy, đối với các dòng dứa này cần phải tiếp tục chọn lựa các marker khác để kiểm tra thêm. Số lượng sản phẩm PCR tạo ra đối với những primer thì còn phụ thuộc nhiều vào đều kiện phản ứng PCR (Ellsworth và ctv, 1993) cho nên chỉ có một số primer cho ra các băng đa hình. Bên cạnh đó, một số sản phẩm PCR khó nhận diện trên gel có thể do số lượng sản phẩm khuếch đại ít nên băng bị mờ hoặc thời gian nhuộm với ethiumbromide ít vì vậy việc thu thập các dữ liệu để phân nhóm cần tiến hành cẩn thận. Bảng 4.4: Sự đa hình của 9 primer với 50 dòng dứa Cayenne Primer Cấu trúc primer Vị trí allen Số dòng tạo băng Tỉ lệ (%) OPD 02 Đa hình A, B, C,D 21 42 % OPA10 Đa hình A, B, C, D 28 56 % RAPD3 Đa hình A, B, C, D 25 50 % OPC15 Đa hình A, B, C, D 25 50 % RAPD2 Đa hình A, B, C, D, E 18 36 % RAPD4 Đa hình A, B, C, D, E, F 24 48 % RAPD6 Đa hình A, B, C 23 46 % AJ01 Đa hình A, B, C 9 18 % OPA04 Đa hình A, B, C, D, E 23 46 % Bên cạnh đó, có một đều lý thú khi phát hiện đa hình trên các primer kết hợp với xem xét kiểu hình cho thấy những primer trong nghiên cứu này có thể tách được hai nhóm dứa với hình dạng lá có gai và không có gai dựa trên những băng đa hình khác nhau trên từng primer (bảng 4.5). 44 Bảng 4.5: Sự khác biệt về kiểu gen giữa dòng dứa có gai và không có gai dựa vào sự đa hình của các primer Tên dòng OPD02 OPA10 RAPD3 OPC15 RAPD2 RAPD4 RAPD6 OPA04 OMK44* OMK19 C No D A, B B, C, D No C, D B, C, D D, E No D, E A, C, D No A, B, C A, B, C, D, E No OMK8* OMK36 A, D C C, D B, C, D B, C, D A, B, D B, C, D A, C, D D, E D B, C, E E A, B, C A A, B, C A, B, C, D, E Chú thích: *: dòng dứa không có gai, No: không có sản phẩm khuếch đại. A, B, C, D, E: các vị trí của allen. Qua sự đa hình khác nhau chứng tỏ rằng những primer này có thể sử dụng trong nghiên cứu thiết lập bản đồ phân nhóm của gen qui định tính trạng về hình dạng lá có gai và không có gai trên cây dứa. Đồng thời, kết quả này cũng xác định rằng dòng OMK19 có nguồn gốc từ Tây Ninh thuộc nhóm giống đối chứng Queen. Qua đó, cũng có thể xác định được dòng OMK36 có nguồn gốc từ Kiên Giang là dòng dứa bị phân ly trong quá trình tiến hóa của giống Cayenne bởi bản chất của giống này là không có gai hoặc rất ít nhưng chúng thì có kiểu hình gai và khác nhau về kiểu gen so với những dòng khác trong giống Cayenne. Như vậy, đối với dòng OMK36 cần phải kiểm tra và xác định lại nguồn gốc giống nhằm góp phần phân nhóm giống Cayenne một cách chính xác hơn cũng như tránh nhầm lẫn giống trong lai tạo và chọn lọc. Kết quả khác biệt này cũng sẽ được biểu hiện trong sơ đồ phân nhóm dựa vào phần mềm NTSYS theo phương pháp phân tích nhóm UPGMA . 4.2.3. Phân tích nhóm của 50 dòng dứa Cayenne dựa trên dữ liệu RAPD Những dữ liệu thu thập từ việc mã hoá sản phẩm PCR theo quy tắc có băng ghi 1 và không có băng ghi 0 sẽ được dùng để tạo ra ma trận khoảng cách của 50 dòng dứa Cayenne sử dụng chỉ số tương ứng giản đơn SM (simple coefficient), từ đó xây dựng sơ đồ phân nhóm hình cây biểu diễn mối quan hệ về di truyền giữa các dòng trong cùng một giống thông qua phần mềm NTSYS-pc. 45 Hình 4.11: Sơ đồ hình cây thể hiện mối tƣơng quan về di truyền giữa 50 dòng dứa Cayenne trên cơ sở kiểu gen. Kết quả thu được ở hình 4.11 cho thấy nếu xét mức độ tương đồng di truyền của 50 dòng Cayenne ở 66 % thì sẽ được chia thành 3 nhóm chính sau:  Nhóm I Nhóm này gồm 20 dòng Cayenne có mức độ tương đồng di truyền nằm trong khoảng 0,66 – 0,74. Các giống thuộc nhóm này phần lớn là các dòng nhập ngoại 9 / 20 dòng. Nhóm I được chia thành 2 nhóm phụ với khoảng cách di truyền gần hơn như sau: - Nhóm Ia: có mức độ tương đồng di truyền nằm trong khoảng 0,74 – 0,83 gồm các dòng dứa nhập ngoại: OMK5, OMK7, OMK2, OMK9, OMK11, OMK1 và các dòng PHAN NHOM DI TRUYEN DUA SM Coefficient 0.49 0.57 0.66 0.74 0.83 0.91 1.00 OMK12 OMK5 OMK11 OMK1 OMK9 OMK20 OMK8 OMK2 OMK7 OMK29 OMK12 OMK10 OMK51 OMK6 OMK50 OMK17 OMK3 OMK15 OMK48 OMK42 OMK45 OMK16 OMK44 OMK52 OMK19 OMK18 OMK4 OMK43 OMK66 OMK71 OMK70 OMK68 OMK62 OMK69 OMK73 OMK76 OMK13 OMK47 OMK64 OMK63 OMK40 OMK67 OMK72 OMK77 OMK65 OMK74 OMK56 OMK75 OMK49 OMK59 OMK61 46 dứa nhập nội: OMK20, OMK59, OMK8. Trong đó, OMK8 có mức độ tương đồng thấp 0,73 nhất nghĩa là có sự khác biệt nhiều về di truyền so với các dòng dứa còn lại trong nhóm. Đồng thời, OMK1 với OMK9 có quan hệ gần nhau về di truyền trên 90 % mặc dù chúng có nguồn gốc khác nhau. Tuy nhiên, OMK11, OMK1 với OMK5 có cùng nguồn gốc nhưng lại nằm khác nhánh với nhau chứng tỏ về nguồn gen có sự đa dạng. Qua phân tích các dòng trong nhóm Ia cho thấy có sự giống nhau về di truyền giữa các dòng dứa Cayenne nhập ngoại với nhau và dòng nhập nội với dòng nhập ngoại. Sự khác nhau giữa dòng dứa OMK8 và OMK9 chứng tỏ chúng là các quần thề xa nhau về nguồn gốc di truyền. Kết quả này cũng đã được xác nhận trong nghiên cứu về đa dạng di truyền trên dứa (Hoàng Thị Bích Thuỷ và ctv, 2004). - Nhóm Ib: nằm trong khoảng tương đồng từ 0,74 – 0,91 bao gồm 11 dòng và phân thành 2 nhóm phụ với mức tương quan di truyền 70 %. Nhóm Ib1: chứa 5 dòng OMK10, OMK12, OMK50, OMK51 và OMK6. Trong đó, OMK10 và OMK12 nằm cùng nhánh bởi chúng xuất phát từ một quần thể và cùng tương quan đến 80 % vớI OMK50. Ngoài ra, OMK51 và OMK6 có thể xuất phát từ cùng một quần thể bởi tương đồng 80 % về di truyền. Nhóm Ib2: gồm những dòng dứa OMK17, OMK3, OMK15, OMK42, OMK45, OMK48 với mức tương đồng di truyền trên 80 %, trừ dòng OMK45 có sự khác biệt di truyền cao với hệ số tương đồng thấp 0,63. Trong nhóm này còn cho biết dòng OMK3 có thể cùng quần thể với OMK17, và sự khác biệt về di truyền giữa dòng OMK45 với OMK42 và OMK48 mặc dù chúng có cùng nguồn gốc từ Bến Tre.  Nhóm II Nhóm II chỉ có 3 dòng OMK16, OMK52 và OMK44 với mức tương đồng về di truyền đối với các nhóm khác nằm trong khoảng 0,66 – 0,83. Trong nhóm này, dòng OMK16 và OMK44 cùng nhánh chứng tỏ chúng có thể xuất phát từ cùng một quần thể.  Nhóm III Với 27 dòng dứa còn lại, nhóm III có hệ số tương đồng giữa các dòng dứa nằm trong khoảng từ 0,66 – 1,0, các dòng dứa trong nhóm này hầu hết là dòng nhập nội như có nguồn gốc từ Hà Nội, Bến Tre và chỉ có 2 dòng nhập ngoại là OMK4 và OMK13. Nhóm III được phân thành 2 nhóm khác biệt: 47 - Nhóm IIIa: chỉ duy nhất dòng OMK19 với mức độ tương đồng là 67 %. - Nhóm IIIb: gồm 26 dòng dứa với khoảng cách tương đồng từ 0,75 – 1,0. Có thể chia nhóm này thành 2 nhóm phụ nhỏ sau: Nhóm IIIb1: chỉ gồm OMK18 với độ tương đồng là 70% so với nhóm. Nhóm IIIb2: gồm 25 dòng còn lại với hệ số tương đồng rất cao nằm trong khoảng 0,85 – 1,0. Bao gồm các dòng: OMK4, OMK40, OMK49, OMK47, OMK56, OMK59, OMK77, OMK13, OMK76 và các dòng OMK61 – OMK75. Các dòng dứa từ Hà Nội phần lớn không có sự khác biệt về di truyền bởi có mức độ tương đồng cao trên 90 % và cùng tương quan gần về di truyền với dòng có nguồn gốc từ Trung Quốc, Cần Thơ và Bến Tre. Đều này cho biết chúng có thể xuất phát từ các quần thể có quan hệ gần nhau. Đây sẽ là yếu tố quan trọng góp phần vào công tác chọn giống nhằm hạn chế việc chọn những giống ít có sự khác biệt di truyền. Kết quả thu được từ phân tích nhóm III cho thấy một số dòng gần như giống nhau hoàn toàn về mặt di truyền bởi chúng đều xuất phát từ một giống. Tuy nhiên đây chỉ là phân tích bước đầu do số lượng primer dùng để phân tích chưa đủ lớn và còn nhiều vấn đề xảy ra trong lúc tiến hành phản ứng mà chưa thể kiểm soát triệt để do đó chưa phân nhóm một cách chi tiết hơn đối với những dòng này. Như vậy, với 9 marker RAPD được sử dụng, 50 dòng dứa từ Cayenne được phân thành 3 nhóm chính (bảng 4.6) với mức độ tương đồng về di truyền giữa các nhóm được thể hiện trong bảng 4.7. Khoảng cách di truyền giữa các dòng dứa Cayenne dao động lớn từ 0,27 – 1,0 (phụ lục III) chứng tỏ có sự đa dạng về mặt di truyền cao. Qua phân nhóm, những dòng dứa thuộc các nhóm khác nhau có thể được sử dụng để làm vật liệu lai tạo trong chọn giống, cụ thể nhóm I, nhóm II có thể lai tạo với nhóm III sẽ tạo ra những quần thể đa dạng về nguồn gen bởi những nhóm có khoảng cách di truyền càng xa thì khả năng cho con lai có nhiều tính trạng càng cao (Bùi Chí Bửu, 2002). 48 Bảng 4.6: Kết quả phân tích nhóm của 50 dòng dứa Cayenne STT Tên dòng Nguồn gốc Phân nhóm STT Tên dòng Nguồn gốc Phân nhóm 1 OMK5 Nhật I 26 OMK47 Thơm Bến Tre III 2 OMK12 Úc I 27 OMK52 Thơm Bến Tre II 3 OMK19 Khóm Tây Ninh III 28 OMK49 Thơm Bến Tre III 4 OMK10 Úc I 29 OMK50 Thơm Bến Tre I 5 OMK17 Codevoire (Pháp) I 30 OMK51 Thơm Bến Tre I 6 OMK2 Đài Loan-BL I 31 OMK61 Thơm Hà Nội III 7 OMK7 MontiqueI (Pháp) I 32 OMK66 Thơm Hà Nội III 8 OMK15 Thơm Phụng I 33 OMK67 Thơm Hà Nội III 9 OMK29 ThomBT9 I 34 OMK64 Thơm Hà Nội III 10 OMK18 Khóm Hà Nội III 35 OMK65 Thơm Hà Nội III 11 OMK20 Thơm Tây Ninh I 36 OMK71 Thơm Hà Nội III 12 OMK4 Thơm Thái Lan III 37 OMK72 Thơm Hà Nội III 13 OMK11 Đài Loan I 38 OMK73 Thơm Hà Nội III 14 OMK1 Đài Loan I 39 OMK74 Thơm Hà Nội III 15 OMK8 Thơm Lâm Đồng I 40 OMK75 Thơm Hà Nội III 16 OMK9 Thái Lan-MC I 41 OMK56 Thơm Bến Tre III 17 OMK3 Thơm Trung An I 42 OMK76 Thơm Cần Thơ III 18 OMK59 Thơm Bến Tre III 43 OMK77 Phụng Hiệp III 19 OMK16 Thơm Kiên Giang II 44 OMK40 Thơm Bến Tre III 20 OMK44 Thơm Bến Tre II 45 OMK13 Trung Quốc III 21 OMK48 Thơm Bến Tre I 46 OMK62 Thơm Hà Nội III 22 OMK42 Thơm Bến Tre I 47 OMK63 Thơm Hà Nội III 23 OMK43 Thơm Bến Tre III 48 OMK68 Thơm Hà Nội III 24 OMK45 Thơm Bến Tre I 49 OMK69 Thơm Hà Nội III 25 OMK6 Thom Bến Lức I 50 OMK70 Thơm Hà Nội III Bảng 4.7: Mối tƣơng quan về di truyền giữa các nhóm Nhóm I II III I 0,67 II 0,63 0,71 III 0,49 0,49 0,69 49 4.3. Ƣớc đoán độ chính xác giữa phân nhóm dựa trên đặc tính kiểu hình và chỉ thị RAPD Qua phân nhóm của 50 dòng dứa Cayenne dựa trên kiểu hình (bảng 4.2) và kiểu gen (bảng 4.6) cho thấy về mặt kiểu hình những dòng dứa có nguồn gốc từ Hà Nội nằm trong 3 nhóm khác nhau, về mặt kiểu gen chúng nằm trong cùng một nhóm với mức tương quan gần với nhau. Tương tự, về kiểu hình OMK16 và OMK44 khác nhau về chiều cao, số lá / bụi, màu sắc, hình dạng lá nhưng trong phân tích kiểu gen thì tương đồng 86 %. Đều này cho thấy sự đa dạng kiểu hình chưa thể nói lên được sự khác biệt về di truyền, kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Bachmann (1992). Dựa trên phần mềm NTSYS-pc, độ tin cậy trong phân nhóm dựa vào kiểu hình và chỉ thị RAPD được đánh giá thông qua kiểm tra Mantel (Mantel, 1967) với kết quả hệ số tương quan trong phân nhóm dựa vào kiểu hình r = 0,66 (p = 1) và phân nhóm dựa trên kiểu gen r = 0,9 (p = 1). Hệ số tương quan càng lớn chứng tỏ độ tin cậy của phương pháp càng cao, đều này cho thấy đánh giá sự đa dạng nguồn gen dứa bằng chỉ thị RAPD chính xác hơn so với kiểu hình, kết quả này cũng đã được báo cáo trong nghiên cứu của Phạm Trung Nghĩa và ctv (1999). Khi so sánh hai ma trận khoảng cách giữa hai phương pháp, kết quả với giá trị tương quan r = 0,073 (p = 0,99) có thể thấy những tính trạng hình thái đang nghiên cứu bị tác động nhiều bởi môi trường nên hệ số tương quan chưa cao. Hệ số này có thể cải tiến nếu như nhiều dữ liệu hình thái được nghiên cứu và nhiều primer được sử dụng để đánh giá sự đa hình hơn nữa ( Martínez de Toda và Sahcha, 1997a). Tóm lại, nghiên cứu và phân nhóm dựa vào đặc tính kiểu hình và kiểu gen có thể giúp đoán được sự tương quan di truyền giữa những dòng dứa có nguồn gốc khác nhau từ giống Cayenne, từ đó giúp cho các nhà chọn giống định hướng sơ khởi về những vật liệu lai tạo, dự kiến các qui trình chọn lọc sao cho đạt hiệu quả cao nhất và rút ngắn thời gian. 50 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận - Dựa vào kiểu hình 50 dòng dứa từ giống Cayenne thuộc 4 nhóm khác nhau, có sự tương quan giữa các giống nhập nội với các giống có nguồn gốc nhập ngoại. Những dòng có cùng nguồn gốc nhưng vẫn có sự đa dạng về kiểu hình. - Trong tổng số 13 primer tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền thì chỉ có 9 primer cho sản phẩm khuếch đại. - Qua phương pháp RAPD đã cho thấy được sự đa dạng và phân nhóm khác nhau trong tập đoàn dứa Cayenne gồm 50 dòng có nguồn gốc khác nhau. - Tập đoàn dứa Cayenne khảo sát được phân thành 3 nhóm chính thông qua 9 marker RAPD ở mức độ tương đồng về di truyền là 66%. Trong đó, những dòng dứa trong nhóm II có khác biệt về di truyền cao hơn so với nhóm I và nhóm III. - Xác định được dòng OMK19 không phải giống Cayenne mà thuộc giống Queen. Một số dòng bị phân ly và lai tạp giữa giống Queen và Cayenne như OMK36, OMK1.. - Sử dụng phương pháp marker phân tử có thể dự đoán những cá thể có khả năng tạo ưu thế lai trong chọn tạo giống - Phương pháp phân nhóm di truyền dựa trên marker RAPD thì tương đối chính xác hơn kiểu hình. Dựa vào marker phân tử có thể đánh giá gián tiếp sự hiện diện hay không hiện diện của gen chọn lọc nhờ marker mà không bị ảnh hưởng của môi trường. - Ứng dụng các phương pháp marker phân tử trong phân tích đa dạng di truyền đòi hỏi có sự đầu tư lớn về trang thiết bị, máy móc cũng như sự kiên trì và lâu dài. 5.2. Đề nghị - Nghiên cứu và phân tích sự đa dạng trên nhiều tính trạng hình thái để có sự phân nhóm chính xác hơn về kiểu hình. Từ đó tìm hiểu những tính trạng có đóng góp nhiều trong sự khác biệt di truyền để kiểm soát và khai thác dễ dàng hơn. - Tiếp tục thử nghiệm, phân tích để tìm ra nhiều primer khác phân biệt những dòng dứa từ Cayenne một cách chi tiết hơn, tạo cơ sở cho việc xây dựng hoàn chỉnh sơ đồ phân nhóm di truyền dứa. - Tiếp tục ứng dụng marker RAPD để tìm sự liên kết với những gen quy định về tính trạng hình thái như năng suất, thời gian sinh trưởng, hình dạng trái, hình dạng lá.. 51 - Tiếp tục ứng dụng phương pháp marker phân tử trên nhiều giống khác để nghiên cứu sự đa dạng di truyền và nhận diện giống. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004. Di truyền phân tử. NXB Nông Nghiệp TP Hồ Chí Minh. 2. Bùi Chí Bửu, 2002. Cơ sở di truyền tính kháng sâu bệnh hại cây trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Tp.Hồ Chí Minh, trang: 11-53, 89-108, 183-195. 3. Claude Py và M. A. tisseau., 1993. Cây dứa (Ưng Định dịch). Nhà xuất bản nông thôn. 4. Trịnh Đình Đạt, Nguyễn Văn Niệm, Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Lê Trung Kiên, 1998. Nghiên cứu một số enzyme của Ong nội (Apis cerana) ở bốn địa phương khác nhau. Báo Cáo khoa học. 5. Nguyễn Thị Thu Đông, 1998. Khảo sát tính đa dạng di truyền của hai tập đoàn giống xoài (Mangifera indica) bằng phương pháp điện di Isozyme. Luận án thạc sĩ khoa học nông học, Đại Học Cần Thơ, Tp. Cần Thơ, trang 14 - 15. 6. Vũ Công Hậu, 1999. Trồng cây ăn quả ở Việt Nam. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, trang 185 – 212. 7. Nguyễn Văn Kế, 2001. Cây ăn quả nhiệt đới. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Thành Phố Hồ Chí Minh. 8. Nguyễn Thị Lang, 1999. Những phương pháp cơ bản trong nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Tp.Hồ Chí Minh. 9. Nguyễn Thanh Nhàn và ctv, 2003. Phân biệt các giống và phân tích nhóm / loài thuộc chi Citrus ở Việt Nam bằng chỉ thị RAPD. Kết quả nghiên cứu công nghệ rau quả, 2002-2003, Viện nghiên cứu cây ăn quả miền nam. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Tp.Hồ Chí Minh, trang 48 - 56. 10. Phan Lê Diệu Phương, 2003. So sánh đặc điểm nông học và bước đầu tìm hiểu tính đa dạng di truyền của một số giống dưa leo được ưa chuộng. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Nông Học, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, 55 trang. 11. Phạm Bình Quyền, 2002. Đa dạng sinh học. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia, Hà Nội. 52 12. Richard B. Primack, 1999. Cơ sở sinh học bảo tồn. Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật. 13. Khuất Hữu Thành, 2003. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, trang 151 – 157. 14. Lê Duy Thành, 2000. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, Hà Nội, trang 139 – 154. 15. Hoàng Thị Bích Thuỷ , 2004. Nghiên cứu đa dạng di truyền của các giống (dòng) dứa bằng chỉ thị RAPD. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. 16. Đoàn Hữu Tuấn và Tạ Minh Tiến, 2003. Khảo sát thị trường dứa thế giới và nhu cầu dứa tươi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Kết quả nghiên cứu khoa học công nghệ rau quả 2001-200, Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả Miền Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh. 17. Trần Thế Tục, Vũ Mạnh Hải, 2002. Kỹ thuật trồng dứa. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội. 257 trang. 18. Đỗ Đức Tuyến, 2000. Nghiên cứu sự đa hình di truyền của một số dòng, giống lúa phục vụ công tác chọn giống. Khoá luận tốt nghiệp hệ đại học chính quy nghành Sinh Học. 19. Trần Thị Oanh Yến, Luro Francosis và Nguyễn Ngọc Thi, 2003. Phân tích tính đa dạng di truyền nguồn gen cây có múi ở Việt Nam bằng microsattelitte marker. Kết quả nghiên cứu công nghệ rau quả, 2002-2003, Viện nghiên cứu cây ăn quả miền nam. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Tp.Hồ Chí Minh, trang 57 - 66. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 20. Anon, 2002. FAOSTAT Database. Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Rome, Italy. 21. Antoni Rafalski, Scott Tingey and Jonhn G.K. Williams, 1994. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Plant molecular biology manual / H4, p.1 - 8. 22. Aradhya M.K., Zee F. and Manshardt R.M. 1994. Isozyme variation in cultivated sand wild pineapple. Euphytica 79: 87–99. 23. Bachmann K., 1992. Phenotypic similarity and genetic relationship among populations of Microseris bigelovi (Aster-aceae: Lactuceae). Bot. Acta, 105: 337- 342 53 24. Boonsermsuk, S., T. Anai, K. Hasegawa, and S. Hisajima, 1997. Variation in Random Amplified Polymorphic DNA of sago palm (Metroxylon Spp.) in ThaiLand. Japan. J. Trop. Agr. 41 (2): 89 – 92. 25. Duval M.F., and d‟Eeckenbrugge G., 1993. Genetic variability in the genus Ananas. Acta Hort 334: 27 – 32. 26. Duval M-F., J-L. Noyer., X. Perrier., G. Coppens d'Eeckenbrugge and P. Hamon., 2001. Molecular diversity in pineapple assessed by RFLP markers. Theoretical and Applied Genetics 102: 83 - 90. 27. Ellsworth, D.L., D. Rittenhouse, and R.L Honeycutt. 1993. Artifactual variation in random amplified polymorphic DNA banding patterns. Bio Techniques 14: 214 – 217. 28. Henry T Nguyen, 1998. Molecular Marker Protocol. Section III, Texas Technology University plant molecular genetics laboratory. 29. Kangle Zheng, Ning Huang, John Bennett and Gurdev S. Khush,1995. PCR- bases marker-assisted selection in rice breeding. IRRI discation paper series No. 12. 30. Martínez de Toada, F. and Sancha, J.C Ampelographical characterization of red Vitis vinifera L. cultivars preserved in Rioja. Bulletin de l`OIV, Mars-Avril 1997a, vol. 70, no. 793 - 794, p. 220 – 234. 31. Nguyen Thi Lang, 2002. Protocol for molecular biotechnology. Ed. Nong Nghiep Publisher, Ho Chi Minh City. 32. Phạm Thi Be Tu, Nguyen Thi Lang và Bui Chi Buu, 2003. Soybean genetic diversity analysis. OmonRice 11: 138 - 141. Agricultural Publishing House, Ho Chi Minh City. 33. Pham Trung Nghia, JPS. Malik, Mp.Paamdeey and NR.Singh, 1999. Genetic distance analysis ò hydrids parental line based on morphological raits and markers. OmonRice, Journ Cuu Long Delta Rice Research Insitute Vietnam, p 49 – 59. Agricultural Publishing House, Ho Chi Minh City. 34. Rohfl FJ, 1992. NTSYSpc: Numercial taxonomy and multivariate analysis system. New York: Exeter Software. 35. Rohrbach, KG, Leal, F., and Coppens d‟Eeckenbrugge, G., 2003. History, distribution and world production. The Pineapple:Botany, Production and Uses (Eds. Bartholomew, DP, Paull, RE and Rohrbach, KG) . CABI Publishing, Oxon, UK, p 1- 12. 36. Sanewski, G and Scott, C., 2000. The Australian pineapple industry. In: Proceedings of the Third International Pineapple Symposium (Eds. 54 Subhadrabandhu, Sand Chairidchai P.). International Society for Horticultural Science, Pattaya, Thailand, p 53 - 55. 37. Sergio Feuse, Kelin Meler, Marcos Daquinta, Miguel P. Guerra and Rubens O. Nordari, 2003. Plantcell, Tissue and Organ Culture, 72: 221 - 227). 38. Sneath, P. H. A. and R. R. Sokal., 1973. Numerical Taxonomy. Freeman, San Francisco. 573 pages. 39. Sun, Samuel S.M., 1994. Methods in plant molecular biology and agricultural biotechnology: a laboratory training manual. Asian Vegetable Research and Development Center: Shahua, Tainan, Taiwan (ROC), p – 41. 40. Tanksley, S.D., N.Ahn, M.Cause, R.Coffman, T.Fulton, S.R.McCouch, G.Sencond, T.Tai, Z.Wang, K.Wu, Z.Yu. 1991. RFLP mapping of rice genome. Rice genetics. Vol II: 435 - 449. Intenational Rice Research Institute. 55 PHỤ LỤC Phụ lục I: Bảng Anova Phân tích Anova về chiều cao cây của 50 dòng dứa Cayenne. ============================================================ SV DF SS MS F ============================================================= LL (R) 1 18.490000 18.490000 1.27 ns NT (T) 49 2123.410000 43.334898 2.97 ** ERROR 49 715.010000 14.592041 ------------------------------------------------------------------------------- TOTAL 99 2856.910000 ============================================================= cv = 3.6% ** = significant at 1% level; ns = not significant. Phân tích Anova về chiều rộng tán của 50 dòng dứa Cayenne. ============================================================ SV DF SS MS F ============================================================= LL (R) 1 1.000000 1.000000 <1 NT (T) 49 6548.040000 133.633469 6.18 ** ERROR 49 1059.000000 21.612245 ------------------------------------------------------------------------------- TOTAL 99 7608.040000 ============================================================= cv = 4.2% ** = significant at 1% level Phân tích Anova về chiều dài lá của 50 dòng dứa Cayenne. ============================================================= SV DF SS MS F ============================================================= LL (R) 1 2.560000 2.560000 <1 NT (T) 49 1702.000000 34.734694 3.81 ** ERROR 49 446.440000 9.111020 ------------------------------------------------------------------------------- TOTAL 99 2151.000000 ============================================================= 56 cv = 4.0% ** = significant at 1% level Phân tích Anova về chiều rộng lá của 50 dòng dứa Cayenne. ============================================================ SV DF SS MS F =========================================================== LL (R) 1 0.64000000 0.64000000 3.07 ns NT (T) 49 20.86040000 0.42572245 2.04 ** ERROR 49 10.22000000 0.20857143 ------------------------------------------------------------------------------- TOTAL 99 31.72040000 ============================================================ cv = 8.5% ** = significant at 1% level; ns = not significant Phân tích Anova về số lá trên bụi của 50 dòng dứa Cayenne. =========================================================== SV DF SS MS F ============================================================= LL (R) 1 40.960000 40.960000 5.03 * NT (T) 49 1496.240000 30.535510 3.75 ** ERROR 49 399.040000 8.143673 ------------------------------------------------------------------------------- TOTAL 99 1936.240000 ============================================================ cv = 4.3% ** = significant at 1% level; * = significant at 5% level Phụ lục II: Hình dạng và màu sắc lá của 50 giống Cayenne. Tên giống Màu sắc Hình dạng Tên giống Màu sắc Hình dạng OMK5 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK47 Xanh đậm Không gai OMK12 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK52 Xanh đậm Không gai OMK19 Xanh đỏ tía Có gai OMK49 Xanh với đốm nâu đỏ Không gai OMK10 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK50 Xanh nhạt Không gai OMK17 Xanh đậm Không có gai OMK51 Xanh với đốm nâu đỏ Có viền OMK2 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK61 Xanh đỏ tía Có gai OMK7 Xanh với đốm nâu đỏ Có gai OMK66 Xanh với đốm nâu đỏ Không gai OMK15 Xanh nhạt Có gai OMK67 Xanh với đốm nâu đỏ Không gai OMK29 Xanh nhạt Có viền OMK64 Xanh với đốm nâu đỏ Có viền OMK18 Xanh đậm Có gai OMK65 Xanh với đốm nâu đậm Có gai OMK20 Xanh đậm Có viền OMK71 Xanh đậm Không gai 57 OMK4 Xanh với đốm nâu đỏ Có viền OMK72 Xanh đậm Có viền OMK11 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK73 Xanh với đốm nâu đỏ Không gai OMK1 Xanh với đốm nâu đỏ có gai OMK74 Xanh đốm nâu đỏ nhạt Không gai OMK8 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK75 Xanh đậm Không gai OMK9 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK56 Xanh đậm Không gai OMK3 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK76 Xanh đậm Có viền OMK59 Xanh đậm Không có gai OMK77 Xanh với đốm nâu đỏ Có gai OMK16 Xanh đỏ tía Có gai OMK40 Xanh đậm Có viền OMK44 Xanh đậm Không có gai OMK13 Xanh nhạt Có gai OMK48 Xanh với đốm nâu nhạt Không có gai OMK62 Xanh với đốm nâu đỏ Không gai OMK42 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK63 Xanh với đốm nâu đỏ Có viền OMK43 Xanh với đốm nâu đậm Không có gai OMK68 Xanh với đốm nâu đỏ Không gai OMK45 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK69 Xanh đỏ tía Có viền OMK6 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK70 Xanh với đốm nâu đỏ Không gai Phụ lục III: Ma trận tƣơng đồng của 50 dòng)Cayenne dựa trên dữ liệu RAPD " SIMQUAL: input=E:\tuyen\de tai\XU LY THONG KE\xuly NTSYS\tuyen.xls, coeff=SM " by Cols 3 50L 50 0 ThomNhat UcI KhomTayNinh UcII Codevoire DailoanBL Montique Thomphung ThomBT9 KhomHaNoi ThomTayNinh ThomThaiLan DailoanII DailoanI ThomLamDong ThomThailanMC ThomTrungAn ThomBT39 ThomKienGiang ThomBT24 ThomBT28 ThomBT22 ThomBT23 ThomBT25 ThomBenLuc ThomBT27 ThomBT32 ThomBT29 ThomBT30 ThomBT31 HaNoi1 HaNoi6 HaNoi7 HaNoi4 HaNoi5 HaNoi11 HaNoi12 HaNoi13 HaNoi14 HaNoi15 ThomBT36 ThomCanTho PhungHiep ThomBT20 TrungQuoc HaNoi2 HaNoi3 HaNoi8 HaNoi9 HaNoi10 1.0000000 0.7297297 1.0000000 0.6216216 0.6756757 1.0000000 0.7297297 0.8378378 0.7297297 1.0000000 0.7027027 0.6486486 0.4324324 0.7027027 1.0000000 0.7567568 0.6486486 0.5405405 0.8108108 0.7837838 1.0000000 58 0.7837838 0.6216216 0.5135135 0.6756757 0.7567568 0.8648649 1.0000000 0.7837838 0.6756757 0.5675676 0.7837838 0.8108108 0.7567568 0.6756757 1.0000000 0.6756757 0.6216216 0.5675676 0.6756757 0.6486486 0.8648649 0.7297297 0.6216216 1.0000000 0.5405405 0.5945946 0.5945946 0.4864865 0.5675676 0.5135135 0.4324324 0.4864865 0.6486486 1.0000000 0.7567568 0.7567568 0.4864865 0.7027027 0.6756757 0.7297297 0.7027027 0.7567568 0.7027027 0.5135135 1.0000000 0.4594595 0.5135135 0.6756757 0.4054054 0.3783784 0.3243243 0.2972973 0.5135135 0.4594595 0.7027027 0.4324324 1.0000000 0.8648649 0.7027027 0.5405405 0.7567568 0.7297297 0.7837838 0.8108108 0.7567568 0.6486486 0.4054054 0.8918919 0.3243243 1.0000000 0.8918919 0.7297297 0.5675676 0.7837838 0.7567568 0.8108108 0.7837838 0.8378378 0.6756757 0.4324324 0.8108108 0.4054054 0.9189189 1.0000000 0.7837838 0.6756757 0.4594595 0.6756757 0.5945946 0.7027027 0.6756757 0.6756757 0.7297297 0.4864865 0.7567568 0.3513514 0.7567568 0.7837838 1.0000000 0.8378378 0.7297297 0.5675676 0.7297297 0.7027027 0.7567568 0.7837838 0.7837838 0.6756757 0.4324324 0.8108108 0.4594595 0.8648649 0.9459459 0.7837838 1.0000000 0.7837838 0.7837838 0.6216216 0.7297297 0.8108108 0.6486486 0.7297297 0.7837838 0.5135135 0.5405405 0.7027027 0.5675676 0.7567568 0.7837838 0.5675676 0.7837838 1.0000000 0.5405405 0.4864865 0.7027027 0.4864865 0.4594595 0.4054054 0.3783784 0.5945946 0.4324324 0.6756757 0.4054054 0.9189189 0.4054054 0.4864865 0.3243243 0.4864865 0.6486486 1.0000000 0.6486486 0.7027027 0.3783784 0.5405405 0.6756757 0.5135135 0.5405405 0.6486486 0.4864865 0.4594595 0.7297297 0.5945946 0.6756757 0.6486486 0.5405405 0.6486486 0.7567568 0.5675676 1.0000000 0.6486486 0.7027027 0.4324324 0.5945946 0.6756757 0.5135135 0.5945946 0.7027027 0.4864865 0.4054054 0.7297297 0.5945946 0.6756757 0.7027027 59 0.5945946 0.7567568 0.7567568 0.5675676 0.8378378 1.0000000 0.6486486 0.5945946 0.5405405 0.6486486 0.7297297 0.6216216 0.5945946 0.8108108 0.4864865 0.5135135 0.6756757 0.6486486 0.6756757 0.7027027 0.4864865 0.7027027 0.8108108 0.7297297 0.6756757 0.7297297 1.0000000 0.7297297 0.6756757 0.5675676 0.7297297 0.8108108 0.7027027 0.6216216 0.8918919 0.5675676 0.5405405 0.7567568 0.5675676 0.7567568 0.7837838 0.5675676 0.7297297 0.8378378 0.6486486 0.7027027 0.7027027 0.9189189 1.0000000 0.4864865 0.5405405 0.7027027 0.4324324 0.3513514 0.3513514 0.3243243 0.4864865 0.4864865 0.7297297 0.4594595 0.9729730 0.3513514 0.3783784 0.3783784 0.4324324 0.5405405 0.8918919 0.5675676 0.5675676 0.6216216 0.5405405 1.0000000 0.6486486 0.7027027 0.5945946 0.6486486 0.6216216 0.6216216 0.4864865 0.7567568 0.6486486 0.6756757 0.7297297 0.7027027 0.6216216 0.6486486 0.5945946 0.6486486 0.6486486 0.6756757 0.6756757 0.6756757 0.7837838 0.8108108 0.7297297 1.0000000 0.5405405 0.7027027 0.7027027 0.7567568 0.6216216 0.5675676 0.5405405 0.7027027 0.4324324 0.4594595 0.6216216 0.5945946 0.6216216 0.6486486 0.4324324 0.6486486 0.7567568 0.6756757 0.5675676 0.6756757 0.8378378 0.8108108 0.5675676 0.7297297 1.0000000 0.5135135 0.5675676 0.7297297 0.4594595 0.3783784 0.3783784 0.3513514 0.5135135 0.5135135 0.7567568 0.4864865 0.9459459 0.3783784 0.4054054 0.4054054 0.4594595 0.5675676 0.8648649 0.5405405 0.5405405 0.6486486 0.5675676 0.9729730 0.7567568 0.5945946 1.0000000 0.5675676 0.6216216 0.5135135 0.5135135 0.4864865 0.5405405 0.6216216 0.5135135 0.5135135 0.4324324 0.5945946 0.6756757 0.5945946 0.5675676 0.5135135 0.6216216 0.6216216 0.5945946 0.7027027 0.7027027 0.7027027 0.6216216 0.7027027 0.6486486 0.5945946 0.6756757 1.0000000 0.4864865 0.5945946 0.5945946 0.4864865 0.4594595 0.4054054 0.4324324 0.5405405 0.3783784 0.6216216 0.5675676 0.8648649 0.4594595 0.4324324 0.3783784 0.4864865 0.6486486 0.7837838 0.6756757 0.6756757 0.7297297 0.6486486 0.8918919 0.7297297 0.6756757 0.8648649 0.8108108 1.0000000 60 0.5675676 0.7837838 0.5675676 0.7297297 0.5945946 0.5945946 0.5675676 0.6216216 0.5135135 0.4324324 0.6486486 0.5135135 0.6486486 0.6216216 0.5135135 0.5675676 0.6756757 0.5405405 0.6486486 0.7027027 0.7027027 0.6756757 0.5405405 0.6486486 0.7567568 0.5675676 0.7297297 0.6486486 1.0000000 0.7567568 0.7567568 0.5405405 0.7567568 0.7297297 0.6756757 0.6486486 0.7027027 0.5945946 0.5135135 0.7837838 0.4324324 0.8378378 0.7567568 0.6486486 0.7027027 0.8108108 0.4594595 0.7837838 0.6756757 0.6756757 0.7567568 0.4594595 0.6756757 0.6216216 0.4864865 0.5945946 0.5675676 0.7027027 1.0000000 0.5675676 0.5135135 0.6756757 0.5135135 0.4324324 0.4324324 0.3513514 0.5675676 0.4594595 0.7027027 0.4324324 0.8378378 0.4324324 0.4594595 0.3513514 0.4054054 0.5675676 0.9189189 0.5405405 0.4864865 0.6486486 0.6216216 0.8648649 0.7027027 0.5945946 0.8378378 0.5675676 0.7567568 0.5675676 0.4864865 1.0000000 0.4864865 0.5405405 0.7027027 0.4324324 0.3513514 0.3513514 0.3243243 0.4864865 0.4864865 0.7297297 0.4594595 0.9729730 0.3513514 0.3783784 0.3783784 0.4324324 0.5405405 0.8918919 0.5675676 0.5675676 0.6216216 0.5405405 1.0000000 0.7297297 0.5675676 0.9729730 0.7027027 0.8918919 0.5405405 0.4594595 0.8648649 1.0000000 0.4324324 0.4864865 0.6486486 0.3783784 0.2972973 0.2972973 0.2702703 0.4324324 0.4324324 0.7297297 0.4054054 0.9189189 0.2972973 0.3243243 0.4324324 0.3783784 0.4864865 0.8378378 0.5135135 0.5135135 0.5675676 0.4864865 0.9459459 0.6756757 0.5135135 0.9189189 0.6486486 0.8378378 0.4864865 0.4054054 0.8108108 0.9459459 1.0000000 0.4594595 0.5135135 0.6756757 0.4054054 0.3243243 0.3783784 0.3513514 0.4594595 0.5135135 0.7027027 0.4324324 0.9459459 0.3243243 0.3513514 0.3513514 0.4054054 0.5135135 0.8648649 0.5405405 0.5405405 0.5945946 0.5135135 0.9729730 0.7027027 0.5405405 0.9459459 0.7297297 0.8648649 0.5675676 0.4324324 0.8378378 0.9729730 0.9189189 1.0000000 0.4054054 0.5135135 0.6756757 0.4054054 0.2702703 0.3243243 0.2972973 0.4054054 0.4594595 0.7027027 0.4324324 0.8918919 0.3243243 0.3513514 61 0.4594595 0.4054054 0.4594595 0.8108108 0.4864865 0.4864865 0.5405405 0.4594595 0.9189189 0.6486486 0.5405405 0.8918919 0.6756757 0.8108108 0.5135135 0.3783784 0.7837838 0.9189189 0.9729730 0.8918919 1.0000000 0.4864865 0.5405405 0.7027027 0.4324324 0.3513514 0.3513514 0.3243243 0.4864865 0.4864865 0.7297297 0.4594595 0.9729730 0.3513514 0.3783784 0.3783784 0.4324324 0.5405405 0.8918919 0.5675676 0.5675676 0.6216216 0.5405405 1.0000000 0.7297297 0.5675676 0.9729730 0.7027027 0.8918919 0.5405405 0.4594595 0.8648649 1.0000000 0.9459459 0.9729730 0.9189189 1.0000000 0.4324324 0.4864865 0.6486486 0.3783784 0.2972973 0.2972973 0.2702703 0.4324324 0.4324324 0.7297297 0.4054054 0.9189189 0.2972973 0.3243243 0.4324324 0.3783784 0.4864865 0.8378378 0.5135135 0.5135135 0.5675676 0.4864865 0.9459459 0.6756757 0.5135135 0.9189189 0.6486486 0.8378378 0.4864865 0.4054054 0.8108108 0.9459459 1.0000000 0.9189189 0.9729730 0.9459459 1.0000000 0.4864865 0.5405405 0.7027027 0.4324324 0.3513514 0.3513514 0.3243243 0.4864865 0.4864865 0.7297297 0.4594595 0.9729730 0.3513514 0.3783784 0.3783784 0.4324324 0.5405405 0.8918919 0.5675676 0.5675676 0.6216216 0.5405405 1.0000000 0.7297297 0.5675676 0.9729730 0.7027027 0.8918919 0.5405405 0.4594595 0.8648649 1.0000000 0.9459459 0.9729730 0.9189189 1.0000000 0.9459459 1.0000000 0.4054054 0.5135135 0.6756757 0.4054054 0.2702703 0.3243243 0.2972973 0.4054054 0.4594595 0.7027027 0.4324324 0.8918919 0.3243243 0.3513514 0.4594595 0.4054054 0.4594595 0.8108108 0.4864865 0.4864865 0.5405405 0.4594595 0.9189189 0.6486486 0.5405405 0.8918919 0.6756757 0.8108108 0.5135135 0.3783784 0.7837838 0.9189189 0.9729730 0.8918919 1.0000000 0.9189189 0.9729730 0.9189189 1.0000000 0.4864865 0.4864865 0.6486486 0.4864865 0.4054054 0.4054054 0.3243243 0.5405405 0.4864865 0.6216216 0.5135135 0.8648649 0.4594595 0.4324324 0.3783784 0.4864865 0.5405405 0.8378378 0.5675676 0.5675676 0.6756757 0.5945946 0.8918919 0.7297297 0.6216216 0.8648649 0.6486486 0.7837838 0.5405405 0.5135135 0.8108108 0.8918919 0.8378378 0.8648649 0.8108108 62 0.8918919 0.8378378 0.8918919 0.8108108 1.0000000 0.4324324 0.4864865 0.5945946 0.3783784 0.2972973 0.2972973 0.2702703 0.4324324 0.4324324 0.6756757 0.4594595 0.8648649 0.3513514 0.3243243 0.4324324 0.3783784 0.4864865 0.7837838 0.5675676 0.5135135 0.5675676 0.4864865 0.8918919 0.6756757 0.5135135 0.8648649 0.6486486 0.7837838 0.4864865 0.4594595 0.7567568 0.8918919 0.9459459 0.8648649 0.9189189 0.8918919 0.9459459 0.8918919 0.9189189 0.8918919 1.0000000 0.4864865 0.5405405 0.7027027 0.4324324 0.3513514 0.3513514 0.3243243 0.4864865 0.4864865 0.7297297 0.4594595 0.9729730 0.3513514 0.3783784 0.3783784 0.4324324 0.5405405 0.8918919 0.5675676 0.5675676 0.6216216 0.5405405 1.0000000 0.7297297 0.5675676 0.9729730 0.7027027 0.8918919 0.5405405 0.4594595 0.8648649 1.0000000 0.9459459 0.9729730 0.9189189 1.0000000 0.9459459 1.0000000 0.9189189 0.8918919 0.8918919 1.0000000 0.4054054 0.4594595 0.6216216 0.3513514 0.2702703 0.2702703 0.2432432 0.4054054 0.4054054 0.7027027 0.3783784 0.8918919 0.2702703 0.2972973 0.4054054 0.3513514 0.4594595 0.8108108 0.4864865 0.4864865 0.5405405 0.4594595 0.9189189 0.6486486 0.4864865 0.8918919 0.6216216 0.8108108 0.4594595 0.3783784 0.8378378 0.9189189 0.9729730 0.8918919 0.9459459 0.9189189 0.9729730 0.9189189 0.9459459 0.8108108 0.9189189 0.9189189 1.0000000 0.5135135 0.5135135 0.7297297 0.4594595 0.3783784 0.3783784 0.3513514 0.5135135 0.4594595 0.7027027 0.4324324 0.9459459 0.3783784 0.4054054 0.3513514 0.4594595 0.5675676 0.9189189 0.5405405 0.5405405 0.6486486 0.5675676 0.9729730 0.7027027 0.5945946 0.9459459 0.6756757 0.8648649 0.5135135 0.4324324 0.8918919 0.9729730 0.9189189 0.9459459 0.8918919 0.9729730 0.9189189 0.9729730 0.8918919 0.9189189 0.8648649 0.9729730 0.8918919 1.0000000 0.4864865 0.5405405 0.7027027 0.4324324 0.3513514 0.3513514 0.3243243 0.4864865 0.4864865 0.7297297 0.4594595 0.9729730 0.3513514 0.3783784 0.3783784 0.4324324 0.5405405 0.8918919 0.5675676 0.5675676 0.6216216 0.5405405 1.0000000 0.7297297 0.5675676 0.9729730 0.7027027 0.8918919 0.5405405 0.4594595 0.8648649 1.0000000 0.9459459 0.9729730 0.9189189 63 1.0000000 0.9459459 1.0000000 0.9189189 0.8918919 0.8918919 1.0000000 0.9189189 0.9729730 1.0000000 0.4864865 0.5405405 0.7027027 0.4324324 0.3513514 0.3513514 0.3243243 0.4864865 0.4864865 0.7297297 0.4594595 0.9729730 0.3513514 0.3783784 0.3783784 0.4324324 0.5405405 0.8918919 0.5675676 0.5675676 0.6216216 0.5405405 1.0000000 0.7297297 0.5675676 0.9729730 0.7027027 0.8918919 0.5405405 0.4594595 0.8648649 1.0000000 0.9459459 0.9729730 0.9189189 1.0000000 0.9459459 1.0000000 0.9189189 0.8918919 0.8918919 1.0000000 0.9189189 0.9729730 1.0000000 1.0000000 0.4594595 0.5135135 0.6756757 0.4054054 0.3243243 0.3783784 0.3513514 0.4594595 0.5135135 0.7027027 0.4324324 0.9459459 0.3243243 0.3513514 0.3513514 0.4054054 0.5135135 0.8648649 0.5405405 0.5405405 0.5945946 0.5135135 0.9729730 0.7027027 0.5405405 0.9459459 0.7297297 0.8648649 0.5675676 0.4324324 0.8378378 0.9729730 0.9189189 1.0000000 0.8918919 0.9729730 0.9189189 0.9729730 0.8918919 0.8648649 0.8648649 0.9729730 0.8918919 0.9459459 0.9729730 0.9729730 1.0000000 0.4864865 0.5405405 0.7027027 0.4324324 0.3513514 0.3513514 0.3243243 0.4864865 0.4864865 0.7297297 0.4594595 0.9729730 0.3513514 0.3783784 0.3783784 0.4324324 0.5405405 0.8918919 0.5675676 0.5675676 0.6216216 0.5405405 1.0000000 0.7297297 0.5675676 0.9729730 0.7027027 0.8918919 0.5405405 0.4594595 0.8648649 1.0000000 0.9459459 0.9729730 0.9189189 1.0000000 0.9459459 1.0000000 0.9189189 0.8918919 0.8918919 1.0000000 0.9189189 0.9729730 1.0000000 1.0000000 0.9729730 1.0000000 0.4864865 0.5405405 0.7027027 0.4324324 0.3513514 0.3513514 0.3243243 0.4864865 0.4864865 0.7297297 0.4594595 0.9729730 0.3513514 0.3783784 0.3783784 0.4324324 0.5405405 0.8918919 0.5675676 0.5675676 0.6216216 0.5405405 1.0000000 0.7297297 0.5675676 0.9729730 0.7027027 0.8918919 0.5405405 0.4594595 0.8648649 1.0000000 0.9459459 0.9729730 0.9189189 1.0000000 0.9459459 1.0000000 0.9189189 0.8918919 0.8918919 1.0000000 0.9189189 0.9729730 1.0000000 1.0000000 0.9729730 1.0000000 1.0000000 0.4864865 0.5405405 0.7027027 0.4324324 0.3513514 0.3513514 0.3243243 0.4864865 0.4864865 0.7297297 0.4594595 0.9729730 0.3513514 0.3783784 64 0.3783784 0.4324324 0.5405405 0.8918919 0.5675676 0.5675676 0.6216216 0.5405405 1.0000000 0.7297297 0.5675676 0.9729730 0.7027027 0.8918919 0.5405405 0.4594595 0.8648649 1.0000000 0.9459459 0.9729730 0.9189189 1.0000000 0.9459459 1.0000000 0.9189189 0.8918919 0.8918919 1.0000000 0.9189189 0.9729730 1.0000000 1.0000000 0.9729730 1.0000000 1.0000000 1.0000000